CN104673780B

CN104673780B - 一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合的方法

Info

Publication number: CN104673780B
Application number: CN201510151684.XA
Authority: CN
Inventors: 范寰; 刘西周; 郭成金; 燕晓翠; 涂苑楠; 孟繁瑞; 马蕊; 马恒德
Original assignee: Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science
Current assignee: Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-04-02
Filing date: 2015-04-02
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2035-04-02
Also published as: CN104673780A

Abstract

本发明公开了一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体的融合方法，是将糙皮侧耳和酿酒酵母制备出的原生质体，然后对糙皮侧耳原生质体进行60℃水浴处理10 min热灭活，酿酒酵母原生质体在距离15W紫外灯20cm处照射230s进行紫外灭活，采用化学融合和电融合。最后从17个融合子中，通过生长速度和木质素降解率的比较，获得了6株生产速度比亲本糙皮侧耳提高1.45‑16.33%左右，木质素降解率提高1.76‑4.16倍的融合子。本发明可以将糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合。该技术可重复性较强，遗传稳定性好且方法简便属于非转基因育种方式，没有创造新基因，不存在基因污染问题。

Description

一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合的方法

技术领域

本发明涉及微生物育种技术领域，更具体地说，是涉及木质素降解菌糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体的融合方法。

背景技术

木质素是构成植物细胞壁的主要成分，是影响动物消化植物性饲料的关键所在。白腐真菌是迄今发现降解木质素最有效的微生物，也是经常用于木质素降解研究的模式菌株。但在自然状态下，由于白腐真菌的定植缓慢，很难形成优势种群，其要求的发酵条件较严格，目前大多数的研究还仅限于实验室的小试阶段。糙皮侧耳作为一种白腐真菌，除具有食用和药用价值外，还具有很强的木质素和纤维素的降解能力，在生物处理过程中能产生并积累大量的微生物菌体蛋白及其他有用代谢产物，如：有机酸醇、酯、维生素和微量元素等使饲料变软变香，并含有多种消化酶，多种未知的促生长因子，能增强动物的抗病能力，刺激其生长发育。有些代谢产物对饲料还具有防腐作用（乳酸和乙醇等），能延长饲料的保质期。酿酒酵母其生长速度快，代谢产物有丰富的优质蛋白、B族维生素和矿物质。基于细胞融合技术原理，将糙皮侧耳和酿酒酵母作为二亲本，对糙皮侧耳原生质体和酿酒酵母原生质体进行化学和电融合，构建出兼具两亲本的优良特性，可有效降解植物性饲料中的木质素，改善高木质素含量粗饲料的营养结构的新菌株。糙皮侧耳属真菌界，担子菌门，伞菌亚门，伞菌纲，伞菌亚纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属。酿酒酵母属真菌界，子囊菌门，半子囊菌纲，酵母目，酵母科，酵母属。糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体融合属于门间融合，查阅资料国内外尚无糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体融合育种报道。

发明内容

本发明公开了一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）分别制备出糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体，然后对糙皮侧耳原生质体进行60℃水浴处理10 min热灭活，侧耳原生质体灭活率达到100％；酿酒酵母原生质体在距离15W紫外灯20cm处照射230s进行紫外灭活，酿酒酵母原生质体灭活率达到100％；

（2）将两亲本原生质体溶液浓度调至10⁵个/mL，分别取双亲原生质体各0.5 mL以重量份数比为1:1混合，4000 r/min离心10 min，弃上层液，得原生质体后加入蔗糖渗稳剂1mL和浓度为30%-45%PEG4000-（0.02 -0.08mol/L ）CaCl₂ 1 mL，调整pH5-pH11；所述的蔗糖渗稳剂指的是0.6 mol /L蔗糖溶液。

（3）将上述原生质体混匀后迅速置于恒温水浴中，在20-35℃条件下进行5-30 min的化学融合，不同时间取样4000 r/min离心10 min，弃上清液；再用蔗糖渗稳剂洗涤2次，去除PEG4000，将得到的原生质体沉淀用蔗糖渗稳剂稀释，定容至1 mL，取其稀释液涂布于固体再生培养基（葡萄糖20 g/L、酵母粉2 g/ L、麦麸（浸提液）15 g/L、蔗糖15 g/L、 KH2 PO41. 5 g/L、MgSO4 7H2 O 0. 05 g /L和维生素 B1 4 mg /L，琼脂20 g/L ，硫酸镁0.6 mol/L）上，置于27℃恒温培养箱中，避光培养22 -30 d，观察记录菌落生长情况并计数，计算融合率；

（4）将两亲本原生质体溶液浓度调至10⁷个/mL，分别取双亲原生质体各0.5 mL以重量份数比为1:1混合，4000 r/min离心10 min，弃上层液，得原生质体后加入PM缓冲液，洗涤2次，定容1mL，用无菌液枪将50-200μl的原生质体混合液加入CRY-3型电融合仪的融合小室，打开融合仪电源，调节交变电压20-50 V、交变电场频率800-1100 kHz、脉冲场强4-7kV／cm、脉冲个数3-6个及脉冲间隔10-80uS到所需位置，时隔30s先后按下成串脉冲、融合脉冲和脉冲触发开关，30s后将小室内溶液吸出并用0.6 mol /L甘露醇稀释，定容至1 mL，取其稀释液涂布于固体再生培养基（蛋白胨 20 g/L、葡萄糖 20 g/L、酵母粉 10 g/L、琼脂 20g/L、山梨醇0.6 mol/L）上，置于27℃恒温培养箱中，避光培养22 -30 d，定期观察记录菌落生长情况并计数，计算融合率；

所述的PM缓冲液指的是：甘露醇和氯化钙配成0. 6 mol /L 质量浓度溶液。

本发明采用常规方法制备出糙皮侧耳（涂苑楠，范寰等，糙皮侧耳的原生质体制备和再生条件的研究[J]. 饲料研究，2013，4：29-31，56.）和酿酒酵母的原生质体（马恒德，郭成金. 啤酒酵母原生质体制备与再生条件的筛选[J]. 中国酿造，2012，31（2）：140-144.）后，对糙皮侧耳原生质体进行60℃水浴处理10 min热灭活，侧耳原生质体灭活率达到100％；酿酒酵母原生质体在距离15W紫外灯20cm处照射230s进行紫外灭活，酿酒酵母原生质体灭活率达到100％，再通过L₁₆（4⁵）正交试验设计获得糙皮侧耳和酿酒酵母的化学融合方法：PEG 4000浓度为30-45%与0.02-0.08 mol/L Ca²⁺的混合溶液（pH5-pH11）作为促融剂，在20-35℃条件下融合5-30 min，融合率达到1.046 -26.09 × 10^-4，共获得183株再生菌株，经颉颃鉴定试验、菌丝形态学比较和随机扩增多态性DNA（Random AmplifiedPolymorphic DNA，RAPD）分子鉴定，得到14个融合株，分别为A、B、C、D、G、I、L、M、N、O、P、X、Y、Z。

颉颃鉴定试验

如图1显示，14株疑似融合株与亲本间均存在明显的颉颃现象，其中菌株A、C、L、N、O、Y与亲本对峙生长，颉颃线处有沟；D、G、I、M、P与亲本对峙生长，颉颃线处形成脊；B越过颉颃线覆盖亲本；X、Z则是被亲本覆盖；B、D在颉颃线处有褐色液体分泌。菌丝形态学比较结果显示（见表1和图2），融合株菌丝体均与糙皮侧耳相似。

表1 亲本与融合株菌丝形态比较结果

注：粗细：< 表示菌丝较糙皮侧耳的细，= 表示菌丝与糙皮侧耳相当，> 表示菌丝较糙皮侧耳的粗；分支：< 表示分支较糙皮侧耳的少，= 表示分支与糙皮侧耳相当，> 表示分支较糙皮侧耳的多；+：有隔膜与锁状联合。

RAPD结果

RAPD扩增结果与多态性分析

用筛选出来的5条RAPD引物对双亲菌株及14株融合株的DNA进行扩增，扩增结果如图3所示；

RAPD-PCR共扩增出了553条较为清晰DNA 条带，片段大小在100~1500之间，比较电泳图发现，5种引物在所有的供试材料中均能获得不同的DNA条带，显示出亲本及融合株各自的特异性，同时亲本与融合株及融合株间又具有相同的条带，说明了亲本与融合株及融合株间的亲缘关系。

相似系数分析

RAPD标记数据计算双亲菌株与融合株间的遗传相似系数范围在0.13~0.58，说明14株再生菌株均为两亲本的融合株。融合株A、C、D、G、I、L、M、N、O、Z与糙皮侧耳的相似系数均大于与啤酒酵母的相似系数，而B、P、X、Y与酿酒酵母的相似系数均大于与糙皮侧耳的相似系数，说明A、C、D、G、I、L、M、N、O、Z与糙皮侧耳亲缘关系较近，B、P、X、Y与酿酒酵母亲缘关系较近，其中Y与酿酒酵母亲缘关系最近，Z与糙皮侧耳亲缘关系最近（结果见表2）：

表2 RAPD法分析16菌株及亲本间相似系数

（母：亲本酿酒酵母，耳：亲本糙皮侧耳，A、B、C、D、G、I、L、M、N、O、P、X、Y、Z为14株融合株）。

聚类分析

通过NTSYS-PC软件构建融合株与亲本遗传相似性聚类分析图（如图4），直观地反映出亲本和融合株之间的遗传差异以及各自亲缘关系的远近。

糙皮侧耳和酿酒酵母的电融合方法：

采用本技术领域常规方法制备出糙皮侧耳（涂苑楠，范寰等，糙皮侧耳的原生质体制备和再生条件的研究[J]. 饲料研究，2013，4：29-31，56.）和酿酒酵母的原生质体（马恒德，郭成金. 啤酒酵母原生质体制备与再生条件的筛选[J]. 中国酿造，2012，31（2）：140-144.）后，对糙皮侧耳原生质体进行60℃水浴处理10 min热灭活，侧耳原生质体灭活率达到100％；酿酒酵母原生质体在距离15W紫外灯20cm处照射230s进行紫外灭活，酿酒酵母原生质体灭活率达到100％，再通过L₁₆（4⁵）正交试验设计获得糙皮侧耳和酿酒酵母的电融合方法：采用宁波新芝生物科技股份有限公司CRY-3型电融合仪，交变电压20-50 V，交变电场频率800-1100 kHz，脉冲场强4-7kV／cm，脉冲个数3-6个，脉冲间隔10-80uS，进行电融合，融合率达到2.37-43.96×10^-6，共获得42株再生菌株，经颉颃鉴定试验、菌丝形态学比较和随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）分子鉴定，得到3个融合株，分别为S、T、G₅。

颉颃鉴定试验

如图5显示，3株疑似融合株与亲本间均存在明显的颉颃现象，其中菌株S、T与亲本对峙生长，颉颃线处有沟；G₅与亲本对峙生长，颉颃线处形成脊。

菌丝形态学比较

菌丝形态学比较结果显示（见表3和图6），融合株菌丝体均与糙皮侧耳相似：

注：粗细：< 表示菌丝较糙皮侧耳的细，= 表示菌丝与糙皮侧耳相当，> 表示菌丝较糙皮侧耳的粗；分支：< 表示分支较糙皮侧耳的少，= 表示分支与糙皮侧耳相当，> 表示分支较糙皮侧耳的多；+：有隔膜与锁状联合

RAPD结果

用筛选出来的5条RAPD引物对双亲菌株及3株融合株的DNA进行扩增，扩增结果如图7所示。

RAPD-PCR共扩增出了164条较为清晰DNA 条带，片段大小在100~1500之间，比较电泳图发现，5种引物在所有的供试材料中均能获得不同的DNA条带，显示出亲本及融合株各自的特异性，同时亲本与融合株及融合株间又具有相同的条带，说明了亲本与融合株及融合株间的亲缘关系。

相似系数分析

表4 RAPD法分析3菌株及亲本间相似系数

（耳：亲本糙皮侧耳，母：亲本酿酒酵母，S、T、G5为3株融合株）

聚类分析

通过NTSYS-PC软件构建融合株与亲本遗传相似性聚类分析图（如图8），直观地反映出亲本和融合株之间的遗传差异以及各自亲缘关系的远近。由图可以看出融合株G₅与亲本糙皮侧耳亲缘关系较近，而S和T与亲本酿酒酵母亲缘关系较近。

本发明更加详细的描述如下：

（1）采用本技术领域常规方法分别制备出糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体。

（2）采用本技术领域常规方法分别对糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体进行热灭活和紫外灭活。

（3）将两亲本原生质体溶液浓度调至10⁵个/mL，分别取双亲原生质体各0.5 mL以1:1混合，4000 r/min离心10 min，弃上层液，得原生质体后加入蔗糖渗稳剂1 mL和浓度为30-45%PEG4000-（0.02 -0.08mol/L ）CaCl₂ 1 mL（pH5-pH11）。将上述原生质体混匀后迅速置于恒温水浴中，在20-35℃条件下进行5-30 min的化学融合。不同时间取样4000 r/min离心10 min，弃上清液；再用蔗糖渗稳剂洗涤2次，去除PEG。将得到的原生质体沉淀用蔗糖渗稳剂稀释，定容至1 mL，取其稀释液涂布于固体再生培养基（葡萄糖20 g/L、酵母粉2 g/ L、麦麸（浸提液）15 g/L、蔗糖15 g/L、 KH2 PO4 1. 5 g/L、MgSO4 7H2 O 0. 05 g /L和维生素 B1 4 mg /L，琼脂20 g/L ，硫酸镁0.6 mol/L）上，置于27℃恒温培养箱中，避光培养22-30 d，观察记录菌落生长情况并计数，计算融合率。

融合率＝2（再生菌落数/两亲本菌落数总和）×100％

（4）将两亲本原生质体溶液浓度调至10⁷个/mL，分别取双亲原生质体各0.5 mL以1:1混合，4000 r/min离心10 min，弃上层液，得原生质体后加入PM缓冲液（甘露醇和氯化钙配成0. 6 mol /L 质量浓度溶液，灭菌后备用），洗涤2次，定容1mL。用无菌液枪将50-200μl的原生质体混合液加入宁波新芝生物科技股份有限公司CRY-3型电融合仪的融合小室，打开融合仪电源，调节交变电压20-50 V、交变电场频率800-1100 kHz、脉冲场强4-7kV／cm、脉冲个数3-6个及脉冲间隔10-80uS到所需位置，时隔30s先后按下成串脉冲、融合脉冲和脉冲触发开关，30s后将小室内溶液吸出并用0.6 mol /L甘露醇稀释，定容至1 mL，取其稀释液涂布于固体再生培养基（蛋白胨 20 g/L、葡萄糖 20 g/L、酵母粉 10 g/L、琼脂 20 g/L、山梨醇0.6 mol/L）上，置于27℃恒温培养箱中，避光培养22 -30 d，定期观察记录菌落生长情况并计数，计算融合率。

本发明公开的糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体的融合方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：本发明首次为糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合并筛选出生长速度和木质素降解能力优于亲本糙皮侧耳的新菌株（名称分别是D，G₅，C，M和A菌株）提供了一种有效的融合方法。该方法有别于传统人工诱变育种，该技术可重复性较强，遗传稳定性好且方法简便属于非转基因育种方式，没有创造新基因，不存在基因污染问题。

综上述本发明获得的糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合新菌株形态特征及生长特性如下：

形态特征：化学融合得到的14个融合株和电融合得到的3个融合株与亲本糙皮侧耳有明显的颉颃现象，菌丝形态也有明显差异。

生长特性：17个融合株通过生长速度和木质素降解能力比较，其中的D、G₅、C、M、A融合菌株生长速度比亲本糙皮侧耳提高1.44—16.33%，木质素降解能力提高1.76—4.16倍。

附图说明：

图1为化学融合得到14株融合株与亲本糙皮侧耳的颉颃现象图；其中14株疑似融合株与亲本间均存在明显的颉颃现象，其中菌株A、C、L、N、O、Y与亲本对峙生长，颉颃线处有沟；D、G、I、M、P与亲本对峙生长，颉颃线处形成脊；B越过颉颃线覆盖亲本；X、Z则是被亲本覆盖；B、D在颉颃线处有褐色液体分泌；（亲：糙皮侧耳， A、B、C、D、G、I、L、M、N、O、P、X、Y、Z：融合株）；

图2为糙皮侧耳和化学融合得到的融合株菌丝体；（侧耳：糙皮侧耳菌丝体， A~Z：14株融合株的菌丝体，侧耳和A箭头指向锁状联合，D和G箭头指向隔膜）；

图3为化学融合得到的14个融合株随机引物扩增的RAPD指纹图谱；（Ld:100bp DNALadder，母：啤酒酵母，耳：糙皮侧耳, A、B、C、D、G、I、L、M、N、O、P、X、Y、Z为14株融合株）；

图4 为化学融合得到的14个菌株及亲本相似性系数聚类图；（母：亲本酿酒酵母，耳：亲本糙皮侧耳，A、B、C、D、G、I、L、M、N、O、P、X、Y、Z为14株融合株）；

图5为电融合得到的3个融合株与亲本糙皮侧耳的颉颃现象图；（左边为亲本糙皮侧耳，右边为融合株）；

图6为糙皮侧耳和电融合得到的3个融合株菌丝体；（侧耳：糙皮侧耳菌丝体， S~G5：3株融合株的菌丝体，侧耳和S箭头指向锁状联合，T和G₅箭头指向隔膜）；

图7为电融合得到的3个融合株的随机引物扩增的RAPD指纹图谱；（Ld:100bp DNALadder，母：啤酒酵母，耳：糙皮侧耳, S、T、G₅为3株融合株）；

图8为电融合得到的3个融合株及亲本相似性系数聚类图。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中糙皮侧耳、酿酒酵母和所需试剂药品均为市售。

实施例1：

（1）采用本技术领域常规方法分别制备出糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体。其中糙皮侧耳的制备参见（涂苑楠，范寰等，糙皮侧耳的原生质体制备和再生条件的研究[J].饲料研究，2013，4：29-31，56.）；酿酒酵母的原生质体的制备参见（马恒德，郭成金. 啤酒酵母原生质体制备与再生条件的筛选[J]. 中国酿造，2012，31（2）：140-144.）

（2）对糙皮侧耳原生质体进行60℃水浴处理10 min热灭活，侧耳原生质体灭活率达到100％；酿酒酵母原生质体在距离15W紫外灯20cm处照射230s进行紫外灭活，酿酒酵母原生质体灭活率达到100％。

（3）将两亲本原生质体溶液浓度调至10⁵个/mL，分别取双亲原生质体各0.5 mL以重量份数比为1:1混合，4000 r/min离心10 min，弃上层液，得原生质体后加入蔗糖渗稳剂1mL和浓度为35%PEG4000（0.06mol/L ）CaCl₂ 1 mL（pH11）。将上述原生质体混匀后迅速置于恒温水浴中，在30℃条件下进行20 min的化学融合。不同时间取样4000 r/min离心10 min，弃上清液；再用蔗糖渗稳剂洗涤2次，去除PEG。将得到的原生质体沉淀用蔗糖渗稳剂稀释，定容至1 mL，取其稀释液涂布于固体再生培养基（葡萄糖20 g/L、酵母粉2 g/ L、麦麸（浸提液）15 g/L、蔗糖15 g/L、 KH2 PO4 1. 5 g/L、MgSO4 7H2 O 0. 05 g /L和维生素 B1 4 mg/L，琼脂20 g/L ，硫酸镁0.6 mol/L）上，置于27℃恒温培养箱中，避光培养25d，观察记录菌落生长情况并计数，计算融合率达到2.609 × 10^-3。

实施例2：

（1）采用本技术领域常规方法分别制备出糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体（见实施例1）。

（2）采用本技术领域常规方法分别对糙皮侧耳和酿酒酵母的原生质体进行热灭活和紫外灭活（见实施例1）。

（3）将两亲本原生质体溶液浓度调至10⁷个/mL，分别取双亲原生质体各0.5 mL以重量份数比为1:1混合，4000 r/min离心10 min，弃上层液，得原生质体后加入PM缓冲液（甘露醇和氯化钙配成0.6 mol /L 质量浓度溶液，灭菌后备用），洗涤2次，定容1mL。用无菌液枪将100μl的原生质体混合液加入宁波新芝生物科技股份有限公司CRY-3型电融合仪的融合小室，打开融合仪电源，调节交变电压30V、交变电场频率1100 kHz、脉冲场强6kV／cm、脉冲个数4个及脉冲间隔10uS到所需位置，时隔30s先后按下成串脉冲、融合脉冲和脉冲触发开关，30s后将小室内溶液吸出并用0.6 mol /L甘露醇稀释，定容至1 mL，取其稀释液涂布于固体再生培养基（蛋白胨 20 g/L、葡萄糖 20 g/L、酵母粉 10 g/L、琼脂 20 g/L、山梨醇0.6 mol/L）上，置于27℃恒温培养箱中，避光培养30d，定期观察记录菌落生长情况并计数，计算融合率达到4.396× 10^-5。

实施例3

本发明的应用：

Claims

1.一种糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体融合的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（2）将两亲本原生质体溶液浓度调至10⁵个/mL，分别取双亲原生质体各0.5 mL以重量份数比为1:1混合，4000 r/min离心10 min，弃上层液，得原生质体后加入蔗糖渗稳剂1 mL和浓度为30%-45%PEG4000-CaCl₂1 mL，调整pH5-pH11；所述的蔗糖渗稳剂指的是0.6 mol /L蔗糖溶液；所述CaCl₂的浓度为0.02 -0.08mol/L；

（3）将上述原生质体混匀后迅速置于恒温水浴中，在20-35℃条件下进行5-30 min的化学融合，不同时间取样4000 r/min离心10 min，弃上清液；再用蔗糖渗稳剂洗涤2次，去除PEG4000，将得到的原生质体沉淀用蔗糖渗稳剂稀释，定容至1 mL，取其稀释液涂布于固体再生培养基上，置于27℃恒温培养箱中，避光培养22 -30 d，观察记录菌落生长情况并计数，计算融合率；所述再生培养基：葡萄糖20 g/L、酵母粉2 g/ L、麦麸浸提液15 g/L、蔗糖15 g/L、 KH₂ PO₄ 1. 5 g/L、MgSO₄ 7H₂ O 0. 05 g /L、维生素 B1 4 mg /L、琼脂20 g/L 、硫酸镁0.6 mol/L；

或

（4）将两亲本原生质体溶液浓度调至10⁷个/mL，分别取双亲原生质体各0.5 mL以重量份数比为1:1混合，4000 r/min离心10 min，弃上层液，得原生质体后加入PM缓冲液，洗涤2次，定容1mL，用无菌液枪将50-200μl的原生质体混合液加入CRY-3型电融合仪的融合小室，打开融合仪电源，调节交变电压20-50 V、交变电场频率800-1100 kHz、脉冲场强4-7kV／cm、脉冲个数3-6个及脉冲间隔10-80uS到所需位置，时隔30s先后按下成串脉冲、融合脉冲和脉冲触发开关，30s后将小室内溶液吸出并用0.6 mol /L甘露醇溶液，定容至1 mL，取其稀释液涂布于固体再生培养基上，置于27℃恒温培养箱中，避光培养22 -30 d，定期观察记录菌落生长情况并计数，计算融合率；所述再生培养基：蛋白胨 20 g/L、葡萄糖 20 g/L、酵母粉10 g/L、琼脂 20 g/L、山梨醇0.6 mol/L；

所述的PM缓冲液指的是：甘露醇和氯化钙配成0. 6 mol /L 浓度溶液。