CN117965588A - 一种在细菌基因组中定点插入dna的基因编辑系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在细菌基因组中定点插入DNA的基因编辑系统及其应用，系统包括：第I调节元件，其包括转座模块和靶向效应模块，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码7个氨基酸序列；第II调节元件，其包括“II‑1核苷酸序列—II‑2核苷酸序列—II‑1核苷酸序列”的从5’端到3’端的串联表达盒，其中II‑2核苷酸序列由靶位点决定；第III调节元件，为靶位点插入的DNA片段，其包括依次从5’端到3’端串联的III‑1核苷酸序列、III‑2核苷酸序列及III‑3核苷酸序列，其中III‑2核苷酸序列可任意更换。本发明不依赖于细菌的同源重组修复系统，可以100%的效率实现大片段的DNA定点整合。
Description
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种在细菌基因组中定点插入DNA的基因编辑系统及其应用，该系统通过crRNA定向引导，在细菌基因组中实现高效的大片段DNA的定点整合。
背景技术
常见的基因编辑工具包括早期的Cre-lox系统、锌指核酸内切酶(ZFNs)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)系统、RNA干扰(RNAi)和CRISPR-Cas9系统。其中，RNAi只能用于基因敲减而无法实现基因敲除，而其它四种方法只能切割DNA生成双链断裂，然后依赖细胞自身的错误修复机制来实现基因敲除或敲入。与CRISPR-Cas9系统相比，Cre-lox系统的编辑位点受限于特定位置，无法对任何基因进行编辑；而ZFNs系统和TALENs系统的操作较为复杂。因此，基于操作简单和灵活的编辑位点，CRISPR-Cas9技术成为最受欢迎的基因编辑工具。值得注意的是，Cas9技术主要用于敲除和降解目标DNA，在实现基因敲入时依赖细胞内的同源重组，编辑效率较低，需要筛选大量个体才能得到目标突变，并且只能插入小片段DNA，限制了对长片段DNA的研究。
转座子是细菌和古菌基因组中广泛存在的一类可移动遗传元件，也被称为“跳跃基因”，可以在基因组上转移，尤其在介导大片段DNA转移的能力被广泛关注。微生物遗传学家利用转座子的可移动性来实现目的基因的插入。他们将目的基因搭载在转座子内部，然后通过转座子的移动将其插入到基因组中。不同的转座子有不同的插入位点策略。有些转座子会随机插入到基因组中，这种策略适用于创建突变体库，例如Tn5转座子。而其它转座子则会在宿主物种中较为保守的特定位点插入，例如Tn7转座子会定向插入到基因组glmS基因下游的保守位点。因此，利用转座子在指定位点插入目的基因是一项具有挑战性的任务。
CRISPR相关转座子系统(CAST)是新发现的一类存在于原核生物基因组中的一类可移动遗传元件，在基因编辑领域引起了广泛关注。该系统主要由Tn7-like转座蛋白和核酸酶缺陷CRISPR-Cas系统(TniQ-cascade-crRNA)以及其它货物基因组成。它主要基于利用TnsABC转座酶高效的无缝整合能力与CRISPR-Cas系统靶向位点的可编辑性相结合，在DNA大片段的定点整合方面提供了显著优势。首先，Cascade处理和组装crRNA，然后与TniQ蛋白结合，形成TniQ-Cascade/crRNA复合物。当复合物在靶位点与DNA结合并轻微改变其构象后，通过TniQ募集TnsABC转座酶复合物，在指定位点完成转座。与原型Tn7转座子一样，tnsA基因的功能完整与否决定了转座机制是“剪切-粘贴”还是“复制-粘贴”，后者导致共整合产物的产生。
目前，已发现Tn7转座子使用的六种类型的CRISPR-Cas系统：I-B型、I-C型、I-D型、I-F型、IV型和V型。不同类型之间在整合效率准确性和靶向机制之间存在显著差异。其中，V型CAST系统的脱靶率<50％，I-F CAST系统的脱靶效率<1％。I-F CAST型系统具有最佳的整合效率、特异性，未观察到与供体质粒的共整合。它也是最常见和结构最多样化的CAST系统。然而目前已被开发的CAST系统较少，霍乱弧菌的Tn6677(VchCAST)是目前研究最深入的I-F-CAST系统，一些新的CAST基因编辑工具包的有待开发和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种在细菌基因组中定点插入DNA的基因编辑系统及其应用，其所述系统不依赖于细菌的同源重组修复系统，可以100％的效率实现大片段的DNA定点整合。
实现本发明目的的具体技术方案是：
一种在细菌基因组中定点插入DNA的基因编辑系统，特点是，所述基因编辑系统包括第I调节元件、第II调节元件和第III调节元件，所述第I调节元件、第II调节元件和第III调节元件被克隆到至少一个载体上；其中，
所述的第I调节元件，其核苷酸的碱基序列如SEQ ID No.1所示；
所述的第I调节元件的核苷酸序列依次编码I-1，I-2，I-3，I-4，I-5，I-6，I-7氨基酸序列，其氨基酸序列依次如SEQ ID No.2～8所示；
所述的第II调节元件，其为II-1核苷酸序列、II-2核苷酸序列、II-1核苷酸序列从5’端到3’端的串联序列，其转录为crRNA以引导第I调节元件编码的蛋白至靶位点处；其中II-1核苷酸序列为5’-GTGACCTGCCGAATAGGCAGCTGAAAAT-3’；II-2核苷酸序列为32个碱基的靶核苷酸序列，来源于目标细菌的基因组，距离靶位点上游47-51个碱基；
所述的第III调节元件，其包括III-1、III-2和III-3核苷酸序列；其中III-1核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述III-3核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；其中III-2核苷酸序列两端有限制性内切酶的克隆位点。
一种在细菌基因组中定点整合的表达载体，特点是，所述载体的核苷酸序列如SEQID NO:12所示；包含所述基因编辑系统的第I调节元件和第III调节元件。
所述的表达载体，第I调节元件和第III调节元件之间存在限制性内切酶的克隆位点，用于第II调节元件的插入。
所述的表达载体，第III调节元件的III-2核苷酸序列两端存在的限制性内切酶的克隆位点，用于任意DNA片段的插入或更换。
所述的第II调节元件，其被整合到上述的表达载体中作为单质粒基因编辑系统实施基因编辑；或单独整合到任意表达载体中与上述的表达载体一起构成双质粒基因编辑系统实施基因编辑。
一种所述的基因编辑系统或上述所述的表达载体，在做细菌基因组基因编辑中的应用。
一种利用上述所述的表达载体在细菌中实现crRNA介导的DNA片段在基因组中定点整合。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种在原核基因组中高效率的定点插入大片段DNA的基因编辑系统。该基因编辑系统相对宽松的PAM序列，能更广泛的适应于原核生物基因组中任意靶位点的基因编辑。该基因编辑系统为剪切-粘贴型转座机制，若细胞中为单拷贝质粒，则在完成基因编辑后可自行消失。该基因编辑系统克服CRISPR系统中HDR效率较低的问题，具有更高的基因组整合效率和较低概率的共整合现象。具体来说，它在大肠杆菌中的位点特异性整合效率接近100％，未检测到脱靶和与供体质粒的共整合现象。本发明还构建了一个可在多种细菌中进行基因编辑的pCAST-Donor质粒。研究人员可以根据具体需求设计和插入靶向序列和替换目的基因，即可实现对目标基因的定向编辑和整合，为不同细菌基因组编辑和改造提供了一种高效精准且便捷途径，推动其在基因组工程领域的更广泛应用。
附图说明
图1为通过卡那霉素筛选和绿色荧光标记基因获得的大肠杆菌阳性转化子图片；
图2为使用pGGA-CAST质粒对大肠杆菌lacZ位点进行基因编辑的PCR鉴定结果；
图3为大肠杆菌阳性单克隆靶位点整合的Sanger测序结果示意图和测序峰图，结果显示插入位点位于靶位点下游48个碱基处；
图4为已整合的大肠杆菌阳性单克隆菌中pGGA-CAST重组质粒的PCR扩增结果；
图5为pGGA-CAST重组质粒的靶向免疫性实验示意图和靶位点整合的PCR扩增结果；
图6pCAST-Donor重组质粒结构图。
图7为pCAST-Donor质粒在希瓦式菌基因组pyrF位点定点整合及整合方向的PCR扩增结果；图8为pCAST-Donor质粒在希瓦式菌阳性单克隆靶位点整合的Sanger测序结果示意图，结果显示插入位点位于靶位点下游47-51个碱基处。
具体实施方式
以下通过优选实施案例的形式对本发明的上述内容进行举例说明，但其不够成对本发明的限制。
如无特殊说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
本发明目的之一从希瓦式菌基因组中开发了一套新的CRISPR相关转座子基因编辑系统。是在原核生物基因组中非常高效地实现长片段DNA在单一方向的定点插入。
该基因编辑系统整体包括第I调节元件、第II调节元件和第III调节元件：
第I调节元件为效应模块，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，来源于希瓦氏菌(Shewanella sp.)。所述第I调节元件的核苷酸序列依次编码I-1，I-2，I-3，I-4，I-5，I-6，I-7氨基酸序列。其中所述I-1氨基酸序列为如SEQ ID No.2所示，所述I-2氨基酸序列为如SEQ ID No.3所示，所述I-3氨基酸序列为如SEQ ID No.4所示，所述I-4氨基酸序列为如SEQIDNo.5所示，所述I-5氨基酸序列为如SEQ ID No.6所示，所述I-6氨基酸序列为如SEQ IDNo.7所示，所述I-7氨基酸序列为如SEQ ID No.8所示。第I调节元件所述I-1，I-2，I-3氨基酸序列为“剪切-粘贴”型转座模块；所述I-4，I-5，I-6，I-7氨基酸序列为靶向效应模块，负责第II调节元件的加工，并与转座模块结合引导至第II调节元件的靶位点处进行转座。
第II调节元件为靶向定位模块，其包括“II-1核苷酸序列—II-2核苷酸序列—II-1核苷酸序列”的从5’端到3’端的串联表达盒；所述第II-1核苷酸序列包括来源于希瓦氏菌的crRNA序列，长度为28个碱基的crRNA核酸序列(5’-GTGACCTGCCGAATAGGCAGCTGAAAAT-3’)；所述第II-2核苷酸序列是长度为32个碱基的人工靶核苷酸序列，所述人工靶核苷酸序列来源于目标生物的基因组中，距离目标生物基因组待插入的靶位点上游47-51个碱基处。所述“II-1核苷酸序列—II-2核苷酸序列—II-1核苷酸序列”的转录形成crRNA序列，引导第I调节元件编码的蛋白至目标生物基因组待插入的靶位点，并在靶位点处插入下述第III调节元件中包含的“感兴趣的基因”。
第II调节元件的II-2靶核苷酸序列是根据编辑位点而变化的，可根据靶向位点设计II-2核苷酸序列，并基于逐渐延伸的step by step法或直接由公司合成完整的“II-1核苷酸序列—II-2核苷酸序列—II-1核苷酸序列”串联的双链DNA片段。
第III调节元件为整合模块,包括在靶位点插入的DNA片段。其包括依次从5’端到3’端串联的III-1核苷酸序列、III-2核苷酸序列、III-3核苷酸序列。其中III-2核苷酸序列为“感兴趣的基因”；所述第III-1核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述第III-3核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示，均来自于希瓦氏菌基因组。
本发明目的之二提供了一个可在细菌基因组中定点整合的表达载体。
该表达载体为本发明之一的基因编辑系统的第I和第III调节元件以串联方式克隆到修改的pURR25载体骨架上，命名为pCAST-Donor重组质粒。在pCAST-Donor重组质粒的第I和第III调节元件之间设计了多个限制性酶切位点，包括SbfI/NotI/ZraI/AatII和PacI，这些酶切位点可用于插入定制的第II调节元件。所述载体的核苷酸序列如SEQ IDNO:12所示。
其中所述第I调节元件的序列为SEQ ID NO:12中自5’端第4935～13434位碱基，同SEQ ID No.1所示。
所述第III调节元件的序列为SEQ ID NO:12中自5’端第5～2069位碱基，其中III-2核苷酸序列为第200～1874位碱基，包括启动基因表达的lac启动子、抗生素筛选基因kanR和荧光筛选基因egfp，如需更换或插入，可通过AscI/BbvCI/RsrII酶切位点进行改造。
所述接合质粒pURR25载体骨架的序列为SEQ ID NO:12中自5’端第2070～4934位碱基，其中4845～4917位碱基为lac操纵子区域。
本发明的目的之三还提供上述pCAST-Donor质粒在细菌中实现crRNA介导的基因组定点整合的方法。包括以下步骤：
1)首先要确定本发明所述的靶核苷酸序列(第II调节元件中的II-2核苷酸序列)，通过以下方法确定：
(1)确定细菌基因组中要插入“感兴趣的基因”的位置，在其上游取一个长度为32个碱基的核苷酸序列，该序列的PAM序列(5’端上游的两个碱基)为“CN”时，整合效率最高达到100％，否则整合效率可能降低；
(2)判断(1)中所述的核苷酸序列在基因组中的特异性(序列特异性越高，则进行基因编辑时准确性越高，否则会产生脱靶效应)。符合预期的即为靶核苷酸序列，具体插入位置为该序列下游47-51个碱基处。
2)根据靶核苷酸序列确定完整的第II调节元件的核苷酸序列，还要在第II调节元件的侧翼添加本发明之二所述的酶切位点，用于将第II调节元件插入pCAST-Donor质粒中。完整的DNA片段可直接由生物公司合成或基于逐渐延伸的step by step法合成。
3)将上述的第II调节元件和pCAST-Donor质粒通过对应的限制性内切酶切割和连接酶连接形成pCAST重组质粒，然后通过电转化至大肠杆菌WM3064中作为接合的供体菌株。
4)将步骤3)所述供体菌株通过接合将pCAST重组质粒转移至要编辑的受体菌株，用于对受体菌的定点整合。
步骤2)所述的第II调节元件也可直接克隆到pURR25载体骨架上，与pCAST-Donor质粒一同导入受体菌中形成双质粒系统共同完成基因组的定点整合。此外，该质粒可编辑的细菌范围取决于是否能完成接合作用和启动子是否能在受体菌中启动基因表达。
实施例1：pGGA-CAST质粒构建及利用pGGA-CAST在大肠杆菌BL21(DE3)基因组的lacZ基因位点插入～2kb的DNA片段。
本发明所述第III调节元件总长度为1935个碱基，其中“感兴趣的基因”——III-2核苷酸序列长1545个碱基，其序列如SEQ ID No.11所示，包括抗生素筛选基因kanR和荧光筛选基因gfp，如需更换或插入，可通过AscI/BbvCI/RsrII酶切位点对SEQ ID No.11所示的序列进行改造。
本实施例所述基因编辑对象为大肠杆菌BL21(DE3)，靶位点为lacZ基因，靶核苷酸序列为5’-CGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACT-3’，因此第II调节元件核苷酸序列由5’-3’端为：
GTGACCTGCCGAATAGGCAGCTGAAAATCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGTGACCTGCCGAATAGGCAGCTGAAAAT，其双链DNA片段直接由上海赛恒生物公司合成。
确定上述两个调节元件的序列后，下一步人工构建单质粒基因编辑系统。将第I、第II和第III调节元件通过golden gate组装试剂盒BsmBI-v2 Golden Gate assembly kit(NEB,USA)以串联方式无缝克隆到一个pGGA-select载体上，得到pGGA-CAST重组质粒。所述载体的三个调节元件在大肠杆菌BL21(DE3)中由T7启动子启动基因的表达。将pGGA-CAST重组质粒在大肠杆菌2-blue克隆菌株中富集后，通过电穿孔法转化到大肠杆菌BL21(DE3)，室温孵育1小时后，涂布到含对应抗生素的LB培养基中37℃过夜培养，然后通过蓝白斑和荧光筛选验证获得的阳性转化子(图1)。
根据靶位点的DNA序列设计引物，对得到的阳性单克隆进行PCR鉴定并对PCR产物进行测序。随机对24个转化子进行PCR鉴定，结果显示100％的整合效率，且插入方向单一(图2)；随机选择三个单克隆进行sanger测序，显示插入位置都在距离靶向位点下游48个碱基处(图3)；没有检测到与供体质粒的共整合。结果表明该系统可将“感兴趣的基因”在大肠杆菌基因组靶位点实现高效的插入。
以已经被整合的阳性菌为模板，对导入的pGGA-CAST重组质粒进行PCR扩增未得到条带，说明pGGA-CAST质粒在经过“剪切-粘贴”转座后未能被细胞自身的修复过程修复而丢失(图4)。当被整合的阳性菌再次引入pGGA-CAST质粒时，靶位点没有发生串联整合，质粒一直游离存在(图5)，说明该系统具有靶向免疫性。
本实施例所描述的插入位置距离靶向位点下游48个碱基仅限这三个单克隆菌株，本领域内技术人员在使用该基因编辑系统时可能还会得到插入位置距离靶向位点下游47-51个碱基之间的插入结果。
实施例2pCAST-Donor质粒在希瓦氏菌基因组的pyrF基因位点插入～2kb的DNA片段
本实施例所述基因编辑对象为希瓦氏菌(Shewanella sp.)基因组的pyrF基因位点，靶核苷酸序列为5’-TCAAAGTGGGCAAAGAAATGTTTACCCTGTTT-3’。完整的第II调节元件的序列由5’-3’端为：
GTGACCTGCCGAATAGGCAGCTGAAAATTCAAAGTGGGCAAAGAAATGTTTACCC TGTTTGTGACCTGCCGAATAGGCAGCTGAAAAT
其DNA片段直接由公司合成，并克隆至接合质粒pURR25载体上。随后将该质粒与pCAST-Donor质粒(图6)通过接合转移至希瓦式菌中，并通过抗性基因和绿色荧光标记筛选阳性单克隆菌株。
根据靶位点的DNA序列设计引物，对得到的8个阳性转化子进行PCR鉴定并对PCR产物进行测序。基于8个阳性转化子的结果显示在靶位点有100％的整合效率，且插入方向单一(图7)；对单克隆进行sanger测序，显示插入位置分布在距离靶向位点下游47-51个碱基处(图8)。结果表明该系统可将“感兴趣的基因”在希瓦式菌基因组pyrF靶位点实现高效的插入。
Claims (7)
1.一种在细菌基因组中定点插入DNA的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括第I调节元件、第II调节元件和第III调节元件，所述第I调节元件、第II调节元件和第III调节元件被克隆到至少一个载体上；其中，
所述的第I调节元件，其核苷酸的碱基序列如SEQ ID No.1所示；
所述的第I调节元件的核苷酸序列依次编码I-1，I-2，I-3，I-4，I-5，I-6，I-7氨基酸序列，其氨基酸序列依次如SEQ ID No.2~8所示；
所述的第II调节元件，其为II-1核苷酸序列、II-2核苷酸序列、II-1核苷酸序列从5’端到3’端的串联序列，其转录为crRNA以引导第I调节元件编码的蛋白至靶位点处；其中II-1核苷酸序列为5’-GTGACCTGCCGAATAGGCAGCTGAAAAT-3’；II-2核苷酸序列为32个碱基的靶核苷酸序列，来源于目标细菌的基因组，距离靶位点上游47-51个碱基；
所述的第III调节元件，其包括III-1、III-2和III-3核苷酸序列；其中III-1核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述III-3核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；所述III-2核苷酸序列两端有限制性内切酶的克隆位点。
2.一种在细菌基因组中定点整合的表达载体，其特征在于，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；包含权利要求1所述基因编辑系统的第I调节元件和第III调节元件。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，第I调节元件和第III调节元件之间存在限制性内切酶的克隆位点，用于第II调节元件的插入。
4.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，第III调节元件的III-2核苷酸序列两端存在的限制性内切酶的克隆位点，用于任意DNA片段的插入或更换。
5.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，所述第II调节元件，其被整合到权利要求2所述的表达载体中作为单质粒基因编辑系统实施基因编辑；或单独整合到任意表达载体中与权利要求2所述的表达载体一起构成双质粒基因编辑系统实施基因编辑。
6.一种权利要求1所述的基因编辑系统或权利要求2所述的表达载体，在做细菌基因组基因编辑中的应用。
7.一种利用权利要求2所述的表达载体在细菌中实现crRNA介导的DNA片段在基因组中定点整合。
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