CN1179794A - 检测dna损伤、测定dna修复速度和监测dna修复酶活性 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种经改进,用少于50ng样品DNA检测和定量分析大片段双链DNA模板中DNA损伤的方法。本发明可用于在病人体内定量基因特异性的DNA损伤,测定DNA修复速度,以及监测抗癌治疗的效果。此外,本发明还可以用于检测和评价由诱变性环境危险场所造成的风险性,以及监测危险性场所的动力学,本发明还包括一用于实现上述目的的设备。

Description

检测DNA损伤，测定DNA修复速度和 监测DNA修复酶活性

技术领域

本发明涉及分子生物学及生物化学领域。更具体地说，本发明涉及在动物体内或细胞培养物内检测和定量DNA损伤，用于测定DNA损伤的动力学，包括损伤发生和DNA修复酶修复的速度，还用于检测和评价环境中的基因毒性风险。

技术背景

用会损伤DNA的外源性和内源性基因毒性试剂连续轰击生物体。这样的DNA损伤如果不加修复会导致细胞死亡，体细胞突变或细胞转化，这些在生物体水平上会导致癌症，衰老和免疫衰弱。现在已有大量证据表明，在整个基因组中，特异性DNA损伤的修复并不同等程度地发生。例如，已经证明转录活跃区的DAN其修复效率高于不活跃区的DNA。这种基因特异性的修复主要是由于对活跃表达的基因其转录链的快速修复(Mellon等，1987；Mellon和Hanawalt，1989；Smerdon和Thoma，1990)，而结果可能导致修复缓慢的非转录链内突变的积累(Chandrasekhar和Van Houten，1994)。

最早，利用基于Southern杂交的实验鉴定出转录活跃的基因中DNA损伤的优选修复，该实验使用特异性地在嘧啶二聚体位置切割DNA的T4内切酶V(Bohr和Okumoto，1988)。虽然该方法被证明在鉴定和研究基因特异性修复中有用，但它的严重缺陷在于需要损伤特异性内切酶在受损的核苷酸附近切断DNA。其它缺点还包括：

-需要比较大量的起始样品DNA；

-在目标DNA区域两侧需要有特异性限制位点。

测定特异性基因组DNA区域中DNA损伤和修复的另一方法是Govan等(Govan等，1990)Taq酶和聚合酶链反应(PCR)。该方法基于，许多DNA损伤会抑制Taq DNA酶，由此造成扩增产物的减少。但是，Govan等的方法并不十分有效，因为被扩增的DNA片段被限制得很小-小于450bp。此后，这类实验的灵敏度被提高至约2至3kb的DNA片段(Jennerwein和Eastman，1991；Kalinowaski等，1992)。目前，对细菌和哺乳动物细胞特异性基因序列内DNA损伤的检测限于定量334bp至3.2kb的扩增产物。

现有技术扩增实验灵敏度的限制

目前的PCR方法不能够有效检测与生物或环境相关剂量的基因毒剂接触，包括离子化辐射造成的DNA损伤。虽然目前用于检测DNA损伤的PCR试验在高损伤剂浓度时似乎是有用的，但在生物相关剂量时的灵敏度过低，所以不能可靠地用于精确检测人体中的DNA损伤和测定DNA修复速度。这是现有技术中的一个主要问题。为了满足这一方面的要求，必须将DNA损伤检测实验的灵敏度从现在的约单个损伤/104核苷酸提高至单个损伤/105核苷酸。

定义

扩增产物-在扩增过程后检测到的，模板的非损伤的互补DNA链的复制产物。

DNA损伤-DNA碱基或糖部分的修饰，造成损伤位置DNA序列复制的中断。

基因特异性-涉及的DNA与某已知基因有关。

基因毒素、基因毒剂-各种直接或间接损伤DNA的试剂。其中包括天然生成于细胞内的化合物，或直接来源于环境的化合物，或与环境中某物质接触(例如其它化合物或离子化辐射)后间接产生的化合物。也可称为诱变剂。

定量长链DNA扩增-长链DNA模板(＞5,000bp)的扩增，基本上只产生代表起始模板样品完好(无损伤的)互补链的扩增产物。

模板-双链DNA，在各自的互补DNA链上至少有一个特异性引物位点，它们在完好的模板上相距至少5,000碱基对。

本发明概述

本发明在多个重要方面对本领域的现有技术进行了拓展：1)确定了成功完成长链DNA，即大于5,000碱基对的DNA定量扩增的必需条件；2)改善DNA损伤检测的灵敏度；3)使与生物相关量的基因毒剂接触包括离子化辐射后测定DNA修复速度成为可能；4)提供了在基因水平检测环境危险性和监测与基因毒剂接触的方法。此外，本发明不需要损伤特异性内切酶，能够同时得到多个基因修复的信息，提高了本领域的研究能力，能够定量DNA扩增产物并能够鉴定出10⁵个DNA核苷酸中的单个损伤。

本发明的另一个优点在于与目前基于Southern杂交的方法相比，检测基因特异性DNA损伤所需的起始样品明显较少，而灵敏度提高了约50至100倍或者更高，因为本发明只需要少至5ηg至约15ηg起始双链DNA模板样品。

本发明的另外一个优点在于在同一定量扩增反应中测试多个模板样品，这允许在反应过程中使用内部对照以及同时处理多份不同的模板样品。

本发明涉及检测双链DNA模板中DNA损伤的方法，这是通过使模板中的互补链各具有一个链特异性引物位点，它们在双链DNA模板中至少相距5,000碱基对；将混合的DNA模板互补链与互补链上各自链特异性引物位点的引物混合；对此混合物进行定量长链DNA扩增以生成扩增产物；在扩增产物中检测模板样品中双链DNA的损伤DNA。该方法的一项内容是双链DNA模板是基因组DNA的基因特异性序列，该方法将检测出基因特异性DNA损伤。本发明的另一方面内容是定量DNA损伤，原始模板样品中损伤DNA的相对量与反应产生的扩增反应产物量成反比。

本发明还包括测定活性生物体或组织培养细胞中DNA修复速度的方法，这是通过在不同时刻从系统中提取双链DNA模板样品分别进行处理；定量每份样品的DNA扩增反应量；利用DNA扩增量的改变确定一段时间后DNA损伤的程度，由此评估该系统中DNA修复的速度。

本发明包括判断抗肿瘤疗法在病人体内效用的方法，这是通过至少在两个不同时刻测定病人DNA修复速度，然后比较各次的修复速度以评估修复速度随时间进程的动力学，由此判断疗法在病人体内的效用。

可将本发明视为包括了一个通过在基因水平检测环境基因毒剂作用来检测其存在性的设备。这一点可如下完成，取至少两份双链DNA模板样品，其中至少一份与环境接触(测试样品)，至少一份被保护不与环境接触(对照样品)。该设备的另一项内容是一种与人体连接的个体DNA诱变剂接触剂量计及相连装置。另外包括监测个体在一段间期内与DNA诱变剂的接触，即通过间隔一段时间将剂量计与个体连接，然后运行设备监测DNA损伤的方法。由此可监测个体与基因毒素或DNA诱变剂的接触。

本发明还涉及环境中基因毒素(诱变剂)存在的方法，即通过将设备在环境中放置一段时间，这段时间可有效地使环境测试样品受到存在的任何基因毒素的诱变作用；处理设备中的DNA样品以检测DNA损伤；将对照和环境实验样品中的DNA损伤进行比较，由此检测环境中基因毒素的存在。本发明这一目的的另一方面是通过使用设备和比较对照样品和测试样品中的DNA损伤量来评估受环境中诱变危险引起的风险程度的方法。

本发明的另一方面内容是测绘环境性诱变危险场所的方法，即通过将本发明设备在该场所不同的测绘位置放置有效长度的时间；处理设备中的模板DNA样品；在图中标示出测绘位置DNA损伤检测结果，由此形成该场所的诱变危险图。更具体地说，这方面的内容包括定量测绘环境性诱变危险场所的方法，即通过测定各测绘位置DNA损伤的量；在图上标示出测绘位置的DNA损伤量，由此形成该场所的定量环境性诱变危险图。

可如下评价由化疗剂顺氯氨铂引起DNA损伤：由接受顺氯氨铂治疗的病人获取第一DNA模板样品，将该样品的一部分与一定量的氰化物离子反应，置换出DNA中的顺氯氨铂加成物，生成第二DNA模板。利用间隔至少5,000碱基对的引物进行定量聚合酶链反应时，氰化物反应过的顺氯氨铂DNA或第二DNA模板其扩增比保留顺氯氨铂的第一DNA模板多。通过比较第一和第二DNA模板的扩增率，就可以评估出由顺氯氨铂引起的DNA损伤。置换顺氯氨铂的氰化物有效量是约1M。优选使用的氰化物盐是氰化钾，反应可在室温下通宵进行。通宵孵育氰化物反应的物质后，例如通过透析去除所有过量的氰化物和顺氯氨铂和/或顺氯氨铂-氰化物加成物。本发明示范了使用微量，例如1至30ηg DNA样品和间隔至少5,000碱基对的预备链反应引物评价各种不同情况的DNA损伤。通过对暴露于基因毒性素危险场所不同位置的DNA样品实施本发明，甚至可以对该场所进行测绘。在一种实施方式中，可使用个人DNA基因毒素接触剂量计，其中包含具有间隔至少5,000碱基对的引物位置的两份双链DNA样品。其中一份样品是可与环境接触的，在使用时，其与环境接触方式使得潜在的基因毒素能与包含的DNA模板反应。一份样品是与环境密封隔离的，但由个体携带作为对照。在与环境接触后，可根据本发明进行定量长链聚合酶链反应来评价接触后样品中DNA损伤。此外，可能发生某些类型的DNA损伤，它们并不抑制聚合酶链反应的扩增。本发明包括至少在部分这类情况中，例如，在形成了8-氧-脱氧鸟苷或甲酰氨基嘧啶时定量DNA损伤的方法。这涉及将这类损伤位点转换成抑制DNA扩增的DNA链断裂。

本发明还可用于监测由自身诱导的基因毒素接触，例如吸烟、日光浴或衰老过程引起的基因损伤。当然，这需要对照DNA样品以进行扩增比较。这些用于一般DNA损伤抑制扩增反应的对照样品需要个体的接触前DNA。可如下获得不抑制扩增的DNA损伤的对照，即将这类DNA损伤位点转换成DNA链断裂，正如本文中为了评价与8-氧-脱氧鸟苷或甲酰氨基嘧啶有关的损伤所述。

虽然以上叙述了大量的本发明目的和优点，对本领域熟练技术人员来说，根据本发明所述，显然应将其它目的和优点理解为在本发明的范围和精神之内。

附图说明

图1.使用定量长链DNA扩增反应在同时含有损伤和非损伤模板的模板样品中检测双链DNA的DNA损伤的图示。

图1A.DNA损伤量一定时，相对片段大小的理论扩增量(左轴)和损伤频率(右轴)(10J/m²UV对扩增的作用)。

图2.人次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因座(hprt)的长链DNA扩增片段。

图3.长链DNA模板的扩增：产生自hprt基因的片段，泳道2-4和9中分别为2.7kb，6.2kb，10.4kb和15.4kb；产生自β球蛋白基因的片段，泳道5和8中为13.5kb，泳道7和11中为17.7kb，12泳道中为24kb；泳道6和10中为完整的16.2kb人线粒体基因组。M1是1KB梯级标准物，M2是λ噬菌体/Hind III标准物。

图4.实施例2结果的表格，显示增加模板长度时，相对扩增产物比(Rel.Amp)和损伤频率。

图5A.对于15.4kb的人hprt片段，循环次数对扩增产物量的作用。

图5B.对于17.7kb的人β球蛋白片段，循环次数对扩增产物量的作用。

图5C.循环27次时，17.7kb片段的相对扩增比与模板浓度0至30ηg的函数关系。

图6.本发明的实施中，UV损伤的人基因组模板(用10J/m²的UVC照射)和非损伤基因组DNA扩增反应产物经溴乙锭染色的凝胶。

图7.10J/m²的UV光对不同大小DNA模板相对扩增比的作用。2.7kb，15.4kb和17.7kb条线的误差是分别三次长链DNA扩增反应的平均值±标准偏差(S.E.)，每次反应定量两次(总n＝6)。

图8A和图8B.UV光对15.4kb的人hprt基因组DNA模板相对扩增比的作用(图8A)和由此产生的损伤频率(图8B)。

图8C和图8D.UV光对17.7kb的人β球蛋白基因组DNA模板相对扩增比的作用(图8C)和由此产生的损伤频率(图8D)。

图9.增加模板的长度和与DNA损伤试剂接触时的相对扩增产物比(Rel.Amp)和损伤频率。

图10.正常细胞和修复缺陷型细胞(XPA)中的UV修复动力学。

图11A和11B.DNA修复动力学。图11A是在经转化的人成纤维细胞内(■＝无活性的β-球蛋白；●＝hprt；--＝转录链的修复速度)。图11B是在正常供体CM01989B的成淋巴细胞内；GM02344A来自A型着色性干皮病的病人；P2是来自结肠癌病人的成淋巴细胞系，在错配矫正基因hPMS2上有纯合突变；P8是来自在错配矫正基因hMSH2上有杂合突变的病人的成淋巴细胞系；P7是表观正常的成淋巴细胞系。

图12A和12B.在线粒体DNA和人成纤维细胞核基因内由过氧化氢诱导的DNA损伤的形成。图12A显示作为过氧化氢浓度的函数的相对扩增比。图12B显示损伤频率。

图13.氧化性DNA损伤的修复动力学。柱状图显示在用过氧化氢处理后，作为时间的函数，β-球蛋白基因和线粒体基因组内的相对损伤。

图14.人成纤维细胞内葡萄糖氧化酶诱导的DNA损伤。图中显示β-球蛋白基因和线粒体基因组内的损伤频率。

图15.人血管细胞原代培养物中的氧化性DNA损伤。图中显示线粒体DNA对β-球蛋白DNA的相对扩增。

图16.使用FPG和QPCR检测8-氧-脱氧鸟苷加成物。柱状图显示未处理和用吖啶橙(AO)加上白光处理的人细胞内的8-oxoG水平。

图17A和17B.人细胞内顺氯氨铂DNA加成物的修复动力学。柱状图显示用150mM顺氯氨铂处理后2小时的相对扩增。实心柱是未损伤对照的相对扩增。(图17A＝β-球蛋白；图1B＝hprt)。

图18A和18B.检测人细胞内的环氧苯并[a]芘二醇DNA加成物损伤。人细胞用环氧苯并[a]芘二醇(BPD)处理1小时，将DNA用于线粒体、hprt或β-球蛋白片段的扩增。图18A显示相对扩增比，图18B显示每10kb的损伤数。

附图并未完全按比例绘制，为了表达的清晰和准确，本发明的某些特征在比例上可能被放大了或者以图表的形式加以表示。对本领域熟练技术人员来说显而易见的是，在本发明的范围和精神内，可对在此公开的发明进行多种取代和修改。

详细说明

本发明包括在双链DNA模板样品中检测DNA损伤的方法(参见图1)。在较好的实施例中，本发明的方法至少使用了两份双链DNA模板样品，通常，一份对照样品和一份测试样品。对照样品可以是未受DNA损伤的测试样品的复制产物，或者是与之不同的另一份测试样品。操作中，双链DNA模板测试样品取自被研究的系统。被研究系统可以是体外系统，例如细胞或组织培养物，或体内系统，例如病人，或者是环境系统，例如充满了化学试剂的场所。对模板的选择使得互补链各自具有一个链特异性的引物位点，而且引物位点在完好的模板DNA上相距至少5,000碱基对。使用纯化的DNA，该方法已被用于扩增30,000碱基对的DNA模板。由技术人员来选择是否使用纯化的DNA。例如，若是取自生物系统，染色质而不是纯化DNA就可以达到技术人员的目的，但在化学系统(例如剂量计)中，纯化的DNA使用较方便。如果该方法使用的DNA模板代表了一段基因特异性DNA序列，那么该方法检测的将是基因特异性DNA损伤。该方法所必需的双链DNA模板量约为50ηg或更少的人基因组DNA(相当于约10,000个细胞)，起始模板DNA的下限是约5ηg至15ηg。

将模板样品或其互补链加在合适的混合物中，其中含有过量的链特异性引物位点的引物。然后对混合物进行定量长链DNA扩增反应，以生成扩增产物。扩增产物基本上仅代表了各非损伤链。任何损伤链基本上都不扩增，所以其扩增产物的含量可忽略不计，而且不会表现在标准凝胶分析中。

典型的反应条件是各50pmol引物，200μM dNTP，1.5mM MgCl₂，50mM Tris-Cl，pH8.0，2.5单位扩增Taq酶和50ng纯化的人细胞DNA，反应体积为50μ1。扩增反应可在Perkin-Elmer 9600热循环仪上进行，这是专门设计用于定量扩增的。扩增反应为先在94℃变性4分钟，然后进行以下循环30次：在94℃变性30秒，在61℃退火1分钟，在72℃延长2分钟。最后的延长步骤可进行7分钟。

利用本领域熟练技术人员已知的多种方法中任何一种鉴定扩增产物。这类方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳，电化学发光，放射性同位素掺入和放射自显影和Betascope^TM成象(Betagen，Waltham，MA)。

将测试样品扩增产物的鉴定结果与以相同方法处理的相同模板的对照样品扩增产物的相比较，由此检测出测试样品中的DNA损伤。如果测试样品模板的扩增产物少于对照样品，那么测试样品的模板DNA经受了DNA损伤。如果测试样品模板与对照样品模板产生基本上等量的扩增产物，则测试样品没有DNA损伤。无论如何，测试样品模板的扩增产物不应该多于对照样品模板，否则表明实验出了问题。

测试样品模板中的DNA损伤量可以通过将对照模板样品的扩增产物量与测试模板样品的扩增产物量进行比较来定量。这可以利用本领域熟练技术人员已知的多种方法中任何一种来完成。这些方法包括：

A.凝胶电泳和放射性同位素成象

凝胶电泳的基础是在扩增反应过程中，扩增产物中掺入了dCTP-α-[³²P]放射性标记的核苷酸。然后，通过在琼脂糖凝胶中电泳将扩增产物与未被结合的dNTP分离。然后干燥凝胶，用2D-放射性同位素成象系统，例如Betagen(Waltham，Mass)的Betascope 603印迹分析仪测定每一条带中的放射量。该实验极其灵敏，因为通过提高放射性示踪物的量可方便地调节产物的特异活性。

B.高效液相色谱。Katz等(Katz等，1992)，在此参考。

不进行任何后续处理，直接将扩增产物上样在阴离子交换柱上(TSKDEAE-NPR)，用两种缓冲液构成的二元流动相洗脱。防护柱与DEAE柱串联，防止基因组DNA造成的堵塞。梯度程序取决于具体的待分离的扩增产物其大小。用设定在260nm的UV检测仪测定DNA。利用前述标准DNA实验测定扩增产物量。

C.电化学发光(ECL)

ECL是Perkin-Elmer开发的一种新的PCR产物定量实验。开发出了几种不同的格式。在此使用其中一种，即利用适当修饰的PCR引物，在扩增产物的一端用特殊的电化学发光探针(TBR)标记，另一端用生物素标记。用包被链霉亲和素的磁珠捕捉扩增产物，并用可准确测定化学探针的电激发光的特殊仪器，QPCR系统5000(Perkin-Elmer，Norwlk，CT)定量产物。

扩增DNA大片段的能力如图1A所示，提高了灵敏度。最近报道了扩增长链PCR片段的方法(Cheng等，1994)。较大的DNA片段可以提高灵敏度，正如定量的UVC光(10J/m²)对扩增的作用与片段大小的函数关系理论图所示，图中右轴显示所示频率增加。例如，10J/m²的UVC光每2.7kb产生约0.2光产物，扩增量降低至非损伤对照的80％。但是，14kb片段的扩增将降低至非损伤对照的37％(每条链一个阻断损伤)，30kb片段的扩增将降低至非损伤对照的11％。

在另一实施例中，本发明包括通过至少两次在不同时刻从细胞系统中取样双链DNA模板来测定其中DNA修复速度的方法。对两份样品分别进行处理并定量DNA损伤后，测定一段时间内扩增产物量的改变作为DNA的修复速度。

该实施例可用于判断抗癌疗法在病人体内的效用。某种抗癌疗法的效用可通过监测该疗法在病人体内对DNA修复速度的作用来评价。这是通过先从病人体内抽取一组双链DNA模板样品，并如前文所述测定DNA修复速度。然后，在一段合适的时间之后，再从病人体内抽取一组样品，并如前文所述测定DNA修复速度。比较两次取样时间的DNA修复速度，由此判断疗法的效用。使用本发明方法可测得DNA修复速度提高，DNA修复速度降低和/或修复速度稳定。

本发明另一实施例是测定环境性基因毒素作用的设备。该设备包含至少一份双链DNA模板样品作为环境试验样品。在设备中可放置一份或多份其它双链DNA模板样品作为对照样品。试验样品暴露于研究环境中，对照样品不暴露。试验样品的模板DNA放置在被研究环境中的环境因素或试剂可透过的容器内。对照样品放置在隔绝环境的容器内或使之与环境隔离。

使用本发明的设备可检测出环境中基因毒性危险的存在。利用相对于对照样品或其它标准，环境性基因毒素对暴露的试验样品的作用可检测出其存在。如果环境中有引起DNA损伤的足量的基因毒素存在，试验样品将显示出DNA损伤。这是通过将设备在研究环境中暴露足够长的时间，处理设备中的模板DNA样品以检测样品模板中的DNA损伤来完成的。如果扩增产物中的DNA损伤量被定量，将暴露时间后的DNA损伤量与相关的暴露标准或毒性表比较，就可以评估出因暴露于环境中而引起的风险程度。

此外，可就引起DNA损伤的试剂的位置和风险程度对环境性危险场所进行测绘，即通过将本发明的设备在环境中的不同位置放置有效长度的时间，如本文所述处理设备中的模板DNA样品并定量DNA损伤量，然后评价并在该场所的地图上绘制出风险程度。通过定量每个位置的DNA损伤量，而不只是基因毒性作用的存在，可以发展得到对危险性场所更为动态的了解，这对于总体风险评估和该场所的防范和清洁措施规划是有用的。

而且，本发明设备可由一人携带，并用作个人剂量计用于研究于基因毒性作用下暴露一段时间后的影响。

本发明设备的有效暴露时间从离子化照射的几分钟(例如放射治疗)至进行环境场所评估的数月不等。熟练技术人员可根据毒性、试剂的浓度和量，以及其它主要环境条件初步判断必需暴露时间。

需要重申的是，本领域熟练技术人员可以使用其它材料和方法，熟练技术人员的不同选择将受原料来源和技术人员对不同的选择的熟悉程度的影响。根据本公开的内容，熟练技术人员能够根据自己的选择使用相当的材料和方法来

实施本发明。

表1至4概括了后文实施例中使用的不同的扩增产物、损伤试剂、细胞系和修复动力学。

                 表I.本发明研究的扩增产物

       基因           大小(kb)    细胞来源

      有活性

       hprt            15.4           人

     β聚合酶          12.2           人

     β聚合酶          6.2            鼠

      线粒体           16.2           人

      线粒体         16.2(发展中)     鼠

       p53             发展中         人

     无活性

    催产素受体         14.4           人

     β球蛋白          17.7           人

     β球蛋白          8.7            鼠

            表II.使用QPCR检测基因特异性损伤损伤剂                   备注石棉                     产生活性氧；引起间皮瘤环氧苯并[a]芘二醇        一般环境致癌物质苯丁酸氮芥               广泛使用的抗癌药顺氯氨铂                 广泛使用的抗癌药葡萄糖氧化酶             产生过氧化氢过氧化氢(H₂O₂)         活性氧百草枯                   一般除草剂；产生活性氧TPZ(tirapazamine)        加强顺氯氨铂的作用UV                       引起皮肤癌

          表III.利用QPCR检查细胞系

   细胞           来源           损伤剂转化的成纤维细胞     人           UV^a，BPDE^b

                                 顺氯氨铂

                                  氧化剂^c

转化的上皮细胞     人           苯丁酸氮芥转化的间皮瘤细胞     人             石棉

成淋巴细胞         人              UV

原代淋巴细胞       人            UV，TNF-α

原代内皮细胞       人             过氧化氢

转化的内皮细胞     人            苯丁酸氮芥

噬中性粒细胞       鼠              LPS^da，UV＝紫外光，254nmb，BPDE＝环氧苯并[a]芘二醇c，氧化剂＝过氧化氢，葡萄糖氧化酶，百草枯，TPZ(tirapazamine)d，LPS＝脂多糖

          表IV.利用QPCR研究人细胞的修复动力学突变体      细胞类型            损伤剂                备注WT       转化的成纤维细胞         UV       ^*快速修复被转录的基因

                               BPDE      ^*转录基因的损伤更多

                             顺氯氨铂    ^*修复速度比UV损伤慢

                               H₂O₂    各种损伤剂都引起较多的

                           葡萄糖氧化酶  mt DNA，其修复情况WT         转化的间皮瘤细胞      石棉      较差WT            成淋巴细胞           UV      ^*快速修复WT           原代淋巴细胞          UVWT            平滑肌细胞          H₂O₂WT          原代脐静脉细胞        H₂O₂WT            内皮细胞            H₂O₂XPA          成纤维细胞            UV      ^*修复不完全XPA          成淋巴细胞            UV      ^*修复不完全XPC          成淋巴细胞            UV      ^*在非转录基因中修复缓慢PMS2^-(P2)     成淋巴细胞            UV      ^*修复缓慢PMS2^+/-(P7)    成淋巴细胞            UV      ^*修复缓慢

后文的实施例是为了说明本发明的实施，而不是限定本发明的范围。

                           实施例1

                     基因组DNA的分离和消化

基因组DNA的分离

在解冻后的细胞沉淀物中加入(3.0ml/1-5×10⁶细胞)含有200μg蛋白酶K的裂解缓冲液(2％SDS，0.5M NaCl，0.05M EDTA，50mM Tris-HCl，pH7.5)，在37℃孵育过夜。裂解液用PCI萃取两次，用CI萃取一次。将上层水相转移到15ml的高压灭菌的Corex试管中，并加人1/10体积3M乙酸钠和2.5体积100％冷乙醇。在-20℃沉淀DNA 30分钟以上，然后在4℃，8,000rpm离心收集30分钟。用70％的乙醇洗涤沉淀，吹干，然后重悬在TE缓冲液中。

基因组DNA的消化

在DNA中加入3-5单位BamHI/μgDNA，在37℃孵育过夜，然后用PCI萃取两次，用CI萃取一次。然后，用2.5体积100％乙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗涤，重悬在TE缓冲液中。使用Hoechst染料33258染色，利用测荧光法定量DNA浓度。

                           实施例2

                     长链DNA模板的扩增

过去，用PCR扩增的长链DNA据报道是hprt基因上从b到e见图2)的一段2.7kb片段。本实施例描述了来自hprt基因座的2.7kb、6.2kb、10.4kb和15.4kb的DNA片段(见图2)，来自β-球蛋白的17.7kb和24kb片段和完整的16.2kb人线粒体基因组的扩增。这些扩增是使用XLPCR^TM条件(PerkinElmer/Roche)完成的。

图3是溴乙锭染色的琼脂糖凝胶的照片，其中用不同的引物对和特定的XLPCR^TM反应试剂与条件对50ng DNA进行了扩增。具体地说，将50ng DNA加入含有dNTP(200μM)，甘油(8％)，DMSO(2％)，Tricene-乙酸(25mM，pH8.0)，乙酸钾(25mM)，乙酸锰(1mM)和各10pmol引物的混合物中。以90秒预热至75℃后，加入热稳定聚合酶混合物(rTth，1单位，和Vent，rTth＞＞Vent)。在94℃变性1分钟后，反应循环36次：94℃15秒，68℃12分钟。在0.6％琼脂糖凝胶(Bethesda Research Labs)的泳道1至7或在0.4％SeaKem^TM琼脂糖凝胶的泳道8至13中加入等量的10μl反应液。凝胶以100V/13cm电泳4小时。

图3显示了长链DNA模板的扩增反应：来自人hprt基因的2.7kb、6.2kb、10.4kb和15.4kb片段分别在泳道2至4和9；来自β-球蛋白的13.5kb片段在泳道5和8，17.7kb片段在泳道7和11，24kb片段在泳道12；完整的16.2kb的人线粒体基因组在泳道6和10。M1是1KB的梯级标准物，M2是λ噬菌体/HindIII标准物。表4中给出了该实施例的结果。

                        实施例3

                  长链DNA模板的定量扩增

长链DNA模板定量扩增的条件，即使扩增量与加入的模板量成正比的条件，通过检查加入模板量不同的不同扩增反应循环的扩增产物量来确定。图7中显示了由此确定的用于15.4kb hprt片段和17.7kbβ-球蛋白片段定量扩增的条件。

图5A显示了循环次数对15.4kb的人hprt片段其扩增量的作用。图5B显示循环次数对7.7kbβ-球蛋白片段其扩增量的作用。图5C显示17.7kb片段循环27轮的相对扩增比作为模板浓度从0至30ng的函数。

                          实施例4

                    长链DNA模板损伤的检测与定量

用10J/m²的UVC照射纯化的人基因组DNA试验样品不同长度的模板以引起对DNA的损伤。根据本发明的操作处理这些照射后模板试验样品和对应的非照射模板对照样品。通过扩增过程中掺入[α-³²P]-dATP来放射性标记扩增产物。通过琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色和放射自显影术来鉴定每份样品的扩增产物(见图6)。与相应的对照样品比较，测试样品扩增产物的溴乙锭染色较弱，以此作为检测出试验样品模板中有DNA损伤。图6中，使用PhosphorImager^TM和Image Quant^TM(Molecular Dynamics)软件，通过放射性同位素成象力定量DNA损伤。

基本上，只有样品中的非损伤模板参与定量扩增试验。所以，该试验是无损伤模板分子数的大致测定值。这是通过，定量试验样品的扩增产物量(A_D)，将它除以等量的未处理的对照样品的扩增产物量(A_O)。假设损伤为随机分布，对零类分子(即不含损伤的分子)使用Poisson方程[f(x)＝e^-λλ^x/x！]，f(0)＝e^-λ，其中λ＝平均损伤频率，由此可计算出每条基因组链的损伤频率：λ＝-1nA_D/A_O。所以，该试验可测定被研究的基因组片段其两条模板链的每条链的平均损伤频率。

使用零类分子的Poisson表达式，每段DNA片段的损伤频率(L)测定为L＝-1nA_UV/A_O，其中A_UV＝UV损伤后的扩增量，A_O是是无损伤对照的扩增量。为了比较与片段大小相关的相对误差，通过将损伤量除以片段总长将其标定至每1kb。

测定了不同长度模板的相对扩增产物，并表示在图7中。可以看到，该剂量的UV使2.7kb片段的扩增降低了30％，但分别使15.4kb的hprt和17.7kb的球蛋白片段的扩增降低了85％和92％。这些数据与图4中的假设图一致，清楚地表明可使用长链DNA模板来提高检测和定量DNA损伤的灵敏度。

                      实施例5

                       重现性

使用接受不同剂量UV光的细胞的DNA抽提物建立量效曲线，以确定基因特异性试验的重现性和人细胞的UV最低检测剂量(图10)。铺有人细胞的培养皿分别用0、2.5、5、10和20J/m² 254nm紫外光处理，每组一式四份。马上收获DNA，用于两次单独的定量长链DNA扩增反应。每一次扩增反应分析两次。各点代表n＝16+/-标准偏差测定值。如前文所述，由扩增产物的相对减少确定模板的DNA损伤量。如图8A-D所示，2.5 J²/m² 254nm紫外光造成的损伤很容易测得(见表，图9)。而且，测量损伤的精确性为5-10％CV。这些结果证明了低剂量时量效特性的重现性。

                      实施例6

               测量生长活跃的人细胞内的DNA修复

在长链DNA扩增试验中使用来自活性的hprt基因和无活性的β-球蛋白基因的DNA模板来测定生长活跃的人细胞内的DNA修复。将DNA修复缺陷型着色性干皮病(A型)细胞用作比较的外部对照。一式四份的正常人细胞或着色性干皮病(A型)病人的修复缺陷型细胞用10J/m²UV光处理，马上收获或允许其修复8小时。对于正常细胞，收获DNA并用作两次单独的长链DNA扩增试验中。对每次扩增试验的扩增产物进行两次分析。分析结果列于表10，其中的点代表n＝16±S.D.正常细胞测定值。XPA数据代表四份单独的DNA样品进行一次长链DNA扩增的平均值。图10显示，在正常细胞中，活性hprt基因内有明显的修复作用，无活性的β-球蛋白基因内几乎无修复作用。而且，在修复缺陷型XPA细胞中，两种基因内都几乎没有或没有观察到修复作用。

在同一系统中，在两个不同的时刻测定了DNA损伤后，就可测得DNA修复的速度，即在时间间隔内不同时刻扩增产物的相对差别。

不同突变细胞系内的修复动力学。为了证实这种新的QPCR试验的有效性，测定了来自表达的人hprt基因一15.4kb片段内和来自非表达的β-球蛋白基因的17.1kb片段内UV诱导的DAN损伤修复动力学。用UV光(10J/m²)处理人细胞。用QIAampTissue试剂盒(QIAGEN，Inc，Chatsworth，CA)抽提DNA。在该方法中，不使用可能引入大量氧化性DNA损伤的苛刻有机化合物来抽提DNA。简而言之，用生产商提供的含有蛋白酶K的高离液序列缓冲液裂解冷冻细胞沉淀。沉淀DNA并上样在螺旋柱上。用TE缓冲液(10mM Tris-Cl，1mMEDTA)稀释DNA。稀释DNA，并用溴乙锭荧光法测定其精确的浓度。将这些DNA用于QPCR试验中。用Perkin-Elmer提供的XLPCR试剂盒和随试剂盒提供的rTth热稳定性酶扩增长片段。每次反应中都加入[P³²]-α-dATP作为示踪物，在0.6％的垂直琼脂糖凝胶上分离放射性标记过的片段。使用PhosphorImager 425和ImageQuant^TM软件(Molecular Dynamics)定量放射性标记的扩增产物。定量基因毒素处理的样品其扩增量(A_D)，将其除以等量的未处理的对照样品的扩增量(A_O)，由此计算出损伤频率。假设损伤随机分布，对零类分子(即不含损伤的分子)使用Poisson方程[f(x)＝e^-λλ^x/x！]， f(0)＝e^-λ，其中λ＝平均损伤频率，由此可计算出每条基因组链的损伤频率：λ＝-1nA_D/-A_O。

SV40-转化成纤维细胞内，表达的hprt基因(●)和非表达的β球蛋白基因(■)的由10J/m²UV诱导的光产物的修复示于图11A，其中各数据点代表N＝4±SEM。这些数据清楚地表明，非表达的β球蛋白基因(t_1/2＝23.5)其修复速度明显慢于hprt基因(t_1/2＝8.3小时)。虚线是hprt基因转录活性链的计算修复速度(t_1/2＝5.0小时)。还对几种腺病毒转化的人成淋巴细胞系进行了修复动力学分析。其中包括：GM01989B是表观正常的；GM02344来自A型着色性干皮病患者；P2是来自错配矫正基因hPMS2纯合突变病人的成淋巴细胞系；P8是来自错配矫正基因hPMS2杂合突变病人的成淋巴细胞系；P7是表观正常的成淋巴细胞。P2、P7和P8由Isabel Mellon博士(University of Kentucky)的联合实验室提供，她正用嘧啶二聚体特异性基因特异性试验检测这些细胞系的修复动力学。图11B的结果显示了几种不同个体以及不同类型细胞间基因特异性修复的明显差异(为了简便起见，只在图11B中显示了β球蛋白基因内的修复)。注意，与成淋巴细胞系(GM019889B)相比，成纤维细胞的修复较缓慢。XPA细胞系(GM02344A)的修复动力学最慢，这与已公开的XPA细胞系的有关信息一致。同时注意，P7内的修复比错配缺陷系P2快。这些结果与Mellon博士实验室未公开的基因特异性修复动力学一致。

                        实施例7

                    多重DNA损伤检测

              同时分析一个以上模板内的DNA损伤

至于多重定量DNA扩增，在50μl反应体积内含有培养在GeneAmp PCR缓冲液II(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3)的DNA 30至60ng，1.5mMMgCl₂，200μM各种dTNP，2μCidCTP-α-[³²p]，0.05至1.0μM引物，和2.5UAmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer)。在Perkin-Elmer GeneAmp PCR System9600热循环仪中，样品在94℃变性4分钟，然后如下循环13轮：94℃变性15秒，用40秒降温至48℃引物退火30秒，在72℃延长2分钟，在72℃最后延长7分钟。扩增反应后，样品在1％垂直琼脂糖凝胶上电泳，干燥，利用Betascope放射性同位素成像定量(见图3)。

在此实施例中，滴定两对引物的浓度，使得两模板产生的扩增产物基本相等。我们发现，在多重扩增反应中，一种产物的扩增会影响另一种产物的扩增。所以，凭经验得出两对引物的相对量，从而产生基本相等的各种扩增产物。

在多重扩增反应中，为了确保选定的引物以定量方式产生所需大小的产物，必须在所有损伤定量研究前对两个重要参数，即模板浓度和PCR循环次数，进行测定。本质上，扩增产物的合成与模板量和扩增循环次数相关。扩增反应经历三个不同的阶段：1)产物随循环次数指数性增长，2)产物随循环次数数学级数性增长，3)产物量接近引物量，产物不再随循环次数增长或者实际上有所下降。因此，增加循环次数并不一定更有利于定量长链DNA扩增反应，因为本质上，产物量与模板量成正比。所以，所有的长链DNA扩增反应都必须在产物浓度以已知方式增加的条件下进行。通常，18轮扩增循环后，对各种基因来说，两倍的模板并不产生两倍的产物。

对基因特异性试验来说，重要的是扩增产物量随循环次数的增加指数性增加，而且扩增产物量依赖于模板浓度。所以，较好的是，扩增反应进行约13轮PCR(Van Houten等，1993)。

              实施例8.检测人细胞中的氧化性DNA损伤

过氧化氢造成的人成纤维细胞核及线粒体内DNA损伤及其修复。活性氧(ROS)可由多种物理及化学试剂产生，也可通过线粒体内电子传递中的氧释放和其它细胞生化过程内源性地产生。检测了全部人基因组中是否发生由ROS不均一地引起的DNA损伤以及这些损伤是否被修复。人SV40-转化的成纤维细胞(SVNF)用0-400μM H₂O₂处理1小时。用QIAGEN柱抽提出DNA，用于16.2kb线粒体基因片段(●)和17.7kbβ球蛋白基因片段(■)的扩增反应(图12A和12B)。图12A显示扩增量的减少与H₂O₂浓度成函数关系，图12B显示损伤/10kb与H₂O₂浓度成函数关系。与核基因相比，mtDNA内的损伤增加了2至3倍。由于ROS可产生多种DNA损伤，所以有必要检测是何种类型的DNA损伤抑制了这些试验中使用的热稳定性聚合酶(rTth)。单链断裂被认为占ROS引起的全部损伤中的25-50％，由于单链断裂是聚合酶的绝对终点，所以利用定量扩增试验可有效地测出这类损伤。我们还发现，我们能够测出100％的某种主要碱基损伤，胸腺嘧啶二醇(未显示数据)。

图13显示了修复试验得出的数据。用200至400μM过氧化氢(H₂O₂)处理一式三份的SVNF平板1小时。马上收获细胞或允许其修复1.5至3小时。抽提DNA用于16.2kb的线粒体片段(空心柱)和17.7kb的β球蛋白基因片段(阴影柱)的扩增反应。这些数据显示，线粒体DNA遭到的损伤多于核基因，线粒体内的DNA损伤几乎没有得到修复。注意，用H₂O₂处理1小时，然后β球蛋白基因损伤在1.5小时内完全修复。

总之，这些数据清楚地表明，定量扩增反应能够准确地检测出ROS造成的损伤及其修复。线粒体DNA被ROS广泛损伤而且不被修复这一出乎意料的结果表明该细胞器可能是ROS和其它与线粒体反应的化学物质的主要毒理目标。如果mtDNA损伤广泛而且不被修复，这将可能抑制mt基因的转录，这种转录对氧化磷酸化过程中的电子传递是十分重要的。

人成纤维细胞内葡萄糖氧化酶诱导的DNA损伤。虽然用较高剂量的H₂O₂处理细胞有效地造成了DNA损伤，但这可能并不能准确概括体内情况。所以，使用了一种H₂O₂产生系统，即葡萄糖氧化酶(GO)，由此在一段时间内产生低水平的H₂O₂。在该试验中，人SVNF用指定浓度的GO处理一小时，一式三份。用QIAGEN柱抽提DNA，扩增16.2kb线粒体片段(■)和17.7kbβ球蛋白基因片段(●)。利用相对扩增比计算损伤频率(图14；n＝4±S.D.)。这些数据表明mt DNA受到连续低浓度H₂O₂造成的损伤多于细胞核DNA。

人血管细胞原代培养物内的氧化性DNA损伤。在与Runge博士与Boor博士的合作中，开始了一系列试验人血管细胞的试验。在这些试验中，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)用不同浓度的H₂O₂处理1小时(图15)。抽提DNA用于17.7kbβ球蛋白片段(空心柱)和16.2kb线粒体片段(阴影柱)的QPCR。这些数据表明，与转化的成纤维细胞一样，血管内皮细胞内mtDNA受到的损伤多于细胞核DNA。这些数据有力地支持了这一假说，即在血管组织中，线粒体是ROS诱导的损伤的主要目标。

         实施例9.使用MutM蛋白(FAPY糖基化酶，FPG)

   检测8-氧-脱氧鸟苷，人细胞内一种特异性的氧化性DNA加成物

检测特异基因序列内的FAPY糖基化酶(FPG)位点。对于检测任何类型导致热稳定性DNA聚合物抑制的DNA损伤来说，QPCR基因特异性试验是一种高效而灵敏的试验。虽然该试验能够有效地检测出大多数类型的碱基损伤(胸腺嘧啶二醇)和单链及双链DNA断裂，但是8-oxodG并不有效抑制DNA聚合酶。为了直接检测特定基因序列内的这种加成物，必需首先用大肠杆菌的糖基化酶/核酸内切酶和甲酰氨基嘧啶DNA糖基化酶(FPG)(MutM蛋白)将8-oxodG转化为链断裂。除了作用于8-氧-脱氧鸟苷加成物外，该酶还去除甲酰氨基嘧啶之类的开环嘌呤(FAPY)。图16中的数据是使用以吖啶橙(AO)加白光(L)处理3、6和9分钟的细胞DNA获得的。AO加上白光产生了导致大量8-oxodG损伤的单态氧。在该试验中，抽提DNA，取一等份用FPG消化。然后将此DNA用作扩增17.7kb的β球蛋白片段的QPCR中。用相对扩增比来确定损伤/17.7kb。这些结果非常重要，至少有如下所述两个原因。这是第一次用15ng基因组DNA检测出特殊基因序列内的8-oxodG或甲酰氨基嘧啶之类的开环嘌呤。其次，事先存在于细胞DNA内的FPG位点量是0.18损伤/17.7kb，可换算成0.9位点/100kb。这与可在大多数生长于培养物中的细胞内测得的8-氧-dG量十分一致。

     实施例10.人细胞内顺氯氨铂加成物DNA损伤的修复动力学

癌症的化疗中主要的限制因素之一是向目标肿瘤释放有效剂量的抗癌药物。一种常用抗癌药物，顺氯氨铂(cis DDP)与DNA反应从而抑制DNA的复制，由此引起细胞死亡。肿瘤细胞能够很快修复顺氯氨铂处理产生的DNA加成物，由此使其失效。开发一种快速有效的方法，用于定量接受顺氯氨铂化疗的病人体内的顺氯氨铂-DNA加成物，将使得更好的治疗方案成为可能。图17A和17B中的数据显示转化的人成纤维细胞的修复动力学，这些细胞用顺氯氨铂(150μM)处理2小时，然后修复不同时间(图17A为β球蛋白；图17B为hprt)。抽提出DNA用于长链扩增反应。注意，与UV损伤的DNA相比，顺氯氨铂-DNA加成物修复缓慢。

   实施例11.检测人细胞DNA内的环氧苯并[a]芘二醇DNA加成物.

许多环境化学污染物会在试验动物中引起癌症。这类化合物之一，环氧苯并[a]芘二醇(BPDE)是由燃烧矿物染料产生的，并被发现存在于香烟的烟雾中。BPDE是已知的最强的人类致癌物质之一。图18A和18B中的数据显示在转化的人细胞内三个不同的基因组区域产生了BPDE-DNA加成物。细胞以BPDE处理(不处理，2μM和4μM)，将DNA用于长链DNA片段的定量扩增反应。

虽然以上说明包含了许多具体条件，但这些不应被理解为是对本发明范围的限制，而应被理解为是对优选实施方式的举例说明。对本领域熟练技术人员来说，可能存在着许多潜在的可改动之处。所以，本发明的范围应由后文的权利要求的范围及其法律上的等同形式来限定，而不只是由实施方式限定。

              参考文献

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Van Houten等，扩增反应(Perkin-Elmer)，10：10-17，1993。

Claims (13)

1.评估测试双链DNA模板中DNA损伤的方法，包括以下步骤：

提供一定量的具有DNA第一和第二互补链的对照双链DNA模板，DNA第一和第二互补链分别具有一链特异性引物位点，引物位点相距至少5,000碱基对；

将第一和第二互补链与各互补链上链特异性引物位点的引物混合；

进行混合物的定量长链DNA扩增反应；

用受到DNA损伤或受潜在DNA损伤性条件作用的测试双链DNA模板重复以上步骤；

测定与对照DNA相比较低的扩增率，由此评估DNA损伤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中的双链DNA模板是基因特异性双链DNA模板。

3.根据权利要求1所述的方法，其中的量从约1ηg至约30ηg。

4.根据权利要求1所述的方法，其中的量为约5ηg至15ηg DNA。

5.将根据权利要求1所述的方法用于测定某系统中的DNA修复速度，这时它进一步包括以下步骤：

在受DNA损伤性条件作用后，至少两次在不同时刻从生物系统中抽取测试双链DNA模板样品；

评估每份样品中的DNA损伤；以及

通过测定DNA扩增率的增加来确定DNA的修复速度。

6.将根据权利要求1所述的方法用于测定抗瘤形成疗法在病人体内效果的方法，包括以下步骤：

在治疗前和治疗后至少一次，获取病人的双链DNA模板样品；

使用权利要求1的方法分别处理样品；以及

通过扩增率的降低评估样品中的DNA损伤；

其中，治疗效果与DNA损伤成正比。

7.检验环境基因毒性存在的方法，包括以下步骤：

获取对照双链DNA模板样品，和至少一份双链DNA模板环境样品；

对样品进行DNA扩增，其中的引物位点相距至少5,000碱基对；以及

将对照样品的DNA扩增率与环境样品的相比较；

其中的环境基因毒性与环境样品中的DNA扩增率降低成反比。

8.评估环境样品中基因毒素的方法，包括以下步骤：

获取一份双链DNA样品和一份怀疑含有基因毒素的环境样品；

将一份测试DNA样品与环境样品密切接触一段时间；

对样品和测试份进行DNA扩增，DNA的引物位点至少相距5,000碱基对；以及

将对照的DNA扩增与测试DNA的比较；

利用测试样品中DNA扩增的减少来评估其中基因毒素含量。

9.根据权利要求8所述的方法，测绘环境基因毒素危险性场所的地图，如下进行：

将DNA样品与不同测绘位置的环境样品接触；

将评估出的基因毒素量标在所述环境的基因毒素危险性地图中的位置上。

10.一种个人的DNA基因毒素接触剂量计，包括：

至少两份双链DNA模板样品，其引物位点相距至少5,000碱基对，至少一份样品与环境接触，一份样品与环境隔离作为对照；以及

将所述剂量计与人体相连的装置。

11.监测一段时间内个体与基因毒素的接触的方法，包括以下步骤：

将权利要求11所述的剂量计与个体相连；

至少将一份样品暴露于环境；

用引物位点的引物对DNA样品进行扩增；以及

通过测定因暴露于环境而引起的扩增率降低来评估与环境毒素的接触。

12.检测DNA损伤产生8-氧-脱氧鸟苷或甲酰氨基嘧啶的方法，该方法包括：

获取具有第一和第二互补DNA链的第一双链DNA模板，第一和第二互补链各自具有一链特异性引物位点，引物位点相距至少约5,000碱基对；

取一份第一双链DNA模板与糖基化酶/核酸内切酶或甲酰氨基嘧啶DNA糖基化酶反应，将DNA损伤转化为链断裂，由此产生第二双链DNA模板样品；

将第一样品和第二样品的第一和第二互补链与各自的链特异性位点的引物混合；

对对照样品和测试样品进行长链DNA扩增反应；

检测与第一样品相比，第二样品DNA扩增率的下降，由此评估形成8-氧-脱氧鸟苷或甲酰氨基嘧啶造成的DNA损伤。

13.评估由顺氯氨铂诱导的DNA损伤的方法，该方法包括：

由接受顺氯氨铂治疗的病人获取第一DNA模板样品，该样品包含具有第一和第二互补DNA链的双链DNA，第一和第二互补链各自具有一链特异性引物位点，引物位点相距至少约5,000碱基对；

取一份第一DNA模板与一定量的氰化物离子反应，从DNA中置换出顺氯氨铂，由此形成第二DNA模板；

分别将第一和第二DNA模板的第一和第二互补链DNA与各自的链特异性位点的引物混合；

对第一和第二DNA模板进行定量长链DNA扩增反应；

以第二模板为对照，与对照相比，第一DNA模板扩增率的降低即为顺氯氨铂诱导的DNA损伤的测定值。

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