CN117929729A - 一种快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒及其应用 - Google Patents
一种快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒及其应用，属于生物技术领域。本发明将待检血清样本与试剂盒中的免疫磁珠共同孵育，免疫磁珠将PDCoV‑N蛋白特异性抗体从反应液中精准捕获，HRP标记的羊抗猪多克隆抗体作为检测抗体与免疫磁珠上PDCoV‑N蛋白的特异性抗体结合，于免疫磁珠上形成“PDCoV‑N蛋白‑PDCoV‑N特异性IgG抗体‑酶标记抗体”三聚体复合物，加入TMB底物液发生显色反应，通过颜色变化和吸光度值的测定可直接判定结果。本发明的试剂盒用于临床检测，结果与中和抗体试验的结果一致，灵敏度为92％，特异度为100％。本发明为猪δ冠状病毒的快速检测和防控提供新方法。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学检测领域，特别是涉及一种快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒及其应用。
背景技术
猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是新发现的一种新型猪肠道冠状病毒，可感染所有日龄的猪，主要引起10日龄以内的仔猪发生急性腹泻、呕吐和新生仔猪死亡。2021年12月《Nature》期刊报道，从海地的三名发热儿童血清样本中检测并分离到了猪δ型冠状病毒，表明猪丁型冠状病毒具有感染人的风险。目前尚无疫苗投放市场，快速准确地疾病诊断对于该病的防控至关重要。
引起猪肠道腹泻的病原有多种，且许多腹泻类疾病症状相似，实验室诊断是判断病猪是否感染PDCoV的主要手段。常用的检测PDCoV的主要实验室检测技术包括：病毒分离和鉴定、血清学检测、免疫学和分子生物学方法。然而，这些方法周期长、操作复杂繁琐，需要专业的技术人员和特定的仪器才可以完成，很难满足临床样品的快速、廉价、高效监测的要求。因此，亟需一种检测PDCoV的新方法，以提高检测效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，以免疫磁珠为捕获PDCoV特异性的IgG抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪多克隆抗体(HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Swine IgG(H+L))为检测抗体，可以在免疫磁珠上形成“PDCoV-N蛋白-PDCoV-N特异性IgG抗体-酶标记抗体”三聚体复合物，通过底物颜色变化和吸光度值的测定即可直接判定结果，方便高效且成本低，可以明显提高检测效率。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒，所述试剂盒包括免疫磁珠，所述免疫磁珠为磁珠与猪δ冠状病毒N蛋白偶联制得；
所述试剂盒以所述免疫磁珠作为捕获抗原，HRP标记的山羊抗猪多克隆抗体作为检测抗体，检测待测样品中是否含有猪δ冠状病毒IgG抗体。
优选的是，所述免疫磁珠的制备方法包括以下步骤：
将磁珠用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合液进行活化；
用包被液稀释猪δ冠状病毒N蛋白后，再与活化后的磁珠进行偶联，将N蛋白包被在活化后的磁珠表面，然后用封闭液封闭所述磁珠上未结合的位点，制得所述免疫磁珠。
优选的是，所述磁珠进行活化之前用MEST(100mM MES，pH 5.0，0.05％ Tween 20)溶液重悬，获取磁珠混悬液；所述磁珠与所述MEST溶液的质量体积比为1:(2-6)；
所述磁珠混悬液与所述混合液的体积比为1:(2-6)，所述混合液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的体积比为1:1。
优选的是，所述磁珠的用量为10-100μg；更优选的是最佳用量为25μg。
优选的是，所述猪δ冠状病毒N蛋白的包被浓度为0.1-20μg/mL；更优选的是最佳包被浓度为5μg/mL。
优选的是，所述封闭液为脱脂奶粉，所述封闭液中脱脂奶粉的质量百分比为2.5％-5％。更优选的是所述封闭液中脱脂奶粉的质量百分比为5％。
本发明还提供所述的免疫磁珠检测试剂盒在非诊断目的的检测猪δ冠状病毒中的应用。
优选的是，所述免疫磁珠检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
将待测样本进行倍比稀释后，与免疫磁珠共同孵育；之后洗涤；
加入稀释HRP标记的山羊抗猪多克隆抗体，孵育；之后洗涤；
加入显色液，避光孵育完成后，加入终止液终止反应，测定所述待测样本的OD450nm值，以判断所述待测样本中是否含有猪δ冠状病毒IgG抗体。
优选的是，所述待测样本与所述免疫磁珠在37℃共同孵育反应30min；
加入稀释的所述HRP标记的山羊抗猪多克隆抗体后，在37℃继续孵育反应30min；所述HRP标记的羊抗猪多克隆抗体的稀释度为1:8000；
加入所述显色液后，37℃避光孵育10min。
优选的是，所述判断的标准为：当OD450 nm≥0.5277时，判定所述待测样本为阳性，即所述待测样本含有猪δ冠状病毒IgG抗体；当OD450 nm＜0.5277时，判断为阴性，即所述待测样本不含猪δ冠状病毒IgG抗体。
本发明试剂盒的检测原理：以表面修饰的羧基磁性微球为载体，利用EDC/NHS将磁珠活化直接与PDCoV-N蛋白进行偶联，然后封闭未结合的位点，制备免疫磁珠。将待检血清与免疫磁珠共同孵育，免疫磁珠将PDCoV-N特异性IgG抗体从反应液中精准捕获，HRP标记的山羊抗猪多克隆抗体作为检测抗体与免疫磁珠上PDCoV-N蛋白的特异性抗体结合，于免疫磁珠上形成“PDCoV-N蛋白-PDCoV-N特异性IgG抗体-酶标记抗体”三聚体复合物，再加入TMB底物液后发生显色反应，通过颜色变化和吸光度值的测定可直接判定结果。
本发明公开了以下技术效果：
本发明基于免疫磁珠检测技术构建的试剂盒，能够在保证高灵敏度和强特异性的条件下将整体反应时间严格控制在1.5-2h内，极大的缩短了操作时间，提高了检测效率。本发明通过优化试剂盒中不同试剂的参数条件，最终得到最优的检测条件：最佳磁珠用量为25μg，最佳包被抗原的浓度为5μg/mL，最佳封闭液为5％脱脂奶粉，封闭时间为2h，最佳酶标抗体(1mg/mL)的稀释度为1/8000，最佳显色时间为10min。在此最优条件下检测猪δ冠状病毒IgG抗体结果显示，当OD450 nm≥0.5277时判定此血清样本为阳性，反之OD450 nm﹤0.5277则为阴性。可见，本发明通过颜色变化和吸光度值的测定可直接判定结果，方便易操作、高效且成本低，灵敏度为92％，特异度为100％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为磁珠用量优化结果；
图2为PDCoV N蛋白用量优化结果；
图3为封闭剂条件优化结果；
图4为酶标抗体条件优化结果；
图5为显色时间优化结果；
图6为临界值确定的结果；
图7为特异性检测结果；
图8为灵敏度检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1一种PDCoV抗体的间接免疫磁珠检测方法，包括以下步骤：
1、PDCoV-N蛋白的制备
a、根据GenBank数据库里收录的PDCoV HNZK-04株(登录号：MH708124)的N基因序列，利用Primmer5.0软件设计一对扩增N全基因的引物，引物信息见表1。以动物病原与生物安全教育部重点实验室保存的测序正确的PDCoV HNZK-04株的cDNA为模板，设计F-EcoR I,R-Xho I为引物，PCR扩增N全基因，PCR反应体系如表2，混合体系离心混匀后，放入PCR仪器内扩增。反应程序为：95℃预变性30s，95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸60s，共32个循环，72℃彻底延伸5min，4℃结束。扩增完成后，取6μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测并进行产物胶回收。利用限制性内切酶EcoR I和Xho I对纯化的PCR产物和pET-28a空载体进行双酶切，通过T4连接酶连接得到重组质粒pET-28a-PDCoV-N，重组质粒pET-28a-PDCoV-N转入大肠杆菌DH5α，利用含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基琼脂平板筛选重组克隆，挑选单个菌落后进行菌液PCR鉴定，并从阳性菌液中提取质粒进行EcoR I和Xho I双酶切鉴定。双酶切鉴定正确的阳性质粒转入到BL21感受态细胞中，利用卡那霉素琼脂培养板挑取单个菌落后进行扩大培养，将提取质粒送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序并进行序列对比。
表1引物信息
表2PCR反应体系
b、取表达PDCoV-N蛋白的重组大肠杆菌BL21-N划线接种于LB琼脂平板(含50μg/mL卡那霉素)上，37℃培养16～20小时，挑取单菌落接种于LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，180r/min培养至OD600nm达到0.6～0.8后，无菌加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，37℃摇床中180r/min振荡诱导6～8小时后，冰浴超声裂解，获得PDCoV-N蛋白，经SDS-PAGE检测应出现大小约44KDa条带。
c、以20mM咪唑浓度的PBS缓冲液(8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24gKH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L)为杂蛋白的清洗缓冲液，以100mM咪唑浓度的PBS缓冲液为PDCoV重组N蛋白的洗脱缓冲液。
d、纯化后获得了高纯度的N蛋白，SDS-PAGE观察为单一清晰的条带，经Bradford方法测定该蛋白浓度为1000μg/mL。
2、磁珠偶联PDCoV蛋白制备免疫磁珠
将磁珠(购自苏州海狸生物医学工程有限公司)震荡混匀后抽取一定量的磁珠混悬液于2mL的离心管中，将其至于磁性分离架进行磁分离，弃去上清；用2-6倍体积的MEST溶液(100mM MES，pH5.0，0.05％ Tween 20)重悬磁珠，磁性分离弃去上清，重复3次洗涤步骤。加入现配3倍体积的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合液(EDC与NHS的体积比为1:1)，混匀后于37℃空气摇床中孵育30min。对已活化的磁珠磁性分离除去上清，用PBS缓冲液充分混悬，洗涤3次后弃去上清。加入已稀释的20-0.1μg/mL PDCoV-N蛋白混悬液，于37℃空气摇床中孵育30min，磁性分离去除上清，用PBST洗涤3次后弃去上清。加入一定量的封闭液(5g脱脂奶粉(S.M.)溶于950mL PBS中，用纯化水定容至1000mL)于37℃的摇床中封闭2h，目的是占据磁珠表面未与PDCoV-N蛋白结合的羧基基团，制得免疫磁珠。
3、所述PDCoV抗体的免疫磁珠检测方法使用方法包括以下步骤：
(1)用稀释液将血浆或血清样本稀释64倍充分混匀后得到样本液；上述稀释液为含10％牛血清蛋白和0.1％液体生物防腐剂Proclin-300的0.01M pH7.4的PBS缓冲液；
(2)分别向含免疫磁珠的2mL离心管中加入200μL稀释液、标准液、阴性标准品、阳性标准品、样本液分别作为空白组、标准组、阴性对照组、阳性对照组、实验组，并做复孔实验，然后在37℃下孵育30分钟；
上述阳性标准品为PDCoV抗体阳性质控猪血清，使用前加入样品稀释液溶解；
上述阴性标准品为含未感染PDCoV抗体阴性质控猪血清，使用前加入样品稀释液溶解；
上述阳性标准品的制备方法为：用灭活后的PDCoV与佐剂等体积混合后，分别颈部肌肉注射免疫经PDCoV抗原抗体均为阴性的3～7周龄健康仔猪后，当血清中PDCoV的效价高于1:16时，采血分离血清，用0.22μm除菌滤器过滤后加入0.01％ Procline-300，1mL/瓶，2～8℃保存备用；
上述阴性标准品的制备方法为：将PDCoV抗原抗体均为阴性的3～7周龄健康仔猪采血分离血清，用0.22μm除菌滤器过滤后加入0.01％ Procline-300，1mL/瓶，2～8℃保存备用；
(3)每个离心管用洗涤液500μL冲洗3遍；上述洗涤液为含有0.05％Tween 20的0.01M PH7.4的PBST缓冲液；
(4)用稀释液将原始浓度为1mg/mL的酶标二抗(HRP标记的山羊抗猪IgG多抗)稀释2000-16000倍，各离心管分别加入200μL稀释后的酶标二抗，并重复步骤(3)进行洗涤；
(5)各离心管加入200μL TMB底物溶液(生工生物工程(上海)股份有限公司)，37℃闭光孵育10min；
(6)各离心管加入50μL终止液(2mol/L H2SO4溶液)，30min内，在450nm波长处用酶标仪测定各离心管的吸光度值；
(7)结果判定：通过所测定的吸光度值绘制不同切点下的灵敏度和特异度曲线，即ROC曲线数据分析，最终依据Youden指数最高点确定为猪δ冠状病毒IgG抗体免疫磁珠抗体检测方法的临界值。
对上述检测方法中的不同条件进行优化：
(1)最佳磁珠用量的确定
首先对所选磁珠的用量进行优化，分别抽取不同含量的磁珠。依据常规操作将进行磁珠活化、负载蛋白和抗原抗体结合，通过TMB显色反应后通过测定吸光度值计算出信噪比(Signal to Noise,S/N)值，从中对比出S/N最高者作为最优磁珠用量，结果如图1所示。当磁珠用量为25μg时的S/N值最高，因此确定磁珠用量为25μg时最佳磁珠用量。
(2)最佳抗原包被量的确定
已活化的磁珠表面具有羧基官能团可与蛋白上的氨基官能团结合，因此在确定最优磁珠用量的基础上进行最佳蛋白负载量的筛选。用包被液将PDCoV-N蛋白稀释至浓度为：20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL，将已稀释的不同浓度的蛋白溶液与200μL重悬已活化的磁珠混合，然后置于37℃空气摇床中使蛋白与磁珠结合30min。后续进行常规步骤操作，待显色完成后通过S/N值选出最佳的蛋白负载量，结果如图2所示。根据S/N值最高时确定PDCoV-N蛋白的浓度为5μg/mL，因此本发明选定所需包被抗原的浓度为5μg/mL。
(3)最佳封闭液的确定
由于不同封闭液的作用不同、封闭液浓度的封闭效果有所差异，同时避免磁珠表面带有羧基官能团的活性位点与酶标抗体的结合，因此将对最佳蛋白浓度包被的磁珠进行封闭。所选封闭液的种类为：2.5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、5％ BSA、2.5％脱脂奶粉(skim milk powder,S.M.)、5％ S.M.、2.5％(BSA+S.M.)、5％(BSA+S.M.)。对已包被的磁珠进行磁性分离且洗涤后，抽取200μL不同种类的封闭液重悬磁珠，置于37℃空气摇床中封闭2h。待封闭完成进行后续常规操作，最终根据S/N值选出最佳封闭液。结果如图3所示，从所计算的信噪比中发现5％S.M的S/N值最高，因此选择5％S.M作为最佳封闭条件。
(4)最佳酶标抗体稀释量
酶标抗体通过抗原抗体结合反应负载到磁珠表面，进而影响检测结果，故而对酶标抗体稀释度进行优化。其中抗体(原始浓度为1mg/mL)稀释度为：1/2000-1/32000，将已稀释的酶标抗体取200μL重悬到已封闭好的磁珠，在37℃条件下震荡混匀30min，通过显色结果计算S/N值以确定最佳酶标抗体稀释度。结果如图4所示，当抗体稀释8000倍时的S/N值最高，因此选择酶标抗体稀释度为1/8000时为最佳反应条件。
(5)最佳显色时间的确定
辣根过氧化物酶(HRP)可催化底物TMB氧化至oxTMB，呈现蓝色反应，通过加入终止液来终止该反应的进行。故而显色时间选取5、10、20、30min，通过测定OD450 nm来计算出S/N值，从中选出最佳显色时间。结果如图5所示，本发明的最佳显色时间为10min。
(6)临界值确定
根据已优化的最佳反应条件建立的方法以检测80份PDCoV阴性血清，当Youden指数最高时为0.92，此时的灵敏度和特异度分别为92％和100％，此时对应的吸光度值为0.5277，曲线下面积为0.9767，95％的可信区间为0.8116～0.9685。结果如图6所示，本发明的判定标准是OD450nm大于0.5277为阳性，反之则为阴性。
实施例2特异性实验
利用所建立的方法检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV，gE基因缺失株和gB基因缺失株)、圆环病毒(PCV2)的阳性血清，同时设立标准阳性对照组和标准阴性对照组，通过测定450nm处的吸光度值以此确定该方法的特异性。
结果如图7所示，本发明与PDCoV-N抗体特异性结合，与其他抗体不结合。因此具有良好的特异性。
实施例3灵敏度试验
将PDCoV病毒高免血清做1:16、1:32、1:64、1:128至1:262144倍(V/V)稀释，利用建立好的检测方法进行测试。结果如图8所示，当PDCoV阳性血清稀释到1:32768(V/V)时，结果均为阳性，而在1:65536的血清稀释度检出结果为阴性。表明本发明建立的检测方法的具有较高的灵敏度。
实施例4临床应用
A、将临床随机收集的猪采集80份血清，通过中和试验进行对比鉴定，确定其中阳性猪血清50份，阴性血清30份。
B、将上述鉴定过的血清样品再通过本发明方法进行检测，结果显示检出阳性血清46份，阴性血清34份，该方法检测结果与中和试验的符合率在95％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括免疫磁珠，所述免疫磁珠为磁珠与猪δ冠状病毒N蛋白偶联制得；
所述试剂盒以所述免疫磁珠作为捕获抗原，HRP标记的羊抗猪多克隆抗体作为检测抗体，检测待测样品中是否含有猪δ冠状病毒IgG抗体。
2.如权利要求1所述的快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠的制备方法包括以下步骤：
将磁珠用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的混合液进行活化；
用包被液稀释猪δ冠状病毒N蛋白后，再与活化后的磁珠进行偶联，将N蛋白包被在活化后的磁珠表面，然后用封闭液封闭所述磁珠上未结合的位点，制得所述免疫磁珠。
3.如权利要求2所述的快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠进行活化之前用MEST溶液重悬，获取磁珠混悬液；所述磁珠与所述MEST溶液的质量体积比为1:(2-6)；
所述磁珠混悬液与所述混合液的体积比为1:(2-6)，所述混合液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的体积比为1:1。
4.如权利要求3所述的快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠的用量为10-100μg。
5.如权利要求2所述的快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述猪δ冠状病毒N蛋白包被浓度为0.1-20μg/mL。
6.如权利要求2所述的快速检测猪δ冠状病毒IgG抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为脱脂奶粉，所述封闭液中脱脂奶粉的质量百分比为2.5％-5％。
7.如权利要求1-6任一项所述的免疫磁珠检测试剂盒在非诊断目的的检测猪δ冠状病毒中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述免疫磁珠检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
将待测样本进行倍比稀释后，与免疫磁珠共同孵育；之后洗涤；
加入稀释HRP标记的山羊抗猪多克隆抗体，孵育；之后洗涤；
加入显色液，避光孵育完成后，加入终止液终止反应，测定所述待测样本的OD450nm值，以判断所述待测样本中是否含有猪δ冠状病毒IgG抗体。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述待测样本与所述免疫磁珠在37℃共同孵育反应30min；
加入稀释的所述HRP标记的山羊抗猪多克隆抗体后，在37℃继续孵育反应30min；所述HRP标记的山羊抗猪多克隆抗体的稀释度为1:8000；
加入所述显色液后，37℃避光孵育10min。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述判断的标准为：当OD450nm≥0.5277时，判定所述待测样本为阳性，即所述待测样本含有猪δ冠状病毒IgG抗体；当OD450nm＜0.5277时，判断为阴性，即所述待测样本不含猪δ冠状病毒IgG抗体。
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