CN117982541A - 中华伊格尔兹氏菌在制备防治炎症性肠病和结直肠癌的产品中的应用 - Google Patents
中华伊格尔兹氏菌在制备防治炎症性肠病和结直肠癌的产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了中华伊格尔兹氏菌在制备防治炎症性肠病和结直肠癌的产品中的应用，所述中华伊格尔兹氏菌的保藏编号为GDMCC No：64286，已于2024年1月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。本发明提供的中华伊格尔兹氏菌具备减轻炎症性肠病的症状和抑制结直肠癌的发生发展的双重功能。不仅，修复黏膜屏障，减少黏膜损伤，降低结肠的通透性，保护肠道黏膜物理屏障，减轻炎症，还能缓解继发性的脾脏肿大，有效帮助机体恢复调节免疫状态，同时能显著抑制结肠肿瘤的增殖，减少结肠上皮细胞的癌变。本发明提供了中华伊格尔兹氏菌的新用途，为防治炎症性肠病、结直肠肿瘤及其相关的消化疾病提供了新的技术选择。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地，涉及中华伊格尔兹氏菌在制备防治炎症性肠病和结直肠癌的产品中的应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)包括溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)，是一类原因不明、特发性的、典型肠道炎症性疾病，曾被称为“绿色癌症”，易病情反复、迁延不愈，目前缺乏有效的治疗方法。此外，长期慢性的肠炎会增加结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)的发病率，CRC的发生率在确诊IBD后10、20、30年的分别为2％、8％、18％。CRC目前是高发病率和死亡率胃肠道恶性肿瘤，多数结直肠癌患者确诊时已属中晚期，目前在临床上治疗结直肠癌的主流方法都有较大的副作用，治疗效果不佳。CRC的发生被认为是多因素多阶段多基因共同参与的、复杂的病理生理及微生物与宿主互作过程。其中，CRC发生发展过程中不可控的慢性炎症、肠道菌群及其代谢紊乱、不可修复的肠黏膜屏障破损，这几大核心因素如何互作、互相促进、互相形成复杂的病理反馈体系，是决定CRC发生发展的核心病理原因。
肠道菌群中大部分是共生菌，参与宿主营养代谢、生理过程和肠道免疫调节，具有维护肠黏膜免疫系统的发育、维持黏膜屏障和肠道结构完整性的作用，IBD和CRC的发病机制都与肠道免疫异常和共生菌群扰乱等因素相关。有益菌是一种安全的可食用和补充的生物制剂，通过补充有益菌来调节宿主黏膜稳态，调节宿主代谢和免疫，能缓解和治疗多种消化系统疾病。
不同有益菌菌株对消化系统疾病表现出不同程度的缓解作用，如罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri，L.r)被能够减少IBD密切相关炎症细胞因子的表达来减轻黏膜炎症，以及嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila，A.m)能改善受损的肠道黏膜屏障和菌群紊乱，抑制结直肠癌的发生发展。然而，这两种菌不具有IBD和CRC兼治的功能，容易引起肠胃不适等副作用。
发明内容
为了解决现有技术中缺少针对抗炎症性肠病和结直肠癌都有优异疗效且副作用小的有益菌的问题，本发明提供了中华伊格尔兹氏菌在制备防治炎症性肠病和结直肠癌的产品中的应用。
本发明的第一个目的是提供一种中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A。
本发明的第二个目的是提供中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备防治炎症性肠病的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备防治结直肠肿瘤的产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备修复黏膜屏障和/或减轻肠道黏膜损伤的产品中的应用。
本发明的第五个目的是提供中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备改善结直肠肿瘤预后效果的产品中的应用。
本发明的第六个目的是提供中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备治疗急性和/或慢性肠炎的产品中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种防治炎症性肠病和/或结直肠肿瘤的菌剂。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明分离得到一株中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis，E.sin)，该菌能显著减轻炎症性肠病模型小鼠的炎症损伤，能够减轻肠黏膜损伤、降低炎症性肠病疾病活动指数和防止炎症性肠病引起的结肠长度缩短和改善预后效果，并且能抑制TNF-α和IL-6的表达和维护结肠黏膜的屏障完整性，减轻炎症反应，减少结直肠肿瘤的数量和负担。
本发明请求保护以下内容：
一种中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A，所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的保藏编号为GDMCC No：64286，已于2024年1月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备防治炎症性肠病的产品中的应用。所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备防治结直肠肿瘤的产品中的应用。
优选地，所述结直肠肿瘤包括良性结直肠肿瘤和/或恶性结直肠肿瘤。
更优选地，所述恶性结直肠肿瘤包括但不限于结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、炎症相关结直肠癌以及结直肠癌相关的癌前病变。
更优选地，所述良性结直肠肿瘤包括结肠腺瘤、直肠腺瘤和结直肠腺瘤中的一种或几种。
优选地，所述防治结直肠肿瘤包括抑制结直肠肿瘤的生长。
更优选地，所述抑制结直肠肿瘤的生长包括抑制结直肠肿瘤的体积增长、抑制结直肠肿瘤的重量增加、减少结直肠肿瘤的数量和抑制与结直肠肿瘤密切相关的炎症因子的表达中一种或几种。
进一步优选地，所述与结直肠肿瘤密切相关的炎症因子包括TNF-α和IL-6。
中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备修复黏膜屏障和/或减轻肠道黏膜损伤的产品中的应用。
优选地，所述肠黏膜损伤是由急性或慢性肠炎引起的。
优选地，所述修复黏膜屏障和/或减轻肠黏膜损伤包括减轻病理损伤、降低黏膜屏障通透性和/或促进黏膜紧密连接蛋白的表达。
中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备改善结直肠肿瘤预后效果的产品中的应用。
中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备治疗急性和/或慢性肠炎的产品中的应用。
中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备减轻肠道炎症的产品中的应用。
优选地，所述肠道炎症是由急性和/或慢性肠炎引起的。
中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备降低炎症性肠病疾病活动指数的产品中的应用。
中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备防止炎症性肠病引起的结肠长度缩短的产品中的应用。
中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备炎症性肠病预后改善的产品中的应用。
中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在抑制肠道中炎症因子表达中的应用。
优选地，所述炎症因子包括TNF-α和IL-6。
中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在降低血清LPS的浓度中的应用。
对于任一项所述的应用，优选地，所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthellasinensis)为中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)的活菌、培养菌液、死菌、细胞裂解物、代谢产物、改造菌、突变菌和/或诱变菌中的一种或几种。所述的活菌为具有新陈代谢活力的完整细菌，所述的细胞裂解物包括细菌组成成分和遗传物质及其相关成分，包括细菌细胞膜、菌毛、鞭毛、LPS、核酸物质等来源于细菌的成分。
更优选地，所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)为中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)的活菌和/或培养菌液。
更优选地，所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)为所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A，或其16S rDNA序列与所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的16S rDNA序列具有至少95％以上一致性的中华伊格尔兹氏菌；所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A菌株的16S rDNA序列如SEQID NO:3所示。
进一步优选地，所述中华伊格尔兹氏菌为所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthellasinensis)YW-2A。
一种防治炎症性肠病和/或结直肠肿瘤的菌剂，包含中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)的活菌、培养菌液、死菌、细胞裂解物、代谢产物、改造菌、突变菌和/或诱变菌中的一种或几种作为活性成分。所述的活菌为具有新陈代谢活力的完整细菌，所述的细胞裂解物包括细菌组成成分和遗传物质及其相关成分，包括细菌细胞膜、菌毛、鞭毛、LPS、核酸物质等来源于细菌的成分。
优选地，所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)为中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)的活菌和/或培养菌液作为活性成分。
优选地，所述中华伊格尔兹氏菌为所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthellasinensis)YW-2A，或其16S rDNA序列与所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的16S rDNA序列具有至少95％以上一致性的中华伊格尔兹氏菌；所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:3所示。
更优选地，所述中华伊格尔兹氏菌为所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthellasinensis)YW-2A。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)具备减轻炎症性肠病的症状和抑制结直肠癌的发生发展的双重功能。不仅，修复黏膜屏障，减少肠屏障损伤，降低结肠的通透性，保护肠道黏膜物理屏障，降低炎症，还能缓解继发性的脾脏肿大，有效帮助机体恢复调节免疫状态，同时能显著抑制结肠肿瘤的增殖，减少结肠上皮细胞的癌变。本发明提供了中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)的新用途，为防治炎症性肠病、结直肠肿瘤及其相关的消化疾病提供了新的技术选择。
附图说明
图1为中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)的人群分布、分离、筛选及鉴定结果；A为正常人(HC)和IBD病人(IBD)粪便的16S rDNA测序结果，伊格尔兹氏菌属(Eggerthella)在正常人的定植丰度显著高于IBD病人；B为16S rDNA测序检测正常组织(Ctrl)和结直肠癌组织(CRC)中差异菌株的富集情况，中华伊格尔兹氏菌(Eggerthellasinensis)在正常组织定植显著多于肿瘤组织；C为从正常结肠黏膜组织分离的、经PCR测序鉴定并归类为中华伊格尔兹氏菌的菌株的菌落形态；D为分离到的中华伊格尔兹氏菌菌株的透射电镜微观形态图；E为分离到的菌株的16S rDNA序列在NCBI数据库中的比对结果。
图2为实施例4中中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A显著降低炎症性肠病模型小鼠肠炎症状；A为生理盐水(Ctrl)、中华伊格尔兹氏菌(E.sin)、罗伊氏乳杆菌(L.r)和Eggerthella sp.(Egg)处理的肠炎模型小鼠疾病活动指数(DAI)结果；B为各组小鼠的结肠解剖图；C为各组小鼠结肠长度统计结果；D为各组小鼠的“瑞士卷”结肠切片的苏木素和伊红(H&E)染色结果，Proximal代表近端结肠，Distal代表远端结肠；E为各组小鼠结肠切片的炎症范围、隐窝损伤、杯状细胞减少和炎症细胞浸润的组织学评分。
图3为实施例4中中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A在炎症性肠病模型小鼠中极大缓解炎症对肠上皮的结构损坏、维护肠黏膜屏障功能的结果；A为生理盐水(Ctrl)、中华伊格尔兹氏菌(E.sin)、罗伊氏乳杆菌(L.r)和Eggerthella sp.(Egg)处理的肠炎模型小鼠的结肠黏膜屏障指标(E-cadherin和Occludin)的免疫组化染色对比图；B为各组小鼠的结肠切片的E-cadherin的染色强度分析统计图；C为各组小鼠的结肠切片的Occludin的染色强度分析统计图；D为各组小鼠的血清LPS水平统计图；E为生理盐水(Ctrl)和中华伊格尔兹氏菌(E.sin)处理组小鼠的AB/PAS染色结果显示的结肠杯状细胞的数量；F为显示生理盐水(Ctrl)和中华伊格尔兹氏菌(E.sin)处理组小鼠的Masson染色结果显示结肠胶原结肠组织纤维化程度。
图4为实施例5中中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A显著缓解结直肠癌模型小鼠肠屏障损伤，抑制结直肠癌的发生发展；A为分别用生理盐水(AOM)、厌氧菌嗜黏蛋白阿克曼菌(AOM+A.m)和中华伊格尔兹氏菌(AOM+E.sin)处理的结直肠癌模型小鼠的肛周肿瘤及出血的情况；B为各组小鼠的结肠内窥镜图；C为各组小鼠的结直肠肿瘤解剖大体图，黑色箭头为结直肠肿瘤；D为结直肠肿瘤的数量统计图；E为肿瘤负荷评分图；F为各组小鼠的结肠肿瘤苏木素-伊红染色图；G为各组小鼠脾脏对比图；H为各组小鼠脾脏重量统计图。
图5为实施例5中中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A显著降低促炎因子分泌，抑制结直肠癌的增殖；A为生理盐水(AOM)、嗜黏蛋白阿克曼菌(AOM+A.m)和中华伊格尔兹氏菌(AOM+E.sin)处理的肠癌模型小鼠的肿瘤增殖指标(Ki-67)和结肠黏膜屏障指标(E-cadherin)的免疫组化染色对比图；B为各组小鼠结肠切片的增殖细胞的相关抗原Ki-67的染色强度分析统计图；C为各组小鼠结肠切片的E-cadherin的染色强度分析统计图；D为AB/PAS染色显示各组小鼠结肠中杯状细胞的数量；E为各组小鼠的血清LPS水平统计图；F为各组小鼠的血清IL-6水平统计图；G为各组小鼠的血清TNF-α水平统计图。
以上图中的*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001；****表示P＜0.0001；图中的NS表示差异不显著。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1炎症性肠病队列中粪便的16S rDNA测序分析
一、实验方法
1、测序样品的制备
从临床共收集31例确证为IBD患者的粪便样品和11例健康人的粪便样品，备用。所有受试者都被告知采样及试验的性质并已征得同意。
2、细菌16S rDNA测序及分析
按照常规方法，对上述粪便样品进行16S rDNA测序分析，主要步骤包括：DNA制备和提取、文库构建、上机测序和数据分析。
对所得到的测序数据进行组装，随后进行物种注释分析、基于物种的α-多样性分析、基于物种的β-多样性分析、基于物种的组间差异分析和相关性分析等。
二、实验结果
如图1中的A所示，相比于健康人，IBD患者的肠道内定植了更多促进肠炎和促进IBD的菌群，如大肠埃氏菌属-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)、韦荣氏球菌属(Veillonella)和梭杆菌属(Fusobacterium)；定植了更少的布劳特氏菌属(Blautia)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、罗氏菌属(Roseburia)和伊格尔兹氏菌(Eggerthella)。说明IBD病人肠道具有独立的菌群聚类和明显的特征，而且减少的菌属如伊格尔兹氏菌(Eggerthella)可能与IBD的发生发展密切相关。
实施例2结直肠肿瘤队列中组织和粪便的16S rDNA测序分析
一、实验方法
1、测序样品的制备
从临床共采集85名病理明确诊断为结直肠癌的患者的肿瘤组织，具体包含在肠癌切除术术中采集的包含85份癌组织(CRC)及77份距离肿瘤5cm以外配对的远癌正常组织(Ctrl)。所有受试者都被告知采样及试验的性质并已征得同意。上述样本均已排除来自具有既往其他癌症史、其他重大全身或消化系统疾病史、慢性病毒感染、手术前细菌感染以及接受免疫抑制治疗的患者(例如化学疗法，口服类固醇等)或术前经其他与癌症相关的治疗的患者的样本。上述样本在液氮中速冻并在24小时内保存于-80℃直到16S rDNA测序。
2、细菌16S rDNA测序及分析
按照常规方法，对上述癌组织和远癌正常组织进行16S rDNA三代全长测序分析，主要步骤包括：DNA制备和提取、文库构建、上机测序和数据分析。
对所得到的测序数据进行组装，随后进行物种注释分析、基于物种的α-多样性分析、基于物种的β-多样性分析、基于物种的组间差异分析和相关性分析等。
二、实验结果
如图1中的B所示，相比于无病理病变正常组织(Ctrl)，结直肠癌组织定植更多的加重结直肠癌的菌群，如具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、麻疹孪生球菌(Gemellamorbillorum)和血液链球菌(Streptococcus sanguinis)，定植更少的普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)和中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)，提示结直肠癌变组织具有独立的菌群聚类和明显的特征，而且中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)的减少可能与结直肠肿瘤的发生发展密切相关。
实施例3中华伊格尔兹氏菌的分离、筛选及鉴定
1、中华伊格尔兹氏菌的分离筛选
(1)配置哥伦比亚血琼脂培养基，经121℃，15min高压灭菌处理后冷却至50℃，先加入5μg/mL的万古霉素和5μg/mL卡那霉素轻轻摇匀，再加入5％v/v脱纤维羊血，混匀后倒入细菌培养皿；
(2)将收取自临床医疗废物的人正常结肠组织经机械分离得到黏膜，经预冷的无菌磷酸缓冲溶液PBS清洗2～3次，然后将干净的黏膜组织用研磨棒研磨成悬浊液，即得到人正常结肠黏膜悬浊液；取经过生理盐水梯度稀释(10倍、1倍、10-1倍、10-2倍、10-3倍和10-4倍)的人正常结肠黏膜悬浊液涂布在哥伦比亚血平板上，在37℃厌氧条件下培养72小时；挑取单个、湿润、凸起的圆形单菌落进行革兰氏染色，记录菌落形态。
(4)弃除菌落中的革兰氏阴性菌菌株，挑选得到革兰氏阳性菌。
(5)用厌氧苯乙醇血琼脂培养基培养所得革兰氏阳性菌，37℃厌氧培养3天，富集得到厌氧革兰氏阳性菌，挑取单菌落，经PCR测序鉴定，即分离筛选得到菌株。
2、菌种保藏
用含20％v/v甘油的培养基以及瓷珠保存管保藏菌种，存放于-80℃冷冻保藏。
3、菌种复苏及形态鉴定
(1)菌种复苏
无菌条件下，用灭过菌的枪头挑出一个含菌种的小瓷珠，将小瓷珠用哥伦比亚血琼脂平板进行划线活化，37℃厌氧恒温培养至生长平台期，得到单菌落。
(2)菌落特征
将单菌落在哥伦比亚血琼脂平板上培养48小时后进行观察，如图1中的C所示，可见菌落生长良好，呈现半透明、白色圆形、微凸、表面光滑的菌落特征。
(3)菌种的微观形态及镜下观察
对菌种复苏培养后，进行革兰氏染色，镜检结果显示为革兰氏阳性菌。
对菌种复苏培养后，通过戊二醛固定、树脂包埋，切片后进行电镜观察鉴定，其微观形态如图1中的D所示，可见单菌的大小为0.4～0.5μm×0.9～1.0μm，呈细杆状，无鞭毛菌毛。
4、16S rDNA序列的PCR扩增、测序及鉴定
采用PCR扩增技术，使用通用引物(正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO:1)；反向引物1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO:2))扩增得到菌种的16S rDNA序列，PCR扩增体系如表1所示，PCR扩增程序如表2所示。
表1 16S rRNA序列的PCR扩增体系
表2 16S rRNA序列的PCR扩增程序
PCR扩增完成后，扩增产物用1.0％琼脂糖电泳检测，上样量5μL，120V跑30min，然后进行凝胶成像，回收得到16S rRNA的PCR产物。
将16S rDNA的PCR产物进行测序分析，本实施例分离得到的菌种的16S rDNA序列(SEQ ID NO:3)如下：
GCCTCCGCCCCTTGCGGGTTCGGCCGGCGGCTTCGGGTGCAGACGACTCGGGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCACGGAGGCGGGTTGCAGCCTCCGATCCGAACTGGGGCCGGCTTTAAGGGATTCGCTCACTCTCGCGAGTTCGCAGCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAGGGCATAAAGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGCTTGACGCCGGCAGTCTCGCATGAGTCCCCAACTGAATGCTGGCAACATGCGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGCGCTAGCTCCTCTCGGCCACCGGGTTTCCCCGGCTTCACTAGCATGTCAAGCCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACGGAGAGGATGACCCTCCCCACACCTAGCGCCCATCGTTTACGGCTAGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCTAGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTTCGGCCCAGCAGGCTGCCTTCGCCATCGGTGTTCTTCCCGATATCTGCGCATTCCACCGCTACACCGGGAATTCCGCCTGCCTCTACCGAACTCGAGCCTCCCAGTTCGGGATCCGGCCGGGGGTTGAGCCCTCGGATTAGAGATCCCGCTTGAAAGGCCGCCTACGCGCTCTTTACGCCCAATGAATCCGGATAACGCTCGCTCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGAGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCGAATTTCTTCCCTGCTGAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCGCACGCGGCGTTGCTGCGTCAGGGTTTCCCCCATTGCGCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCGGTCTCTCAACCCGGCTACCCATCGCAGGCACGGTGGGCCGTTACCCCGCCGTCTACCTAATGGGCCGCGACCCCATCCCCCGCCGTCTGGGCTTTCCCGGGCCCCCCAGGAGGGGGGCGAGGAGTATCCGGTATTAGCCTCGGTTTCCCAAGGTTGTCCCGGAGCGGGGGGCAGGTTGGTCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCTATGTCCGTCCGAGGACGGTTTAATCGTTCGACTTGCAT GTGTTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCTGAATCCAAACCTTAAGAAGAATAATAGGAA。
将得到的16S rDNA序列(SEQ ID NO:3)使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对，结果如图1中的E所示，本实施例分离得到的菌种与中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)最为接近，所以该菌株归类为中华伊格尔兹氏菌(Eggerthellasinensis)。
综上，本发明最终筛选到的菌株为一株中华伊格尔兹氏菌(Eggerthellasinensis)，并于2024年1月16日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：64286，保藏地点为中国广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏名称为中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A。实施例4补充中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A能降低小鼠肠炎症状，缓解炎症对肠上皮的结构损坏，维护肠黏膜屏障功能
1、实验方法
(1)菌悬浊液制备
将中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的单菌落接种于Wilkins-Chalgren厌氧菌肉汤培养基中，37℃厌氧培养至生长平台期，收集得到中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的菌液。
将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri，L.r)(菌株号：DSM20016)的单菌落接种于MRS肉汤培养基中，37℃厌氧培养至生长平台期，收集得到罗伊氏乳杆菌的菌液。
将伊格尔兹氏菌(Eggerthella sp.)(保藏号：GDMCC.No 63327)的单菌落接种于Wilkins-Chalgren厌氧菌肉汤培养基中，37℃厌氧培养至生长平台期，收集得到伊格尔兹氏菌的菌液。
将三种菌的菌液，分别经3000×g，4℃离心10分钟，去上清，收集菌体并用生理盐水重悬至浓度为1×109CFU/mL，即得到中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的悬浊液、罗伊氏乳杆菌的悬浊液、伊格尔兹氏菌的悬浊液。
(2)实验动物
本实施例中的动物实验选取37只6～8周SPF健康C57BL/6小鼠(购于中山大学东校区动物繁育中心)，平均体重为18～22g；适应性喂养1周后，将小鼠随机分为四组，依次命名为：肠炎模型组(Ctrl)8只、中华伊格尔兹氏菌处理组(E.sin)10只、罗伊氏乳杆菌处理组(L.r)9只和伊格尔兹氏菌处理组(Egg)10只。
(3)实验处理
所有小鼠自由饮用2.5％硫酸葡聚糖钠盐(dextran sulfate sodium，DSS)溶液7天，各组小鼠均出现(100％)腹泻，饮食量下降，体重下降，皮毛光泽度下降，炎症性肠病模型构建成功。
建模成功后，E.sin组、L.r组和Egg组每两天灌胃2×108CFU/只(对应菌的悬浊液)直至终点，模型组每两天灌胃等体积生理盐水。
(4)小鼠肠炎严重程度评价
造模及灌胃期间，观察小鼠的体重变化、进食饮水情况、毛发光泽度、精神状态、活动情况及死亡情况等，并根据疾病活动指数(disease activity index，DAI)判定小鼠肠炎严重程度，DAI包括体重下降百分率、粪便腹泻程度及便血情况，具体计算方法为：体重下降百分率、粪便腹泻程度及便血情况评分总和；其中，体重下降百分率评分：0＝无体重下降；1＝1-5％；2＝5-10％；3＝10-20％；4＝超过20％；粪便评分：0＝固态粪便颗粒；1＝固态便颗粒，易变形；2＝不成形大便；3＝稀烂状大便；4＝液体状大便；便血评分：0＝隐血；检测阴性；1＝隐血检测1+，无肉眼可见便血；2＝隐血检测2+；3＝隐血检测3+，粪便中有可见血；4＝严重便血。
(5)大体及病理检测
灌胃的第8天，解剖各组小鼠，分离盲结肠，拍照，测定结肠的长度(colonlength)。
取结直肠组织做瑞士卷后以4％多聚甲醛固定后常规石蜡包埋和切片，得到结肠组织切片，行苏木素-伊红(H&E)染色，检测病理状况并进行评分，标准如下：病理评分包括上皮缺失、隐窝损伤、杯状细胞减少和炎症细胞浸润；上皮缺失：0＝无病理改变；1＝0-5％上皮丢失；2＝5-10％上皮丢失；3＝超10％上皮丢失；隐窝损伤：0＝隐窝完好；1＝0-10％隐窝受损；2＝10-20％隐窝受损；3＝超20％隐窝受损；杯状细胞减少：0＝无；1＝轻微；2＝中度；3＝重度；炎症细胞浸润；0＝无浸润；1＝固有层炎性细胞增多；2＝炎症细胞向黏膜下层延伸；3＝跨壁炎性细胞浸润。
为了分析损伤结肠组织的炎症浸润和黏膜屏障完整情况，对结肠组织切片行免疫组化染色，分析黏膜屏障指标(E-cadherin、Occludin)。具体方法如下：将结肠组织切片在柠檬酸缓冲液中煮沸15分钟以灭活内源性过氧化物酶；山羊血清封闭后，用抗体(细胞粘附蛋白E-cadherin(1：400；CST，3195s)或紧密连接蛋白Occludin(1:200；Affinity，DF7504))充分孵育，显色后拍照，用Image J分析照片的平均光密度值，得到E-cadherin蛋白和Occludin蛋白的相对表达量(Quantification)。
此外，还对肠组织切片行阿利新蓝-过碘酸-雪夫(AB-PAS)染色检测杯状细胞情况，和马松(Masson)染色检测胶原结肠组织纤维化程度。
(6)血清检测
灌胃的第8天，收集各组小鼠的血清，行ELISA检测脂多糖(LPS)水平。
2、实验结果
造模结束，小鼠死亡情况如表3所示，罗伊氏乳杆菌处理组(L.r)有两只小鼠死亡，而其他组在终点没有死亡，说明(Eggerthella sinensis)YW-2A的副作用低于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri，L.r)。
表3不同处理的肠炎模型小鼠在实验终点的死亡情况
如图2中的A所示，相比于肠炎模型组(Ctrl)，罗伊氏乳杆菌处理组(L.r)和中华伊格尔兹氏菌处理组(E.sin)的疾病活动指数(DAI)明显降低，伊格尔兹氏菌处理组(Egg)没有明显差异。
结肠长度是反映肠炎症状的一个重要大体指标，结肠越短表示肠炎症状越重。如图2中的B和C所示，中华伊格尔兹氏菌处理组(E.sin)小鼠结肠长度明显长于肠炎模型组(Ctrl)且与罗伊氏乳杆菌处理组(L.r)和伊格尔兹氏菌处理组(Egg)没有明显差异，说明中华伊格尔兹氏菌显著缓解肠炎的症状，效果与罗伊氏乳杆菌相当。
此外，如图2中的D和E所示，结肠组织的病理学分析显示，肠炎模型组(Ctrl)小鼠的结肠组织各层的基本结构均显示破坏，炎症细胞广泛浸润且溃疡明显，相比之下，中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A缓解了小鼠结肠黏膜结构破坏、杯状细胞丢失及炎性细胞浸润程度等病理特征。
Occludin和E-cadherin的免疫组化染色结果如图3中的A～C所示，与肠炎模型组(Ctrl)相比，中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A处理增加了Occludin和E-cadherin的表达。
血清检测结果如图3中的D所示，与肠炎模型组(Ctrl)相比，中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A处理显著降低了小鼠血清的LPS水平，而罗伊氏乳杆菌和伊格尔兹氏菌并未能减少血清LPS水平。
结肠黏液层是形成肠道屏障的关键成分，维持肠道稳态。AB-PAS和Masson染色结果依次如图3中的E和F所示，可见肠炎模型组的杯状细胞黏液层变薄、杯状细胞和分泌细胞减少、胶原结肠组织纤维化程度增加，而中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A部分恢复了黏膜层杯状细胞的数量和功能、减少胶原结肠组织纤维化程度。
上述结果说明，中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A明显减轻炎症性肠病的症状，与现有菌株相比，更优地上调肠上皮紧密连接蛋白的表达来保护肠道黏膜物理屏障，降低结肠的通透性，减少血清的LPS水平，极大缓解炎症对肠上皮的结构损坏、维护肠黏膜屏障功能，降低肠炎症状，副作用更低。实施例5补充中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A能缓解肠屏障损伤，显著降低促炎因子分泌，抑制结直肠癌的发生发展
1、实验方法
(1)菌悬浊液制备
将中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的单菌落接种于Wilkins-Chalgren厌氧菌肉汤培养基中，37℃厌氧培养至生长平台期，收集得到中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的菌液。
将厌氧菌嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila，A.m)(菌株号：ATCCBAA-835)的单菌落接种于添加0.2％粘蛋白的脑心浸出液肉汤中，37℃厌氧培养至生长平台期，收集得到嗜黏蛋白阿克曼菌的菌液。
将两种菌的菌液，分别经3000×g，4℃离心10分钟，去上清，收集菌体并用生理盐水重悬至浓度为1×109CFU/mL，即得到中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的悬浊液和嗜黏蛋白阿克曼菌的悬浊液。
(2)实验动物
本实施例中的动物实验选取26只5～6周SPF健康C57BL/6小鼠(购于珠海百试通生物科技有限公司)，平均体重为18～22g；适应性喂养1周后，将小鼠随机分为三组，依次命名：肠癌模型组(AOM)9只、嗜黏蛋白阿克曼菌处理组(AOM+A.m)8只和中华伊格尔兹氏菌处理组(AOM+E.sin)9只。
(3)实验处理
待所有小鼠适应生长且体重稳定(此时为8周龄左右)，随后参照现有技术“DOI:10.4103/1477-3163.78279”，用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)构建原位结直肠癌模型。
第一天腹腔注射氧化偶氮甲烷10mg/kg，并于第五天饮用2.5％葡聚糖硫酸钠(DSS)纯净水，每日更换新鲜配制DSS水溶液，连续五天，之后更换纯净水，连续14天，此为一个周期，上述过程连续进行3个周期，各组小鼠均出现肛门出血，且肛周有明显肿瘤，结直肠癌模型构建成功。
建模成功后，嗜黏蛋白阿克曼菌处理组(AOM+A.m)和中华伊格尔兹氏菌处理组(AOM+E.sin)每两天灌胃2×108CFU/只(对应菌的悬浊液)直至造模的第九十天，即为实验终点。模型组每两天灌胃等体积生理盐水直至实验终点。
(4)小鼠体况监测
造模及灌胃期间，观察小鼠的体重变化、进食饮水情况、毛发光泽度、精神状态、活动情况及死亡情况，期间记录小鼠的肛血情况、肛周肿瘤情况。
(5)大体及病理检测
在实验终点解剖各组小鼠，分离脾脏和结直肠组织，拍照，称量脾脏的质量，统计结直肠中的肿瘤数量，并进行肿瘤负荷评分(tumor burden score)，标准如下：肿瘤负荷评分(tumor burden score)：肿瘤直径＜1mm，评分＝1；1mm≤肿瘤直径＜2mm，评分＝2；2mm≤肿瘤直径，评分＝3，统计各组小鼠肿瘤负荷评分结果。
取结直肠组织以4％多聚甲醛固定后常规石蜡包埋和切片，得到结肠组织切片，行苏木素-伊红(H&E)染色，检测病理状况；行阿利新蓝-过碘酸-雪夫(AB-PAS)染色检测杯状细胞情况。
为了分析肿瘤增殖、损伤结肠组织的炎症浸润和黏膜屏障完整情况，将结肠组织切片在柠檬酸缓冲液中煮沸15分钟以灭活内源性过氧化物酶；山羊血清封闭后，用抗体(肿瘤增殖增殖相关抗原Ki-67(1:400；CST，12202S)或细胞粘附蛋白E-cadherin(1：400；CST，3195s))，充分孵育，显色后拍照，用Image J分析照片的平均光密度值或阳性细胞数。
(6)血清检测
在实验终点，收集各组小鼠的血清，行ELISA检测LPS水平。
结直肠癌是肠道上皮癌变的异质性疾病，以肠道黏膜屏障破损及慢性炎症为典型特征的消化道肿瘤。肠黏膜屏障功能障碍是影响结直肠癌发生发展的主要因素，而内外因素诱发肠黏膜炎症反应所致的肠黏膜上皮通透性增高和上皮细胞间紧密连接破坏，是导致肠黏膜功能障碍的关键环节。为此，还对血清行ELISA检测IL-6和TNF-α水平。
2、实验结果
造模结束，小鼠死亡情况如表4所示，肠癌模型组(AOM)小鼠有两只死亡，而其他组在终点没有死亡，说明中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A在生物体内的安全性与嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila)相当。
表4不同处理的肠癌模型小鼠实验终点的死亡情况
如图4中的A～E所示，相比于肠癌模型组(AOM)，中华伊格尔兹氏菌处理组(AOM+E.sin)和嗜黏蛋白阿克曼菌处理组(AOM+A.m)小鼠的肛周红肿情况减少，结直肠的肿瘤数量减少，肿瘤大小减小，肿瘤负担评分降低。说明中华伊格尔兹氏菌能显著抑制结直肠癌的发生发展。
结肠肿瘤病理学分析结果如图4中的F所示，肠癌模型组(AOM)小鼠的结肠组织有明显大量肿瘤细胞浸润，结肠各层的基本结构均显示破坏，浸润的癌细胞排列不规整，细胞核质比例明显增加，可见明显炎症细胞浸润和溃疡现象；与肠癌模型组(AOM)和嗜黏蛋白阿克曼菌处理组(AOM+A.m)相比，中华伊格尔兹氏菌处理组(AOM+E.sin)小鼠的结肠组织，结肠黏膜细胞趋于正常状态，只有少许排列不整齐现象，核质比例明显降低，基本的病理学形态明显得到改善。说明中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A具有明显更优的抗结直肠肿瘤活性和功能。
如图4中的G和H所示，肠癌模型组(AOM)小鼠的脾脏肿大且质量增加，而嗜黏蛋白阿克曼菌处理组(AOM+A.m)和中华伊格尔兹氏菌处理组(AOM+E.sin)小鼠的脾脏体积更小，质量更轻，且中华伊格尔兹氏菌处理组(AOM+E.sin)的脾脏比嗜黏蛋白阿克曼菌处理组(AOM+A.m)更小更轻。说明中华伊格尔兹氏菌具有明显更优的减少脾肿大的功能，更能恢复机体的免疫状态。
增殖细胞的相关抗原Ki-67和细胞粘附蛋白E-cadherin的免疫组化染色结果如图5中的A～C所示，中华伊格尔兹氏菌处理组(AOM+E.sin)和嗜黏蛋白阿克曼菌处理组(AOM+A.m)的小鼠结肠肿瘤中Ki-67的表达显著减少，细胞粘附蛋白E-cadherin的表达显著增加，并且中华伊格尔兹氏菌处理组(AOM+E.sin)小鼠结肠肿瘤的Ki-67的表达比嗜黏蛋白阿克曼菌处理组(AOM+A.m)更低。说明中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A更优地抑制结肠肿瘤的增殖，及维护肠黏膜屏障功能。
AB-PAS染色结果如图5中的D所示，可见肠癌模型组(AOM)和嗜黏蛋白阿克曼菌处理组(AOM+A.m)的小鼠结直肠中杯状细胞黏液层变薄、杯状细胞和分泌细胞减少，取而代之的是结肠肿瘤细胞增多(非着色区域)，而中华伊格尔兹氏菌处理组(AOM+E.sin)的小鼠结直肠中黏膜层杯状细胞的数量明显增多。说明中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A具有更优的恢复肠道黏膜屏障的功能，减少结肠上皮细胞的癌变。
血清的LPS水平检测结果如图5中的E所示，与肠癌模型组(AOM)相比，中华伊格尔兹氏菌处理组(AOM+E.sin)和嗜黏蛋白阿克曼菌处理组(AOM+A.m)小鼠的血清的LPS水平显著降低。说明中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A具有保护肠黏膜屏障的功能。
血清的炎症因子IL-6、TNF-α水平检测结果如图5中的F和G所示，与肠癌模型组(AOM)相比，中华伊格尔兹氏菌处理组(AOM+E.sin)小鼠血清的IL-6和TNF-α水平显著降低，而嗜黏蛋白阿克曼菌组(AOM+A.m)小鼠的血清IL-6和TNF-α水平未显著降低。说明中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A更高效地降低促炎因子分泌。
以上结果表明，中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A明显缓解肠屏障损伤，抑制结直肠癌的发生发展，与现有菌株相比，更能缓解继发性的脾脏肿大并恢复机体的免疫状态，更抑制结肠肿瘤的增殖，恢复并维护肠道黏膜屏障的功能，减少结肠上皮细胞的癌变，降低促炎因子分泌，抗结直肠肿瘤活性和功能更强。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A，其特征在于，所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的保藏编号为GDMCC No：64286，已于2024年1月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
2.中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备防治炎症性肠病的产品中的应用。
3.中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备防治结直肠肿瘤的产品中的应用。
4.中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备修复黏膜屏障和/或减轻肠道黏膜损伤的产品中的应用。
5.中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备改善结直肠肿瘤预后效果的产品中的应用。
6.中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)在制备治疗急性和/或慢性肠炎的产品中的应用。
7.根据权利要求2～6任一项所述的应用，其特征在于，所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)为中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)的活菌、培养菌液、死菌、细胞裂解物、代谢产物、改造菌、突变菌和/或诱变菌中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthellasinensis)为权利要求1所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A，或其16SrDNA序列与权利要求1所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的16S rDNA序列具有至少95％以上一致性的中华伊格尔兹氏菌；所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthellasinensis)YW-2A菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:3所示。
9.一种防治炎症性肠病和/或结直肠肿瘤的菌剂，其特征在于，包含中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)的活菌、培养菌液、死菌、细胞裂解物、代谢产物、改造菌、突变菌和/或诱变菌中的一种或几种作为活性成分。
10.根据权利要求9所述的菌剂，其特征在于，所述中华伊格尔兹氏菌为权利要求1所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A，或其16S rDNA序列与权利要求1所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A的16SrDNA序列具有至少95％以上一致性的中华伊格尔兹氏菌；所述中华伊格尔兹氏菌(Eggerthella sinensis)YW-2A菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO:3所示。
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