CN117965416A - 一种适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法，涉及生物工程技术领域。本发明将带有自主复制序列的外源蛋白表达载体转化到丝状真菌新鲜原生质体中。在液体培养基中培养转化的原生质体，在抑制原生质体萌发的同时使外源蛋白基因瞬时表达，之后可以借助流式细胞仪等仪器高通量筛选转化子。本发明的方法可以明显缩短丝状真菌原生质体转化周期，简化操作流程，提高丝状真菌转化成功率和筛选效率，为构建工业丝状真菌微生物细胞工厂拓展了思路，并对其他丝状真菌理性高通量筛选具有重要参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法。利用PEG介导的原生质体液体转化以及抑制原生质体萌发，和丝状真菌瞬时表达可提高丝状真菌转化子筛选效率，为高通量微生物选育提供可行的方案和依据。
背景技术
丝状真菌有重要经济价值，被广泛应用于生物制造领域。比如其中的黑曲霉、米曲霉等是工业常用的发酵菌株，能高产柠檬酸，苹果酸等多种有机酸，同时还能高水平分泌糖化酶，蛋白酶等多种水解酶，也能产曲酸，洛伐他汀等多种有价值的次级代谢产物。目前工业上常用的丝状真菌生产菌株往往是通过随机诱变后筛选得到的，一方面这是种劳动密集型的低效率筛选方式，另一方面诱变的随机性也使得筛选高性状菌株的阳性率很低。
丝状真菌基因定向改造是一种获得高性状菌株成功率更高的方法，可是目前丝状真菌基因改造比较困难。这一方面是由于重组丝状真菌筛选周期长、转化效率低，另外丝状真菌菌丝的发散生长使得重组丝状真菌很难像细菌、单细胞真菌、动物细胞和植物那样用高通量的方式来快速筛选转化子。
重组丝状真菌的转化子不适合用流式细胞仪等高通量筛选的主要原因就是高通量筛选常适用于单细胞液体培养。但是在液体培养状态下，无论是丝状真菌的孢子还是原生质体都会在12h-24h之内萌发出大量菌丝并自发成团聚集，进而会堵塞筛选设备的管道，因而不适用于高通量筛选丝状真菌转化子。然而如果培养时间过短，重组丝状真菌的外源基因常常尚未表达或者表达量较低，也难以有效地高通量筛选转化子。
目前丝状真菌高通量筛选的专利虽然有数个，但同时也各自都有些局限性。一方面这些专利通常不涉及重组丝状真菌转化子的直接筛选，另一方面也未能解决液体培养状态下丝状真菌菌丝成团和外源基因表达的平衡问题。如授权专利CN 112981002 B基于流式细胞仪和孔板筛选构巢曲霉高强度的启动子，获得较为有意义的结果。但该方法实质是用常规方法构建出来不同启动子的基因改造菌株之后，再用孔板酶解菌丝制备原生质体，然后在有限的时间窗口内依据用流式细胞仪检测荧光强度来筛选强启动子。这里面高通量筛选主要涉及最后检测方面，而不涉及前期复杂的曲霉基因改造，因此整个过程也比较消耗人力物力。又如公开专利CN 116334169 A基于流式细胞仪和液滴微流控技术来筛选高产酶菌株。该方案首先通过随机突变获得大量突变株，然后用荧光底物与酶活力偶联来筛选高产株菌。该方案筛选效率较高，但实质是随机诱变或随机插入后筛选，不涉及菌株的高通量定向基因改造。
综上所述，目前重组丝状真菌高通量筛选存在两个明显缺陷：(1)丝状真菌转化效率低；(2)难以维持丝状真菌外源基因表达与菌丝迅速成团的平衡。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法。本发明使用PEG介导的原生质体液体转化将带有自主复制序列的外源蛋白表达载体导入丝状真菌新鲜原生质体，以提高转化效率。转化后将原生质体置于丰富的培养基上，使原生质体提前表达蛋白。同时抑制原生质体表达蛋白之后的菌丝萌发，使转化后的原生质体在数天内基本保持原生质体球状形态，进而适用于流式细胞仪等高通量筛选设备，可高效筛选出正确转化子。本发明可将曲霉原生质体转化筛选的周期从7-10天缩短至1-2天。转化成功率从不足0.01％提高至1％以上，使曲霉基因编辑，快速定向改造，高通量筛选建库成为可能。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
钙荧光白在抑制丝状真菌原生质体萌发菌丝中的应用。
进一步的，钙荧光白的终浓度为0.1～1mg/mL；优选为0.5～1mg/mL；更优选为0.5～0.75mg/mL。
一种适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法，包括如下步骤：
(1)将丝状真菌重组表达载体转化至丝状真菌原生质体，获得含有丝状真菌重组表达载体的原生质体；
(2)将步骤(1)的含有丝状真菌重组表达载体的原生质体在含有钙荧光白的液体培养基中培养，获得转化原生质体；
(3)对步骤(2)获得的转化原生质体使用高通量筛选设备进行高通量分选，高效筛选出转化子，再经过进一步验证，获得重组丝状真菌。
进一步的，所述丝状真菌包括曲霉和木霉等中的至少一种，优选包括黑曲霉、米曲霉、土曲霉、构巢曲霉、里氏木霉和烟曲霉等中的至少一种。
进一步的，步骤(1)中，将感兴趣基因GOI与报告基因融合，构建丝状真菌重组表达载体。
进一步的，报告基因包括荧光蛋白基因等，优选为绿色荧光蛋白基因，比如单体型增强绿色荧光蛋白基因megfp，但不限于此。
为了更好的实现感兴趣基因GOI与报告基因在丝状真菌的表达，可以对感兴趣基因GOI与报告基因进行对应丝状真菌(比如黑曲霉)密码子优化。
其中，单体型增强绿色荧光蛋白基因megfp编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述黑曲霉密码子优化的megfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，还可在融合基因的上游加上启动子、下游加上终止子，组成融合基因表达盒，构建含有融合基因表达盒的丝状真菌重组表达载体。
优选的，所述启动子为组成型强启动子，如黑曲霉来源的PgpdA或构巢曲霉来源的Ptef，或其他丝状真菌来源的组成型强启动子等。
优选的，所述终止子为构巢曲霉来源的Ttef，或其他丝状真菌来源的终止子等。
进一步的，步骤(1)中，丝状真菌重组表达载体的出发载体包括含自主复制序列的载体等；优选的，所述自主复制序列为AMA1等。具体的，出发载体包括pFC330载体等。
进一步的，步骤(1)中，所述转化所用的方法为PEG介导的原生质体转化法，具体参照丝状真菌工业微生物原生质体转化方法。简单讲就是用包含0.1％蜗牛酶，0.1％纤维素酶，0.05％溶壁酶的20mL酶解液酶解0.1～1.0g新鲜菌体，30℃，100r/min酶解3-5h，然后过四层滤布收集新鲜原生质体，用STC缓冲液清洗两次后用1mL STC缓冲液重悬，最后分装160μL；添加PEG 4000缓冲液60μL，浓度大于200ng/μL的丝状真菌重组表达载体100μL，冰上孵育30min，之后添加1.5mL PEG 4000缓冲液，常温孵育25min得到原生质体转化液。
优选的，所述原生质体颗粒饱满，有胞内环流，活力较高，不成团聚集，原生质体数目大于100000个/mL。
进一步的，步骤(2)中，所述含有钙荧光白的液体培养基为含有钙荧光白的KCl/CA高渗缓冲液与DPY培养基混合的液体培养基；
优选的，KCl/CA高渗缓冲液与DPY培养基的体积比为1：1。
将原生质体转化液加入含有钙荧光白的5mL KCl/CA高渗缓冲液，5mL DPY培养基1：1混合的高渗培养液，混合均匀并置于30℃黑暗环境下静置培养。优选的，可在高渗培养液中加入对应载体上筛选标记的抗性药品或营养成分，以提高阳性筛选率。
所述PEG 4000缓冲液由溶质和溶剂构成，溶质为PEG 4000 60％w/v，氯化钙50mM，pH＝7.5Tris-HCl 10mM，其他部分为溶剂，溶剂为蒸馏水。将溶剂与溶质混匀后，过膜除菌。
所述STC缓冲液由溶质和溶剂构成，溶质为山梨醇1.2M，氯化钙100mM，pH＝7.5Tris-HCl 10mM，其他部分为溶剂，溶剂为蒸馏水。将溶剂与溶质混匀后，过膜除菌。
所述KCl/CA高渗缓冲液由溶质和溶剂构成，溶质为氯化钾8.2％，一水柠檬酸2.1％，其他部分为溶剂，溶剂为蒸馏水。将溶剂与溶质混匀后，用氢氧化钾调节pH＝5.8，121℃高压蒸汽灭菌20min。
所述DPY培养基由溶质和溶剂构成，溶质为一水葡萄糖2.0％，酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.5％，七水合硫酸镁0.05％，其他部分为溶剂，溶剂为蒸馏水。将溶剂与溶质混匀后，115℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步的，步骤(2)中，所述钙荧光白的终浓度为0.1～1mg/mL；优选为0.5～1mg/mL；更优选为0.5～0.75mg/mL。
所述钙荧光白母液由溶质和溶剂构成，每10mL钙荧光白母液的溶质为100mg的钙荧光白，其他部分为溶剂。溶剂是二甲基亚砜，将溶剂与溶质混匀后，用0.22μm的有机系滤膜过膜除菌。
进一步的，步骤(2)中，所述培养的时间为12～72h；优选为16～72h；更优选为24～72h。
更进一步的，所述培养为黑暗环境下静置培养12～72h；优选为16～72h；更优选为24～72h。
将原生质体转化液在含有钙荧光白的高渗培养液中培养12-72h的范围之间可用于曲霉的流式细胞仪筛选。分选明显有荧光蛋白表达的菌株可进行后续表型验证或改造菌株发酵。
进一步的，步骤(3)中，所述高通量筛选设备包括流式细胞仪、微流控设备或微孔板摇床等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用带有自主复制序列的载体作为出发载体，使表达框可在曲霉原生质体水平上瞬时表达，显著提高了曲霉转化效率；
(2)本发明所用的转化后的高渗培养液兼具维持原生质体渗透压和营养丰富两个优点，能使原生质体内部导入载体的外源蛋白基因表达时间提前，能用于转化且有助于保持原生质体的活力；
(3)本发明在转化后的高渗培养液中额外添加抑制原生质萌发的物质，可以延迟原生质体萌发，并且不影响外源蛋白基因的表达，从而扩张了原生质体高通量分选的时间范围，降低了原生质体高通量筛选难度，进一步提高了转化效率。
(4)本发明将带有自主复制序列的外源蛋白表达载体转化到丝状真菌新鲜原生质体中。在液体培养基中培养转化的原生质体，在抑制原生质体萌发的同时使外源蛋白基因瞬时表达，之后可以借助流式细胞仪等仪器高通量筛选转化子。本发明的方法可以明显缩短丝状真菌原生质体转化周期，简化操作流程，提高丝状真菌转化成功率和筛选效率，为构建工业丝状真菌微生物细胞工厂拓展了思路，并对其他丝状真菌理性高通量筛选具有重要参考价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的，保护一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的流程示意图；
图2为本发明实施例1用到的原生质体萌发抑制的效果图；
图3为本发明实施例1用到的载体构建流程示意图；
图4为本发明实施例1用到的原生质体转化子流式细胞仪筛选前转化子的绿色荧光显微观察图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
本发明所涉及的菌株、原材料、试剂、仪器：黑曲霉(Aspergillus niger CBS-CT)在文献“董宏智.黑曲霉CRISPR基因组编辑技术建立与内质网磷脂调控机制的研究[D].华南理工大学.”中公开，为本实验室保藏的材料，大肠杆菌MachT1感受态细胞为本实验室保藏的材料；本发明涉及的化学试剂药品：氯化钠、柠檬酸、氯化钾、葡萄糖、七水合硫酸镁、磷酸二氢钾(天津市大茂化学试剂厂)，蜗牛酶、纤维素酶(北京鼎国昌盛生物技术公司)，蛋白胨、酵母粉(英国OXOID公司)，二甲基亚砜(DMSO)、钙荧光白(Calcofluor white，CFW)、聚乙二醇(PEG4000)、Tris、山梨醇、无水氯化钙、氨苄青霉素、溶菌酶、尿嘧啶核苷、Triton X-100(美国Sigma公司)，琼脂糖、限制性内切酶、Rapid Taq Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，Max DNA polymerase、/>Snap AssemblyMaster Mix、DNA marker、6×Loading buffer(日本TaKaRa公司)，GelRed核酸染料(美国Biotum公司)，Miracloth滤布(德国默克公司)，PCR产物纯化试剂盒、质粒大量提取试剂盒(广州捷倍斯生物科技有限公司)，其它化学试剂药品为国产或进口分析纯级别及以上；本发明所涉及的主要仪器设备：NanoDrop1000微量分光光度计(美国Thermo Fisher公司)，高压灭菌锅(MLS-3750，日本SANYO公司)，s3e流式细胞仪、DNA凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)，DNA凝胶成像仪(美国CareStream Health公司)，霉菌培养箱(SHP-450D，上海森信实验仪器有限公司)，恒温空气浴摇床(苏州培英实验仪器有限公司)，移液枪、小型台式离心机(德国Eppendorf公司)，超净工作台(SW-CJ-1FD，苏州净化有限公司)，制冰机(IMS-20广州市深华生物技术有限公司)，超纯水仪(上海领德仪器有限公司)，pH计、高精度天平(德国赛多利斯公司)，涡旋振荡器(美国SCILOGEX公司)，真空泵(DOA-P70-BN，美国PALL公司)。
pFC330质粒在文献“CN106480036A、一种具有启动子功能的DNA片段及其应用”中公开。
实施例1
本发明为了验证原生质体添加钙荧光白之后和转入瞬时表达质粒之后，能否抑制原生质体萌发，并及时表达导入质粒上的外源蛋白。可以根据实际需要选择标签蛋白，融合蛋白来应用此方法表达。下述所使用的转化方法是发明人选择的较优的实验方法，所使用的序列及材料均为本领域技术人员可以根据需要从公开渠道获得的，但是本发明的实施方案并不限于这一种方法。本发明的流程示意图如图1所示。
(1)黑曲霉菌丝体的培养：将10的4次方的黑曲霉CBS-CT孢子接种于装有100mLDPY培养基(一水葡萄糖2.0％，酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.5％，七水合硫酸镁0.05％)的三角瓶中，30℃，220r/min摇床培养2天，抽滤收集菌体，并依次用蒸馏水，0.8M氯化钠清洗菌丝两次。取0.6g，加入20mL含有0.1％蜗牛酶，0.1％纤维素酶，0.05％溶壁酶的无菌酶解液中，30℃，100r/min摇床酶解4h以释放出丰富的原生质体。新鲜酶解的原生质体经四层Miracloth神奇滤布过滤，然后用高渗溶液STC缓冲液(10mM Tris-HCl，1.2M山梨醇，100mM氯化钙，pH 7.5，先定容后调节pH，0.22μm膜过滤除菌)清洗两次后，用1mLSTC缓冲液重悬，分装160μL原生质体到2mL EP管，4℃保藏。
(2)钙荧光白抑制原生质体萌发：在原生质体中加入5倍含有1M蔗糖培养基的高渗CD培养基(1M蔗糖，2g/L氯化钾，1g/L磷酸二氢钾，3g/L硝酸钠，0.5g/L七水硫酸镁，0.01g/L七水硫酸亚铁)，0.75mg/mL的钙荧光白，以同样条件但未添加钙荧光白的原生质体作为对照。从0h到72h每24h用移液枪吸取10μL原生质体于载玻片上，轻轻盖上盖玻片，在10倍目镜10倍物镜的普通光学显微镜下观察原生质体萌发情况，如图2所示。从图2可知，未添加钙荧光白的原生质体在24h即明显萌发成团，随着时间增加菌丝增长，原生质体长成越来越大的菌团。而大的菌团会轻易堵住流式细胞仪等高通量筛选设备的液流孔，因此正常培养大于等于24h的原生质体不适用于流式细胞仪等高通量筛选。作为对比，原生质体在添加钙荧光白的高渗CD培养基中培养24h到72h的范围内，大部分原生质体仍然保持原生质体状态，少部分原生质体稍有萌发但未成团，因而适用于流式细胞仪等高通量筛选。
(3)荧光蛋白瞬时表达载体的构建：
以pUC57-megfp(pUC57-megfp由南京金斯瑞生物科技股份有限公司购买，其中megfp核酸序列经由黑曲霉密码子优化后合成)为模板，用Max DNAPolymerase以正向引物megfp-F，反向引物megfp-R，扩增megfp。同样的，以pFC330质粒为模板，用/>Max DNA Polymerase以正向引物Ttef-F，反向引物Ttef-R扩增T(Ttef half)，随后同样的，以megfp和T(Ttef half)为模板，用正向引物megfp-F，反向引物Ttef-R将megfp和T两片段融合成一个片段megfp-T，并用DNA纯化试剂盒纯化片段，megfp-T的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中第1～720bp为经黑曲霉密码子优化的megfp的核苷酸序列。用限制性内切酶Nco I，Eco72 I双酶切出发载体pFC330，之后切胶回收双酶切后的线性化载体。使用/>Snap Assembly Master Mix将megfp-T连接到双酶切后的pFC330载体，并化转到大肠杆菌MachT1感受态细胞。最后得到包含曲霉自主复制序列AMA1的megfp蛋白表达载体pFC330-megfp。质粒构建过程如图3所示。
用到的引物如下，所述引物均由广州天一辉远基因科技有限公司合成：
正向引物megfp-F：5′-aaacataacacaaccttcacatggtctcgaaaggcgaggagc-3′；
反向引物megfp-R：5′-cgaatgtccgcagatctttatttgtatagctcatccatgccgag-3′；
正向引物Ttef-F：5′-taaagatctgcggacattcgatttatgccgt-3′；
反向引物Ttef-R：5′-ccaggtcatgtaatatcacgtgataagcaaggtacacgca-3′。
(4)原生质体转化：
在步骤(1)新制备的原生质体中添加PEG 4000缓冲液(60％(w：v)PEG4000，50mM氯化钙，10mM Tris-HCl，pH 7.5，先定容后调节pH，高温高压灭菌)60μL，浓度大于200ng/μL的pFC330-megfp载体100μL，冰上孵育30min并每隔10min轻轻颠倒混匀，之后添加1.5mL PEG4000缓冲液，常温孵育25min得到原生质体转化液。
将原生质体转化液加入5mL KCl/CA高渗缓冲液(氯化钾8.2％，一水柠檬酸2.1％，用氢氧化钾调节pH＝5.8，121℃高压蒸汽灭菌20min)，5mL DPY培养基1：1混合的高渗培养液，混合均匀并置于30℃黑暗环境下静置培养12-72h。为抑制原生质体萌发，在高渗培养液中加入0.75mg/mL的钙荧光白。每隔一段时间取500μL高渗培养液，900g离心15min，富集原生质体转化子。在10倍目镜10倍物镜的荧光显微镜下，用荧光光源观察原生质体转化子荧光蛋白表达情况，用可见光源观察同一视野下原生质体的形态。典型的原生质体形态如图4所示。从图4可知，在未添加钙荧光白的转化液中培养16h原生质体就已经萌发成团，不适用于流式细胞仪的高通量筛选，而添加的钙荧光白的转化液中在16h、24h乃至72h均可观察到成功表达绿色荧光蛋白的未萌发原生质体。这一方面说明钙荧光白在抑制原生质体转化子萌发的同时不影响外源蛋白表达，另一方面也进一步验证了该方案在曲霉转化子高通量筛选的可行性。
取培养48h的原生质体转化子，900g离心15min，去上清，富集转化原生质体，经200目滤网过滤后，进样流式细胞仪在488nm激发光下分选，设定分选阳性事件500，筛选速度为1000CFU/S。之后将分选出明显有荧光的转化子接种于DPY培养基的24孔板，挑取部分提基因组验证，或者挑菌丝荧光观察，进一步确认质粒的插入情况。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料过着特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.钙荧光白在抑制丝状真菌原生质体萌发菌丝中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：钙荧光白的终浓度为0.1～1mg/mL；进一步为0.5～1mg/mL；更进一步为0.5～0.75mg/mL。
3.一种适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将丝状真菌重组表达载体转化至丝状真菌原生质体，获得含有丝状真菌重组表达载体的原生质体；
(2)将步骤(1)的含有丝状真菌重组表达载体的原生质体在含有钙荧光白的液体培养基中培养，获得转化原生质体；
(3)对步骤(2)获得的转化原生质体使用高通量筛选设备进行高通量分选，高效筛选出转化子，再经过进一步验证，获得重组丝状真菌。
4.根据权利要求3所述的适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法，其特征在于：
所述丝状真菌包括曲霉和木霉中的至少一种；进一步包括黑曲霉、米曲霉、土曲霉、构巢曲霉、里氏木霉和烟曲霉中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法，其特征在于：
步骤(2)中，所述钙荧光白的终浓度为0.1～1mg/mL；进一步为0.5～1mg/mL；更进一步为0.5～0.75mg/mL。
6.根据权利要求3所述的适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法，其特征在于：
步骤(2)中，所述培养的时间为12～72h；进一步为16～72h；更进一步为24～72h。
7.根据权利要求3～6任一项所述的适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法，其特征在于：
步骤(1)中，将感兴趣基因GOI与报告基因融合，构建丝状真菌重组表达载体；进一步的，报告基因包括荧光蛋白基因。
8.根据权利要求7所述的适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法，其特征在于：
还能在融合基因的上游加上启动子、下游加上终止子，组成融合基因表达盒，构建含有融合基因表达盒的丝状真菌重组表达载体；
所述启动子为组成型强启动子。
9.根据权利要求3～6任一项所述的适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法，其特征在于：
步骤(1)中，丝状真菌重组表达载体的出发载体包括含自主复制序列的载体；
步骤(2)中，所述含有钙荧光白的液体培养基为含有钙荧光白的KCl/CA高渗缓冲液与DPY培养基混合的液体培养基。
10.根据权利要求3～6任一项所述的适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法，其特征在于：
步骤(3)中，所述高通量筛选设备包括流式细胞仪、微流控设备或微孔板摇床。
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| CN202410143241.5A CN117965416A (zh) | 2024-02-01 | 2024-02-01 | 一种适合重组丝状真菌高通量筛选的培养方法 |
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