CN108384797A - 一种无痕迹木霉真菌基因编辑方法 - Google Patents

一种无痕迹木霉真菌基因编辑方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种无痕迹木霉真菌基因编辑方法。首先，通过两次同源重组事件并结合潮霉素B抗性筛选策略和5‑FOA致死策略获得贵州木霉ura3基因无痕敲除突变体。基于该突变体，通过同源重组方式将包含ura3基因表达框的敲除片段插入目的基因位置，并利用ura3无痕突变体的营养缺陷特征筛选出发生第一次同源重组的突变体。第二次同源重组发生后，ura3基因和目的基因均被重组去除，此时利用5‑FOA的致死特性进行反向筛选，得到目的基因被完全删除的无痕突变体。该系统得到足够优化，同源重组比例在15％以上，单基因无痕操作周期缩短在15天以内，同时还能够实现目的基因的无痕过表达，过程中不引入任何外源片段。

Description

一种无痕迹木霉真菌基因编辑方法
技术领域
本发明属于应用微生物技术领域，涉及无痕迹木霉基因循环编辑方法。
背景技术
微生物有机肥具有促进植物生长、防控土传病害的功能，能够替代或部分替代化肥，其在农业上的广泛应用符合国家“减肥减药”政策。微生物有机肥中最重要成分为各活性菌株，主要包括细菌分类中的芽孢杆菌属以及真菌分类中的木霉属丝状真菌。长期研究表明，木霉属丝状真菌具有促进植物生长(黄瓜、玉米、香蕉、西瓜等)，诱导植物外源免疫、增强植物系统抗性以及防控土传病害的功能，因其环境友好、功能多样而被广泛应用于微生物有机肥生产。
推广应用的同时，理论研究也是重中之重。木霉的理论研究主要集中在植物促生、病原菌拮抗以及秸秆利用等几个方面，涉及到真菌分子生物学、真菌遗传学、细胞生物学、植物营养学等诸多学科之间的交叉。在这一过程中，一套成熟的遗传操作手段对于木霉各功能内在机制的深入探究是必需的。本发明人所在团队前期工作表明，木霉只对少数抗生素敏感，其中潮霉素B(Hygromycin B)得以应用，并利用潮霉素B磷酸转移酶编码基因的外源导入，经转化、筛选、纯化后验证等步骤成功实现了木霉中基因的敲除和过表达。然而，木霉不同功能的内在机制十分复杂，是一种多基因参与、共同调控的结果。上述基于潮霉素B的遗传操作只能针对木霉基因组中的单个基因进行，在很多情况下对单一基因性状和功能的研究远远不能够解释多基因产物互作的综合结果(促生、拮抗、秸秆利用等)。同时，理论研究的最终目的是推向应用，对木霉各功能内在机制的深入研究帮助我们理解它是如何有效促进植物生长和防控土传病害的同时，也给我们增强其功能提供有效路径，从而不断提高微生物有机肥的田间功效。出于生物安全考虑，微生物有机肥中主要功能菌株的人工遗传改造是不能够带入任何外源DNA片段的。综上考虑，木霉的理论研究和实际应用中都需要一种无痕迹的能够实现无基因数量限制的快速、高效、可循环的基因编辑系统。
发明内容
本发明的目的是针对木霉多基因遗传操作十分困难的现实，提供一种无痕迹的可循环操作的木霉基因编辑方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一株木霉ura3基因无痕敲除突变体构建,包括以下步骤:
针对ura3基因序列设计四对引物：其中，一对引物扩增ura3基因起始密码子ATG上游的1-1.5kb序列，为上游片段；一对引物扩增上游片段到ura3基因起始密码子ATG中间的1-1.5kb序列，为基因片段；一对引物扩增目的基因终止密码子下游的500-800bp序列，为下游片段；最后一对引物扩增潮霉素B磷酸转移酶基因完整表达框，命名为HygB抗性基因表达框；上述四种不同片段之间通过引物设计使得相邻两片段之间存在25bp的末端重合区域。其中，上游片段末端与下游片段起始端重合，下游片段末端与HygB抗性基因表达框起始端重合，HygB抗性基因表达框末端与ura3基因片段起始端重合。以木霉基因组DNA为模板，利用高保真酶分别通过PCR扩增得到上游片段、下游片段、ura3基因片段，以pcDNA1质粒为模板PCR扩增得到HygB抗性基因表达框。通过融合PCR获得上游片段+下游片段+HygB抗性基因表达框+ura3基因片段的ura3基因敲除片段。将该ura3基因敲除片段转化木霉原生质体获得突变体。在含有200ppm HygB的PDA培养基上培养突变体。通过菌丝裂解试剂盒(PlantDirect PCR kit，Thermo Secientific)提取能够在含有200ppm HygB的PDA培养基上生长的突变体DNA并进行第一次同源重组验证，保留发生正确同源重组的突变体菌株，并28℃继续培养直至产孢。将发生第一次同源重组的正确突变体的孢子涂布于含有1.5mg/ml 5-FOA、5nmol尿苷的GSM固体培养基上，发生正确二次同源重组的突变体孢子能够在含有5-氟乳清酸(5-FOA)和尿苷的GSM平板上萌发并长出菌落，挑取阳性突变体并经纯化验证后得到ura3基因无痕敲除的木霉突变体。
所述的木霉为含有ura3基因的“非”营养缺陷型木霉，优选贵州木霉NJAU4742。
所述的上游片段扩增引物为5’端引物U3_upF：SEQ ID NO.1和3’端引物U3_upR：SEQ ID NO.2；下游片段扩增引物为5’端引物U3_downF：SEQ ID NO.3和3’端引物U3_downR：SEQ ID NO.4；HygB抗性基因表达框扩增引物为5’端引物hygBox_F：SEQ ID NO.5和3’端引物hygBox_R：SEQ ID NO.6；ura3基因片段扩增引物为5’端引物U3_geneF：SEQ ID NO.7和3’端引物U3_geneR：SEQ ID NO.8。
所述的融合PCR第一步反应体系中HiFi Premix 10μl，四种片段各2μl，ddH2O 2μl，反应程序为98℃1s，(98℃10s，60℃7s，72℃40s)15个循环，4℃保存。融合PCR第二步反应体系中HiFi Premix 25μl，第一步反应产物4μl，U3_upF和U3_geneR引物各2μl，ddH2O 17μl，反应程序为98℃1s，(98℃10s，60℃7s，72℃40s)30个循环，4℃保存。
所述的突变体第一次同源重组验证引物为E_u3F：SEQ ID NO.9和E_hygB_R：SEQID NO.10。
基于木霉Δura3无痕突变体的目的基因无痕敲除方法，包含以下步骤：
(1)构建目的基因敲除片段：针对目的基因序列设计四对引物：其中，一对引物扩增目的基因起始密码子ATG上游的1-1.5kb序列，为上游片段；一对引物扩增目的基因内部的1-1.5kb序列，为基因片段；一对引物扩增目的基因终止密码子下游的500-800bp序列，为下游片段；最后一对引物扩增贵州木霉的ura3基因完整表达框，全长3598bp，命名为U3表达框；上述四种不同片段之间通过引物设计使得相邻两片段之间具有25bp的末端重合区域，其中，上游片段末端与下游片段起始端重合；下游片段末端与U3表达框起始端重合；U3表达框末端与基因片段起始端重合；以木霉基因组为模板，以上述四对引物PCR扩增获得四片段后，通过融合PCR的方法将上述四种片段按上游片段+下游片段+U3表达框+基因片段进行连接，并最终获得四片段融合产物即为目的基因敲除片段；
(2)目的基因敲除片段转化权利要求1-7中任一项所述的无痕敲除ura3基因的木霉突变体原生质体；
(3)通过两次同源重组筛选获得目的基因被无痕迹敲除的木霉突变体。优选采用GSM(9.89mM KNO3，7.35mM KH2PO4，6.7mM KCl，2.03mM MgSO4·7H2O，0.9mM CaCl2，0.094mMMnSO4·H2O，0.048mM ZnSO4·7H2O，0.18mM FeSO4·7H2O，0.121mM CoCl2·6H2O，1％葡萄糖)培养基作为第一次同源重组突变体的筛选培养基，筛选到的第一次同源重组的突变体接种于PDA平板上，28℃培养产孢；将孢子涂布于含有1.5mg/ml 5-氟乳清酸(5-FOA)、5nmol尿苷的GSM固体培养基进行第二次同源重组突变体的筛选。
所述的目的基因无痕敲除方法，优选包含以下步骤：
1.1目的基因敲除片段构建：
根据研究需求，选择目的基因并从基因组中获得该基因的基因组序列。利用SnapGene等可视化软件显示目的基因序列，并设计四对引物，用于扩增敲除片段内部序列元件。其中，一对引物扩增目的基因起始密码子ATG上游的1-1.5kb序列，为上游片段；一对引物扩增目的基因内部的1-1.5kb序列，为基因片段；另一对引物扩增目的基因终止密码子下游的500-800bp序列，为下游片段；最后一对引物扩增木霉的ura3基因完整表达框，全长3598bp，命名为U3表达框。上述四种不同片段之间通过引物设计使得相邻两片段之间具有25bp的末端重合区域，通过融合PCR的方法将上述四种片段按上游片段+下游片段+U3表达框+基因片段进行连接，获得的四片段融合产物即为目的基因敲除片段，产物浓度确保在200ng/μl以上。融合PCR步骤如技术方案1中所述。
1.2木霉Δura3无痕突变体的原生质体制备
首先，配置适量PDA固体培养基(美国BD公司)并进行115℃、20min灭菌处理。准备20个左右9cm直径的PDA固体平板，并覆盖上一层灭菌的纤维膜。将50μl木霉Δura3无痕突变体的孢子(约108个/ml)均匀涂布于含有纤维膜的PDA平板上。28℃静置培养20h后，取出PDA平板，将长有菌丝的纤维膜取出并反向贴在含有3-4ml原生质体裂解液(1.2Msorbitol，0.1M KH2PO4，pH 5.6，7.5mg/ml Lysing enzyme,Sigma:L1412)的平板上，如此操作，保证每块平板处理5-7片纤维膜。接着将平板于28℃、100rpm条件下培养100min，之后在无菌超净台下将平板中的纤维膜取出，并确保大部分菌丝体保留在平板中，在此过程中可以用溶液A(1.2M sorbitol，0.1M KH2PO4，pH 5.6)冲洗纤维膜上残留的菌丝块，利用枪头反复吹吸液体中菌丝块200次以上，充分释放内部的原生质体。然后利用装有4层纱布的1.5ml管过滤上述混合液，保留下层滤液并进行2000rpm、4℃、10min的离心处理。离心结束后，弃上清，保留底部的原生质体沉淀，并用4℃的溶液B(1M sorbitol，50mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH 7.5)重悬，即得木霉Δura3无痕突变体的原生质体，确保原生质体浓度在107个/ml以上。
1.3目的基因敲除片段的转化及第一次同源重组突变体筛选、纯化和验证
原生质体转化：将200μl上述原生质体溶液、10μl目的基因敲除片段溶液和50μlPEG溶液(25％PEG6000，50mM CaCl2、10mM Tris-HCl，pH 7.5)按顺序加入15ml无菌管中，轻微混匀后冰上放置20min。接着加入2ml PEG溶液并颠倒混匀，室温放置5min，接着加入3ml溶液B并颠倒混匀。将最终约5ml转化液按500μl每份均匀涂布于含有1/2PDA和1M蔗糖的9cm平板上，平板不需吹干，涂匀即可，并且不需要封口。随后将转化平板放置于28℃静置培养约24h，待原生质体萌发后，在原有平板上覆盖一层GSM固体无机盐培养基，继续放置28℃培养。约48h后，下层实现成功转化的原生质体基因组中将包含完整的ura3基因表达框，因此能够在没有尿苷存在的GSM培养基中生长，表现出从下层的1/2PDA培养基中生长到上层的GSM培养基表面，并形成规则的类圆形生长圈。随即挑取表面菌块并转接到新的GSM固体平板上，待长满平板后利用菌丝裂解试剂盒快速释放突变体基因组DNA，并利用同源重组检测引物进行目的基因第一次同源重组发生的PCR验证。将验证正确的突变体孢子进行稀释，涂布于GSM固体平板上，挑取单孢转接到PDA固体培养基上，待菌丝生长好后再进行一次PCR验证，确保其正确性。
1.4目的基因无痕敲除突变体的筛选
上述1.3中的最终突变体为目的基因位置发生第一次同源重组的产物，敲除片段两端的上游片段和基因片段分别与目的基因位置的相同片段发生同源重组，并将U3表达框整合到目的基因位置，因此，相对于无ura3基因的营养缺陷菌株，突变体本身能够在正常GSM固体平板上生长。将突变体在PDA固体平板上的孢子进行回收，在产孢这一过程中突变体会自发的进行第二次同源重组，重组事件发生在敲除片段的下游片段和目的基因的下游片段之间，重组结果为去除所有U3表达框和目的基因序列，在目的基因位置只保留其上游片段和下游片段序列。因此，将突变体孢子涂布于含有1.5mg/ml 5-氟乳清酸(5-FOA)、5nmol尿苷的GSM固体培养基上时，未发生第二次同源重组的孢子因含有完整的ura3基因，5-FOA对其具有致死功能，相反发生第二次同源重组的孢子因ura3基因已被去除则不被致死，表现出能够在外源添加尿苷的条件下良好的生长于GSM固体平板上。因此，72h后，含有5-FOA和尿苷的GSM平板上生长出来的菌落均是发生第二次重组的目的基因无痕敲除突变体，挑取其菌丝块至新的含有5-FOA和尿苷的GSM平板上，28℃放置培养4d后，收取孢子，并进行稀释涂布，挑取单孢验证即得目的基因的无痕敲除菌株。
1.5其他目的基因的循环敲除操作
上述得到的目的基因1无痕敲除突变体实现目的基因无痕敲除的同时，也保留了木霉Δura3无痕突变体的特性，即不含有ura3基因表达框。因此其他目的基因的敲除能够以目的基因1无痕敲除突变体作为原生质体的制备菌株，按照上述方法对目的基因2进行同样操作即可得到目的基因1和2的均得到无痕敲除的突变体，以此类推，可以获得按研究人员意愿的多基因无痕敲除突变体。
1.6 ura3基因表达框的回补插入
ura3基因的缺失能够导致木霉菌株营养缺陷特征，即需要外源提供尿苷或尿嘧啶，菌株才能够正常生长。因此，在多基因编辑中最后一个基因或单个基因的无痕敲除需要将木霉内源的ura3基因表达框进行回补。以多基因编辑中最后一个基因为例具体操作步骤为：首先，通过上述融合PCR方法构建3片段同源敲除片段，即最后一个基因的上游片段+U3表达框+最后一个基因的下游片段。同时，准备其他目的基因均无痕敲除的突变体的原生质体。通过上述PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法将敲除片段导入制备的原生质体中，并按1.3所述方法进行筛选和验证。在这一过程中，敲除片段中最后一个基因的上游片段和下游片段会分别与基因组中目的基因的相应位置发生同源重组，从而将目的基因片段去除并替换成U3表达框，因此实现了最有一个基因的敲除和ura3基因的回补。
目的基因的无痕过表达方法，包含以下步骤：
过表达方法要比无痕敲除相对简单，但同样是基于木霉营养缺陷型菌株Δura3无痕突变体。过表达采用的目的基因以及其过表达所需的强启动子均为木霉的内源片段，通过融合PCR将U3表达框和目的基因过表达框融合成一个完整的片段。接着按上述2.3转化方法，将过表达片段转入木霉中并筛选出正确的突变体。过表达突变体因具有完整的木霉内源U3表达框，而能够表现出和原始菌株相同的营养利用特性，不需要外源添加尿苷或尿嘧啶，同时目的基因也能够得到正确的过表达。
本发明的有益效果:
本发明首次解决了木霉多基因操作极其困难的科研难题，实现了木霉中多基因的无痕可循环操作(基因敲除和过表达)，为微生物有机肥中的重要菌株木霉的植物促生、病原菌拮抗以及秸秆利用等功能机制的深入研究提供了强有力的方法学支撑；同时，也为微生物有机肥中功能菌株木霉的理论研究向成果转化提供了一套安全有效的无外源片段介入的遗传改造系统。
附图说明
图1贵州木霉无痕基因编辑系统原理图
图2贵州木霉NJAU4742中ura3基因无痕敲除第一次同源重组突变体的平板筛选；白色箭头所标示的菌落为敲除片段正确插入NJAU4742基因组中
图3贵州木霉NJAU4742中ura3基因无痕敲除第二次同源重组突变的平板筛选；图中黑色箭头标示及未标示的一系列白色圆斑均为发生正确二次同源重组的ura3基因无痕敲除菌株
图4贵州木霉不同突变体在不同培养基上的菌落生长直径图；NJAU4742为原始菌株，NJAU4742-Δura3为ura3基因无痕敲除突变体，NJAU4742-1为ura3基因无痕敲除过程中发生第一次同源重组突变体；GSM为GSM无机盐培养基，B为添加200ppm HygB，U为添加5nmol的尿苷
图5贵州木霉NJAU4742-Δura3中xyr1基因无痕敲除第一次同源重组突变体的平板筛选；黑色虚线圈起来的菌落为下层培养基中能够生长到上层GSM培养基表面的疑似发生第一次同源重组的突变体菌株
图6贵州木霉NJAU4742和NJAU4742-Δura3-Δxyr1木质纤维诱导的胞外蛋白SDS-PAGE图；M为蛋白质marker，C1,C2,C3为纤维素诱导72h后胞外蛋白SDS-PAGE银染泳道，X1,X2,X3为木聚糖诱导72h后胞外蛋白SDS-PAGE银染泳道。xyr1基因突变体几乎不能够分泌任何胞外蛋白。
图7贵州木霉NJAU4742中碳源抑制因子编码基因cre1的敲除及ura3基因回补验证；A为cre1基因位置发生正确同源重组的PCR验证胶图，NJAU4742-Δura3-Δxyr1-Δcre1::ura3突变体具有约1600bp的扩增产物，而NJAU4742-Δura3-Δxyr1则没有任何扩增产物。B为cre1基因片段检测胶图，NJAU4742-Δura3-Δxyr1-Δcre1::ura3因cre1基因被完全敲除则没有扩增产物，而NJAU4742-Δura3-Δxyr1有约970bp的扩增产物。C为ura3基因检测胶图，NJAU4742-Δura3-Δxyr1-Δcre1::ura3因ura3基因得到正确回补而具有约600bp的扩增产物，而NJAU4742-Δura3-Δxyr1则没有任何扩增产物。D为NJAU4742-Δura3-Δxyr1-Δcre1::ura3和NJAU4742-Δura3-Δxyr1在PDA培养基上的生长状况图。其中：a:NJAU4742-Δura3-Δxyr1-Δcre1::ura3，b：NJAU4742-Δura3-Δxyr1，M：DNAmarker，DL2000。
图8贵州木霉NJAU4742中nit3基因的无痕过表达qPCR验证；a：NJAU4742-Δura3-OEnit3::ura3，b：NJAU4742-Δura3。
生物样品保藏信息
NJAU4742，分类命名为贵州木霉Trichoderma guizhouense，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年04月11日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.12166。
具体实施方式
下面结合具体实施案例进一步阐述本发明。列举的实施案例仅用于举例说明本发明的实施方法，不用于限制本发明的使用范围。凡未注明具体实施条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件进行。
实施1：贵州木霉NJAU4742营养缺陷型菌株NJAU4742-Δura3无痕突变体构建(1)敲除片段构建
ura3的无痕敲除过程中要利用到该基因自身的有无来作为二次同源重组的筛选标记，因此在构建敲除片段的时候略有不同。敲除片段有4个不同部分组成：上游片段+下游片段+HygB抗性基因表达框+基因片段。其中，HygB抗性基因表达框能够转录并翻译成潮霉素B磷酸转移酶，使得原始菌株NJAU4742具有潮霉素B抗性，在发生二次同源重组后，HygB抗性基因表达框和ura3基因序列将共同被删除，因此可以利用5-FOA做反向筛选获得ura3基因的无痕敲除突变体。综上考虑，在第一次同源重组时，利用HygB抗性基因作为筛选标记的同时，需要不破坏ura3基因的原始表达框，否则二次同源重组则无法进行筛选。因此，敲除片段引物设计如下：上游片段扩增引物为5’端引物U3_upF：CTGTCAGGCAATTAGCACAGG(SEQID NO.1)和3’端引物U3_upR：CGGCATTGGACAAGAGCTTCTGACTAACAAGCGCCATCAATGC(SEQ IDNO.2)；下游片段扩增引物为5’端引物U3_downF：GCATTGATGGCGCTTGTTAGTCAGAAGCTCTTGTCCAATGCCG(SEQ ID NO.3)和3’端引物U3_downR：GCCATATTGATGTAAGGTAGCTCTCCGTATTCTCTGCCCTTGTTGC(SEQ ID NO.4)；HygB抗性基因表达框扩增引物为5’端引物hygBox_F：GAGAGCTACCTTACATCAATATGGC(SEQ ID NO.5)和3’端引物hygBox_R：GGTACTATGGCTTAGATGGAATACCC(SEQ ID NO.6)；基因片段扩增引物为5’端引物U3_geneF：GGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCACATTTACATCCAGGTCGACG(SEQ ID NO.7)和3’端引物U3_geneR：CTAGATATGAAGGACAGCTGGCG(SEQ ID NO.8)。利用PrimeSTAR HS DNApolymerase(TAKARA)高保真酶分别从NJAU4742基因组和pcDNA1质粒上PCR扩增得到上游片段(223ng/μl)、下游片段(236ng/μl)、基因片段(195ng/μl)和HygB抗性基因表达框(264ng/μl)。通过以下融合PCR步骤，利用胶回收试剂盒切胶回收最终长度为5950bp的敲除片段(341ng/μl，50μl)。
融合PCR第一步反应体系中HiFi Premix 10μl，片段各2μl，ddH2O 2μl；反应程序为98℃1s，(98℃10s，60℃7s，72℃40s)15个循环，4℃保存。融合PCR第二步反应体系中HiFiPremix 25μl，第一步反应产物4μl，U3_upF和U3_geneR引物各2μl，ddH2O 17μl；反应程序为98℃1s，(98℃10s，60℃7s，72℃40s)30个循环，4℃保存。
(2)原生质体转化
通过发明内容中的原生质体制备流程制备原始菌株NJAU4742新鲜原生质体(终浓度为2.51×107个/ml)。利用PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法将10μl敲除片段约3.41μgDNA与200μl原生质体混合实施转化，最终将约5ml转化液按500μl每份均匀涂布于含有1M蔗糖的PDA固体平板上，28℃放置培养24h后，在其上覆盖一层含有200ppm的HygB的固体PDA培养基，28℃继续放置培养3-5天。
(3)第一次同源重组突变体筛选及纯化
生长3-5天后的双层PDA平板，正确插入敲除片段的突变体菌株能够抵抗HygB，从而在上层含有200ppm HygB的PDA培养基中生长，因此能够观察到生长良好的白色菌丝块(如图2所示)，挑取菌块并转接到新的含有200ppm HygB的PDA平板上让其继续生长，利用菌丝裂解试剂盒(Plant Direct PCR kit，Thermo Secientific)进行突变体第一次同源重组验证,验证引物为E_u3F：AGCGAGGGACTGGGATTATGAG(SEQ ID NO.9)和E_hygB_R：CAAGTACAACCTAACAGCTGAGCAC(SEQ ID NO.10),保留发生正确同源重组的突变体菌株，并让其继续生长至产孢。
(4)第二次同源重组突变体筛选、纯化及NJAU4742-Δura3无痕突变体验证
将上述发生第一次同源重组的正确突变体的孢子涂布于含有1.5mg/ml5-FOA、5nmol尿苷的GSM固体培养基上，28℃培养3-5d后观察孢子萌发和生长情况。如图3所示，发生二次同源重组的片段能够在含有5-FOA和尿苷的GSM平板上萌发并长出菌落，挑取突变体并进行纯化验证后得到NJAU4742-Δura3无痕突变体。如图4所示，对原始菌株NJAU4742、发生第一次同源重组的突变菌株以及NJAU4742-Δura3无痕突变体进行功能验证表明：NJAU4742不能够在HygB平板上生长，同时也不能够在含有5-FOA的平板上生长，这表明NJAU4742具有完整的ura3基因表达框但不具有HygB抗性；发生第一次同源重组的突变菌株能够在HygB平板上生长但不能够在含有5-FOA的平板上生长，这表明其具有完整的HygB抗性基因表达框和完整的ura3基因表达框；NJAU4742-Δura3无痕突变体不能够在HygB平板上生长，但能够在含有5-FOA的平板上生长，这表明NJAU4742-Δura3无痕突变体不具有HygB抗性基因表达框，也不具有ura3基因表达框。
实施2：贵州木霉NJAU4742木质纤维降解酶调控基因xyr1的无痕敲除
木霉菌株：贵州木霉NJAU4742-Δura3(NJAU4742-Δura3)
(1)敲除片段构建
敲除片段扩增引物分别为：上游片段扩增引物x1_upF：GGCCTTGAAACGGTATGTCGA(SEQ ID NO.11)和x1_upR：CGTACACACCATCACAGGGATATCAATAGGAGATGGCTGAACTGTGTG(SEQID NO.12)；下游片段扩增引物x1_downF：CACACAGTTCAGCCATCTCCTATTGATATCCCTGTGATGGTGTGTACG(SEQ ID NO.13)和x1_downR：GCCATATTGATGTAAGGTAGCTCTCCTCACTTCCGCTTCACATAGACC(SEQ ID NO.14)；U3表达框扩增引物U3box_F：GAGAGCTACCTTACATCAATATGGCGCGCAGATGTAGCGGTACATG(SEQ ID NO.15)和U3box_R：GGTACTATGGCTTAGATGGAATACCCCGTATTCTCTGCCCTTGTTGC(SEQ ID NO.16)；基因片段扩增引物x1_geneF：GGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCCTTCTTCAGCCCTTGATCCACAC(SEQ IDNO.17)和x1_geneR：CCTTGATTCACACGCAAATGTTCC(SEQ ID NO.18)。通过融合PCR构建敲除片段的终浓度为263ng/μl，共40μl。
(2)原生质体转化
按上述PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法，获得约5ml转化液，500μl每份涂布于含有1M蔗糖的1/2PDA平板上，28℃放置培养24h后，在上面覆盖一层固体GSM培养基，28℃继续培养。
(3)第一次同源重组突变体筛选及纯化
上述双层筛选平板于28℃培养培养48-72h后，会在上层GSM培养基表面长出明显的圆形菌块，如图5所示。将各圆形菌块的突变体接种于新的GSM固体平板上，利用菌丝裂解试剂盒(Plant Direct PCR kit，Thermo Secientific)进行第一次同源重组验证，验证引物为E_x1_F，AGCGAGGGACTGGGATTATGAG(SEQ ID NO.19)和Eu3box_R，CATCCAATGCAATGCATGCGAG(SEQ ID NO.20)。验证共获得3个独立的发生第一次同源重组的突变体。
(4)第二次同源重组突变体筛选、纯化及NJAU4742-Δura3-Δxyr1无痕突变体验证
将3个独立发生第一次同源重组的突变体分别接种于PDA平板上，28℃培养产孢。将其孢子涂布于含有1.5mg/ml 5-FOA、5nmol尿苷的GSM固体培养基上，5d后突变体1和突变体2的GSM平板上分别出现大量由孢子萌发生长而成的圆形小菌块，突变子3则无任何菌块生长，推测可能是发生同源重组的同时，敲除片段也随机插入到染色体其他位置，随机插入的片段不能够发生二次同源重组，因此ura3基因表达框不能够被消除，从而导致突变体不能够在含有5-FOA的GSM平板上生长。
xyr1基因的无痕敲除共获得2个独立的NJAU4742-Δura3-Δxyr1突变体。对其进行功能研究表明xyr1基因的缺失，能够使得贵州木霉NJAU4742完全丧失木质纤维降解酶的诱导和分泌能力。具体检测方法为，将NJAU4742-Δura3-Δxyr1突变体和原始菌株NJAU4742分别接种于GSM液体培养基中，28℃、150rpm培养48h，接着通过2层无菌纱布过滤获得突变体和原始菌株的菌丝体，并分别转接到含有1％(w/v)木聚糖或纤维素的GSM液体培养基(不添加葡萄糖)中继续进行木质纤维降解酶的诱导培养。72h后，回收液体发酵液，10000rpm离心5min并保留上清。将NJAU4742-Δura3-Δxyr1突变体和原始菌株的发酵上清液通过SDS-PAGE的方法进行蛋白分离，并通过银染进行蛋白显色。结果显示，NJAU4742-Δura3-Δxyr1不能够分泌包括木质纤维降解酶在内的任何胞外蛋白(如图6所示)。
实施3：贵州木霉NJAU4742碳源抑制调控基因cre1无痕敲除及ura3基因回补木霉菌株：贵州木霉NJAU4742-Δura3-Δxyr1(NJAU4742-Δura3-Δxyr1)
(1)同源敲除片段构建
敲除片段为：cre1基因上游片段+U3表达框+cre1基因下游片段。扩增引物分别为：上游片段扩增引物c1_upF：GGTGGGCAAAAAGGAACCTGG(SEQ ID NO.21)和c1_upR：GCCATATTGATGTAAGGTAGCTCTCAGAGATTATCCGCTGGTGGAGTG(SEQ ID NO.22)；U3表达框扩增引物U3box_F：GAGAGCTACCTTACATCAATATGGCGCGCAGATGTAGCGGTACATG(SEQ ID NO.23)和U3box_R：GGTACTATGGCTTAGATGGAATACCCCGTATTCTCTGCCCTTGTTGC(SEQ ID NO.24)；下游片段扩增引物c1_downF：GGGTATTCCATCTAAGCCATAGTACCGCGCCTCGAATGACTTGATGAC(SEQ IDNO.25)和c1_downR：GCCCTACGAGAATGTCGGTTC(SEQ ID NO.26)。通过融合PCR构建敲除片段的终浓度为383ng/μl，共40μl。
(2)原生质体转化
按上述PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法，获得约5ml转化液，500μl每份涂布于含有1M蔗糖的1/2PDA平板上，28℃放置培养24h后，在上面覆盖一层固体GSM培养基，28℃继续培养。
(3)cre1无痕敲除及ura3基因回补突变体的筛选和纯化
上述双层筛选平板于28℃培养培养48-72h后，会在上层GSM培养基表面长出明显的圆形菌落，将其转接到新的GSM固体平板上，利用菌丝裂解试剂盒进行同源重组验证，验证引物为E_c1_F：CACACCAGACCAAGCCGTATTC(SEQ ID NO.27)和Eu3box_R：CATCCAATGCAATGCATGCGAG(SEQ ID NO.28)，该对引物能够检测敲除片段正确同源重组到目的基因位置，PCR产物正确大小约为1600bp。对正确突变体进行产孢并稀释涂布，挑取单孢到新的GSM培养基上，28℃继续培养。通过验证引物E_c1_F和Eu3box_R继续验证正确同源重组片段；验证引物cre1_F，GTGCCCTCTTTGTGAAAAGGC(SEQ ID NO.29)和cre1_R，GCAGTTGAACTTCTGCCGCT(SEQ ID NO.30)验证cre1基因是否敲除，扩增产物为cre1基因内部约970bp片段，发生完全敲除突变体则无该PCR产物；通过验证引物ura3_F：ATGACATGGTCTCTGGATGGG(SEQ ID NO.31)和ura3_R：GTTGCCTTGGCTAGACATCTGG(SEQ IDNO.32)验证ura3基因成功回补，正确回补的PCR产物约为600bp。实验结果表明cre1基因被完全敲除，且ura3基因完整表达框得到回补(如图7所示)，所得突变体NJAU4742-Δura3-Δxyr1-Δcre1::ura3能够在不添加尿苷或尿嘧啶的GSM培养基上生长。cre1基因的无痕敲除则会导致菌株在PDA培养基上极性生长缓慢，表现出与原始菌株NJAU4742完全不同的菌落形态(如图7所示)。
实施4：贵州木霉NJAU4742生长素合成相关基因nit3的无痕过表达
木霉菌株：贵州木霉NJAU4742-Δura3(NJAU4742-Δura3)
(1)过表达片段构建
过表达片段构建的内部元件顺序为：内源性强启动子序列+nit3完整基因序列+nit3完整终止子序列+U3表达框。内源性强启动子序列通过引物P_F：CTGATCTGGGTTGCACGCTTG(SEQ ID NO.33)和引物P_R：GATGATTGATGTGGGTTGTTTTGGG(SEQ IDNO.34)从NJAU4742基因组DNA中扩增得到；nit3完整基因序列+nit3完整终止子序列通过引物nit3_F：CCCAAAACAACCCACATCAATCATCATGAGCGAAACTATCAAAGTTGGC(SEQ ID NO.35)和引物nit3_R：GCCATATTGATGTAAGGTAGCTCTCCCAACTAGCAAGTACCTCGAGC(SEQ ID NO.36)从NJAU4742基因组DNA中扩增得到；U3表达框通过引物U3box_F：GAGAGCTACCTTACATCAATATGGCGCGCAGATGTAGCGGTACATG(SEQ ID NO.37)和U3box_R：GGTACTATGGCTTAGATGGAATACCCCGTATTCTCTGCCCTTGTTGC(SEQ ID NO.38)从NJAU4742基因组DNA中扩增得到。通过上述融合PCR步骤获得最终过表达片段产物，浓度为268ng/μl，共40μl。
(2)过表达片段转化
按上述PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法，获得约5ml转化液，500μl每份涂布于含有1M蔗糖的1/2PDA平板上，28℃放置培养24h后，在上面覆盖一层固体GSM培养基，28℃继续培养。
(3)过表达突变子筛选、纯化及qPCR验证
上述双层筛选平板于28℃培养培养48-72h后，会在上层GSM培养基表面长出明显的圆形菌落，将其转接到新的GSM固体平板上，利用菌丝裂解试剂盒提取突变体DNA，通过PCR验证过表达片段是否被正确插入基因组中，验证引物为nit3_F：CCCAAAACAACCCACATCAATCATCATGAGCGAAACTATCAAAGTTGGC(SEQ ID NO.39)和Eu3box_R：CATCCAATGCAATGCATGCGAG(SEQ ID NO.40)，PCR验证产物大小约为2200bp。过表达突变体基因型为NJAU4742-Δura3-OEnit3::ura3。突变体能够在不添加尿苷或尿嘧啶的GSM培养基上正常生长，ura3基因的得到正确回补。
将突变子NJAU4742-Δura3-OEnit3::ura3和原始菌株NJAU4742在28℃、150rpm进行GSM液体培养基发酵，48h后回收二者菌丝体。利用RNA提取试剂盒(RNeasy Plant MiniKit，QIAGEN)提取突变体和原始菌株总RNA，接着通过cDNA反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT-PCR Kit，TAKARA)将总RNA中的mRNA反转录成cDNA。然后，利用定量PCR试剂盒(SYBRPremix Ex TaqTM Kit，TAKARA)进行nit3基因转录水平的验证，内参基因选择木霉属管家基因tef1的定量引物qtef1-F：TACAAGATCGGTGGTATTGGAACA(SEQ ID NO.41)和qtef1-R：AGCTGCTCGTGGTGCATCTC(SEQ ID NO.42)。qPCR验证结果表明，nit3过表达突变体NJAU4742-Δura3-OEnit3::ura3中nit3的表达量要比原始菌株NJAU4742高约360倍(如图8所示)，这表明nit3基因过表达成功。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种无痕迹木霉真菌基因编辑方法
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgtcaggca attagcacag g 21
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggcattgga caagagcttc tgactaacaa gcgccatcaa tgc 43
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcattgatgg cgcttgttag tcagaagctc ttgtccaatg ccg 43
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccatattga tgtaaggtag ctctccgtat tctctgccct tgttgc 46
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagagctacc ttacatcaat atggc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtactatgg cttagatgga atacc 25
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggtattcca tctaagccat agtacccaca tttacatcca ggtcgacg 48
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctagatatga aggacagctg gcg 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agcgagggac tgggattatg ag 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caagtacaac ctaacagctg agcac 25
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggccttgaaa cggtatgtcg a 21
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgtacacacc atcacaggga tatcaatagg agatggctga actgtgtg 48
<210> 13
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cacacagttc agccatctcc tattgatatc cctgtgatgg tgtgtacg 48
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gccatattga tgtaaggtag ctctcctcac ttccgcttca catagacc 48
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagagctacc ttacatcaat atggcgcgca gatgtagcgg tacatg 46
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggtactatgg cttagatgga ataccccgta ttctctgccc ttgttgc 47
<210> 17
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gggtattcca tctaagccat agtacccttc ttcagccctt gatccacac 49
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccttgattca cacgcaaatg ttcc 24
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agcgagggac tgggattatg ag 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
catccaatgc aatgcatgcg ag 22
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggtgggcaaa aaggaacctg g 21
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gccatattga tgtaaggtag ctctcagaga ttatccgctg gtggagtg 48
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagagctacc ttacatcaat atggcgcgca gatgtagcgg tacatg 46
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggtactatgg cttagatgga ataccccgta ttctctgccc ttgttgc 47
<210> 25
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gggtattcca tctaagccat agtaccgcgc ctcgaatgac ttgatgac 48
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gccctacgag aatgtcggtt c 21
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cacaccagac caagccgtat tc 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
catccaatgc aatgcatgcg ag 22
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gtgccctctt tgtgaaaagg c 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gcagttgaac ttctgccgct 20
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgacatggt ctctggatgg g 21
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gttgccttgg ctagacatct gg 22
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctgatctggg ttgcacgctt g 21
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gatgattgat gtgggttgtt ttggg 25
<210> 33
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccaaaacaa cccacatcaa tcatcatgag cgaaactatc aaagttggc 49
<210> 34
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccatattga tgtaaggtag ctctcccaac tagcaagtac ctcgagc 47
<210> 35
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagagctacc ttacatcaat atggcgcgca gatgtagcgg tacatg 46
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtactatgg cttagatgga ataccccgta ttctctgccc ttgttgc 47
<210> 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccaaaacaa cccacatcaa tcatcatgag cgaaactatc aaagttggc 49
<210> 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
catccaatgc aatgcatgcg ag 22
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
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<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
agctgctcgt ggtgcatctc 20

Claims (12)

1.一株无痕敲除ura3基因的木霉突变体，其特征在于按照以下方法构建得到：针对ura3基因序列设计四对引物：其中，一对引物扩增ura3基因起始密码子ATG上游的1-1.5kb序列，为上游片段；一对引物扩增上游片段到ura3基因起始密码子ATG之间的1-1.5kb序列，为基因片段；一对引物扩增目的基因终止密码子下游的500-800bp序列，为下游片段；最后一对引物扩增潮霉素B磷酸转移酶基因完整表达框，命名为HygB抗性基因表达框；上述四种不同片段之间通过引物设计使得相邻两片段之间具有25bp的末端重合区域，其中，上游片段末端与下游片段起始端重合；下游片段末端与HygB抗性基因表达框起始端重合；HygB抗性基因表达框末端与ura3基因片段起始端重合；利用高保真酶从木霉基因组上分别通过PCR扩增得到上游片段、下游片段、ura3基因片段，从pcDNA1质粒上PCR扩增得到HygB抗性基因表达框；通过融合PCR获得上游片段+下游片段+HygB抗性基因表达框+ura3基因片段的ura3基因敲除片段；将该ura3基因敲除片段转化木霉原生质体获得突变体；在含有HygB的PDA培养基上培养突变体，对能够在含有HygB的PDA培养上生长的木霉利用菌丝裂解试剂盒进行突变体第一次同源重组验证，保留发生正确同源重组的突变体菌株，并让其继续生长至产孢；将上述发生第一次同源重组的正确突变体的孢子涂布于含有1.5mg/ml 5-FOA、5nmol尿苷的GSM固体培养基上进行培养，发生二次同源重组的片段能够在含有5-FOA和尿苷的GSM平板上萌发并长出菌块，挑取阳性突变体并进行纯化验证后得到无痕敲除ura3基因的木霉突变体。
2.根据权利要求1所述的木霉突变体，其特征在于所述的木霉为含有ura3基因的木霉。
3.根据权利要求2所述的木霉突变体，其特征在于所述的木霉为贵州木霉NJAU4742。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的上游片段扩增引物为5’端引物U3_upF：SEQ ID NO.1和3’端引物U3_upR：SEQ ID NO.2；下游片段扩增引物为5’端引物U3_downF：SEQ ID NO.3和3’端引物U3_downR：SEQ ID NO.4；HygB抗性基因表达框扩增引物为5’端引物hygBox_F：SEQ ID NO.5和3’端引物hygBox_R：SEQ ID NO.6；ura3基因片段扩增引物为5’端引物U3_geneF：SEQ ID NO.7和3’端引物U3_geneR：SEQ ID NO.8。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的融合PCR第一步反应体系中HiFiPremix 10μl，四种片段各2μl，ddH2O 2μl；反应程序为98℃1s，(98℃10s，60℃7s，72℃40s)15个循环，4℃保存；融合PCR第二步反应体系中HiFi Premix 25μl，第一步反应产物4μl，U3_upF和U3_geneR引物各2μl，ddH2O 17μl；反应程序为98℃1s，(98℃10s，60℃7s，72℃40s)30个循环，4℃保存。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的突变体第一次同源重组验证引物为E_u3F：SEQ ID NO.9和E_hygB_R：SEQ ID NO.10。
7.权利要求1-6中任一项所述的无痕敲除ura3基因的木霉突变体在木霉基因组编辑中的应用。
8.一种无痕迹木霉真菌基因敲除方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)构建目的基因敲除片段：针对目的基因序列设计四对引物：其中，一对引物扩增目的基因起始密码子ATG上游的1-1.5kb序列，为上游片段；一对引物扩增目的基因内部的1-1.5kb序列，为基因片段；一对引物扩增目的基因终止密码子下游的500-800bp序列，为下游片段；最后一对引物扩增贵州木霉的ura3基因完整表达框，全长3598bp，命名为U3表达框；上述四种不同片段之间通过引物设计使得相邻两片段之间具有25bp的末端重合区域，其中，上游片段末端与下游片段起始端重合；下游片段末端与U3表达框起始端重合；U3表达框末端与基因片段起始端重合；以木霉基因组为模板，以上述四对引物PCR扩增成功获得四片段后，通过融合PCR的方法将上述四种片段按上游片段-下游片段-U3表达框-基因片段进行连接，并最终获得四片段融合产物即为目的基因敲除片段；
(2)目的基因敲除片段转化权利要求1-7中任一项所述的无痕敲除ura3基因的木霉突变体原生质体；
(3)通过两次同源重组筛选获得目的基因被无痕迹敲除的木霉突变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于采用GSM培养基作为第一次同源重组突变体的筛选培养基，筛选到的第一次同源重组的突变体接种于PDA平板上，28℃培养产孢；将孢子涂布于含有1.5mg/ml 5-氟乳清酸(5-FOA)、5nmol尿苷的GSM固体培养基进行第二次同源重组突变体的筛选。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于当需要敲除多个目的基因时，以目的基因1无痕敲除菌株替换无痕敲除ura3基因的木霉突变体作为原生质体的制备菌株，按照权利要求9所述的方法对目的基因2进行同样操作即可得到目的基因1和2的无痕敲除菌株，以此类推，可以获得多个目的基因敲除的无痕菌株。
11.根据权利要求10所述方法，其特征在于当进行到多基因敲除最后一个基因的无痕敲除过程时，需要对ura3基因进行回补以恢复木霉正常营养利用特征,具体包括以下步骤：
(1)构建最后一个目的基因的敲除片段：针对最后一个目的基因序列设计三对引物：其中，一对引物扩增目的基因起始密码子ATG上游的1-1.5kb序列，为上游片段；另一对引物扩增目的基因终止密码子下游的1-1.5kb序列，为下游片段；最后一对引物扩增贵州木霉的ura3基因完整表达框，全长3598bp，命名为U3表达框；上述三种不同片段之间通过引物设计而使得相邻两片段之间具有25bp的末端重合区域，其中，上游片段末端与U3表达框起始端重合；U3表达框末端与下游片段起始端重合；以木霉基因组为模板，以上述三对引物PCR扩增成功获得三片段后，通过融合PCR的方法将上述三种片段按上游片段-U3表达框-下游片段进行连接，并最终获得三片段融合产物即为最后一个目的基因的敲除片段；
(2)目的基因敲除片段转化权利要求10中除最后一个目的基因外其他所有目的基因均被无痕敲除的木霉突变体的原生质体；
(3)通过一次同源重组筛选获得最后一个目的基因也被无痕敲除的突变体，该突变体为所有目的基因均被无痕敲除的突变体，且ura3基因被正确回补到最后一个目的基因原先所在的基因组位置。
12.一种无痕迹木霉真菌基因过表达方法，其特征在于所述的方法包括：通过融合PCR将U3表达框和目的基因过表达框融合成一个完整的片段；通过原生质体转化将过表达片段转入权利要求1-7中任一项所述的无痕敲除ura3基因的木霉突变体中并筛选出正确的突变体；其中过表达的目的基因以及其过表达所需的强启动子均为木霉的内源片段。
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