CN112592865B

CN112592865B - 一株可保护肠道屏障的瘤胃乳杆菌及应用

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Publication number: CN112592865B
Application number: CN202011632736.2A
Authority: CN
Inventors: 陈卫; 杨波; 王烁; 崔树茂; 陆文伟; 赵建新; 张灏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2040-12-31
Also published as: CN112592865A

Abstract

本发明公开了一株可保护肠道屏障的瘤胃乳杆菌及应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株瘤胃乳杆菌，能够显著降低DSS诱导的肠道损坏小鼠的疾病活动指数，与模型组小鼠相比，瘤胃乳杆菌CCFM1140干预组小鼠的组织损伤显著减轻，促炎细胞因子TNF‑α，IL‑1β，IL‑17的浓度降低，抑炎细胞因子IL‑10的浓度上调。该菌株具有改善肠道机械屏障，免疫屏障，生物屏障的功能，可作为益生菌制剂的主要成分，具有广阔的市场前景。

Description

一株可保护肠道屏障的瘤胃乳杆菌及应用

技术领域

本发明涉及一株可保护肠道屏障的瘤胃乳杆菌及应用，尤其是一种能够保护肠道屏障的菌株，其可添加在各种健康食品及保健食品中，属于微生物技术领域。

背景技术

肠道屏障是指能够阻止肠腔内病原菌和毒素穿过肠黏膜入侵到血液系统和其它组织器官的结构和功能的总和，对人体健康起重要作用。肠道屏障由机械屏障、免疫屏障、生物屏障和化学屏障共同构成。机械屏障是指肠上皮分泌的黏液、肠上皮细胞及其紧密连接等，直接与肠道疾病的发生有关；免疫屏障包含了肠道相关淋巴組织、吞噬细胞、sIgA、防御素等，直接影响肠道的免疫细胞、细胞因子等，进而通过血液，淋巴循环影响全身的免疫器官；生物屏障是肠黏膜菌与宿主微环境形成的相互依赖、相互作用的肠道菌群，更是与肥胖、非酒精性脂肪肝等疾病密切相关；化学屏障包括胃酸、胆汁酸、溶菌酶、各种消化酶等，与肠道炎症、代谢疾病直接相关。

许多肠道相关的疾病，如结肠炎，易激性肠炎，腹泻，便秘等肠道疾病都与肠道屏障的破坏直接相关。因此，维护肠道屏障的正常是保护肠道健康的关键。结肠炎，易激性肠炎，腹泻，便秘等肠道疾病会对肠道造成较大的影响，会影响患者的生活质量，导致社会、心理和专业领域的变化。使用药物进行常规治疗的研究越来越多，目的是减少症状和炎症。长期使用肠道肠道炎症相关的药物(抑制剂类，激素类，抗生素类)可能会导致高血压、糖尿病、骨质疏松等其他疾病，从而影响治疗的成功。

鉴于现有治疗方案存在的多种问题，替代传统方法的方案显得尤为重要了，新的治疗方案包括单克隆抗体、益生元、益生菌等。而上述多种疗法的可行性也促使我们继续寻找应用更广泛、潜力更巨大，同时又具有调节肠道屏障作用的膳食补充剂。益生菌对便秘、肠炎、腹泻、非酒精性脂肪肝、糖脂代谢紊乱、情绪及行为障碍均具有显著改善作用，而这与益生菌对肠上皮细胞及紧密连接的调节作用(机械屏障)、肠道免疫细胞及细胞因子(免疫屏障)和肠道菌群(生物屏障)密不可分。

发明内容

本发明提供了一种瘤胃乳杆菌在制备预防和/或保护肠道屏障的产品中的应用，所述瘤胃乳杆菌能够用于制备预防和/或保护肠道屏障的产品中。

本发明的第一个目的是提供一株瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)CCFM1140，所述瘤胃乳杆菌CCFM1140保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61158，保藏日期为2020年8月21日。

所述瘤胃乳杆菌CCFM1140来源于新疆乌苏的健康人粪便，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCBI数据库中进行核酸序列比对，结果显示菌株为瘤胃乳杆菌，命名为瘤胃乳杆菌CCFM1140，留存于江南大学食品生物技术菌种保藏中心。

所述瘤胃乳杆菌CCFM1140在MRS固体培养基上的菌落突起，光滑、圆形、乳白色、半透明、直径为1-2mm。

本发明的第二个目的是提供含有所述瘤胃乳杆菌CCFM1140的制剂，其中的瘤胃乳杆菌CCFM1140数量≥1×10¹⁰CFU/g或1×10¹⁰CFU/mL。

在一种实施方式中，所述制剂为菌悬液。

在一种实施方式中，所述制剂为冻干菌粉。

在一种实施方式中，所述产品中，瘤胃乳杆菌的活菌数为不低于1×10¹⁰CFU/g。

本发明的第三个目的是提供所述瘤胃乳杆菌CCFM1140在制备具备缓解和/或治疗肠道屏障损坏方面的应用。

在一种实施方式中，所述应用包括如下至少一种功能：

(1)缓解因肠道屏障损坏导致的结肠缩短；

(2)减轻结肠组织损伤；

(3)上调结肠紧密连接蛋白的表达，改善肠道的机械屏障；

(4)降低促炎细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-17的浓度，并且上调抑炎细胞因子IL-10的浓度，改善肠道免疫屏障；

(5)增加有益菌群瘤胃梭菌属、阿克曼菌属的相对丰度，改善肠道生物屏障。

在一种实施方式中，所述产品包括食品、药品或保健品。

在一种实施方式中，所述产品是冻干粉。

在一种实施方式中，所述冻干粉的制备方法为将上述瘤胃乳杆菌接种至种子培养基中进行培养，得到种子液；将种子液接种到发酵培养基中进行培养，得到细胞培养液；将细胞培养液离心，收集菌泥；将菌泥用生理盐水清洗后重悬，得到重悬液；向重悬液中添加冻干保护剂，得到混合液；将混合液真空冷冻干燥，得到冻干粉。

在一种实施方式中，将种子液按2～4％(v/v)的接种量接种到培养基中进行培养。

在一种实施方式中，所述冻干保护剂的成分包括脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖和水。

在一种实施方式中，所述冻干保护剂为含80-120g/L脱脂乳粉、80-140g/L海藻糖、140-180g/L蔗糖的溶液。

在一种实施方式中，所述冻干保护剂的成分包括100g/L脱脂乳粉、100g/L海藻糖、160g/L蔗糖和水。

在一种实施方式中，所述冻干保护剂在重悬液中的添加量为菌泥总重量的2～4倍。

在一种实施方式中，种子培养基为MRS固体培养基，发酵培养基为MRS液体培养基。

在一种实施方式中，所述MRS液体培养基是加了半胱氨酸盐酸盐的MRS液体培养基。

在一种实施方式中，所述半胱氨酸盐酸盐的添加量为按质量分数0.04-0.1％。

在一种实施方式中，将种子液按2-4％的接种量接种到MRS液体培养基中进行培养的培养条件为：34-38℃厌氧培养24h～36h，7000-12000rmp离心20～30min，收集菌泥，用生理盐水清洗3～4次后重悬。

本发明还提供了一种用于预防和/或保护肠道屏障的产品，所述产品中含有上述瘤胃乳杆菌。

在一种实施方式中，所述产品中瘤胃乳杆菌的活菌数为不低于1×10¹⁰CFU/g。

有益效果：

(1)本发明所提供的瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)CCFM1140分离自健康人的肠道菌群，该菌株对人体无毒副作用，因此采用本发明提供的瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)CCFM1140制备的药物，相对于用于保护肠道屏障的传统药物具有一定的优势，并且该菌株可用于制作益生菌制剂等，具有广阔的市场前景。

(2)采用本发明所提供的瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)CCFM1140，能够显著降低DSS诱导肠炎期间小鼠的疾病活动指数，减轻结肠的缩短，显著减轻结肠组织的损伤。

(3)瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)CCFM1140干预能显著上调结肠紧密连接蛋白，改善肠道的机械屏障。

(4)瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)CCFM1140干预显著降低了促炎细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-17的浓度，并且上调了抑炎细胞因子IL-10的浓度，改善肠道的免疫屏障。

(5)瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)CCFM1140干预增加了有益菌群瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium 6)、阿克曼菌属(Akkermansia)的相对丰度，改善肠道的生物屏障。

生物材料保藏

一株瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)CCFM1140，分类学命名为Lactobacillus ruminis，已于2020年8月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61158，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1：瘤胃乳杆菌对小鼠DSS造模期间体重的影响；

图2：瘤胃乳杆菌对小鼠疾病活动指数DAI的影响；

图3：瘤胃乳杆菌对小鼠结肠长度的影响；

图4：瘤胃乳杆菌对小鼠结肠组织HE染色的影响；

图5：瘤胃乳杆菌对小鼠组织病理评分的影响；

图6：瘤胃乳杆菌对小鼠结肠组织机械屏障的影响；

图7：瘤胃乳杆菌对小鼠结肠组织免疫屏障的影响；

图8：瘤胃乳杆菌对小鼠结肠组织生物屏障的影响；

图1～8中，“*”、“**”、“***”、“****”均表示与DSS组具有显著性差异，*越多，显著性差异越大，误差以Mean±SEM的形式展现。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的小鼠为8周龄雄性SPF(Specific pathogen free，无特定病原体)级C57BL/6J小鼠，购自南京大学模式动物研究所；下述实施例中涉及的ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；下述实施例中涉及的脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖、多聚甲醛购自国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的葡聚糖硫酸钠(DSS)购自南京百凯斯公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS液体培养基：胰蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、七水硫酸镁0.5g/L、一水硫酸锰0.25g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、三水磷酸氢二钾2.6g/L、Tween80 1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。

MRS固体培养基：胰蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、七水硫酸镁0.5g/L、一水硫酸锰0.25g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、三水磷酸氢二钾2.6g/L、Tween80 1mL/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，琼脂20g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

疾病活动指数(Disease activity index，DAI)的检测方法：

DAI评分参照Murthy的评分系统，包括体重变化，便血情况和大便性状三个方面(具体评分标准如表1所示)。造模期间，每天测量小鼠体重，检测小鼠便血情况和大便性状，根据表1进行评分，DAI为三者分数之和，即DAI＝体重变化分数+便血分数+大便性状分数。粪便隐血情况用皮拉米洞法便隐血试剂测定，具体操作按照试剂说明书进行，若粪便肉眼可见有红褐色或鲜红色血液，则为肉眼血便。粪便性状分为三个等级：正常、松散和稀便，小鼠正常粪便成型，为颗粒状；若粪便粘度增加且易散，但不粘附于肛门则为松散；若粪便不成形或呈稀水样，且粘附于肛门，则为稀便。

表1疾病活动指数评分标准

体重下降(％)	隐血/肉眼血便	大便性状	分数
				0	隐血阴性	正常	0
1～5	隐血阴性	松散	1
				6～10	隐血阳性	松散	2
11～15	隐血阳性	稀便	3
				>15	肉眼血便	稀便	4

结肠长度的检测方法：

小鼠处死后，取整段结肠(盲肠末端至肛门)，测量长度。

结肠组织病理学特征的检测方法：

取1cm远端结肠(距肛门1cm)于4％多聚甲醛溶液中4℃下浸泡24h后，得到固定好的远端结肠组织；将固定好的远端结肠组织依次进行脱水、透明、浸蜡后，用莱卡石蜡包埋机将组织包埋于蜡块中，得到包埋好结肠组织的蜡块；其中，脱水、透明、浸蜡的具体步骤如下：(1)脱水：将固定好的组织先依次经70％、80％和90％(v/v)梯度乙醇溶液进行脱水，每个梯度各30min，然后放入95％和100％(v/v)酒精溶液各2次，每次20min；(2)透明：将组织先放入酒精和二甲苯等体积比混合液中15min，然后放入二甲苯I和二甲苯II各15min；(3)浸蜡：将组织样放入62℃的石蜡I和石蜡II液体中各30min。

将包埋好结肠组织的蜡块用莱卡手动轮转切片机进行切片，切片厚度为5μm，得到结肠组织切片；将结肠组织切片经展片和捞片、烤片、苏木精染色、分化、漂洗、伊红复染、脱水、透明、封片，得到H&E结肠切片；其中，展片和捞片、烤片、苏木精染色、分化、漂洗、伊红复染、脱水、透明、封片的具体操作如下：(1)展片和捞片：将切片放于42℃恒温水浴中进行展片后用载玻片小心地捞出；(2)烤片：将切片放于37℃烘箱中过夜烤片；(3)苏木精染色：将切片先进行水化(即先将切片置于二甲苯I和二甲苯II各5min，然后依次放入100％、95％、90％、80％和70％(v/v)梯度酒精溶液中各5min，最后放入蒸馏水中3min)，然后进行染色(即将切片放入苏木精染色液中约20s)，最后进行水洗(即将切片用自来水冲洗约30min)；(4)分化：将切片放入1％(v/v)盐酸乙醇溶液中7s，进行褪色；(5)漂洗：用自来水冲洗切片约20min；(6)复染：将切片浸入伊红染色液，立即取出；(7)脱水：将切片先依次放入95％(v/v)乙醇溶液I、95％(v/v)乙醇溶液II、70％(v/v)乙醇溶液，放入后立即取出，然后浸入80％(v/v)乙醇溶液50s，最后浸入100％(v/v)乙醇2min；(8)透明：将切片先浸入乙醇和二甲苯等体积比混合液1min，然后浸入二甲苯I和二甲苯II各2min；(9)封片：将切片用中性树胶封片。

用Pannoramic MIDI数字切片扫描仪扫描制作好的H&E结肠切片，进行拍照，并采用Dieleman的评分系统对各组结肠组织切片进行组织损伤评分，组织损伤评分包括炎症程度、病变深度、隐窝破坏和病变范围四个方面(具体标准见表2)。

表2组织损伤评分标准

结肠组织生化指标的测定：

结肠组织按1：9加入组织裂解液，组织裂解液含有1％(v/v)蛋白酶抑制剂和1％(v/v)磷酸酶抑制剂，利用高通量破碎仪破碎结肠组织得到匀浆，然后12000g、4℃离心15min，收集上清，得到结肠组织上清液。

结肠组织上清中细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-17和IL-10浓度通过ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)检测。结肠组织上清中总蛋白的浓度利用BCA试剂盒(碧云天生物技术有限公司)测量，单位为mg/mL。其中，细胞因子以pg/mg结肠蛋白为单位。

肠道菌群检测：

采用MP的粪便试剂盒提取小鼠粪便样品中总DNA，然后进行16S rDNA可变区(V3-V4区)扩增，进行胶回收。之后进行混样、构建文库以及Illumina Miseq平台测序。数据下机后进行生物信息学分析。

实施例1：瘤胃乳杆菌CCFM1140的筛选、鉴定、培养、观察和保存

1、筛选

取1g来源于新疆乌苏的健康人粪便样本，梯度稀释后涂布于MRS固体培养基中，置于37℃厌氧环境中培养72h，观察并记录菌落形态；挑取表面湿润、有凸起的、白色泛黄的菌落在MRS固体培养基上划线，于37℃厌氧的条件下进行纯化培养，重复此操作3次，获得纯化后的单菌落；挑取单菌落在MRS固体培养基上划线，37℃厌氧培养36h，对所得菌落进行革兰氏染色(革兰氏染色方法参考教科书《工业微生物育种学》作者：诸葛健著)，记录菌落的形态，并根据教科书《常见细菌系统鉴定手册》(作者：东秀珠)考察菌株的生理生化特性(考察结果见表3)，保留革兰氏阴性、菌落呈凸起且白色泛黄状、过氧化氢酶阴性的菌株。

2、鉴定

提取筛选得到的菌株的基因组，将菌株的16S rDNA进行扩增和测序(扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将获得的序列在NCBI-Blast中进行核酸序列比对，结果显示菌株为瘤胃乳杆菌，命名为瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)CCFM1140；

其中，16S rDNA扩增所用引物如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.2)；

1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.3)；

16S rDNA扩增程序如下：

95℃5min；35各循环(95℃30s；55℃30s；72℃2min)；72℃10min。

表3菌株的生理生化特性

实验项目	结果	实验项目	结果
				过氧化氢酶	-	纤维二糖	+
接触酶	-	海藻糖	-
				半乳糖	+	棉子糖	+
蔗糖	+	蜜二糖	+

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。

3、培养和观察

挑取瘤胃乳杆菌CCFM1140的单菌落接入MRS固体培养基上，37℃培养48h后，观察瘤胃乳杆菌CCFM1140在mMRS固体培养基上的菌落特征。观察可得，瘤胃乳杆菌CCFM1140在MRS固体培养基上的菌落突起，呈光滑、圆形、乳白色、半透明状，直径为1～2mm。

4、保存

挑取瘤胃乳杆菌CCFM1140的单菌落接入MRS液体培养基中，于37℃厌氧的条件下培养24h，得到菌液；将菌液置于离心管中3000rpm离心10min收集菌体；在菌体中加入灭菌后的PBS缓冲溶液后置于离心管中3000rpm离心10min进行洗涤，得到洗涤后的菌体，重复此操作3次，在所得菌体中加入灭菌后的30％(v/v)甘油后-80℃保存于甘油管中。

实施例2：瘤胃乳杆菌CCFM1140菌悬液的制备

(1)从甘油管中蘸取瘤胃乳杆菌CCFM1140的菌液在MRS固体培养基上划线，厌氧环境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行活化培养，重复此操作3次，得到活化后的菌液。

(2)将步骤(1)得到的活化后的菌液按照按2％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，37℃培养24h后得到发酵液，将发酵液离心收集菌体，用生理盐水重悬菌体，并调整活菌数5×10⁹CFU/mL，制成菌悬液。

实施例3：瘤胃乳杆菌CCFM1140对DSS诱导肠道屏障损坏小鼠症状的缓解作用

造模步骤如下：

(1)配制2.5％的葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液：将DSS用灭菌自来水配成浓度为2.5％(w/v)的DSS溶液。

(2)取8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠24只，随机分为3组，3组分别命名为：对照组(Control)、造模组(DSS)、瘤胃乳杆菌CCFM1140干预组(CCFM1140+DSS)；采用每组8只，实验方案和各组小鼠的处理方式如表4所示。

(3)对对照组(Control)、造模组(DSS)、瘤胃乳杆菌CCFM1140干预组进行处理；

其中，瘤胃乳杆菌CCFM1140干预组的处理方法为：实验第1-7天，每天给瘤胃乳杆菌CCFM1140干预组灌胃5×10⁹CFU/mL瘤胃乳杆菌菌悬液200μL，自由饮用蒸馏水；实验第8-14天，每天给瘤胃乳杆菌CCFM1140干预组灌胃5×10⁹CFU/mL菌量的瘤胃乳杆菌菌悬液200μL，自由饮用含2.5％的DSS溶液；

造模组(DSS)的处理方法为：实验第1-7天，DSS组每天灌胃200μL生理盐水，自由饮用蒸馏水；实验第8-14天，每天给DSS组灌胃生理盐水200μL，自由饮用2.5％的DSS溶液；

对照组(Control)的处理方法为：实验过程中，每天给对照组灌胃生理盐水200μL，自由饮用蒸馏水。

造模期间，检测各组小鼠体重(如图1)及各组小鼠疾病活动指数DAI指数变化(如图2)。

造模结束后，分别将对照组(Control)、造模组(DSS)、瘤胃乳杆菌CCFM1140干预组处死，取整段结肠(盲肠末端至肛门)，测量结肠长度(如图3)并且，对结肠外观进行观察(如图4)。

表4实验小鼠处理方案

DSS造模过程中各组小鼠的疾病活动指数如图2所示；造模第7天，DSS组小鼠体重降低了12.86％，而CCFM1140干预组小鼠体重仅降低了12.79％，因此CCFM1140干预对小鼠的体重没有影响(如图1)。

造模结束时，DSS组小鼠的DAI指数升高至10.5，而CCFM1140干预组干预使小鼠的DAI指数降低至7.57，因此CCFM1140干预组的DAI指数显著低于模型组(检测结果见图2)。

正常组小鼠结肠长度为6.713cm，DSS造模组小鼠的结肠长度仅为5.067cm，而CCFM1140干预组干预显著增加了结肠长度，达到5.90cm(如图3)。

将造模结束后小鼠处死，取远端结肠组织1cm进行固定，脱水，包埋，HE染色，观察不同组别小鼠结肠组织HE染色(如图4)。

由图4可以看出CCFM1140干预组的结肠组织结构与正常组相似，腺体和隐窝较完整，杯状细胞较多，没有发生炎性细胞浸润和粘膜下层水肿。而DSS诱导后，小鼠的结肠组织会出现明显的损伤，包括炎症细胞浸润、隐窝结构的破坏，杯状细胞的消失，粘膜下层水肿等。因此造模组的结肠粘膜层结构几乎完全破坏，炎性细胞浸润严重，隐窝和腺体结构几乎完全消失，杯状细胞消失殆尽。

组织病理学评分标准参考相关文献(具体参考J Agr Food Chem,2019,67(48):13282-13298)。组织病理学评分显示，造模组的病理学评分达到13.13分，而CCFM1140干预组(CCFM1140+DSS)的评分显著低于造模组，仅为7.75分(检测结果见图5)。

因此，本发明的瘤胃乳杆菌CCFM1140对DSS诱导的肠道屏障损坏小鼠模型具有较好的改善效果。

实施例4：瘤胃乳杆菌CCFM1140对小鼠结肠机械屏障的影响

将造模结束后小鼠处死，取远端结肠组织1cm进行固定，脱水，包埋，进行紧密连接蛋白ZO-1，紧密连接蛋白Occludin和紧密连接蛋白claudin-3的免疫荧光染色(具体方法参考J Agr Food Chem,2019,67(48):13282-13298)(如图6)。

免疫组化实验结果表明CCFM1140处理能增加紧密连接蛋白claudin-3，occludin和ZO-1的浓度。证明本发明的瘤胃乳杆菌CCFM1140干预后显著改善了结肠上皮细胞的紧密连接蛋白，使粘膜上皮屏障保持完整，改善了小鼠结肠机械屏障。

实施例5：瘤胃乳杆菌CCFM1140对小鼠结肠免疫屏障的影响

造模方法同实施例3中的步骤(1)-(3)；

将实施例3中的步骤(3)得到的造模结束后小鼠处死，取结肠组织按照结肠组织生化指标测定方法检测结肠组织上清中的生化指标，生化指标包括结肠组织内TNF-α的表达量、IL-1β的表达量、IL-17的表达量、IL-10的表达量。

由图7可知，DSS处理增加了结肠组织促炎细胞因子TNF-α，IL-1β和IL-17的浓度，使之分别达到了321.1pg/mg蛋白，88.52pg/mg蛋白和9.195pg/mg蛋白，使抑炎细胞因子IL-10的浓度降低至62.34pg/mg蛋白。而瘤胃乳杆菌CCFM1140处理可以显著降低TNF-α，IL-1β和IL-17的浓度253.4pg/mg蛋白，60.03pg/mg蛋白和5.778pg/mg蛋白，并使IL-10的浓度增加至83.02pg/mg蛋白。因此，瘤胃乳杆菌CCFM1140干预后显著改善了肠道的免疫屏障。

实施例6：瘤胃乳杆菌CCFM1140对小鼠结肠生物屏障的影响

造模方法同实施例3中的步骤(1)-(3)；对小鼠粪便进行DNA提取，V3-V4区PCR，胶回收，上机测序，分析肠道菌群的变化。

由图8可知，DSS处理降低了粪便中瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium 6)、阿克曼菌属(Akkermansia)的相对丰度，使之分别从0.429％和％7.56，降低到0.014％和2.24％。而瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)处理可以增加瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium 6)、阿克曼菌属(Akkermansia)的相对丰度至0.46％和2.68％。

实施例7：瘤胃乳杆菌CCFM1140制剂的制备

具体步骤如下：

(1)菌株的活化：从甘油管中蘸取瘤胃乳杆菌CCFM1140的菌液在MRS固体培养基上划线，厌氧环境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行活化培养，重复此操作3次，得到活化后的菌液。

(2)将步骤(1)得到的菌液按3％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃厌氧培养28h得到发酵液，将得到的发酵液在10000rpm下离心20min后收集菌泥，将菌泥用生理盐水清洗3次后备用，并调整活菌数1×10¹¹CFU/mL，获得液态制剂。

(3)冻干保护剂的配制：将100g/L脱脂乳粉、100g/L海藻糖、160g/L蔗糖和余量的水混合后得到冻干保护剂。

(4)向步骤(2)中得到的菌泥中添加步骤(3)配制好的冻干保护剂，其中冻干保护剂的重量为菌泥重量的3倍，混合均匀后进行真空冷冻干燥，获得冻干制剂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株可保护肠道屏障的瘤胃乳杆菌及应用

<130> BAA201613A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1302

<212> DNA

<213> Lactobacillus ruminis

<400> 1

acacgtaggc aacctgccca aaagaggggg ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgc 60

ataaccatga acaccgcatg atgttcatgt aaaagacggc ttttgctgtc acttttggat 120

gggcctgcgg cgtattaact tgttggtggg gtaacggcct accaaggtga tgatacgtag 180

ccgaactgag aggttgatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga 240

ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgaat 300

gaagaaggcc ttcgggtcgt aaaattctgt tgtcagagaa gaacgtgcgt gagagtaact 360

gttcacgtat tgacggtatc tgaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 420

gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagggaa cgcaggcggt 480

cttttaagtc tgatgtgaaa gccttcggct taaccgaagt agtgcattgg aaactggaag 540

acttgagtgc agaagaggag agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat 600

ggaagaacac cagtggcgaa agcggctctc tggtctgtaa ctgacgctga ggttcgaaag 660

cgtgggtagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 720

gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 780

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 840

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ttctgacaat 900

tccagagatg gaacgttccc ttcggggaca gaatgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 960

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tgtcagttgc 1020

catcattaag ttgggcactc tggcgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1080

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac 1140

aacgagtcgc taactcgcga gggcaagcta atctcttaaa gccgttctca gttcggattg 1200

caggctgcaa ctcgcctgca tgaagtcgga atcgctagta atcgcgaatc agcatgtcgc 1260

ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac ac 1302

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims

1.瘤胃乳杆菌（Lactobacillus ruminis）CCFM1140，已于2020年8月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No. 61158。

2.含有权利要求1所述瘤胃乳杆菌CCFM1140的制剂，其中的瘤胃乳杆菌CCFM1140数量≥1×10¹⁰CFU/g或1×10¹⁰CFU/mL。

3.权利要求1所述的瘤胃乳杆菌CCFM1140在制备保护肠道屏障的药品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药品中瘤胃乳杆菌的活菌数不低于1×10¹⁰CFU/g。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药品为冻干粉；所述冻干粉是将权利要求1所述的瘤胃乳杆菌CCFM1140与冻干保护剂混合，冻干后制得。

6.用于治疗肠道屏障受损的药物，其特征在于，含有权利要求1所述的瘤胃乳杆菌CCFM1140。

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，还含有药物载体和/或药用辅料。