CN117980720A - 粒子测量装置、粒子测量方法、样品容器 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于，在通过光照射来测量粒子的尺寸、密度等的情况下，减轻用户对测量装置输入粒子的折射率、溶剂的折射率的负担，并且提高依赖于折射率的测定精度。本发明的粒子测量装置确定透光窗与样品之间的沿着光轴方向的边界位置，使用该边界位置处的已知样品的折射率和所述透光窗的折射率来计算所述样品的折射率(参照图6)。

Description

粒子测量装置、粒子测量方法、样品容器

技术领域

本发明涉及测量在包含溶剂和粒子的样品内悬浮的粒子的尺寸分布的技术。

背景技术

近年来，医药品的开发对象正在从低分子药转移到生物医药品。生物医药品为高分子，因此容易凝集，凝集时有时产生毒性。例如美国食品医药品管理局等要加强凝集体的浓度管理限制。因此，对于0.1μm～1μm的亚微米区域中的凝集体，需要定量地测量期望密度的尺寸分布的技术。蛋白质的凝集体在溶剂中悬浮，位置因布朗运动而随时间变化。以下，在本发明中，对蛋白质的凝集体及聚苯乙烯珠等标准粒子的尺寸和密度的测量技术进行记述。将这些被检物统一记述为“粒子”。

专利文献1记载了使用光测量来检测粒子的技术。该文献公开了“一种光测量方法，对光进行聚光而生成光斑，对所述光斑的尺寸的大致3倍以下的被检物进行测量，其特征在于，具有：信号取得步骤，至少一边使所述光的焦点位置在光轴方向上移动一边对所述被检物进行照射，由此检测从所述被检物反射的反射光；取得对应关系数据的步骤，该对应关系数据记述了所述反射光的强度与所述被检物的尺寸之间的对应关系；以及尺寸计算步骤，使用所述反射光的强度来查询所述对应关系数据，由此取得所述被检物的尺寸”(权利要求1)。该文献记载的技术通过使反射光与参照光干涉来增强信号，从而不需要预处理，能够实现高分辨率的测量。

专利文献2公开了如下技术：对物镜进行物理扫描，并且利用相位条件不同的4个检测器接收信号光与干涉光的干涉，由此不需要时域OCT(Optical CoherenceTomography)中的基于反射镜的扫描的参照光的相位调整。进而，专利文献2基于专利文献1的技术，公开了使光斑的扫描高速化的技术，以免受到在液体中进行布朗运动的粒子的运动的影响。

专利文献3公开了如下技术：在使用半导体激光器作为光源的生物断层图像的测量中，通过将高频叠加在驱动电流上来将相干长度控制在预定范围内，由此降低所获取的断层图像中所包括的噪声的影响。

专利文献4公开了使用特殊的容器和光学系统来测定溶剂的折射率的技术。

非专利文献1公开了与作为用于生物医药品的分析的容器的代表性的微孔板的功能、形状相关的规格信息。该规格在后述的样品容器的实施方式中提及。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2017-102032号公报

专利文献2：WO 2020/144754

专利文献3：日本特开2015-049204号公报

专利文献4：日本特开平7-055700号公报

非专利文献

非专利文献1：URL：

https://www.slas.org/education/ansi-slas-microplate-standards/(2022年1月18日取得)

发明内容

发明所要解决的课题

考虑使用专利文献1或2所记载的技术来测量蛋白质凝集体等粒子的尺寸和密度。使用该文献记载的技术检测的反射光与粒子的尺寸一起根据其折射率而变化。该文献记载的技术通过利用光的干涉将反射光的电场振幅转换为电压，能够得到检测信号。该检测信号的大小不仅根据粒子的尺寸，还根据粒子的折射率和溶剂的折射率而变化。另一方面，在生物药物中，为了使蛋白质尽可能不凝集，以适当的量添加例如pH、盐、糖、表面活性剂等。因此，溶剂的折射率根据添加剂的条件而变化。

在与溶剂之间的折射率差小的蛋白质凝集体的情况下，相对于溶剂的折射率的变化，检测信号的大小的变化大。因此，在利用专利文献1和专利文献2中记载的技术测量蛋白质凝集体的尺寸和密度的情况下，用户需要对测定装置高精度地输入蛋白质凝集体和溶剂的折射率。

也可以考虑使用专利文献4那样的测量折射率的装置来代替用户输入折射率。但是，在包含该文献记载的方法的市售的折射率测定装置中，使用的光源的波长大多为离散的值。因此，从用户的便利性的观点出发，难以根据波长的差异和添加物条件的差异准确地求出溶剂和粒子各自的折射率。

本发明是为了解决上述课题而完成的，其目的在于，在通过光照射来测量粒子的尺寸、密度等的情况下，减轻用户对测量装置输入粒子的折射率、溶剂的折射率的负担，并且提高依赖于折射率的测定精度。

用于解决课题的手段

本发明的粒子测量装置确定透光窗与样品之间的沿着光轴方向的边界位置，使用该边界位置处的已知样品的折射率和所述透光窗的折射率来计算所述样品的折射率。

发明效果

根据本发明，能够提高使用光来测量介质中的粒子的尺寸和密度时的便利性和测量精度。关于上述以外的课题、结构、效果等，通过以下的实施方式的说明而明确。

附图说明

图1是表示在专利文献1记载的技术中，焦点偏移、检测信号以及粒子尺寸的关系的示意图。

图2是表示粒子的直径与信号强度之间的关系的模拟结果。

图3是表示基于式1计算出的溶剂的折射率与检测信号的大小之间的关系的计算结果。

图4是表示加入了含有测定对象粒子的溶剂的容器与要测定的激光之间的关系的示意图。

图5A是表示使样品沿Z方向移动而使焦点位置变化时的检测信号的实验结果。

图5B是表示将焦点位置固定为Z0并使参照光反射镜的位置变化时的检测信号的变化的实验结果。

图6是表示实施方式1中的测量流程的流程图。

图7是表示实施方式1中的测量流程的其他流程图。

图8是作为溶剂而使用蔗糖水溶液来测定的溶剂的折射率的测定结果。

图9A是表示激光的焦点位于透明窗与溶剂之间的边界的情况下的光路的示意图。

图9B是表示将激光的焦点移动到样品内时的移动量的示意图。

图10是表示样品内的焦点位置Z与检测信号的关系的计算结果。

图11是表示通过专利文献3记载的高频叠加技术将光源的半导体激光器的相干长度L设为210μm的情况下的样品内的焦点位置Z与检测信号之间的关系的计算结果。

图12是表示用于高精度地实现本发明的溶剂的折射率的测定的透明窗的厚度偏差的规格的计算结果。

图13是表示专利文献2中记载的样品容器的截面结构的示意图。

图14A表示本发明中优选的样品容器的平面图。

图14B是图14A的AA’截面图。

图15A示出了表示使用专利文献2中记载的样品容器在分注样品时在测定区域不产生气泡的影响而正常地实施测定的比率的实验结果。

图15B示出了表示使用专利文献2中记载的样品容器在分注样品时在测定区域不产生气泡的影响而正常地实施测定的比率的实验结果。

图16A是表示通过实施方式3的样品容器在分注样品时在测定区域不产生气泡的影响而正常地实施测定的比率的实验结果。

图16B是表示通过实施方式3的样品容器在分注样品时在测定区域不产生气泡的影响而正常地实施测定的比率的实验结果。

图17A是表示实施方式3的样品容器、框架以及底板的结构的图。

图17B是表示实施方式3的容器与底板之间的关系的示意图。

图18A是表示作为溶剂的折射率的测定基准的优选的容器的结构的示意图。

图18B是表示与实施方式1同样地作为对象的样品的溶剂的测定情况的示意图。

图19是实施方式4的粒子测量装置的结构图的一例。

图20A示意性地表示一边使样品容器在Z方向上移动一边取得检测信号的本发明的粒子尺寸分布测定方法。

图20B示意性地表示一边使样品容器在Z方向上移动一边取得检测信号的本发明的粒子尺寸分布测定方法。

图21A示意地表示一边使物镜在Z方向上移动一边取得检测信号的本发明的粒子尺寸分布测定方法。

图21B示意地表示一边使物镜在Z方向上移动一边取得检测信号的本发明的粒子尺寸分布测定方法。

图22A示意性地表示将本发明的样品容器相对于本发明的粒子测量装置安装、拆卸的情况。

图22B示意性地表示将本发明的样品容器安装于粒子测量装置的情况下的截面图。

具体实施方式

＜实施方式1：现有技术的课题＞

图1是表示专利文献1记载的技术中焦点偏移、检测信号及粒子尺寸的关系的示意图。图1的左上部以几何方式示出了相对于相对小的粒子具有焦点偏移时的光学系统。粒子在z位置(沿光轴的坐标)的几何斑点尺寸由物镜的数值孔径和焦点偏移量几何地决定。根据几何射束的面积内的粒子的投影面积的比率，检测信号衰减。该投影面积之比相当于光的反射的反应截面积。图1的右上部是示出相对于相对大的粒子具有焦点偏移的情况的示意图。与图1的左上部相比，粒子尺寸大，因此反应截面积大，反射的光量也变大。因此，能够将粒子尺寸的差异检测为反射光量的差异(检测信号量的差异)。图1的下方是表示焦点位置的检测信号量与粒子尺寸之间的关系的实验结果。

图2是表示粒子的直径与信号强度之间的关系的模拟结果。模拟方法使用专利文献1记载的“波动光线追踪法”，将光源的波长设为785nm，将物镜的数值孔径设为0.45。如图所示，可知检测信号的大小依赖于粒子的大小而变化。通过预先存储这些对应关系数据，能够根据检测信号的大小测量粒子尺寸。

另一方面，所检测的反射光根据粒子尺寸而变化，并且根据粒子的折射率而变化。在专利文献1以及专利文献2所记载的技术中，利用光的干涉将反射光的电场振幅转换为电压，从而能够得到检测信号。此时，检测信号的大小|E_sig|使用粒子的折射率n_p和溶剂的折射率n_m，根据Fresnel定律，在光源的相干长度充分长的情况下，能够由下式表示。S是向样品照射的光的电场振幅，R是参照光的电场振幅，σ是根据粒子尺寸而变化的系数，η是表示反射光与参照光的干涉效率以及光检测器的光电转换的效率的常数。

[数式1]

如式1所示，检测信号的大小不仅根据粒子的尺寸，还根据粒子的折射率n_p和溶剂的折射率n_m而变化。另一方面，在生物药物中，以适当的量添加例如pH、盐、糖、表面活性剂等，以使蛋白质尽可能不凝集。因此，溶剂的折射率根据添加剂的条件而变化。

图3是表示基于式1计算出的溶剂的折射率与检测信号的大小之间的关系的计算结果。在此，聚苯乙烯的折射率为1.58，蛋白质凝集体的折射率为1.40。从图中可知，在与溶剂之间的折射率差小的蛋白质凝集体的情况下，相对于溶剂的折射率的变化，检测信号的大小的变化较大。

由于存在这样的关系，因此在通过专利文献1和专利文献2中记载的技术来测量蛋白质凝集体的尺寸和密度的情况下，用户需要将蛋白质凝集体和溶剂的折射率高精度地输入到测定装置中。该输入有时对用户来说成为测量时的负担。在本发明的实施方式1中，说明减轻伴随这样的折射率的输入的用户负担的方法。

在以下的记载中，如图1所记载的那样，统一为将光轴方向设为z轴的坐标系来进行说明。另外，作为测定对象的粒子的尺寸作为体积相等的球的直径来处理。

＜实施方式1：关于溶剂和对象粒子的折射率的测定方法＞

图4是表示加入了含有测定对象粒子的溶剂的容器与要测定的激光之间的关系的示意图。在图中，108是物镜，300是激光，204是样品，203是容器，202是设置于容器的底面的透明窗。本实施方式中，为了测定溶剂的折射率，利用溶剂与透明窗202之间的边界的反射率依赖于溶剂的折射率。一边使未图示的样品工作台在Z方向上移动，一边确定检测信号成为最大的条件，从而能够将物镜108的焦点定位于样品204与透明窗202之间的边界。此时，根据Fresnel的式子，使用溶剂的折射率n_m、透明窗的折射率n_g，通过下述式表示检测信号的大小E_sig。S是向样品照射的光的电场振幅，R是未图示的参照光的电场振幅，η是表示反射光与参照光的干涉效率以及光检测器的光电转换的效率的常数。

[数式2]

在本实施方式中，通过选择透明窗202的材质，其折射率能够用作规定的值。同样地，通过将未图示的半导体激光器的出射功率条件设为恒定，能够将对样品204照射的光的电场振幅S以及参照光的电场振幅R作为常数值来处理。进而，预先测量将洁净室用纯水等已知的折射率n₀的液体用作样品的情况下的检测信号的大小，将其值设为|E0_sig|。|E0_sig|由下式表示。

[数式3]

根据式2和式3，下述式成立。

[数式4]

式4中，溶剂的折射率n_m以外为已知的值或测量值。因此，使用式4，能够对要测定的样品直接量化溶剂的折射率n_m。此时，光源的波长是测定波长本身，因此也不需要将上述那样的依赖于波长而变化的值换算为相当于测定波长的值等的处理。

图5A是表示使样品沿Z方向移动而使焦点位置变化时的检测信号的实验结果。在焦点位置约200μm看到的峰值表示来自透明窗与空气的界面的反射光，在焦点位置约375μm看到的峰值表示来自透明窗与样品(溶剂)的界面的反射光。两者的间隔表示透明窗的厚度。这样，以包含透明窗与空气之间的界面、以及透明窗与溶剂之间的界面的方式，一边扫描焦点位置一边取得检测信号，由此，若求出图中的左起第二个峰值位置，则能够对透明窗与溶剂之间的边界的焦点位置Z0进行定位。

图5B是表示将焦点位置固定为Z0并使参照光反射镜的位置变化时的检测信号的变化的实验结果。如图所示，在参照光反射镜的位置约为300μm时，反射光到达检测器为止的光路长度与参照光到达相同的检测器为止的光路长度相等，检测信号最大。此时的检测信号的最大值为式4中的E_sig。省略了对参照光的说明，但是对于光学系统的细节进行后述。

图6是表示本实施方式中的测量流程的流程图。在步骤S600中，将焦点位置Z0及参照光反射镜位置R0初始化为预定的初始值Z00、R00。在步骤S601和S602中，在扫描焦点位置Z0的同时取得检测信号，并且更新Z0以便聚焦在透明窗和溶剂之间的边界。在步骤S603和S604中，更新检测信号的光路长度与参照光的光路长度一致的参照光反射镜位置R0。在步骤S605中，使用式4求出溶剂的折射率n_m。在步骤S606中，将焦点位置移动到样品内，使用折射率n_m，测定样品中包含的粒子的尺寸和密度。关于粒子的尺寸和密度的测定，一边使焦点位置在预定的范围内沿X、Y、Z方向移动，一边将来自粒子的反射光作为检测信号转换为电信号进行测量，对每个粒子求出焦点位置的检测信号的最大值，利用介质的折射率n_m，测定每个粒子的尺寸和密度，以用户能够视觉辨认的形式进行提示。此时，在根据检测信号的最大值求出粒子的尺寸的转换中，使用根据溶剂的折射率n_m校正后的图2的关系。

图7是表示本实施方式中的测量流程的另一流程图。在本发明中，为了实现用户的便利性和尺寸分布测量精度的提高，能够将样品容器设为一次性类型。此时，由于样品容器的形状的个体差、用户将样品容器设置于装置时产生的位置偏移等，有时在透明窗与溶剂之间的边界聚焦的条件从预先决定的初始值大幅(例：10μm左右以上)偏移。图7是在这样的情况下优选的本实施方式的流程图。反复进行Z0和R0的更新直到激光的光斑位置和参照光反射镜的位置相对于上次值的变化成为预定的阈值Δ以下为止，从而能够实现这一点。

在步骤S700中，将焦点位置Z0及参照光反射镜位置R0初始化为预先决定的初始值Z00、R00。步骤S701～S704与S601～S604相同。在步骤S705中，判定Z0的当前值与上次值之间的差分以及R0的当前值与上次值之间的差分是否均小于阈值Δ。在不满足的情况下，在利用当前值更新Z0和R0各自的上次值之后，返回S701反复进行尝试。在满足S705的条件的情况下，实施步骤S706～S707。它们与步骤S605～S606相同。与Z0相关的阈值Δ和与R0相关的阈值Δ可以是彼此相同的值，也可以是不同的值。

通过发明人的实验研究可知，在使用波长785nm的半导体激光器作为光源、使用数值孔径0.45的显微镜透镜作为物镜、使用厚度175μm的硼硅酸玻璃(折射率实测值＝1.520)作为透明窗的情况下，阈值Δ相对于Z方向优选为约1μm，相对于R方向优选为约5μm。另外，关于尺寸分布测定中的焦点位置的移动范围，可知在Z方向上优选为50μm～100μm，在X、Y方向上优选为300μm～500μm左右。另外，为了与在溶剂内杂乱地进行布朗运动的粒子的位置的变化对应地测量粒子的尺寸，对于X或Y方向的焦点扫描中的任一个，优选使用在扫描型激光显微镜等中广泛使用的谐振型电流镜。关于在此所述的数值，根据波长、光束直径、物镜的规格等，只要是一般的干涉测量的技术人员就能够适当地决定。

图8是作为溶剂使用蔗糖水溶液测定的溶剂的折射率的测定结果。众所周知，蔗糖水溶液的折射率根据浓度而线性变化。图中的参照数据表示使用Kalnew精密折射仪通过C线(656.27nm)测定的蔗糖水溶液的折射率的公开数据(http://www.shimadzu.co.jp/products/opt/products/ref/ref-app05.html)。如上所述，一般的折射率测定方法使用平行光，对离散的波长实施，因此难以与例如将波长785nm的半导体激光器用作光源时的波长直接对应。通常，已知电介质的折射率具有波长越长则越降低的倾向，已知它们依赖于温度。利用本实施方式测定出的折射率是直接使用测定尺寸分布的光源且相对于由物镜聚光的激光的折射率，并且样品的温度条件等与实施尺寸测定的条件相同，因此不需要如上述那样由用户换算这些因素来输入折射率，能够实现便利性的提高。

＜实施方式2：关于焦点位置向样品内的移动量和参照光反射镜的移动量＞

本发明通过零差相位分集法放大并检测来自在溶剂内悬浮的粒子的微弱的反射光。构成零差相位分集法的光学系统的详细情况在后面叙述，但为了使其实现预定的放大，要求反射光和参照光在光检测器上的光路长度一致。在本发明的实施方式2中，对用于使光路长度一致的具体方法进行说明。

图9A是表示激光的焦点位于透明窗与溶剂之间的边界的情况下的光路的示意图。将由未图示的Z工作台保持的样品的位置设为Z0，将由未图示的R工作台保持的参照光反射镜的位置设为R0。从作为光源的半导体激光器照射的光的一部分作为信号光朝向样品行进并被反射而被引导至检测光学系统。同时，从半导体激光器照射的光的另一部分作为参照光朝向参照光反射镜行进并被反射而被引导至检测光学系统。在Z0和R0，从半导体激光器到检测光学系统的信号光和参照光各自的光路长度在波长数量级一致。

图9B是表示将激光的焦点移动到样品内的情况下的移动量的示意图。如图所示，为了将激光的焦点移动到样品内，只要将保持样品的Z工作台移动dz，将保持参照光反射镜的R工作台移动dr即可。本发明中作为测定对象的粒子在介质中杂乱地进行布朗运动，位置不确定，因此难以如上述那样确定为一边扫描Z和R一边使光路长度一致。假设实施该测定，则一边使参照光反射镜位置以5μm左右的间隔变化数十次，一边实施上面所示的粒子尺寸分布的测定，作为来自检测出的多个粒子的检测信号的平均值成为最大的条件来确定参照光反射镜的位置。但是，这样的过程在测定上花费多余的时间，大大损害用户的便利性。因此，在本实施方式中，从光学的观点出发，如以下那样确定dz与dr的关系。

将样品位置向物镜的方向移动了dz的情况下的焦点位置的变化dFP依赖于溶剂的折射率n_m，能够根据斯涅尔定律或光学中的近轴理论通过下述式来进行近似。

[数式5]

dFP＝dz n_m (式5)

空气中的光路长度减小dz，介质中的光路长度增大dFP，因此，来自焦点的反射光到达检测光学系统为止的光路长度的变化dL能够用下式表示。

[数式6]

dL＝2(n_m ²-1)dz (式6)

因此，能够将上面的近似的校正项设为α而由下式表示用于使光路长度与信号光一致的参照光反射镜的移动量dr。

[数式7]

dr＝α(n_m ²-1)dz (式7)

校正项α以物镜的球面像差的变化的影响为主体，在物镜的构造已知的情况下能够通过光线追踪法求出。通过发明人的实验研究可知，在使用波长785nm的半导体激光器作为光源、使用数值孔径0.45的显微镜透镜作为物镜、使用厚度175μm的硼硅酸玻璃(折射率实测值＝1.520)作为透明窗的情况下，在dz的范围为100～900μm的范围内，能够以α＝1.029良好地进行校正。在变更光源的波长、物镜的情况下，如上所述，通过基于光线追踪的计算、实验性研究来适当确定α的值即可。α的值根据光学系统的选择而变化，但其范围为0.8～1.2。

如果使用式5和式7，则即使不进行上述那样的参照光反射镜位置的全面扫描，也能够唯一地确定相对于样品的移动量的焦点的位置以及参照光反射镜的移动量，能够抑制测定时间的延长，同时实现测定精度的保证和用户的便利性的提高。

在此，示出了使样品位置向物镜的方向移动的移动量与参照光反射镜的移动量之间的关系，但同样也可以固定样品位置来移动物镜。在该情况下，当使物镜位置在样品的方向上移动相同的dz时，能够直接使用式5～式7的关系来确定参照光反射镜的移动量dr。对于具体的实施方式进行后述。

接着，对本发明的粒子尺寸分布测定中优选的样品的移动量dz的优选值进行叙述。在本发明中，通过零差相位分集法放大来自在溶剂内悬浮的粒子的微弱的反射光并转换为电信号进行检测。对于式1，若考虑作为光源的半导体激光器的相干长度的影响，则来自位于激光的焦点的粒子的检测信号的大小|E_sig|与反射光的电场E_s的大小和参照光的电场E_r的大小成比例，将相干长度设为L，将信号光与参照光的光路长度之差设为ΔL，如以下那样表示。

[数式8]

相干长度是检测信号的平方|E_sig|²成为最大值的1/2的光路长度差的FWHM范围。对于其他项与式1的说明重复，因此在此省略说明。

在本发明中，通过零差相位分集法检测来自对象粒子的反射光，但与其他光学测定法同样地，来自透明窗与溶剂之间的边界的反射光也被检测光学系统接收。来自透明窗和溶剂的反射光与来自对象粒子的反射光相比大10倍～100倍左右，在测量粒子尺寸分布时作为不需要的噪声而作用，因此接下来对其影响进行叙述。

当激光的焦点在样品内时，来自透明窗与溶剂的边界的反射光作为来自从焦点偏离的面的反射光而伴随散焦像差被检测。该情况下的检测信号的大小|E_{sig_boundary}|由下式表示。

[数式9]

在式9中，散焦像差的影响是sinc函数的项，Z是样品内的焦点位置(相当于散焦量)，λ表示光源的波长，NA表示物镜的数值孔径。

图10是表示样品内的焦点位置Z与检测信号的关系的计算结果。在此，设激光的相干长度足够大，使用式8和式9，计算从对象粒子得到的检测信号以及从透明窗与溶剂的边界得到的噪声。图中，Z＝0为透明窗与溶剂的边界位置。在此，将溶剂的折射率设为1.333，将粒子的折射率设为1.400，将尺寸设为0.1μm，将位置设为Z＝500μm。从图中可以看出，从透明窗与溶剂的边界得到的信号随着Z的增加而衰减，如果对象粒子的位置为500μm，则来自粒子的检测信号与来自边界的噪声相比约大10倍。根据附图，两者的大小相同的条件为Z＞约50μm。由该结果可知，在本发明的尺寸分布测量中，样品内的激光的焦点位置优选从透明窗离开至少50μm以上。

图11是表示通过专利文献3记载的高频叠加技术将光源的半导体激光器的相干长度L设为210μm的情况下的样品内的焦点位置Z与检测信号之间的关系的计算结果。通过发明人的实验研究可知，在使用波长785nm的半导体激光器作为光源、使用数值孔径0.45的显微镜透镜作为物镜的情况下，通过将高频叠加的频率设为约300MHz并将相干长度设为约210μm，从激光噪声的观点、以及来自透明窗与溶剂的边界的噪声的观点等来看，这是适合于本发明的高频叠加的条件。计算结果基于此。

如图所示可知，通过高频叠加来控制作为光源的半导体激光器的相干长度，由此在对象粒子的位置为500μm的情况下，来自粒子的检测信号与来自边界的噪声相比增大约100倍，通过高频叠加的效果，噪声的影响改善到约1/10。由图可知，通过使用高频叠加，为了将S/N比设为10以上来实施测量，使样品内的焦点位置从透明窗的边界离开130μm以上即可。通常，如果S/N比为3左右，则可以认为能够实施测量，因此可以说，本实施方式的效果是通过从透明窗的边界离开100μm以上来测量样品而得到的。

关于基于高频叠加的相干长度的控制，优选的条件根据使用的电路形式、阻抗匹配条件等而变化。从激光噪声的观点出发，一边观察发光功率的时间变化和振荡波长的扩展，一边考虑对式9的测定的噪声影响，对于对象粒子，使检测信号的S/N比成为最大，由此在其他光学系统中也能够应用本实施方式的技术。这对于本技术领域的一般技术人员来说是容易的。

来自样品的液面的上端与空气的边界的反射光也同样地作为噪声对测定产生影响。如图所示，如果使测定焦点位置从透明窗离开500μm左右，则能够充分地减小噪声的影响，因此为了良好地实现本实施方式的效果，要求样品的液面的上端距离透明窗的边界500μm的2倍即1mm以上。

接着，对对象粒子的折射率的测定方法进行叙述。通过本实施方式预先测定溶剂的折射率后，按照式5～式7，在样品内移动激光的焦点位置，测定来自对象粒子的检测信号，由此能够测量与溶剂和对象粒子各自的折射率对应的检测信号。在如聚苯乙烯标准粒子那样对象粒子的尺寸已知的情况下，能够使用得到的检测信号和式8计算对象粒子的折射率n_p。另一方面，如在特定的条件下形成的蛋白质凝集体那样尺寸未知的对象的情况下，使用如图8所示的蔗糖水溶液等那样折射率已知的介质即可。如果通过测定用至少2种以上浓度的蔗糖水溶液稀释样品而得到的样品，取得2个与溶剂的折射率和尺寸分布对应的检测信号的平均值(由于存在尺寸分布，因此可以使用平均值)，则使用式8将与尺寸分布相关的量σ和对象粒子的折射率n_p作为2个未知数联立，从而能够计算出两者。

＜实施方式3：样品容器＞

根据实施方式1～2，为了高精度地测量粒子尺寸分布，包含作为测定光学系统的一部分的透明窗的样品容器需要满足预定的规格。如上所述，液面高度1mm以上是其条件之一。在本发明的实施方式3中，对满足这些规格的样品容器的具体例进行说明。测量方法与实施方式1～2相同。

图12是表示用于高精度地实现本发明的溶剂的折射率的测定的透明窗的厚度偏差的规格的计算结果。众所周知，当透明窗的厚度偏离预定值时，在光学上产生球面像差。对式1～式2所示的检测信号的影响能够作为基于波面像差的Strehl强度的降低来处理。图12是表示由透明窗的厚度的偏差引起的检测信号(Strehl强度)的降低的情况的计算结果。在此，示出了使用波长785nm的半导体激光器作为光源，使用数值孔径0.45的显微镜透镜作为物镜，使用厚度175μm的硼硅酸玻璃(折射率实测值＝1.520)作为透明窗的情况下的结果。如图所示，为了使检测信号的降低量为0.2％以下，可知透明窗的厚度的偏差(最厚的部位与最薄的部位之间的厚度差)要求为70μm以下。

如实施方式1所示，为了测量溶剂的折射率和粒子尺寸分布，优选一边使样品容器在Z方向上移动，一边将反射光变换为检测信号而取得。在原理上，固定样品容器的位置，一边使光学系统整体移动一边实施测量也是同样的，但与样品容器相比，光学系统整体的重量和体积非常大，因此从消耗电力、装置的小型化的观点来看不能说是优选的。如上所述，在通过电动工作台使样品容器在Z方向上移动的情况下，由于其加减速的影响，无法避免在样品内产生液面的振动。为了使该液面振动相对于布朗运动的量足够小，要求通过在容器的壁面形成狭窄部等而提高粘性阻力等。

图13是表示专利文献2所记载的样品容器的截面构造的示意图。在此，示意性地示出了如上述那样由于通过电动工作台使样品容器在Z方向上移动的影响而液面振动的情形。如图所示，专利文献2所记载的样品容器具有如下构造：为了防止气泡混入测定部，以能够经由气泡流路释放气泡的方式连接2个区域。由此，作为Z方向的移动的影响，容易产生2个区域的液面高度上下振动的模式。这容易比测定中的粒子的布朗运动大，容易导致测定精度的降低。

图14A表示在本发明中优选的样品容器的平面图。图中，1401为容器，1402为形成于槽孔外周部的狭窄部，1403为注入槽孔中的样品，1404为槽孔。如图所示，在本实施方式中，将注入样品的槽孔1404一体成型为阵列状地排列。特征在于，在槽孔1404的外周形成有狭窄部1402。狭窄部1402形成为从槽孔1404的侧壁朝向槽孔1404的外侧突出。图14A的平面上的狭窄部1402的截面积比槽孔1404的截面积小。

图14B是图14A的AA’截面图。1405表示透明窗。容器1401为了降低由Z方向的容器的移动引起的液面的振动，不使用专利文献2那样的气泡流路，取而代之具有狭窄部1402。狭窄部1402具有不使气泡逸出而在槽孔1404的外周部捕获气泡来抑制对测定的影响的功能。进而，通过形成狭窄部1402，利用毛细管现象有效地使液体与壁面之间的流动阻力增加，实现液面振动的降低。

通过本实施方式的容器1401，能够解决上述的液面振动的课题，实现稳定的粒子尺寸分布测量。另外，为了减少贵重的生物医药品样品的使用量，在20μL的样品的情况下，将槽孔1404的直径设为4.0mm以下，以使液面高度为1mm以上。作为透明窗1405的材质，使用厚度175μm的硼硅酸玻璃(折射率实测值＝1.520)。厚度精度以满足上述规格(偏差≤70μm)的方式以±15μm的精度进行管理而制作。容器1401的外形以不产生透明窗1405的倾斜等的方式进行管理，通过黑色的聚丙烯树脂的成型来制作。

图15A和图15B示出了表示使用专利文献2所记载的样品容器在分注样品时在测定区域不产生气泡的影响而正常地实施测定的比率的实验结果。图15A是容器的截面结构。在此，按照上述规格，作为样品量20μL且液面高度为1mm以上的条件的范围，制作使槽孔的内径在2～3mm的范围内变化的容器。图15B是将实施50次分注试验而能够正常地实施尺寸分布测量的比率汇总到表中的实验结果。如图所示，在槽孔的内径为3mm的情况下，不发生气泡的混入而能够实施尺寸分布测量。但是，为了使液面的振动的影响比布朗运动小的测定等待时间需要1分钟。可知这与尺寸分布测定时间20秒相比较长。

图16A和图16B是表示通过本实施方式的样品容器在分注样品时在测定区域不产生气泡的影响而正常地实施测定的比率的实验结果。如图16A所示，在此，制作了使狭窄部的形成个数在0～4个的范围、使槽孔的内径在2～4mm的范围变化的容器。图16B是将实施50次分注试验而能够正常地实施尺寸分布测量的比率汇总到表中的实验结果。如图所示，可知在狭窄部的个数为0个的情况下，没有能够实现全部的正常测量的条件。另一方面，可知在如本实施方式的容器那样形成狭窄部的情况下，如果狭窄部为2个以上或1个且槽孔的内径为3.5mm～4.0mm的范围，则存在能够实现全部的正常测量的条件。此时，液面振动的影响比布朗运动小的测定等待时间约为5秒。

如以上那样，通过使用本实施方式的样品容器，能够得到与专利文献1所记载的容器同等的气泡的影响抑制性能，并且削减伴随样品容器在Z方向的移动的等待时间，实现短时间内的测量完成这样的用户便利性的提高。

图17A是表示本实施方式的样品容器和框架以及底板的结构的图。在图17A中，1701表示底板，1702表示框架，1703表示样品容器。在底板1701上沿着框架1702定位放置样品容器1703。此时，作为样品容器的底面的透明窗与底板接触。作为底板1701的材质，优选使用热传导率高的金属材料。在此，使用热传导率高且加工精度优异的石墨基铝复合材料ACM-io。通过这样的结构，样品容器能够在每次测定时一次性使用，能够避免附着物对容器的清洗、测定的影响，提高用户的便利性。

在本实施方式中，考虑用户的操作性，示出了样品容器具有4个槽孔的组的情况，但样品容器所具有的槽孔的个数是任意的。例如也能够制作将32个槽孔作为1组的容器，能够考虑容器的成本、成品率等而适当地选择组数。

图17B是表示本实施方式的容器与底板之间的关系的示意图。在图中，1701表示底板，1703表示样品容器，1704表示透明窗，1705表示样品，1706表示用于抑制样品的蒸发的密封件，1710表示用于提高基于注射成型的容器的形状精度的空隙，1711表示用于温度稳定化的从样品向底板的热流。

通过本结构，透明窗1704能够与底板1701直接接触。在底板1701设置有与透明窗1704对应的孔，其直径比槽孔的直径大。在本发明的粒子尺寸测定方法中，若样品的温度与测定装置的温度存在差异，则产生由对流引起的粒子的流动，测定精度降低。在本实施方式中，作为透明窗1704，使用相对于塑料材料热传导率高的玻璃材料，进而通过使透明窗1704与金属制且热传导率高的底板1701接触的结构，能够在短时间内使样品的温度与装置内的温度相同，能够缩短温度稳定化的等待时间而提高用户的便利性。发明人通过实验确认的用于温度稳定化的等待时间与专利文献2中记载的样品容器相比，能够从30分钟缩短至10分钟。另外，在本实施方式中，能够通过一次操作连续地实施96个样品的测定。在对各样品重复10次上述标准测定的条件下完成96个样品的测定所需的时间为约4.8个小时。

如实施方式1所述，在本发明中，使用样品容器的透明窗作为光学系统的一部分来测定溶剂的折射率。在上述实施方式中，公开了在装置出厂时预先存储成为基准的信号的方法。另一方面，已知作为光源的半导体激光器由于长时间的使用而量子效率降低，并且发光波长分布根据温度而变化也是已知的。进而，也有由于在物镜的表面附着灰尘等而透射率下降、检测信号的大小变小的情况。在这种情况下，如果将装置出厂时预先存储的信号电平用作基准值，则折射率的测定误差变大。

图18A是表示作为溶剂的折射率的测定基准优选的容器的结构的示意图。图18A表示使用了代替样品而密封了洁净室用的纯水或已知折射率的紫外线或热固化树脂(基准样品)的样品容器的基准信号的测定方法。在透明窗与纯水或紫外线固化树脂、热固化树脂的界面定位激光的焦点，将参照光反射镜的位置调整为光路长度相等后，取得基准信号，由此能够得到式2～式4中所需的基准信号。

图18B是与实施方式1同样地表示作为对象的样品的溶剂的测定情况的示意图。通过如本实施方式那样使用密封有已知的折射率的物质的样品容器，能够使用式4将上述的半导体激光器的量子效率的变化、附着于物镜的灰尘等的影响作为共同项而排除，能够高精度地保持本发明的溶剂的折射率的测定精度。这样的容器可以在用户需要时设置于上述的框架，也可以预先固定于装置内的特定的部位。作为密封的材料，在纯水的情况下，具有用户容易根据需要准备的优点。另外，在密封UV固化树脂、热固化树脂的情况下，具有没有液量、蒸发等的影响，操作容易，用户的便利性提高的优点。

＜实施方式4：粒子测量装置＞

图19是本发明的实施方式4的粒子测量装置的结构图的1例。从由控制高频叠加、射出功率的激光驱动器101控制了发光状态的光源100射出的激光通过准直透镜102变换为平行光，通过光学轴相对于水平方向设定为约22.5度的λ/2板103调整偏振方位后，通过偏振分束器104分离为信号光和参照光。

参照光通过λ/4板105变换为圆偏振状态后，被参照光反射镜106反射，通过λ/4板105成为偏振光相对于去路旋转了90度的偏振光状态，被偏振分束器104反射。信号光通过XY方向的复合偏转元件107偏转行进方向后，通过内置的λ/4板的作用变换为圆偏振状态，通过物镜108在样品204内聚焦。使样品在Z轴方向上移动的驱动机构109具有沿着Z轴方向(光轴方向)扫描信号光的焦点位置的功能。从样品204反射的信号光的成分通过XY方向的复合偏转元件107向与去路相同的方向偏转，并且通过内置的λ/4板的作用，成为圆、与去路相比偏振光旋转了90度的偏振光状态，透过偏振分束器104。在此，样品容器200在槽孔内保持样品204，并且经由透明窗202将信号光引导至样品内。203是形成样品容器的槽孔的树脂部件。底板201与透明窗202接触，机械地保持样品容器200，并且承担样品的温度的稳定化。

信号光和参照光被偏振分束器104合波，被引导至检测光学系统112，经由针孔111被半分束器113分支为透射光和反射光。

反射光在通过光学轴相对于水平方向设定为约45度的λ/4板114后，被聚光透镜115聚光，并且通过偏振分束器116分支为2路，分别通过光检测器150、151进行光电变换，通过电流差动放大器152进行差动放大，成为检测信号123。

透射光透射光学轴相对于水平方向设定为约22.5度的λ/2板118后，被聚光透镜119聚光，并且通过偏振分束器120被分支为2路，分别通过光检测器153、154进行光电转换，通过电流差动放大器155进行差动放大，成为检测信号122。

这里所示的检测光学系统112构成零差相位分集法，检测信号122和123分别是(式8)(式9)所示的检测信号的实数部和虚数部。检测信号的大小作为根据它们计算出的绝对值，由信号处理部124处理。显示部125显示信号处理部124的计算结果并提示给用户。信号处理部124通过实施在以上的实施方式中说明的方法(例如图6～图7的流程图)，计算溶剂的折射率、粒子的折射率、粒子尺寸等。除此之外，信号处理部124还控制粒子测量装置所具备的各部。

使用本装置对图17A所示的多个样品容器的阵列实施连续自动测定，作为驱动机构109的功能，不仅是Z方向，通过附加X、Y方向的样品移动功能也能够容易地实现。

＜实施方式5：尺寸分布测定中的焦点位置的移动方法＞

如实施方式1所示，根据本发明，为了测定粒子尺寸分布，需要一边在样品内沿Z方向移动焦点位置一边取得检测信号。此时，使样品容器在Z方向上移动的同时取得检测信号，在将光学系统的光路长度条件保持为一定的意义上是优选的。另一方面，即使固定样品容器的位置，一边使光学系统整体移动一边实施测量，将光学系统的光路长度条件保持为一定的效果也是同样的，但与样品容器相比，光学系统整体的重量和体积非常大，因此从消耗电力、装置的小型化的观点来看不能说是优选的。但是，如果透过物镜的光的功率变动等在一定的基准内，则能够不使光学系统整体，而仅使物镜向样品的方向移动来测定粒子尺寸分布。在本发明的实施方式5中，说明其具体例。除了代替样品容器而移动物镜这一点以外，与以上的实施方式相同。

图20A和图20B示意性地表示一边使样品容器在Z方向上移动一边取得检测信号的本发明的粒子尺寸分布测定方法。图20A是表示焦点位置位于开始点的情况的示意图。图20B是表示焦点位置位于结束点的情况的示意图。在图中，Δz表示两者的样品容器的位置的差异。如上所述，可知Δz优选为50μm～100μm。样品容器的移动由未图示的Z工作台控制。

图21A和图21B示意地表示一边使物镜在Z方向上移动一边取得检测信号的本发明的粒子尺寸分布测定方法。图21A是表示焦点位置位于开始点的情况的示意图。图21B是表示焦点位置位于结束点的情况的示意图。在图中，Δz表示两者的物镜的位置的差异。物镜的移动由物镜驱动部2101(例如，相当于扫描Z工作台、物镜的位置的“扫描部”)控制。在本图的结构中，在测定中样品容器的位置不动，因此具有抑制由惯性力以及来自工作台的振动的传播引起的样品液面的振动的优点。另一方面，由于追加了移动物镜的Z工作台，因此存在装置结构变得复杂的缺点。由于尺寸分布测定时的物镜的移动量为50μm～100μm左右，所以如果将光束直径设为5mm左右，则即使是用电流镜扫描焦点位置的方法，只要是一般的光学技术人员就容易以透过物镜的光的功率变动充分变小的方式构成光学系统。物镜的重量相对于光学系统整体足够小，因此该方式的消耗电力与移动样品容器的方式相同。

如以上说明的那样，本发明的方法在移动样品容器的方式和移动物镜的方式中都能够应用。

＜实施方式6：样品容器＞

图22A是表示将本发明的实施方式6的样品容器相对于本发明的粒子测量装置安装/拆卸的情况下的情形的示意图。图中，1701是底板，1702是框架，1703是样品容器。在此，底板1701和框架1702安装并固定于粒子测量装置，形成样品架。通过这样的结构，能够将样品容器1703安装于样品架并卸下。用户不进行分注样品的槽孔的清洗、异物管理，就能够一次性使用样品容器，能够进行迅速且稳定的测量。另外，在将本样品容器全部安装在样品架上的情况下，成为与上述的微孔板的96槽孔规格(127.76mm宽×85.48mm深)相同的尺寸。同时，槽孔之间的间距与该规格(9mm)相同。由此，能够提供保管库的共同利用等用户便利性。

图22B是表示将本发明的样品容器安装于粒子测量装置的情况下的情形的截面图。图中，1701是底板，1702是框架，1703是样品容器，1704是透明窗，1705是样品，108是物镜。在本发明中，需要经由透明窗对样品容器照射从物镜射出的光。因此，样品容器需要在收容于支架的状态下，以槽孔不妨碍测量的方式定位。本发明为了使其成为可能而在构造上下工夫。如图所示，槽孔在XY方向的定位通过框架1702和样品容器1703的外形的尺寸精度来实现。两者的间隙优选为30～300μm左右。槽孔在Z方向的定位通过使透明窗1704与底板1701接触来实现。

本实施方式的样品容器内置有4个槽孔。与内置1个槽孔的样品容器相比，能够将容器在XY方向的宽度设为约17.5mm，将高度设为约11mm，在尺寸上容易用手捏住，在分注时不会自立而翻倒，因此能够提高用户的作业性。另外，通过将本发明的容器的宽度设为上述微孔板的96槽孔标准的槽孔间距9mm的2倍(18mm)以下，能够不重叠地配置96槽孔。

＜关于本发明的变形例＞

本发明不限于上述实施方式，包括各种变形例。例如，上述的实施方式是为了容易理解地说明本发明而详细地说明的实施方式，并不限定于必须具备所说明的全部结构。另外，能够将某实施方式的结构的一部分置换为其他实施方式的结构，另外，也能够对某实施方式的结构添加其他实施方式的结构。另外，关于各实施方式的结构的一部分，能够进行其他结构的追加、删除、置换。

在以上的实施方式中，将构成透明窗的部件(例如202、1704)例示为配置于形成槽孔的部件(例如203、1703)的下方的1个板状的部件，但形成透明窗的部件的构造不限于此。只要通过至少在与槽孔内的样品之间形成透射光的区域，能够作为透明窗发挥作用即可。并且，构成透明窗的部件既可以构成为样品容器的一部分，也可以构成为通过安装于样品容器而形成透明窗的部件。

符号说明

100：光源、

101：激光驱动器、

108：物镜、

109：驱动机构、

112：检测光学系统、

124：信号处理部、

200：样品容器、

201：底板、

202：透明窗、

203：形成槽孔的树脂部件。

Claims (15)

1.一种粒子测量装置，其测量在包含溶剂和粒子的样品内悬浮的所述粒子的尺寸，其特征在于，

所述粒子测量装置具备：

光源，其射出光；

物镜，其对所述样品照射所述光；

扫描部，其沿着所述光的光轴方向扫描所述样品的位置和所述物镜的位置中的至少任一个；

检测部，其检测从所述样品反射的所述光的强度；以及

运算部，其基于所述强度和所述溶剂的折射率来计算所述粒子的尺寸，

所述光源经由透光窗对与所述透光窗接触的所述样品照射所述光，

所述运算部在所述扫描部扫描所述样品的位置或所述物镜的位置的过程中确定所述强度的峰值，由此确定所述透光窗与所述样品之间的沿着所述光轴方向的边界位置，

所述运算部根据将所述透光窗与所述样品之间的沿着所述光轴方向的边界位置作为所述物镜的焦点来照射所述光而反射的所述光的第一强度、将所述透光窗和具有已知的折射率的已知样品之间的沿着所述光轴方向的边界位置作为所述物镜的焦点来照射所述光而反射的所述光的第二强度、所述溶剂的折射率、所述已知样品的折射率、所述透光窗的折射率之间的关系，来计算所述溶剂的折射率。

2.根据权利要求1所述的粒子测量装置，其特征在于，

所述扫描部在所述运算部取得所述溶剂的折射率之后，使所述光的焦点移动到所述样品内，

所述运算部取得记述了所述溶剂的折射率、所述粒子的尺寸以及所述第一强度之间的关系的数据，

所述运算部使用所述溶剂的折射率和所述光的焦点位于所述样品内时的所述第一强度来参照所述数据，由此计算所述粒子的尺寸。

3.根据权利要求1所述的粒子测量装置，其特征在于，

所述运算部通过重复在所述扫描部扫描所述样品的位置或所述物镜的位置的过程中确定所述强度的峰值来计算所述边界位置的候选，

所述运算部计算在所述重复的过程中计算出的所述候选与其上次值之间的差分，

所述运算部采用所述差分达到小于阈值的时间点的所述候选作为所述边界位置。

4.根据权利要求1所述的粒子测量装置，其特征在于，

所述粒子测量装置还具备：

光分支部，其将所述光源射出的所述光分支为测定光和参照光；

光照射部，其将所述测定光会聚并照射至所述样品；

光路长度调整部，其调整所述参照光的光路长度；

干涉光学系统，其将所述测定光从所述样品反射而产生的信号光与所述参照光合波来生成干涉光；以及

光检测部，其检测所述干涉光，

所述运算部通过控制所述光路长度调整部来调整所述光路长度，使得针对所述光的每个焦点位置所述干涉光成为最大强度，

所述运算部使用得到所述最大强度的所述光路长度来计算所述粒子的尺寸。

5.根据权利要求4所述的粒子测量装置，其特征在于，

在所述扫描部沿着所述光轴方向使所述样品的位置朝向所述光照射部移动dz或者使所述物镜的位置朝向所述样品移动dz时，所述光路长度调整部使所述参照光的光路长度增加dr，

dr＝α(n²-1)dz，

n是所述样品的折射率，

α是0.8至1.2的常数。

6.根据权利要求4所述的粒子测量装置，其特征在于，

所述运算部使用所述光检测部检测出的所述干涉光的信号值、所述粒子的尺寸、所述测定光的电场振幅、所述参照光的电场振幅、所述溶剂的折射率、所述光的相干长度、所述信号光与所述参照光之间的光路长度差，来计算所述粒子的折射率。

7.根据权利要求4所述的粒子测量装置，其特征在于，

所述运算部针对具有互不相同的折射率的所述溶剂分别取得所述光检测部检测出的所述干涉光的信号值、所述测定光的电场振幅、所述参照光的电场振幅、所述溶剂的折射率、所述光的相干长度、所述信号光与所述参照光之间的光路长度差的组合，

所述运算部使用各所述组合来计算所述粒子的尺寸和所述粒子的折射率。

8.根据权利要求1所述的粒子测量装置，其特征在于，

所述粒子测量装置还具备样品容器，

所述样品容器具备收容所述样品的槽孔，

所述样品容器还具有从所述槽孔的侧壁朝向所述槽孔的外侧突出的狭窄部，

与所述样品容器的高度方向垂直的平面上的所述狭窄部的截面积小于所述平面上的所述槽孔的截面积。

9.一种粒子测量方法，测量在包含溶剂和粒子的样品内悬浮的所述粒子的尺寸，其特征在于，

所述粒子测量方法具有如下步骤：

通过物镜经由透光窗对与所述透光窗接触的所述样品照射从光源射出的光；

沿着所述光的光轴方向扫描所述样品的位置和所述物镜的位置中的至少任一个；

检测从所述样品反射的所述光的强度；以及

基于所述强度和所述溶剂的折射率来计算所述粒子的尺寸，

在计算所述粒子的尺寸的步骤中，在通过所述扫描的步骤扫描所述样品的位置或所述物镜的位置的过程中确定所述强度的峰值，由此确定所述透光窗与所述样品之间的沿着所述光轴方向的边界位置，

在计算所述粒子的尺寸的步骤中，根据将所述透光窗与所述样品之间的沿着所述光轴方向的边界位置作为所述物镜的焦点来照射所述光而反射的所述光的第一强度、将所述透光窗和具有已知的折射率的已知样品之间的沿着所述光轴方向的边界位置作为所述物镜的焦点来照射所述光而反射的所述光的第二强度、所述溶剂的折射率、所述已知样品的折射率、所述透光窗的折射率之间的关系，来计算所述溶剂的折射率。

10.根据权利要求9所述的粒子测量方法，其特征在于，

所述样品保持在具备收容所述样品的槽孔的样品容器内，

所述样品容器还具有从所述槽孔的侧壁朝向所述槽孔的外侧突出的狭窄部，

与所述样品容器的高度方向垂直的平面上的所述狭窄部的截面积小于所述平面上的所述槽孔的截面积。

11.根据权利要求10所述的粒子测量方法，其特征在于，

所述槽孔的内径为3.5mm～4.0mm的范围。

12.根据权利要求9所述的粒子测量方法，其特征在于，

所述透光窗作为收纳所述样品的样品容器的一部分或者由能够安装于所述样品容器的部件构成，

所述透光窗的最大厚度与最小厚度之间的差值为70μm以下。

13.根据权利要求9所述的粒子测量方法，其特征在于，

所述样品保持在具备收容所述样品的槽孔的样品容器内，

所述样品容器构成为经由形成有所述透光窗的框架与金属制的底板接触，

所述底板具有与所述透光窗相对的孔，

所述孔的开口尺寸大于所述透光窗的开口尺寸。

14.根据权利要求9所述的粒子测量方法，其特征在于，

所述粒子测量方法还使用与所述样品分开设置的折射率已知的基准样品来测量所述溶剂的折射率。

15.一种样品容器，其能够相对于样品架装卸，将样品保持在形成于内部的槽孔内，所述样品架由设置于尺寸测量装置的框架和金属制的底板形成，所述尺寸测量装置对包含溶剂和粒子的所述样品照射光，测量悬浮于所述溶剂中的所述粒子的尺寸，其特征在于，

所述样品容器具备以下形状特征：

提供通过插入到所述框架来进行与所述光的光轴正交的2个方向的定位，通过与所述底板接触来进行所述光的光轴方向的定位的定位功能；

通过设置于所述底板的孔和配置于所述样品容器的底部的透明部件，提供形成能够向所述样品照射所述光的透光窗的功能；

通过将所述槽孔的内径设为3.5mm～4.0mm的范围，将所述样品的使用量设为20μL左右，提供将样品的消耗量抑制得较少的功能；

通过形成4个以上的所述槽孔，提供使分注时、装卸时的处理变得容易的功能；

所述槽孔具有2个以上4个以下的从侧壁向外侧突出的狭窄部，在与所述光的光轴正交的平面内，所述狭窄部的截面积比所述槽孔的截面积小，由此提供降低在所述样品内产生的气泡的影响的功能；以及

将所述透明部件的厚度的最大值与最小值之差设为70μm以下的范围，来提供能够利用所述尺寸测量装置测定所述溶剂的折射率的功能。