CN117070409A - 一种动物双歧杆菌乳亚种的细菌及其在炎性肠病中的应用 - Google Patents

一种动物双歧杆菌乳亚种的细菌及其在炎性肠病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animals subsp.lactis)的细菌及其炎性肠病中的应用，涉及微生物技术领域。该细菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221672。其菌落形态符合长双歧杆菌的形态。该细菌菌株可以改善或缓解哺乳动物的体重降低的趋势、提高哺乳动物的疾病活动指数、恢复哺乳动物的结肠长度、修复哺乳动物受损的结肠。表明分离筛选出的细菌菌株对结肠炎具有预防和一定的治疗作用。因此，细菌菌株具有制备预防和/或治疗炎性肠病药物的良好的应用前景。

Description

一种动物双歧杆菌乳亚种的细菌及其在炎性肠病中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种动物双歧杆菌乳亚种的细菌及其炎性肠病中的应用。
背景技术
炎症性肠病(Inflammatory bowel diseases，IBD)是一种尚不明原因的慢性且反复性发作的胃肠道炎症性疾病，近年来在世界范围内的发病率逐渐上升。IBD的病因和发病机制，目前尚不十分清楚，多数研究认为：IBD发病涉及遗传因素、感染因素和肠道免疫功能异常等机制。由于发病部位在结肠、直肠、回肠等肠道接触细菌最多的部位，很多学者推测肠道内的细菌可能参与了IBD发病。
有报道IBD患者肠道菌群失调。IBD患者的肠道菌群中，双歧杆菌、乳酸杆菌等细菌数量明显减少，致病菌、条件致病菌的数量剧增，这些致病菌能损伤肠上皮细胞、破坏肠粘膜屏障、诱发异常的肠粘膜免疫反应。正常人肠道粘膜固有层单个核细胞，对自身肠道内细菌存在耐受，而患者肠道对失调的菌群失去耐受，触发大肠粘膜异常免疫反应，加重肠道组织损伤。许多动物实验也证实，肠道菌群参与了实验性结肠炎的发病。
双歧杆菌是人体肠道中典型的益生菌，具有维持肠道细菌菌群平衡，抑制病原菌，修复肠道障碍，调节人体免疫等功效，是世界公认的益生菌。丰富用于人体炎症性肠疾病双歧杆菌种质库十分必要。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动物双歧杆菌乳亚种的细菌及其炎性肠病中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalssubsp.lactis)的细菌菌株，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221672。
上述动物双歧杆菌乳亚种为双歧杆菌属，保藏编号为CCTCCNO：M 20221672，保藏日期为2022年10月26日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。分类命名为：Bifidobacterium animals subsp.lactis PRS-33，菌种名称：动物双歧杆菌乳亚种PRS-33。鉴定结果为存活。
发明人从健康人粪便中分离获得一种细菌菌株，对其16s rDNA序列见SEQ IDNO.1。将其16srDNA序列与NCBI数据库进行比对后，发现与Bifidobacterium animalssubsp.lactis DSM 10140(T)相似性为99.72％，与该模式菌株相比，平均核苷酸相似度ANI为99.99％，因此可以认定为Bifidobacterium animals subsp.lactis同种的菌株，且菌落形态符合长双歧杆菌的形态。
SEQ ID NO.1所示的序列如下：
ACTATGGGGGGCTTACACATGCAGTCGAACGGGATCCCTGGCAGCTTGCTGTCGGGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCAACCTGCCCTGTGCACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATACCGGATGCTCCGCTCCATCGCATGGTGGGGTGGGAAATGCTTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGTTGGCGGGGTGATGGCCCACCAAGGCGTTGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGCGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTTGTTCAAGGGCAAGGCACGGTTTCGGCCGTGTTGAGTGGATTGTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCCTAACGGTGGATCTGCGCCGGGTACGGGCGGGCTGGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTCACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCTTTCCACGGGTCCCGTGTCGGAGCCAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTGCCGGATCGCCGTGGAGACACGGTTTCCCTTCGGGGCCGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCGCATGTTGCCAGCGGGTGATGCCGGGAACTCATGTGGGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGCGGTGCGACACGGTGACGTGGGGCGGATCGCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAACGCCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGTAGCACCCGAAGCCGGTGGCCCGACCCTTGTGGGGGAGCCGTCTAAGGGAGGATTTGGTT。
第二方面，本发明还提供了一种动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalssubsp.lactis)的细菌菌株在制备预防和/或治疗炎性肠病药物中的应用。动物双歧杆菌乳亚种的细菌菌株的16srDNA序列与SEQ ID NO.1所示的序列具有至少99.0％的一致性。例如99％，或99.2％，或99.3％，或99.6％，或99.8，或99.9％，或100％的序列一致性。
在一种可选的实施方式中，动物双歧杆菌乳亚种的细菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221672。
对分离筛选出的细菌菌株进行毒力基因和耐药基因分析，未在基因组中发现潜在的毒力基因；且抗性基因较少。菌株对常见的抗生素具有一致的敏感性。经过实验证明，细菌菌株可以改善或缓解哺乳动物的体重降低的趋势、提高哺乳动物的疾病活动指数、恢复哺乳动物的结肠长度、修复哺乳动物受损的结肠。表明分离筛选出的细菌菌株对结肠炎具有预防和一定的治疗作用。因此，细菌菌株具有制备预防和/或治疗炎性肠病药物的良好的应用前景。
上述治疗是指干预或改变特定健康状态的过程，包括预防、治愈或抑制炎性肠病中的至少一种。
在一种可选的实施方式中，上述治疗是指：使炎性肠病的症状从活动期进入到缓解期，例如溃疡性结肠炎的缓解维持是指使缓解期持续而不反复出现活动期的状态。
预防是指：对于尚未生病、但对炎性肠病疾病易感、可能处在或处在炎性肠病疾病风险的哺乳动物，具有预防性治疗效果。
哺乳动物包括不限于：小鼠、大鼠、猴、牛、羊、人等动物。
在本发明应用较佳的实施方式中，炎性肠病包括不限于急性结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、显微镜结肠炎、改道性结肠炎、贝赫切特病免疫肿瘤学结肠炎、化疗或放射性结肠炎、移植物抗宿主病结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和结肠袋炎中的任意一种。
在本发明应用较佳的实施方式中，药物用于如下任意一种的用途：
(1)改善或缓解哺乳动物的体重降低的趋势；
(2)提高哺乳动物的疾病活动指数；
(3)恢复哺乳动物的结肠长度；
(4)修复哺乳动物受损的结肠。
上述改善或缓解哺乳动物的体重降低的趋势包括不限于：缓解哺乳动物由于炎性肠病导致的体重下降。
在一种可选的实施方式中，修复哺乳动物受损的结肠包括如下至少一种的用途：减少或消除结肠粘膜下水肿、降低或消除结肠的炎症细胞浸润、减少或消除结肠粘膜腺体坏死和减少或消除结肠隐窝脓肿。
疾病活动指数通过如下方法计算：
疾病活动指数(DAI)评分＝(体积减轻得分+大便性状得分+便血程度得分)/3。
在本发明应用较佳的实施方式中，药物包括不限于粉剂、液体制剂或颗粒剂。例如冻干(粉)制剂。
在一种可选的实施方式中，上述药物为液体药物制剂(如作为注射剂的一种)，例如溶液、悬浮液和凝胶通常含有液体载体，例如水和/或药学上可接受的有机溶剂。此外，此类液体制剂还可包含pH调节剂、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、润湿剂、胶凝剂(例如甲基纤维素)、染料和/或调味剂，例如如上所定义的。药物可以是等渗的，即，它们可具有与血液相同的渗透压。药物的等渗性可通过使用氯化钠和其他药学上可接受的试剂来调节，这些试剂例如葡萄糖、麦芽糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇和其他无机或有机可溶性物质。液体组合物的粘度可通过药学上可接受的增稠剂例如甲基纤维素来调节。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度取决于所选择的试剂。
在一种可选的实施方式中，药物被配制用于经口施用、注射施用或灌胃施用。
在一种可选的实施方式中，药物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
其中，药学上可接受的载体、辅助物质或溶剂是常见的药物载体、辅助物质或溶剂，包括各种有机或无机载体和/或辅助材料，因为它们通常用于药物目的，特别是用于固体药物制剂。示例包括：赋形剂，例如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙；粘合剂，例如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉；崩解剂，例如淀粉、水解淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙盐、羟丙基淀粉、乙二醇淀粉钠、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、月桂基硫酸钠；香料，例如柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸、橙粉；防腐剂，例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯)；稳定剂，例如柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸和来自titriplex系列的多羧酸，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；悬浮剂，例如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝；分散剂；稀释剂，例如水、有机溶剂；蜡、脂肪和油，例如蜂蜡、可可脂；聚乙二醇；白凡士林等。
在本发明应用较佳的实施方式中，药物为疫苗组合物。
第三方面，本发明还提供了一种组合物，其包括上述的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animals subsp.lactis)的细菌菌株。
在一种可选的实施方式中，组合物为细菌菌株的发酵培养物或制剂。
在一种可选的实施方式中，制剂由细菌菌株的活菌、细胞破碎物、发酵上清液或发酵沉淀制得。包括不限于对发酵上清液或发酵沉淀进行有效成分的分离，以有效成分制备相应的制剂。
此外，本领域的技术人员根据本发明提供的菌株进行定向或不定性改造获得相应的改造菌、或者进行突变获得相应的突变菌、或者进行化学或物理诱变以获得相应的诱变菌，也在本发明的发明构思范围内。
发酵培养物选自：细菌菌株的发酵上清液或发酵沉淀物。
在一种可选的实施方式中，制剂为液体、固体或半固体制剂。
在一种可选的实施方式中，当制剂为液体制剂时，制剂中动物双歧杆菌乳亚种的含量为≥108CFU/mL。例如制剂中动物双歧杆菌乳亚种的含量为108CFU/mL-1010CFU/mL，或者109CFU/mL-1010CFU/mL。
在一种可选的实施方式中，当制剂为固体或半固体制剂时，制剂中动物双歧杆菌乳亚种的含量为≥108CFU/g。例如制剂中动物双歧杆菌乳亚种的含量为108CFU/g-1010CFU/g，或者109CFU/g-1010CFU/g。
第四方面，本发明还提供了一种组合物在制备预防和/或治疗炎性肠病药物中的应用，组合物包括上述的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animals subsp.lactis)的细菌菌株。
在一种可选的实施方式中，组合物为制剂，制剂由细菌菌株的活菌、细胞破碎物、发酵上清液或发酵沉淀制得。
在本发明应用较佳的实施方式中，炎性肠病选自急性结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、显微镜结肠炎、改道性结肠炎、贝赫切特病免疫肿瘤学结肠炎、化疗或放射性结肠炎、移植物抗宿主病结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和结肠袋炎中的任意一种。
在本发明应用较佳的实施方式中，药物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
其中，药学上可接受的载体、辅助物质或溶剂是常见的药物载体、辅助物质或溶剂，包括各种有机或无机载体和/或辅助材料，因为它们通常用于药物目的，特别是用于固体药物制剂。示例包括：赋形剂，例如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙；粘合剂，例如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉；崩解剂，例如淀粉、水解淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙盐、羟丙基淀粉、乙二醇淀粉钠、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、月桂基硫酸钠；香料，例如柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸、橙粉；防腐剂，例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯)；稳定剂，例如柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸和来自titriplex系列的多羧酸，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；悬浮剂，例如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝；分散剂；稀释剂，例如水、有机溶剂；蜡、脂肪和油，例如蜂蜡、可可脂；聚乙二醇；白凡士林等。
本发明具有以下有益效果：
本发明分离筛选获得一种动物双歧杆菌乳亚种的细菌菌株，其菌落形态符合长双歧杆菌的形态。该细菌菌株可以改善或缓解哺乳动物的体重降低的趋势、提高哺乳动物的疾病活动指数、恢复哺乳动物的结肠长度、修复哺乳动物受损的结肠。表明分离筛选出的细菌菌株对结肠炎具有预防和一定的治疗作用。因此，细菌菌株具有制备预防和/或治疗炎性肠病药物的良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为动物双歧杆菌乳亚种PRS-33在MRS平板上培养48h的菌落图；
图2为动物双歧杆菌乳亚种PRS-33革兰氏染色后在光学显微镜下的图片；
图3为动物实验中小鼠体重变化图；
图4为动物实验中疾病活跃指数DAI评分结果图
图5为动物实验中小鼠结肠长度结果分析图；
图6为动物实验中小鼠结肠病理组织评分图；
图7为不同分组的实验流程图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
动物双歧杆菌乳亚种分离及鉴定。
(1)菌株分离及鉴定
以健康人粪便为样品，在无菌条件下，将粪便用无菌PBS进行10倍梯度稀释，选取三个浓度梯度，涂布于加有莫匹罗星锂盐(购自青岛海博生物科技有限公司，货号：HB0384-6a)的MRS琼脂培养基上(购自青岛海博生物科技有限公司，货号：HB0384)，同时用PBS做空白对照，置37℃恒温厌氧工作台中厌氧培养24-72h，随后挑取不同形态的菌落于MRS琼脂培养基中进行2次划线纯化，纯化后用革兰氏染色试剂盒(购自青岛海博生物科技有限公司，货号：HB8278)进行革兰氏染色、镜检，观察细菌形态及是否纯化。
对纯菌株进行16s rDNA基因分析，初步确定其种属。经过筛选得到一株菌，将其命名为PRS-33。
分离得到的PRS-33的16s rDNA序列见SEQ ID NO.1所示。将16s rDNA序列通过NCBI库比对后，发现与Bifidobacterium animals subsp.lactis DSM 10140(T)相似性为99.72％。
分离到的菌株PRS-33在MRS琼脂培养基上菌落形态如图1所示，该菌株在MRS琼脂培养基上，培养48h后菌落呈白色凸起，表面湿润，不透明，边缘整齐。经革兰氏染色后在光学显微镜下的形态如图2所示，该菌株长而弯曲，呈匙状或棒状，一端膨胀，单个、成对或呈链排列，无芽孢，着色不规则，革兰氏阳性杆菌，符合长双歧杆菌的形态。
(2)生理生化实验
分离到的菌株PRS-33生理生化特征参照表1所示，本实施例中采用生化试剂盒(购自青岛海博生物科技有限公司)进行微生物的生理生化鉴定。PRS--33生理生化特性见下表1。
“+”表示阳性，“-”表示阴性
实施例2
本实施例进行全基因组序列分析以及毒力基因和耐药基因分析。
(1)全基因组序列分析
本实施例对实施例1分离获得的PRS-33原始菌株委托金唯智生物科技有限公司进行全基因组的制备、测序，再进行组装和分析。
基因组相似度最高的模式菌株为Bifidobacterium animals subsp.lactis DSM10140(T)，平均核苷酸相似度ANI为99.99％，因此可以认定为Bifidobacterium animalssubsp.lactis同种的菌株。
(2)毒力基因和耐药基因分析
对基因组中潜在的毒力基因及相关基因的分析采用的是NCBI BLASTP(版本:v2.9.0)，比对毒力因子VFDB setA数据库(更新于2021.5)。
基因组中潜在的抗生素耐药基因使用prokka 1.14.6使用默认参数rgi(版本:v5.1.1)流程分析，其中抗生素耐药基因数据库为CARD，版本：v3.2.5。
毒力基因：未发现任何毒力基因。
抗性基因：组装好的基因组使用prokka进行基因预测，预测的基因使用RGI软件进行抗性基因注释。结果如下所示，与tet(W/N/W)和rpoB抗性基因的序列相似度较高。
实施例3
本实施例对实施例1分离出的菌株进行耐药性检测。
采用肉汤稀释法进行，具体操作参照国际标准方法ISO 10932(IDF 223:2010)，并基于已公布的双歧杆菌属水平抗生素耐药折点值进行抗生素敏感性分析。
“S”表示敏感、“R”表示耐药。
结果表明，该菌株对常见的抗生素具有一致的敏感性，仅对环丙沙星和四环素表现出耐药性。
实施例4
本实施例对实施例1分离出的菌株进行代谢产物分析。
参考《中国药典》2020版，用气相色谱法对菌株发酵上清液中的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的含量进行检测。具体操作如下：取-80℃冻存的甘油菌在MRS肉汤中活化2次后，按照1％接种量接种MRS培养基中培养24h，将菌液按6000rpm/min离心10min，收集30mL上清液。同时做3平行，并以未加菌的MRS肉汤作为空白对照。委托苏州百拓生物技术服务有限公司进行上清液中代谢产物中短链脂肪酸分析。除去空白对照后，结果如下表所示，结果表明该菌株代谢产物以乙酸为主。
上述表格中，结果为平均值±标准差，NA表示未检测到。
实施例5
对实施例1分离出的菌株进行体内药效评价。
实验动物：C57BL/6J小鼠，雌性，6-8周龄，购自百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司。实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，实验开展前提前适应环境7天左右，饲养级别为SPF级，光照/黑暗周期为12h，自由饮水饮食。
实验试剂：造模剂葡聚糖硫酸钠(DSS)购自美国MP Biomedicals(批号：S7102)；粪隐血测试盒购自南京建成生物工程研究所(批号：20220601)。
实验菌株的制备：
PRS-33：从-80℃取出甘油菌，在MRS琼脂平板上划线活化，37℃、严格厌氧活化72h，挑取单菌落接种于50mL MRS肉汤培养基中，在厌氧箱中37℃培养48h，以5％接种量转接于含有1.5L MRS肉汤的大瓶中，在厌氧箱中37℃厌氧发酵24h。将发酵好的发酵液于4℃、4000g的离心率下离心10min收集菌体，再用PBS洗涤一次，然后用20％无菌甘油溶液将菌体进行重悬、分装、-80℃冻存，给药时取出冻存菌液在37℃水浴锅中复溶，然后在4℃、4000g的离心率下离心10min，弃上清，用PBS重悬使菌液浓度总活菌数为5×109CFU/ml。
PRS-45：为本实验室自健康人体肠道分离菌株，经16s rDNA鉴定为长双歧杆菌长亚种，菌株的悬浮液制备方法同PRS-33。
药效评价：
小鼠到达实验室后适应一周左右，按照体重将小鼠分3组，每组10只，分别为DSS模型组、PRS-33给药组、PRS-45给药组、Vehicle组(PBS组)。具体操作如下：PRS-33及PRS-45给药组小鼠预先灌胃菌液一周(菌液活菌数5×109CFU/mL，每只小鼠每天给药200μL)，其余两组小鼠灌胃PBS。随后，在模型组小鼠的饮水中添加3％的葡聚糖硫酸钠(DSS)持续一周，进行IBD模型的诱导。在给予DSS饮水的同时，模型组小鼠灌胃PBS，PRS-33给药组小鼠继续灌胃PRS-33菌液；PRS-45组小鼠继续灌胃PRS-45菌液，Vehicle组小鼠全程给予PBS。实验流程参照图7所示，第0d开始每天进行称重。
(1)疾病活动指数(DAI)评分：
实验最后一天记录小鼠的体重、粪便形状及便血程度，并要照下表进行疾病活动指数(DAI)评分＝(体积减轻得分+大便性状得分+便血程度得分)/3。
(2)结肠病理评分的评估：
为了进行形态学分析，在室温下用4％福尔马林整夜固定结肠组织一夜，然后将其包埋在石蜡中。切片采用了苏木精和伊红(H&E)染色来进行病理分析。在显微镜下详细观察组织切片。通过扫描和浏览软件和全景切片扫描仪对图像进行评估。结肠的组织病理学评分如下表所示：
粘膜下水肿 炎症细胞浸润 粘膜腺体坏死 隐窝脓肿
0 无 无 无 无
1 少数细胞水肿 粘膜内 粘膜浅表层 少数炎症细胞
2 局灶状水肿 粘膜内+粘膜下 粘膜深层 局灶状
3 多灶性水肿 粘膜内+粘膜下+肌层 粘膜全层 多灶状
4 弥漫性水肿 粘膜+肌层+浆膜层 全层+溃疡 重度
实验结果的分析方法：
使用GraphPad Prism 8软件，对实验结果进行了分析。实验数据用平均值±SEM表示。P<0.05表明差异有统计学意义。其中，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。
动物实验中小鼠体重变化图参照图3所示，动物实验中疾病活跃指数DAI评分结果图参照图4所示，动物实验中小鼠结肠长度结果分析图参照图5所示，动物实验中小鼠结肠病理组织评分图参照图6所示。
其中，IBD模型小鼠(DSS组、PRS-33组和PRS-45组)表现为体重减轻、DAI评分升高、结肠长度缩短及出现明显的结肠组织损伤，表明造模成功。
与DSS组小鼠相比，灌胃PRS-33具有改善IBD小鼠体重的作用趋势(图3)，可明显降低IBD小鼠DAI评分(图4)、明显恢复(P<0.001)IBD小鼠结肠长度(图5)及显著降低(P<0.05)IBD小鼠结肠病理组织评分(图6)。而PRS-45对IBD小鼠降低的体重、升高的DAI评分、缩短的结肠长度及受损的结肠组织均无明显作用。以上结果表明PRS-33对结肠炎具有预防和一定的治疗作用，且效果优于对照菌株PRS-45(长双歧杆菌长亚种)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animals subsp.lactis)的细菌菌株，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221672。
2.一种动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animals subsp.lactis)的细菌菌株在制备预防和/或治疗炎性肠病药物中的应用，其特征在于：所述动物双歧杆菌乳亚种的细菌菌株的16s rDNA序列与SEQ ID NO.1所示的序列具有至少99.0％的一致性；
优选地，所述动物双歧杆菌乳亚种的细菌菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221672。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述炎性肠病选自急性结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、显微镜结肠炎、改道性结肠炎、贝赫切特病免疫肿瘤学结肠炎、化疗或放射性结肠炎、移植物抗宿主病结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和结肠袋炎中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物用于如下任意一种的用途：
(1)改善或缓解哺乳动物的体重降低的趋势；
(2)提高哺乳动物的疾病活动指数；
(3)恢复哺乳动物的结肠长度；
(4)修复哺乳动物受损的结肠；
优选地，所述修复哺乳动物受损的结肠包括如下至少一种的用途：减少或消除结肠粘膜下水肿、降低或消除结肠的炎症细胞浸润、减少或消除结肠粘膜腺体坏死和减少或消除结肠隐窝脓肿。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为粉剂、液体制剂或颗粒剂；
优选地，所述药物被配制用于经口施用、注射施用或灌胃施用；
优选地，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗组合物。
7.一种组合物，其特征在于，其包括权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animals subsp.lactis)的细菌菌株；
优选地，所述组合物为所述细菌菌株的发酵培养物或制剂；
优选地，所述制剂由所述细菌菌株的活菌、细胞破碎物、发酵上清液或发酵沉淀制得；
所述发酵培养物选自：所述细菌菌株的发酵上清液或发酵沉淀物；
优选地，所述制剂为液体、固体或半固体制剂；
优选地，当所述制剂为液体制剂时，所述制剂中所述动物双歧杆菌乳亚种的含量为≥108CFU/mL；
优选地，当所述制剂为固体或半固体制剂时，所述制剂中所述动物双歧杆菌乳亚种的含量为≥108CFU/g。
8.一种组合物在制备预防和/或治疗炎性肠病药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animals subsp.lactis)的细菌菌株；
优选地，所述组合物为制剂，所述制剂由所述细菌菌株的活菌、细胞破碎物、发酵上清液或发酵沉淀制得。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述炎性肠病选自急性结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、显微镜结肠炎、改道性结肠炎、贝赫切特病免疫肿瘤学结肠炎、化疗或放射性结肠炎、移植物抗宿主病结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎和结肠袋炎中的任意一种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117701456A (zh) * 2023-12-22 2024-03-15 善恩康生物科技（苏州）有限公司 乳双歧杆菌、其制剂及其在生殖损伤或疾病中的应用

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