CN102031285A - 一种基于双核微核的dna修复能力检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种基于双核微核的DNA修复能力检测方法。本发明利用博莱霉素致淋巴细胞DNA损伤，用胞质分裂阻滞微核试验与DNA修复酶抑制剂3-氨基苯甲酰胺结合，测定修复后剩余的DNA损伤，检测、评价DNA损伤后修复能力，以微核率和3AB指数作为分析指标。经过细胞活力和微核率确定博莱霉素浓度和3-AB浓度，本发明方法经人群样本检测结果显示，受试对象做平行试验的结果与预期结果一致，表明本方法以微核为观察终点，结果更为客观，易于获得，且重现性好，稳定可靠。本发明为大样本流行病学研究提供了客观地检测、评价机体DNA修复能力的方法。

Description

一种基于双核微核的DNA修复能力检测方法

技术领域

本发明属生物技术领域，是一种基于双核微核的DNA修复能力检测方法。

背景技术

细胞DNA时常受到来自细胞内外环境因子的不断攻击，导致DNA损伤，并使细胞周期延迟；同时细胞启动DNA损伤修复机制，使受损的DNA得以修复。人类DNA修复功能是在机体与有害环境交互作用下不断发展和完善的。当有害环境因素造成超出自然状态下达到的DNA损伤程度或因遗传因素如基因变异导致DNA修复能力降低时，机体将不能进行有效的修复，其后果是细胞出现功能改变(如异常的细胞周期)并发生死亡；或带有基因突变的细胞增多，导致人体疾病(如癌症)的发生。尽管机体对致癌物的代谢能力决定DNA遭受损伤的程度，但DNA修复能力(DNA repair capacity，DRC)的强弱则是维持基因组稳定和细胞正常功能的中心环节。如果DRC缺陷或低下，将不能及时和有效地修复受损的DNA，从而导致基因突变甚至细胞癌变，增加个体罹患肿瘤的危险^[1]。

随着分子生物学实验技术的迅速发展，新的检测DNA损伤方法不断涌现，主要有诱变剂敏感性试验^[2]、单细胞凝胶电泳^[3]，和胞质阻断微核(cytokinesis-block micronucleus method，CBMN)即双核微核^[4]等。相对于其他几种方法，以DNA损伤、DNA链断裂或微核作为观察终点的诱变剂敏感性试验取材方便、操作简单、灵敏度高、更适用于分子流行病学研究；而双核微核的优点是其既反映了从干细胞分化到终末淋巴细胞过程中产生和保留的染色体损伤，还包括终末分化淋巴细胞在外周血循环时受化学物损伤而在体外培养时所形成的染色体损伤；由于只计数双核细胞中的微核，镜下阅片易于识别，而且各个实验室之间结果可比性好，更适用于低诱变性化学物遗传损伤的检测^[5，6]。

现有技术中，采用诱变剂敏感性试验的方法，大多以博莱霉素(bleomycin，BLM)作为诱变剂造成淋巴细胞DNA损伤，在彗星试验的基础上，分别在分子水平和细胞水平上测定修复后剩余的DNA损伤，间接反映个体对DNA损伤修复的能力；该方法方便易行，灵敏度高，无需细胞处于生长状态，也无需同位素标记，因此得到了广泛应用；但各实验室彗星试验的操作方法差异大，结果判别主观性强，致使不同实验室间的结果重现性不高，不适宜应用于大样本流行病学研究。

与本发明有关的现有技术的参考文献有：

1 LIN J，KADLUBAR FF，SPITZ MR，et al.A modified host cell reactivation assay to measure DNA repair capacity for removing 4-aminobiphenyl adducts：a pilot study of bladder cancer[J].Cancer Epidemiology，Biomarkers&Prevention，2005，14(7)：1832-1836

2 HEMMINKI K，XU G，LE CURIEUX F，et al.Re：markers of DNA repair and susceptibility to cancer in humans：an epidemiologic review.[comment][J].Journal of the National Cancer Institute，2000，92(18)：1536-1537

3 ROSS GM，MCMILLAN TJ，WILCOX P，et al.The single cell microgel electrophoresis assay(comet assay)：technical aspects and applications.Report on the 5th LH Gray Trust Workshop，Institute of Cancer Research，1994[J].Mutation Research，1995，337(1)：57-60

4 Bonassi S，Fenech M，Lando C，et al.Human Micronucleus project：international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes：I.Effect of laboratory protocol，scoring criteria，and host factors on the frequency of micronuclei[J].Environmental&Molecular Mutagenesis，2001，37(1)：31-45.

5 Fenech M.The in vitro micronucleus technique[J].Mutation Research，2000，455(1-2)：81-95.

6 SINGH NP，MCCOY MT，TICE RR，et al.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells[J].Experimental Cell Research，1988，175(1)：184-191

7 Wei Z，Lifen J，Jiliang H，et al.Detecting DNA repair capacity of peripheral lymphocytes from cancer patients with UVC challenge test and bleomycin challenge test[J].Mutagenesis.2005 Jul；20(4)：271-7.Epub 2005May 17.

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种客观地检测、评价机体DNA修复能力的方法。

研究表明，博莱霉素(BLM)是一种拟辐射剂，其主要是通过与亚铁离子和分子氧相结合形成一种复合物，该复合物嵌入DNA链导致氧自由基的释放，最终导致DNA单链双链断裂；其导致的DNA损伤主要通过碱基切除修复(Base excision repair，BER)、同源重组修复(homologous recombination repair，HRR)和非同源末端连接(nonhomologous end joining，NHEJ)路径来修复。

本发明以公认的博莱霉素DNA损伤模型和双核微核为观察终点，应用胞质阻断微核法，通过加入DNA修复酶抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-Aminobenzamide，3-AB)测定修复后剩余的DNA损伤，客观直接地检测上述机体DNA损伤修复的能力。

具体而言，本发明的一种基于双核微核的DNA修复能力检测方法，其特征在于，以双核微核为观察终点，以博莱霉素来诱导淋巴细胞DNA染色体损伤，应用胞质分裂阻滞微核试验与DNA修复酶抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)结合，测定修复后剩余的DNA损伤，计算微核率和3AB指数，检测、评价DNA损伤后修复能力。

本发明中，微核率＝微核数/观察细胞数×1000‰。

本发明中，3AB指数＝(加3AB的微核率-不加3AB的微核率)/加3AB的微核率。

本发明中，所述的3AB指数反映个体的DNA修复能力，3AB指数越大，则说明个体的DNA修复能力越高。

本发明的检测方法包括下述步骤：

1)胞质分裂阻滞微核试验

建立胞质分裂阻滞微核试验技术；

2)博莱霉素试验浓度和3-AB试验浓度的确定

选取受试对象外周血淋巴细胞，采用不同浓度博莱霉素和不同浓度的3-AB来进行该试验，每次试验均进行平行试验，根据细胞活力和每1000个淋巴细胞中的微核数确定博莱霉素浓度和3-AB浓度，分别为1ug/ml和1.25mmol/L；

3)淋巴细胞培养；

4)淋巴细胞收获与制片；

5)镜检阅片与DNA修复能力的检测。

本发明中，淋巴细胞培养通过下述步骤：

在15ml的刻度离心管中加入组合培养液，每管4.5ml。PHA 0.2ml/管(每支PHA加2ml无菌双蒸水溶解)，最后加0.5ml抗凝血(每份样品均做平行培养)，37℃培养24h，加入BLM(BLM应用液加入50ul为3ug/ml，加入16.67ul为lug/ml)，37℃培养30min，之后用5ml的培养基(含10％胎牛血清)1000g离心10min洗两次，之后一份继续培养，另一份加入3-AB(本次采用1.25mmol/L即在5ml体系中加入31.25ul)继续培养。20h后加细胞松弛素B应用液100μl，终浓度6μg/ml，继续培养28h收获。

本发明中淋巴细胞收获与制片通过下述步骤：

a.培养结束后离心(1000g/min)10min，弃上清液。b.低渗：将3ml 0.075M KCl(37℃)加入离心管，立即混匀1-5min。c.加固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1)4ml，混匀，预固定。d.离心(1000g/min)10min，弃上清液。e.加固定液5ml，混匀，室温固定30min，离心，弃固定液。f.重复步骤e，加适量固定液(0.3-0.5ml)混匀。h.滴片：将玻片从冰水中取出，滴片(滴管下端距玻璃片10cm高度)，自然干燥。可过夜后再染色。i.10％Giemsa染色10min，镜检分析。

本发明所述的DNA修复能力检测通过下述步骤：

低倍镜下寻找细胞分散均匀的视野，转油镜或计算机图像转换分析系统下观察。选择胞浆完整的双核淋巴细胞(图1-2-1)，微核位于细胞质中，与细胞核相切或完全分开，边缘光滑，嗜色性与细胞核完全一致，大小为主核的1/3以下，不与主核接触(图2，图3，图4和图5)。计数1000个双核淋巴细胞中含一个、两个或多于两个微核的细胞数，以计算双核微核细胞率(以下简称微核率‰)。以微核率和3AB指数作为分析指标。微核率＝微核数/观察细胞数×1000‰。3AB指数＝(加3AB的微核率-不加3AB的微核率)/加3AB的微核率。3AB指数反映了个体的DNA修复能力，3AB指数越大，则说明个体的DNA修复能力越高。

本发明按上述检测方法，对所研究的每名对象取0.5ml肝素抗凝外周血分别接种到4.5ml含PHA和RPMI1640的培养体系(含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)，置37℃CO2培养箱培养24h后加入BLM溶液(终浓度1μg/ml)，培养30min后用5mlRPMI1640培养基(含10％胎牛血清)1000g×10min离心洗两次，弃上清，用10ml含PHA和RPMI1640的培养体系(含10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素)混悬细胞，将其等分为两份，一份继续37℃培养20h，加入细胞松弛素B应用液100μl(终浓度为6μg/ml)，继续培养28h后收获细胞。另一份立即加入DNA修复酶抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3AB，终浓度1.25mmol/L)再进行培养20h后加入细胞松弛素B(终浓度为6μg/ml)，继续培养28h收获细胞。细胞经低渗，固定后滴片，玻片在室温下自然晾干后，用Gimsa染色。显微镜下观察1000个双核细胞，计数微核总数。微核的判断标准是，在间期细胞中观察到的游离于胞质中、与主核完全分开(如与主核相切应见到各自的核膜)、呈圆形或椭圆形、边缘光滑、嗜色性与主核一致或略浅，为主核1/3以下的小核。以微核率和3AB指数作为分析指标。微核率＝微核数/观察细胞数×1000‰。3AB指数＝(加3AB的微核率-不加3AB的微核率)/加3AB的微核率。3AB指数反映了个体的DNA修复能力，3AB指数越大，则说明个体的DNA修复能力越高。

检测结果显示，本发明以微核为观察终点更为客观，易于获得，重现性好，结果显示，不加BLM与不加3-AB组，加BLM与不加3-AB组，加BLM与加3-AB组微核数依次升高，与预期完全一致。

附图说明

图1正常单核淋巴细胞与正常双核淋巴细胞。

图2含一个微核不加BLM与不加3-AB组双核淋巴细胞。

图3含一个微核加BLM与不加3-AB组双核淋巴细胞。

图4含两个微核加BLM与加3-AB组双核淋巴细胞。

图5含三个微核加BLM与加3-AB组双核淋巴细胞。

具体实施方式

实施例1

选取3名正常人作为研究对象分别编号为A，B，C.

1.主要仪器和试剂

RPMI1640：Gibco公司；六孔培养板：Corning公司；PHA：上海伊华科技有限公司；BLM：Sigma公司；15ml离心管；细胞松弛素B：Sigma公司；CO2培养箱：REVCO HABITATTM公司。

2 试剂配制

2.1培养基

RPMI16404ml，小牛血清1ml，双抗(青霉素100u/ml，链霉素100ug/ml)。

2.2博莱霉素(Bleomycin，BLM)

存储液：1mg BLM加入无菌生理盐水0.5ml，得2000μg/ml原液，-20℃冻存。临用前配制应用液。

应用液：在0.5ml原液中加无菌生理盐水2.8ml，得303μg/ml应用液。2ml培养体系中加应用液40μl，终浓度为6μg/ml。-20℃保存。

2.3细胞松弛素(cytochalasins B，Cyt-B)

存储液：1mg Cyt-B加入二甲基亚砜0.5ml，得2000μg/ml原液，-20℃冻存。临用前配制应用液。

应用液：在0.5ml原液中加无菌生理盐水2.8ml，得303μg/ml应用液。5ml培养体系中加应用液100μl，终浓度为6μg/ml。-20℃保存。

2.4 3-氨基苯甲酰胺(3-Aminobenzami de，3-AB)：

其分子量136.15g/mol，配制为终浓度为200mmol/L：称取0.2mmol的3-AB即27.23mg，用1ml的无菌生理盐水溶解，即配置成200mmol/L浓度的3-AB。5ml培养体系中加50ul浓度为200mmol/L 3-AB，即为终浓度为2mmol/L，加25ul则终浓度为1mmol/L，加31.25ul为1.25mmol/L。

2.5植物血凝素(Phytohaemagglutinin，PHA)

PHA 0.2ml/孔(每支PHA加2ml无菌双蒸水溶解)

2.6无菌双蒸水

2.7Giemsa染液

原液：Giemsa粉剂0.8g，医用甘油50ml，甲醇50ml

将Giemsa粉剂置于研钵中，加少许甘油充分研磨，然后转移至棕色瓶中，用甲醇冲洗数次，置于37℃温箱内12h，密封保存备用。

稀释液：临用时取Giemsa原液5ml，加PBS溶液50ml。

PBS(1/15M磷酸缓冲液，pH 6.98)：甲液52ml，乙液48ml混匀即可。

甲液：KH2PO4            0.908g

      ddH2O             100ml

乙液：Na2 HPO4·2H2O    1.188g

      ddH2O             100ml

2.8固定液

甲醇∶冰醋酸为3∶1，临用前配制，4℃保存。

2.9低渗液

0.075M氯化钾。

3操作步骤

3.1培养

在15ml的刻度离心管中加入组合培养液，每管4.5ml。PHA 0.2ml/管(每支PHA加2ml无菌双蒸水溶解)，最后加0.5ml抗凝血(每份样品均做平行培养)，37℃CO₂培养箱培养24h，加入BLM(BLM应用液加入50ul为3ug/ml，加入16.67ul为1ug/ml)，37℃培养30min，之后用5ml的培养基(含10％胎牛血清)1000g离心10min洗两次，之后一份继续培养，另一份加入3-AB(1.25mmol/L即在5ml体系中加入31.25ul)继续培养。20h后加细胞松弛素B应用液100μl，终浓度6μg/ml，继续培养28h收获。

3.2收获与制片

a.培养结束后离心(1000r/min)10min，弃上清液。

b.低渗：将3ml 0.075M KCl(37℃)加入离心管，立即混匀1-5min。

c.加固定液(甲醇∶冰醋酸为3∶1)4ml，混匀，预固定。

d.离心(1000r/min)10min，弃上清液。

e.加固定液5ml，混匀，室温固定30min，离心，弃固定液。

f.重复固定1次，吸弃固定液，加适量固定液(0.3-0.5ml)混匀。

h.滴片：将玻片从冰水中取出，滴片(滴管下端距玻璃片10cm高度)，自然干燥。可过夜后再染色。

i.10％Giemsa染色10min，镜检分析。

3.3镜检分析

低倍镜下寻找细胞分散均匀的视野，转油镜或计算机图像转换分析系统下观察。选择胞浆完整的双核淋巴细胞(图1)，微核位于细胞质中，与细胞核相切或完全分开，边缘光滑，嗜色性与细胞核完全一致，大小为主核的1/3以下，不与主核接触(图2，图3，图4和图5)。计数1000个双核淋巴细胞中含一个、两个或多于两个微核的细胞数，以计算双核微核细胞率(以下简称微核率‰)。以微核率和3AB指数作为分析指标。微核率＝微核数/观察细胞数×1000‰。3AB指数＝(加3AB的微核率-不加3AB的微核率)/加3AB的微核率。3AB指数反映了个体的DNA修复能力，3AB指数越大，则说明个体的DNA修复能力越高。

4 试验结果如表1所示。

表1受试对象A、B、C在不同试验组的微核率(％)和3AB指数

注：CBMN指即不加博莱霉素也不加DNA修复酶抑制剂(3-AB)组微核率

CBMN+BLM即加博莱霉素组微核率

CBMN+BLM+3AB即加博莱霉素又加DNA修复酶抑制剂(3-AB)微核率

3AB指数＝(加3AB的微核率-不加3AB的微核率)/加3AB的微核率

受试对象均做平行试验，试验结果与上述一致。

Claims (8)

1.一种基于双核微核的DNA修复能力检测方法，其特征在于，以双核微核为观察终点，以博莱霉素诱导淋巴细胞DNA染色体损伤，用胞质分裂阻滞微核试验与DNA修复酶抑制剂3-氨基苯甲酰胺结合，测定修复后剩余的DNA损伤，通过下式分别计算微核率和3AB指数，检测、评价DNA损伤后修复能力；

微核率＝微核数/观察细胞数×1000‰；

3AB指数＝(加3AB的微核率-不加3AB的微核率)/加3AB的微核率。

2.按权利要求1所述的DNA修复能力检测方法，，其特征在于，包括下述步骤：

1)胞质分裂阻滞微核试验

建立胞质分裂阻滞微核试验技术；

2)博莱霉素试验浓度和3-AB试验浓度的确定

选取受试对象外周血淋巴细胞，采用不同浓度博莱霉素和不同浓度的3-AB来进行该试验，每次试验均进行平行试验，根据细胞活力和每1000个淋巴细胞中的微核数确定博莱霉素浓度和3-AB浓度；

3)淋巴细胞培养；

4)淋巴细胞收获与制片；

5)镜检阅片与DNA修复能力的检测。

3.按权利要求2所述方法，其特征在于，其中步骤2)的博莱霉素浓度和3-AB浓度，分别为1ug/ml和1.25mmol/L。

4.按权利要求2所述的方法，其特征在于，通过下述步骤培养所述的淋巴细胞：

在15ml的刻度离心管中加入组合培养液，每管4.5ml，PHA 0.2ml/管，最后加0.5ml抗凝血，每份样品均做平行培养，37℃培养24h，加入BLM(BLM应用液加入50ul为3ug/ml，加入16.67ul为1ug/ml)，37℃培养30min，之后用5ml的培养基(含10％胎牛血清)1000g离心10min洗两次，之后一份继续培养，另一份加入3-AB(本次采用1.25mmol/L即在5ml体系中加入31.25ul)继续培养。20h后加细胞松弛素B应用液100μl，终浓度6μg/ml，继续培养28h收获。

5.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的BLM应用液加入50ul为3ug/ml，加入16.67ul为1ug/ml；所述的的5ml的培养基中含10％胎牛血清。

6.按权利要求2所述方法，其特征在于，其中淋巴细胞收获与制片通过下述步骤：

a.培养结束后离心1000g/min 10min，弃上清液；

b.低渗：将3ml 0.075M KCl 37℃加入离心管，混匀1-5min；

c.加固定液4ml，混匀，预固定；

d.离心10min，弃上清液；e.加固定液5ml，混匀，室温固定30min，离心，弃固定液；f.重复步骤e，加0.3-0.5ml固定液混匀；

h.滴片：将玻片从冰水中取出，滴片，自然干燥，过夜后再染色；

i.10％Giemsa染色10min，镜检分析。

7.按权利要求6所述方法，其特征在于，所属的步骤c)的固定液中，甲醇∶冰醋酸为3∶1。

8.按权利要求2所述方法，其特征在于，通过下述步骤检测所述的DNA修复能力：

低倍镜下寻找细胞分散均匀的视野，转油镜或计算机图像转换分析系统下观察；选择胞浆完整的双核淋巴细胞，微核位于细胞质中，与细胞核相切或完全分开，边缘光滑，嗜色性与细胞核完全一致，大小为主核的1/3以下，不与主核接触；计数1000个双核淋巴细胞中含一个、两个或多于两个微核的细胞数，计算双核微核细胞率；以微核率和3AB指数作为分析指标；所述微核率＝微核数/观察细胞数×1000‰；所述3AB指数＝(加3AB的微核率-不加3AB的微核率)/加3AB的微核率。

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