CN117881968A

CN117881968A - 凝血反应异常的检测方法

Info

Publication number: CN117881968A
Application number: CN202280058484.8A
Authority: CN
Inventors: 川边俊树; 大西健悟
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2022-08-30
Publication date: 2024-04-12
Also published as: WO2023032978A1

Abstract

一种凝血反应异常的检测方法，该方法包括：1)检测被检血液样本的凝固反应曲线的凝固反应结束点Pe；2)算出T(X)，这里，T(X)表示该凝固反应曲线达到Pe的X％的测量点或时间，X是大于0且为100以下的变量；3)根据T(X)来检测该被检血液样本的凝血反应异常。

Description

凝血反应异常的检测方法

技术领域

本发明涉及一种凝血反应异常的检测方法。

背景技术

血液凝固检查是通过对受试者的血液样本的凝固反应进行调查来诊断该受试者的凝血功能的检查。血液凝固检查中，一般在血液样本中添加规定试剂后，经时检测其凝固反应，根据得到的凝固反应来测定血液凝固时间。血液凝固时间以往作为用于检测凝血功能异常的指标使用。作为血液凝固时间的典型例子，有凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、凝血酶时间等。另外，在利用凝血酶时间法检查纤维蛋白原浓度的情况下，有时测定从在稀释后的血浆样本中添加一定量的凝血酶到析出纤维蛋白为止的凝固时间。凝固反应的测量通常使用测量散射光量、透射率、吸光度等的光学方法、或者测量血浆粘度的力学方法等。近年来，普遍采用用于测量凝固反应的自动分析装置。

凝血反应中包含由反应测量部、试剂、样本的状态等引起的各种噪声。例如，有时发生被称为初期反应异常的现象，即从真正的凝固反应应该开始的时间之前产生凝固反应曲线的上升的现象。另外，有时受凝血功能障碍、给药等影响而导致凝固反应曲线具有异常的形状。这样产生的凝固反应曲线的异常成为凝固时间的准确测定的障碍。

需要除去凝固反应中的噪声等不良影响来对凝固反应进行准确的评价。专利文献1中记载了一种凝血反应分析方法，其特征在于，在从凝血反应的测定开始到凝固反应结束之间设定检查点或检查区域，对该检查点或检查区域的反应状态进行监测来检测初期反应异常。专利文献2中记载了如下内容：根据凝固时间与当时测定的散射光量的关系设定噪声判定线，如果被检样本的凝固时间的散射光量超过该噪声判定线，则将该被检样本的凝固时间判定为正常，并非如此的情况下，继续测量凝固反应直至取得正常的凝固时间，由此来防止由噪声导致的凝固时间的误检。专利文献3中记载了如下内容：根据与凝固率(i)对应的时间(T[i])和与凝固率(i+1)对应的时间(T[i+1])之差(T[i+1]－T[i])跟从凝固开始点到凝固结束点的时间(SP～EP)的比率来判断凝固反应的异常。

在以往的血液凝固检查中，通常测量凝固反应直至足以使凝固反应结束的时间，根据取得的数据算出凝固时间。然而，凝固反应存在异常的血液样本常常表现出凝固反应的开始或进行的缓慢，结果，直到凝固反应结束大多耗费很多时间。因此，特别是利用自动分析装置测量凝固反应时，需要延长测量时间用以防止数据遗漏，但另一方面，如果测量时间变长，则直至得到检查结果的时间变长，整体分析效率降低。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2003－169700号公报

专利文献2：日本特开2010－217059号公报

专利文献3：日本特开2007－107889号公报

发明内容

本发明提供一种用于检测由噪声等引起的异常凝血反应的方法。

即，本发明提供以下方案。

〔1〕一种凝血反应异常的检测方法，包括：

1)检测被检血液样本的凝固反应曲线的凝固反应结束点Pe；

2)算出T(X)，这里，T(X)表示该凝固反应曲线达到Pe的X％的测量点或时间，X是大于0且为100以下的变量；

3)根据T(X)来检测该被检血液样本的凝血反应异常。

〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，上述3)包括：根据T(X)算出指标R，根据该指标R来检测上述被检血液样本有无凝血反应异常。

〔3〕根据〔2〕所述的方法，其中，上述指标R为选自给定X范围内的T(X)之比、给定X范围内的T(X)的变化率、和给定X范围内的T(X)的变动系数中的至少1者。

〔4〕根据〔3〕所述的方法，其中，上述给定X范围内的T(X)之比为[T(X₁)/T(X₂)]；

上述给定X范围内的T(X)的变化率为[(T(X₃)－T(X₅))/T(X₄)]；

上述给定X范围内的T(X)的变动系数为X₆～X₇的范围内的变动系数T(X)的变动系数。

〔5〕根据〔2〕～〔4〕中任1项所述的方法，包括：通过将上述指标R与给定阈值进行比较来检测上述被检血液样本有无凝血反应异常。

〔6〕根据〔5〕所述的方法，其中，根据由样本集团取得的指标R来确定上述阈值。

〔7〕根据〔5〕所述的方法，其中，在以下的情况下，检测为上述被检血液样本的凝血反应异常：

上述阈值为由正常样本集团取得的指标R的平均值+2×标准偏差以上，并且上述被检血液样本的指标R为该阈值或大于该阈值时，或者

上述阈值为由正常样本集团取得的指标R的平均值－2×标准偏差以下，并且上述被检血液样本的指标R为该阈值或小于该阈值时。

〔8〕根据〔1〕所述的方法，其中，上述3)包括：根据T(X)算出指标R1和R2，根据该指标R1和R2来检测上述被检血液样本的凝血反应异常的种类。

〔9〕根据〔8〕所述的方法，其中，上述指标R1为第1给定X范围内的T(X)的变化率，

上述指标R2为以下的第2给定X范围内的T(X)的变化率、或者给定X范围内的T(X)的变动系数。

〔10〕根据〔9〕所述的方法，其中，上述第1给定X范围内的T(X)的变化率为[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)]；

上述第2给定X范围内的T(X)的变化率为[(T(X₄)－T(X₆))/T(X₅)]；

上述给定X范围内的T(X)的变动系数为X₇～X₈的范围内的T(X)的变动系数。

〔11〕根据〔9〕或〔10〕所述的方法，包括：

将上述R1与阈值Th1进行比较，将上述R2与阈值Th2进行比较；以及

根据该R1和R2是否达到各自的阈值来检测上述被检血液样本的凝血反应异常的种类，

该R1为上述第1给定X范围内的T(X)的变化率，该R2为上述第2给定X范围内的T(X)的变化率。

〔12〕根据〔9〕或〔10〕所述的方法，包括：

将上述R1与阈值Th1进行比较，在该R1达到Th1的情况下，检测为上述被检血液样本具有凝血反应异常；

将检测为具有凝血反应异常的该被检血液样本的上述R2与阈值Th2和Th3进行比较，以及

根据该R2是否分别达到Th2和Th3来检测上述被检血液样本的凝血反应异常的种类，

该R1为上述第1给定X范围内的T(X)的变化率，该R2为上述给定X范围内的T(X)的变动系数。

〔13〕根据〔11〕所述的方法，其中，根据由样本集团取得的指标R1来确定上述阈值Th1，根据由该样本集团取得的指标R2来确定上述阈值Th2。

〔14〕根据〔12〕所述的方法，其中，根据由样本集团取得的指标R1来确定上述阈值Th1，根据由该样本集团取得的指标R2来确定上述阈值Th2和Th3。

〔15〕根据〔1〕～〔14〕中任1项所述的方法，进一步包含：算出上述被检血液样本的凝固时间。

〔16〕根据〔1〕～〔15〕中任1项所述的方法，其中，与上述被检血液样本的凝固反应曲线的取得平行地进行Pe的检测，如果检测到Pe则结束凝固反应曲线的取得。

〔17〕一种程序，用于实施〔1〕～〔16〕中任1项所述的方法。

〔18〕一种装置，用于实施〔1〕～〔16〕中任1项所述的方法。

根据本发明的方法，能够检测由噪声等引起的异常凝血反应。因此，根据本发明，能够防止由异常凝血反应引起的血液凝固时间的误测、受试者的凝血功能的误评。

附图说明

图1是凝固反应曲线的一个例子。

图2是T(X)的说明。将凝固反应曲线上的达到Pe的10％、50％和90％的时刻分别示为T(10)、T(50)和T(90)。

图3A是通过本发明的方法来检测凝固反应异常的例示流程。

图3B是根据P(i)的累积比Z(i)和阈值Zs进行Pe检测时的通过本发明的方法来检测凝固反应异常的例示流程。

图4是示出用于进行本发明的凝固反应异常的检测方法的自动分析装置的构成的概念图。

图5是正常样本组(样本1～17)的反应曲线P(散射光量)。A：设定为Zs＝1.001时得到的直到凝固反应结束点Pe的反应曲线P，B：设定为Zs＝1.010时得到的直到凝固反应结束点Pe的反应曲线P。

图6中的A是正常样本组(样本1～17)的反应曲线P达到Pe的时间tPe。B是样本1～17的APTT。PmaxT(〇)：将反应曲线P的最大值Pmax作为Pe时的数据，Zs＝1.001(+)：设定为Zs＝1.001而检测Pe时的数据，Zs＝1.010(×)：设定为Zs＝1.010而检测Pe时的数据。

图7是基于设定为Zs＝1.001时检测到的Pe的正常样本组(样本1～17)的凝固反应。A：到Pe为止的反应曲线P(散射光量)，B：T(X)，C：T(X)/T(50)，D：C的在纵轴方向上的放大图，点划线表示平均+3SD，双点划线表示平均－3SD。

图8是基于设定为Zs＝1.010时检测到的Pe的正常样本组(样本1～17)的凝固反应。A：到Pe为止的反应曲线P(散射光量)，B：T(X)，C：T(X)/T(50)，D：C的在纵轴方向的放大图，点划线表示平均+3SD，双点划线表示平均－3SD。

图9是基于设定为Zs＝1.001时检测到的Pe的异常样本(样本18～20)的凝固反应。A～C：与正常样本的数据一并示出样本18(A)、19(B)、20(C)的到Pe为止的反应曲线P(散射光量)；实线表示正常样本，虚线表示异常样本。D～F：与正常样本的数据一并示出样本18(D)、19(E)、20(F)的T(X)/T(50)；实线表示正常样本，虚线表示异常样本，点划线和双点划线分别表示正常样本组的平均值+3SD和平均值－3SD。

图10是基于设定为Zs＝1.010时检测到的Pe的异常样本(样本18～20)的凝固反应。A～C：与正常样本的数据一并示出样本18(A)、19(B)、20(C)的到Pe为止的反应曲线P(散射光量)；实线表示正常样本，虚线表示异常样本。D～F：与正常样本的数据一并示出样本18(D)、19(E)、20(F)的T(X)/T(50)；实线表示正常样本，虚线表示异常样本，点划线和双点划线分别表示正常样本组的平均值+3SD和平均值－3SD。

图11是异常样本(样本20)的T(X)/T(40)(左)和T(X)/T(60)(右)。实线表示正常样本，虚线表示异常样本(样本20)，点划线和双点划线分别表示正常样本组的平均值+3SD和平均值－3SD。

图12是T(X)的区间变化率[(T(90)－T(10))/T(50)]相对于APTT标绘而成的图。上列：Zs＝1.001时标绘而成的图，下列：Zs＝1.010时标绘而成的图。×：正常样本，●：异常样本(样本18)，▲：异常样本(样本19)，■：异常样本(样本20)。虚线表示正常样本组的值的平均+3SD。

图13是指标[(T(90)－T(10))/T(50)]的说明。该指标表示图中的W[(T(90)/T(50))－(T(10)/T(50))]。

图14是异常样本(样本18～20)的SDI(X)＝[(R(X)－M)/SD]。R(X)是T(X)/T(Y)(X为1～100，Y在A～E中分别为10、40、50、60和90)，M和SD为正常样本组(样本1～17)的R(X)的平均值和SD。图中的实线表示样本18，虚线表示样本19，长虚线表示样本20。

图15是T(X)比[T(X₁)/T(X₂)]相对于APTT标绘而成的图。+：对照样本，●：异常样本(样本18)，▲：异常样本(样本19)，■：异常样本(样本20)，虚线表示对照样本组的值的平均+5SD。

图16是T(X)的区间变化率[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)]相对于APTT标绘而成的图。+：对照样本，●：异常样本(样本18)，▲：异常样本(样本19)，■：异常样本(样本20)，虚线表示对照样本组的值的平均+5SD。

图17是CV[T(X₁):T(X₂)]相对于APTT标绘而成的图。+：对照样本，●：异常样本(样本18)，▲：异常样本(样本19)，■：异常样本(样本20)，虚线表示对照样本组的值的平均+5SD。

图18是T(X)差[T(X₁)－T(X₂)]相对于APTT标绘而成的图。+：对照样本，●：异常样本(样本18)，▲：异常样本(样本19)，■：异常样本(样本20)，虚线表示对照样本组的值的平均+5SD。

图19是用于异常种判定的指标R1的例子：[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)](X₁＝99～100，X₂＝50～80，X₃＝5～12)相对于APTT标绘而成的图。

图20是用于异常种判定的指标R2的例子：[(T(X₄)－T(X₆))/T(X₅)](X₄＝70～80，X₅＝40～60，X₆＝20～30)相对于APTT标绘而成的图。

图21中的A～C是正常样本组(样本1～17)和异常样本(样本18～20)的d(X)＝[T(X)－T(X－1)]。实线表示正常样本，虚线表示样本18(A)、19(B)、20(C)。

图22是CV[T(X₁):T(X₂)]相对于APTT标绘而成的图。+：对照样本，●：异常样本(样本18)，▲：异常样本(样本19)，■：异常样本(样本20)，虚线表示对照样本组的值的平均+5SD。

具体实施方式

凝血检查中，在血液样本中添加规定试剂并对随后的凝血反应进行测量。凝血反应一般由表示凝固反应量的经时变化的凝固反应曲线表示。根据凝固反应所测定的凝血时间以往作为用于检测凝血功能异常的指标使用。本说明书中，有时将血液样本、凝血反应和凝血时间分别简称为样本、凝固反应和凝固时间。

凝固反应曲线在基于散射光量进行测量的情况下，通常，在从在样本中添加试剂起经过某种程度的时间的时刻因开始凝固反应而表现出缓慢上升，接着由于凝固反应的进行而急剧上升，然后，随着凝固反应接近尾声而达到平台期，最终显示为S形状。另一方面，基于透过光量而测量到的凝固反应曲线显示为倒S形状。然而，凝固反应有时包含初期反应异常等噪声，这样的噪声会对凝固反应曲线的形状造成影响，有时成为准确测定凝固时间的障碍。另外，凝固反应具有异常的样本的凝固反应曲线具有反应小、反应的开始或结束不明确、不出现急剧上升等异常的形状，由此有时难以准确地测定凝固时间。或者，有时影响凝血功能的药剂(肝素等)的给予也会对凝固反应曲线造成影响。

在基于自动分析装置的凝血检查中，为了高效地分析多个样本，希望对1个样本取得凝固反应的评价所需的数据后迅速结束测量，开始下一样本的测量。但是，如果考虑上述噪声的影响、异常样本的情况，这样的方法存在因凝固反应结束的误检或未检测而导致数据遗漏的风险。只要将每一个样本的凝固反应测量时间设定为足够长的时间，就能够防止由凝固反应结束的误检或未检测所导致的数据遗漏。但是，这样的方法由于对大多数样本而言测量时间变长至所需以上，因此得到检查结果为止的时间长，并且使整体的分析效率降低。

本发明中，通过对凝固反应曲线的形状进行分析，能够检测由噪声等引起的异常凝血反应。

作为本发明中可检测到的凝血反应的“异常”的例子，可优选举出：初期反应异常(例如，从真正的凝固反应应该开始的时间之前开始的凝固反应曲线的过早上升)、反应的开始或结束不明确的凝固反应(例如，凝固反应曲线的上升不明显的凝固反应、反应进行慢而凝固反应曲线没有达到平台期的凝固反应等)、凝固反应曲线以双阶段进行上升的凝固反应等。

作为与其对照的概念的本说明书中所说的“正常”的凝血反应是指优选凝固反应曲线为S形状(基于散射光量进行测量时)的凝固反应。即，正常的凝固反应曲线示为具有从在样本中添加凝固试剂起经过一定的潜伏期曲线开始缓慢上升的“反应初期”、曲线急剧上升并包含拐点的“反应进行期”、曲线上升变缓进入平台期(平坦化)的“反应后期”这3个区间的S形状。因此，本发明中可检测到的异常凝固反应的典型例是凝固反应曲线不为S形状的情况(基于散射光量进行测量情况)。

〔凝血反应异常的检测方法〕

由本发明提供的凝血反应异常的检测方法(以下，也称为本发明的方法)中，基于对被检血液样本(以下，也称为被检样本)的凝固反应进行测量而取得的凝固反应曲线数据来检测凝固反应中有无异常。

以下，对本发明的方法进行说明。

1.凝固反应曲线的取得和凝固反应结束点Pe的检测

1.1.凝固反应测量

本发明的方法中使用的被检样本只要是需要检测有无凝血反应异常的血液样本即可。该被检样本优选使用受试者的血浆。该被检样本中可以添加凝固检查中通常使用的抗凝剂。例如，可以使用加入了柠檬酸钠的采血管采血后，进行离心分离而得到血浆，将其作为被检样本使用。

对该被检样本进行凝血反应测量，取得凝固反应的时序数据。基于此时序数据而取得该被检样本的凝固反应曲线。凝血反应测量可以根据可用于凝血检查的任意方法、例如用于测定凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)、或者基于凝血酶时间法的纤维蛋白原浓度检查时的凝固时间的方法来实施。以下的本说明书中，主要按照用于测定APTT的方法对本发明的方法进行说明。对本领域技术人员而言，可以将本发明的方法应用于用于测定其它凝固时间(例如凝血酶原时间(PT))的方法来实施。

凝血反应的测量中，在被检样本中添加凝固时间测定试剂，开始凝固反应。可以对包含该试剂和被检样本的混合液的凝固反应进行测量。所使用的凝固时间测定试剂可以根据测定目的进行任意选择。市售有用于测定各种凝固时间的试剂(例如，APTT试剂CoagpiaAPTT－N；积水医疗株式会社制)。凝固反应的测量中只要使用一般的方法，例如测量散射光量、透射率、吸光度等的光学方法、或者测量血浆粘度的力学方法等即可。以下的本说明书中，以基于散射光量的凝固反应测量为例对本发明的方法进行说明。

凝固反应的反应开始时刻典型而言可以定义为在被检样本中混合钙离子(例如氯化钙溶液)开始凝固反应的时刻，也可以将其它时刻定义为反应开始时刻。持续测量凝固反应的时间例如可以为从被检样本与试剂混合的时刻起几十秒～7分钟左右。该测量时间可以为任意确定的固定值，也可以直到检测到各被检样本的凝固反应结束的时刻为止。在该测量时间期间，可以以规定间隔反复进行凝固反应的进行状况的测量(进行光学检测时为测光)。例如，只要以0.1秒间隔进行测量即可。该测量中的混合液的温度在通常条件下例如为30℃～40℃，优选为35℃～39℃。另外，测量的各种条件可以根据样本或试剂、测量方法等而适当地设定。

上述凝固反应测量中的一系列操作可以使用自动分析装置进行。作为自动分析装置的一个例子，可举出凝血自动分析装置CP3000(积水医疗株式会社制)。或者，也可以手动进行一部分操作。例如，可以人为进行被检样本的制备，并利用自动分析装置进行后续操作。

1.2.凝固反应曲线的取得

通过上述凝固反应测量而取得凝固反应曲线P(i)。这里，“i”表示测量点数、或者从凝固反应开始的时间(也简称为时间)。例如，如果测量(测光)间隔为0.1秒，则由时间＝0.1×测量点数表示。即，P(i)可以为测量点数的函数，也可以为时间的函数。以下的本说明书中，有时将P(i)简记为P。一般，凝固反应曲线P是对凝固反应测量的测量值利用通常的方法进行噪声除去或平滑化处理、或者根据需要进行用于调整初始值的调零或曲线的相对值化而得的。将凝固反应曲线的一个例子示于图1。图1的横轴表示时间，纵轴表示散射光量。随着时间经过，混合液的凝固反应进行，因此散射光量增加。

也可以根据需要由取得的凝固反应曲线P取得其微分曲线、例如反应速度曲线(一阶微分)或反应加速度曲线(二阶微分)。凝固反应曲线的微分处理可以利用任意方法来实施，例如，可以通过区间内平均斜率值的计算来进行。本说明书中，也将凝固反应曲线、反应速度曲线等一阶微分曲线和反应加速度曲线等二阶微分曲线分别称为“0次曲线”、“一次曲线”和“二次曲线”。

1.3.凝固反应结束点Pe的检测

本发明的方法中，对被检样本的凝固反应曲线P中的凝固反应结束点Pe进行检测。Pe可以按照P达到平台期的时刻、P的一次曲线达到峰值后减少到0或一定值的时刻(参照日本特愿2020－068877)、在微小时间段的P(i)的累积值之比小于阈值(例如1.001)的最早点(参照国际申请号PCT/JP2020/048676或者后述的实施例)等任意基准来确定。Pe的检测可以在取得直到规定的测定时间为止的P后进行，或者与P的取得并行地进行Pe的检测，如果检测到Pe，则可以结束P的取得。例如，日本特愿2020－068877或国际申请号PCT/JP2020/048676中记载的步骤能够实现与P的取得并行地进行Pe的检测(所谓的实时Pe检测)。

作为本发明的方法的一个实施方式，基于国际申请号PCT/JP2020/048676中记载的方法对Pe的检测步骤的例子进行详述。微小时间段内的P(i)的累积值之比规定为累积比Z(i)，由下述式算出：

Z(i)＝{P(i+1)+P(i+2)+...+P(i+m)}/{P(i－m)+P(i－m+1)+...+P(i－1)}

上式中，i表示测量点编号，m可以根据凝固反应的测量条件、分析项目等而适当地设定，例如m＝10～30。检测Z(i)小于阈值Zs的最早的测量点或时刻的P(i)作为凝固反应结束点Pe。Zs可以根据分析项目而适当地设定，大于1且为1.100以下，例如在APTT测定的情况下，优选为1.050以下，更优选Zs为1.010～1.001的范围。为了防止由初期反应异常等所致的Pe的误检，优选Z(i)的计算从i达到规定的计算开始点以后且P(i)为规定值以上开始进行。该步骤中，能够一边测量凝固反应，一边并行地取得P(i)、算出Z(i)、检测Pe。

1.4.凝固时间的计算

本发明的方法中，能够基于凝固反应曲线P算出被检样本的凝固时间。凝固时间的计算可以按照任意方法进行。作为凝固时间的计算方法的例子，可举出：算出P(i)达到凝固反应结束点Pe的N％的时刻作为凝固时间的方法；算出P的一次曲线达到其最大值的N％的时刻作为凝固时间的方法；将微小时间段内的P(i)的累积值之比达到规定值时作为计算起点Te算出P(i)达到P(Te)的N％的时刻作为凝固时间的方法(日本特开平6－249855号公报)；基于微小时间段内的P(i)的累积值的经时变化算出凝固时间的方法(参照国际申请号PCT/JP2020/048676或者后述的实施例)；基于P的一次曲线的加权平均时间算出凝固时间的方法(参照日本特愿2020－039344)；将P的一次曲线达到最大值后达到规定值时作为计算起点Te而算出P(i)达到P(Te)的N％的时刻作为凝固时间的方法(参照日本特愿2020－068877)等。

2.T(X)的计算

如果检测到Pe，则算出表示凝固反应曲线P(i)达到Pe的X％的测量点或时间的T(X)。更详细而言，T(X)为从凝固反应开始点(时间0)到P达到Pe的X％为止的测量点数或时间。即，对于T(X)，下述式成立。

P(T(X))＝Pe×X％

这里，X为大于0且为100以下的变量。因此，T(X)为变量X的函数。本发明的方法中，X优选为1～100，更优选为5～95。例如，各个X可以为相距1以上的值(即，X的增量≥1)，或者也可以为相距5以上的值(即，X的增量≥5)。一个例子中，X是在1～100的范围以增量1进行变化的变量(即，X＝{1，2，3，···，97，98，99，100})。另一个例子中，X是在5～95的范围以增量5进行变化的变量(即，X＝{5，10，15，···，90，95})。

或者，T(X)也可以表示为T(X－K)～T(X+K)的平均值。该情况下，K优选小于前述X的增量。例如，如果是K＝2，则T(X)可以在X＝10时表示为T(8)～T(12)的平均值，或者可以在X＝15时表示为T(13)～T(17)的平均值。

图2是对T(X)进行说明的图。图中，示出标记了达到Pe的10～90％的点的凝固反应曲线，将达到Pe的10％、50％和90％的时刻分别表示为T(10)、T(50)和T(90)。Pe的时刻tPe相当于T(100)。应予说明，本说明书和附图中，T(X)有时没有X的括号标记而标记为“TX”。将T(X)相对于X进行标绘所得的T(X)曲线一般如后述的图7B所示，X在从0到5附近之间急剧上升，X在从10～15附近到约80为止上升变得缓慢而接近直线状，X在90附近以后再次大幅上升。

3.基于T(X)曲线的形状来检测凝固反应异常

本发明的方法中，基于将T(X)相对于X进行标绘所得的T(X)曲线的形状(以下，也简称为T(X)曲线的形状)来检测被检样本的凝固反应的异常。在优选的实施方式中，本发明的方法中，算出反映被检样本的T(X)曲线的形状的指标R。基于该指标R的值来检测该被检样本的凝固反应的异常。

3.1.指标R的计算

指标R是能够反映T(X)曲线的形状的参数。一个实施方式中，为了算出R而算出2个、3个或4个以上的T(X)。一个实施方式中，设定2个X即X₁和X₂，算出2个T(X)即T(X₁)和T(X₂)。另一个实施方式中，设定3个X即X₁、X₂和X₃，算出3个T(X)即T(X₁)、T(X₂)和T(X₃)。又一个实施方式中，设定4个X即X₁、X₂、X₃和X₄，算出4个T(X)即T(X₁)、T(X₂)、T(X₃)和T(X₄)。又一个实施方式中，设定5个X即X₁、X₂、X₃、X₄和X₅，算出5个T(X)即T(X₁)、T(X₂)、T(X₃)、T(X₄)和T(X₅)。又一个实施方式中，设定6个X即X₁、X₂、X₃、X₄、X₅和X₆，算出6个T(X)即T(X₁)、T(X₂)、T(X₃)、T(X₄)、T(X₅)和T(X₆)。又一个实施方式中，设定8个X即X₁～X₈，算出8个T(X)即T(X₁)～T(X₈)。以下的本说明书中，表示各个指标R的式中的X_k(例如X₁～X₈)在各式中独立进行规定。其中，T(X)曲线如上所述，一般，可以在X小于5和超过90的范围急剧变化，因此优选由这些范围以外的T(X)算出指标R。X优选为5以上，更优选为6以上，进一步优选为7以上，进一步优选为9以上，进一步优选为10以上，进一步优选为11以上。另一方面，X为100以下，优选为99以下，更优选为95以下，进一步优选为94以下，进一步优选为90以下，进一步优选为89以下。

一个实施方式中，R可以是给定X的T(X)的相对值。优选R可以为T(X)比即T(X₁)与T(X₂)之比[T(X₁)/T(X₂)]。此时，优选X₁和X₂分别选自5～100的范围，其中，X₁≠X₂，可以为X₁＜X₂，也可以为X₁＞X₂。一个实施方式中，X₁＞X₂，并且优选X₁为7～99、X₂为6～95，更优选X₁为11～99、X₂为10～90。另一个实施方式中，X₁＜X₂，并且优选X₁为6～94、X₂为7～95，更优选X₁为9～89、X₂为10～90。在更优选的实施方式中，X₁为20～100，X₂为10～14。

一个实施方式中，R可以为给定X范围内的T(X)的变化率(区间变化率)。优选R可以为[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)]。一个实施方式中，X₁＞X₃，X₁优选为10～100，X₂优选为10～90，更优选为40～60，X₃优选为5～95。

一个实施方式中，R可以为给定X范围内的T(X)的变动系数。优选R可以为X＝X₁～X₂的范围内的T(X)的变动系数CV[T(X₁):T(X₂)]。此时，X₁＜X₂，优选X₁为10～86，X₂为14～90，(X₂－X₁)＝4～80。

3.2.凝固反应异常的检测

算出的指标R可以在显示凝固反应异常的样本与正常样本之间表现出不同的分布(例如参照后述的图12)。因此，指标R可以作为用于检测凝固反应异常的指标使用。本发明的方法中，能够根据上述指标R来检测被检样本的凝固反应中有无异常。

例如，正常样本的凝固反应曲线为S形状(基于散射光量进行测量的情况)，异常样本的凝固反应曲线显示为因初期反应异常而存在过早上升、或没有急剧上升而以直线状上升的形状、或者没有达到平台期的部分等异常形状。结果，异常样本的T(X)曲线的形状显示出与正常样本不同的趋势。指标R优选反映这样的T(X)曲线的形状的异常。

一个实施方式中，R＝[T(X₁)/T(X₂)]，X₁＞X₂(优选X₁为7～99、X₂为6～95，更优选X₁为11～99、X₂为10～90，进一步优选X₁为20～100、X₂为10～14)，异常样本的R大于正常样本。

另一个实施方式中，R＝[T(X₁)/T(X₂)]，X₁＜X₂(优选X₁为6～94、X₂为7～95，更优选X₁为9～89、X₂为10～90)，异常样本的R小于正常样本。

另一个实施方式中，R＝[(T(X₃)－T(X₅))/T(X₄)](这里，X₃＞X₅，X₃优选为10～100，X₄优选为10～90，X₅优选为5～95)，异常样本的R大于正常样本。一个优选的实施方式中，X₃为65～90，X₄为40～60，X₅为7～13。

另一个实施方式中，在R＝CV[T(X₆):T(X₇)](这里，优选X₆为10～86、X₇为14～90，(X₇－X₆)＝4～80)的情况下，异常样本的R大于正常样本。

一个实施方式中，通过将被检样本的指标R与基准值进行比较，能够检测出该被检样本的凝固反应中有无异常。基准值可以在实施本发明的方法之前预先确定好。基准值可以根据来自给定样本集团的指标R来确定。

一个例子中，可以由包含显示凝固反应异常的样本(以下，也简称为“异常样本”)和不显示凝固反应异常的样本(以下，也简称为“正常样本”)的样本集团算出各样本的指标R，根据所算出的指标R来确定用于检测凝固反应异常的基准值。

另一个例子中，可以由正常样本的集团算出各样本的指标R，基于所算出的指标R来确定用于检测凝固反应异常的基准值。

另一个例子中，可以由异常样本的集团算出各样本的指标R，基于所算出的指标R来确定用于检测凝固反应异常的基准值。

因此，本发明的方法的优选的实施方式中，可以设定用于区别异常样本和正常样本的阈值Th。如前所述，阈值Th可以根据来自给定样本集团的指标R来确定。以异常样本的R为阈值Th或小于该值、或者为阈值Th或大于该值的方式来确定阈值Th。

随着每个分析项目或Zs值的差异而存在正常样本的反应曲线(即T(X)曲线)的形状的差异，因此阈值Th可以对每个分析项目或每个Zs值进行适当设定。另外，在有可能随着试剂的批次而使凝固时间产生差异的情况下，可以对每一试剂批次设定阈值Th。

例如，对于异常样本中的值小于正常样本的指标R，可以在样本集团中的异常样本的R的最大值与正常样本的R的最小值之间设定阈值Th。或者，对于异常样本中的值小于正常样本的指标R，可以设定为阈值Th＝[M－(K×SD)]或该值以下。这里，M和SD分别为由正常样本的集团得到的指标R的平均值和标准偏差，K可以设定为任意的数，例如为2～15、优选2～10、更优选2～5的范围。例如K优选为2或大于2，更优选为3或大于3，进一步优选为4或大于4，进一步优选为5。如果被检样本的指标R为阈值Th或小于阈值Th，则该被检样本可以检测为存在凝固反应异常。

另一方面，对于异常样本中的值大于正常样本的指标R，可以在样本集团中的异常样本的R的最小值与正常样本的R的最大值之间设定阈值Th。或者，对于异常样本中的值大于正常样本的指标R，可以设定为阈值Th＝[M+(K×SD)]或该值以上。这里，M、K、SD与上述进行同样的规定。如果被检样本的指标R为阈值Th或大于该值，可以将该被检样本检测为存在凝固反应异常。

为了检测凝固反应异常，可以组合使用多个指标R。例如，可以将选自前述的T(X)比、T(X)的变化率和T(X)的变动系数中的2种以上组合使用。例如，可以使用T(X)比与T(X)的变化率的组合、不同X的T(X)比的组合、或者不同X的T(X)的变化率的组合。可以对多个指标R分别设定阈值Th。例如，可以对指标R1和R2分别设定阈值Th1和Th2。或者，为了检测凝固反应异常，可以针对1个指标R设定2个以上的阈值Th。例如，可以针对指标R1设定阈值Th1和Th2。

3.3.异常种的辨别

作为凝血反应的异常的种类(异常种)，可代表性地举出以下3种：(1)具有初期反应异常，从测量开始后反应曲线单调上升的异常(参照以下记为“异常种1”的实施例2的样本18)，(2)存在初期反应异常，反应曲线以双阶段上升的异常(参照以下记为“异常种2”的实施例2的样本19)，(3)不存在初期反应异常，但反应曲线从反应开始初期以直线状上升的异常(参照以下记为“异常种3”的实施例2的样本20)。作为(3)的异常的例子，可举出反应从开始初期以直线状上升并在反应中途结束测量(以下，将这样的反应称为“直线结束”)。有时指标R的值根据异常种而不同。可以使用指标R来辨别异常的种类。以下，对基于本发明的方法进行的异常样本的异常种的辨别方法进行说明。

一个实施方式中，使用2个指标R(R1和R2)、以及2个阈值Th1和Th2。将R1与Th1进行比较，将R2与Th2进行比较。根据R1和R2是否达到各自的阈值来辨别被检样本的异常种。例如，针对被检样本的R1和R2均未达到各自的阈值的情况下，可以将该被检样本辨别为正常，R1和R2均达到了各自的阈值的情况下，可以将该被检样本辨别为异常种1，R1未达到Th1而R2达到了Th2的情况下，可以将该被检样本辨别为异常种2，在R1达到了Th1而R2未达到Th2的情况下，可以将该被检样本辨别为异常种3。

应予说明，本说明书中，“被检样本的R达到阈值”在(正常样本的R)＜(异常样本的R)时是指被检样本的R为阈值或该值以上的情况，在(正常样本的R)＞(异常样本的R)时是指被检样本的R为阈值或该值以下的情况。

一个实施方式中，首先以R1的阈值Th1为基准对正常样本和异常样本进行区分。即，将R1与Th1进行比较，根据R1是否达到了Th1来辨别被检样本是正常还是异常。接着，对异常样本算出R2。对R2设定2个阈值Th2和Th3(Th2＜Th3)。在异常样本的R2未达到Th2的情况下，将被检样本辨别为异常种2，在R2达到了Th3的情况下，将被检样本辨别为异常种1，在R2达到了Th2而未达到Th3的情况下，将被检样本辨别为异常种3。

作为指标R，可以使用以下的值。下述举出的指标R可以作为R1使用，也可以作为R2使用。或者，可以将不同的X应用于相同的指标R的公式中而分别作为R1和R2使用。

·R＝[T(X₁)/T(X₂)]

(这里，

X₁＞X₂，并且优选X₁为7～99、X₂为6～95，更优选X₁为11～99、X₂为10～90，进一步优选X₁为20～100、X₂为10～14，或者

X₁＜X₂，并且优选X₁为6～94、X₂为7～95，更优选X₁为9～89、X₂为10～90)

·R＝[(T(X₃)－T(X₅))/T(X₄)]

(这里，X₃＞X₅，X₃优选为10～100，X₄优选为10～90，更优选为40～60，X₅优选为5～95)

·R＝CV[T(X₆):T(X₇)]

(这里，优选X₆为10～86，X₇为14～90，(X₇－X₆)＝4～80)

各个R的阈值可以由上述3.2中记载的步骤进行确定。

3.4.检测例

对使用指标R的凝固反应异常的检测程序的例子进行说明。

步骤A－1)R＝T(X₁)/T(X₂)

将T(X)曲线进行相对值化所得的R＝[T(X₁)/T(X₂)]在X₁＞X₂时，异常样本的R大于正常样本，在X₁＜X₂时，异常样本的R小于正常样本。阈值Th可以使用正常样本的R的平均值+K×SD(K＞2)。例如，X₁＝20～100，X₂＝10～14，阈值Th可以使用正常样本的R+5SD。被检样本的R为Th或超过Th时，被检样本被检测为存在凝固反应异常，在并非如此的情况下，被检样本被检测为正常(表1－A)。或者，在X₁＜X₂时，阈值Th可以使用正常样本的R－5SD。被检样本的R为Th或小于该值时，被检样本被检测为存在凝固反应异常，在并非如此的情况下，被检样本被检测为正常。利用该指标R，能够检测到异常种1～3中的任一者。通过进一步与以下的步骤B)～D)组合，能够辨别异常种。

步骤A－2)R＝(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)

异常样本的凝固反应曲线具有如下特征：与接近S型的正常样本的凝固反应曲线相比变为“在时间轴方向上较宽的曲线形状”。反应曲线较宽反映为T(X₁)－T(X₃)(X₁＞X₃)。使用对其进行相对值化所得的[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)]作为指标R。优选X₁为65～90、X₂为40～60、X₃为7～13。阈值Th可以使用正常样本的R的平均值+K×SD(K＞2)。优选Th可以使用正常样本的R+5SD。被检样本的R为Th以上或超过Th的情况下，被检样本被检测为存在凝固反应异常，在小于Th或为Th以下的情况下，被检样本被检测为正常(表1－A)。利用该指标R，能够检测到异常种1～3中的任一者。通过进一步组合以下的步骤B)～D)，能够辨别异常种。

步骤B)R1＝(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)和R2＝(T(X₄)－T(X₆))/T(X₅)

使用2个指标R1＝[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)]和R2＝[(T(X₄)－T(X₆))/T(X₅)]。优选X₁为99～100、X₂为50～80、X₃为5～12、X₄为70～80、X₅为40～60、X₆为20～30。阈值可以使用R1的阈值Th1＝正常样本的R1的平均值+K1×SD(K1＞2)和R2的阈值Th2＝正常样本的R2的平均值+K2×SD(K2＞2)。可以优选使用Th1＝正常样本的R1+5SD、Th2＝正常样本的R2+5SD。被检样本的R1或R2为各自的阈值以上或者超过各自的阈值的情况下，被检样本被检测为存在凝固反应异常。进而，通过R1或R2中的某一个超过阈值来辨别异常种(表1－B)。例如，在被检样本的R1超过Th1且R2超过Th2的情况下，可以将被检样本辨别为异常种1，在被检样本的R1超过Th1且R2不超过Th2的情况下，可以将被检样本辨别为异常种2，在被检样本的R1不超过Th1且R2超过Th2的情况下，可以将被检样本辨别为异常种3。

步骤C)R1＝(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)，R2＝CV[T(X₄):T(X₅)]

正常样本组的“反应进行期”具有T(X)曲线的波动较小的特征。因此，可以将反应进行期的T(X)的变动系数CV作为指标R来检测异常样本。变动系数CV[T(X₄):(T(X₅)]是将X＝X₄～X₅的范围内的T(X)的标准偏差除以平均值所得的值。显示为双阶段反应的异常种2时，在反应的第一阶段结束以后的时间CV变小。

因此，该步骤中，首先使用R1，如步骤A那样检测异常样本。接着，针对所检测到的异常样本，算出R2＝CV[T(X₄):T(X₅)](X₄为20～66，X₅为24～70，(X₅－X₄)＝4～80、优选为10～80)。R2的阈值Th2可以使用正常样本的R的平均值+K×SD(K＞2)。可以优选使用Th2＝正常样本的R+5SD。被检样本的R2为Th2或小于该值的情况下，被检样本被检测为异常种2。此外，也可以使用针对R2的第2个阈值Th3，阈值Th3可以使用正常样本的R的平均值+K×SD(K＞9)。可以优选使用Th3＝正常样本的R+15SD。被检样本的R2为Th3以上或超过Th3的情况下，被检样本被检测为异常种1(表1－C)。此外，在R2为Th2与Th3之间的情况下，可以辨别为异常种3。例如，通过步骤A(R1＝[(T(90)－T(10))/T(50)]，Th1＝正常样本的R+5SD)来检测异常样本。接下来，使用R2＝CV[T(20):T(70)]、Th2＝正常样本的R+5SD、以及Th3＝正常样本的R+15SD对异常样本进行如下区别：在R2为Th2以下的情况下，可以辨别为异常种2，在超过Th2且为Th3以下的情况下，可以辨别为异常种3，在超过Th2的情况下，可以辨别为异常种1。

[表1]

表1-A

表1-B

表1-C

本说明书中记载的凝血反应异常的辨别基准中，只要能够区别异常种，“小于阈值”和“阈值以下”的基准值就可以进行交换，或者“大于阈值”和“阈值以上”的基准值就可以进行交换，这对本领域技术人员而言是可以理解的。

3.5.结果的输出

凝固反应异常的检测结果可以以任意形式输出。可以根据需要与被检样本的凝固反应异常的有无、异常种的检测结果一起输出该被检样本的凝固时间、检测的精度等信息。优选将被检样本的凝固反应异常的有无、异常种的检测结果和凝固时间一起输出。本发明的方法提供显示有无凝固反应异常的数据。由本发明的方法提供的数据本身并不表示临床诊断结果。

3.6.检测流程

作为一个实施方式，将基于本发明的方法来检测凝固反应异常的例示流程示于图3－A。下述示出图3－A的流程的详细步骤。

S00：凝固反应的测量开始。

S01：取得时间i时的凝固反应曲线P(i)。

S02：判定有无检测到Pe。

检测到Pe时进入S03。

无法检测到时返回到S01继续取得P(i)。

S03：根据P(i)和Pe算出APTT。

S04：根据P(i)和Pe算出T(X)。

S05：根据T(X)算出指标R。

S06：将指标R与用于检测凝固反应异常的阈值Th进行比较。

如果将凝固反应判定为正常则进入S10。

如果判定为凝固异常则进入S20。

S10：与APTT一起输出显示凝固反应正常的结果。

S20：与APTT一起输出显示检测到凝固反应异常的结果。

本发明的方法的一个实施方式中，与P的取得并行地进行Pe的检测(所谓的实时Pe检测)，由此能够在得到凝血时间的计算所需的凝固反应测量数据的时刻立即检测异常凝血反应。由此，本实施方式能够在实时得到凝血时间的同时检测有无凝血反应异常，因此对自动分析装置的分析效率的提高作出了贡献。

作为这样的实时检测的一个实施方式，将基于国际申请号PCT/JP2020/048676中记载的方法由P(i)的累积比Z(i)和阈值Zs进行Pe检测时的通过本发明的方法来检测凝固反应异常的例示流程示于图3－B。下述示出图3－B的流程的详细步骤。

S00：设定Zs的初始值。

S01：开始测量凝固反应。

S02：取得时间i时的凝固反应曲线P(i)。

S03：由P(i)算出Z(i)。

S04：Z(i)小于阈值Zs时作为Pe检测P(i)。

检测到Pe时进入S05。

无法检测到时返回S02继续取得P(i)。

S05：根据P(i)和Pe算出APTT。

S06：根据P(i)和Pe算出T(X)。

S07：根据T(X)算出指标R。

S08：确认Zs是否为初始值。

如果为初始值则进入S09。

如果不为初始值则进入S30。

S09：将指标R与用于检测凝固反应异常的阈值Th进行比较。

如果将凝固反应判定为正常则进入S20。

如果判定为凝固异常则进入S10。

S10：辨别凝固异常的种类(反应是否为“直线结束”)。

如果为“直线结束”则进入S11。

如果为“直线结束”以外则进入S21。

S11：再设定Zs，返回S02继续取得P(i)。

S20：与APTT一起输出显示凝固反应正常的结果。

S21：与APTT一起输出显示检测到凝固反应异常的结果。

S30：将指标R与用于检测凝固反应异常的阈值Th进行比较。

S31：与APTT一起输出显示凝固反应正常的结果。

S32：与APTT一起输出显示检测到凝固反应异常的结果。

4.在其它凝固反应测量法中的应用

以上，以基于散射光量的凝固反应测量的情况为例对本发明的凝固反应异常的检测方法进行了说明。然而，只要是本领域技术人员，就可以将上述基于散射光量的方法用于使用其它凝固反应测量法(例如基于透射率、吸光度、粘度等的凝血反应测量法)的方法，因此该应用包含于本发明的范围。

5.程序和装置

上述的本发明的凝固反应异常的检测方法可以使用计算机程序自动进行。因此，本发明的一个方式为用于进行上述本发明的凝固反应异常的检测方法的程序。在优选的实施方式中，本发明的程序为用于实施上述图3－A或3－B的流程的程序。另外，上述本发明的方法的一系列的工序可以利用自动分析装置自动进行。因此，本发明的一个方式为用于进行上述本发明的凝固反应异常的检测方法的装置。

以下，对本发明的装置的一个实施方式进行说明。本发明的装置的一个实施方式为如图4所示的自动分析装置1。自动分析装置1具备控制单元10、操作单元20、测定单元30和输出单元40。

控制单元10控制自动分析装置1的整体的动作。控制单元10例如可以由1台以上的计算机构成。控制单元10具备CPU、内存、存储器、通信接口(I/F)等，进行来自操作单元20的指令的处理、测定单元30的动作的控制、由测定单元30接收的测定数据的保存、数据分析、分析结果的保存、利用输出单元40的测定数据、分析结果的输出的控制等。进而，控制单元10可以与外部媒体、主机等其它设备连接。应予说明，控制单元10中，控制测定单元30的动作的计算机与进行测量数据分析的计算机可以相同，也可以不同。

操作单元20取得来自操作者的输入，将得到的输入信息传递到控制单元10。例如，操作单元20具备键盘、触控面板等用户接口(UI)。输出单元40在控制单元10的控制下输出测定单元30的测量数据、基于该数据的凝固反应曲线P、凝固反应结束点Pe、凝固时间、T(X)、指标R、被检样本中的凝固反应异常的检测结果等分析结果。例如，输出单元40具备显示器等显示装置。

测定单元30执行用于凝血检查的一系列操作，取得包含血液样本的试样的凝固反应的测量数据。测定单元30具备凝血检查所需的各种器材、分析模块、例如收容血液样本的样本容器、收纳检查用试剂的试剂容器、用于样本与试剂反应的反应容器、用于将血液样本和试剂分注到反应容器中的探头、光源、用于检测来自反应容器内的试样的散射光或透过光的探测器、将来自探测器的数据传送到控制单元10的数据处理电路、接收控制单元10的指令来控制测定单元30的操作的控制电路等。

控制单元10基于测定单元30所测量的数据来进行被检样本中有无凝固反应异常的分析。本分析中可以包含上述凝固反应曲线P的取得和凝固时间的计算、以及凝固反应结束点Pe的检测、T(X)和指标R的计算等。此外，控制单元10也可以进行使用了所算出的R的凝固反应异常的检测。或者，凝固反应曲线P和Pe可以基于来自测定单元30的测量数据由控制单元10取得，或由其它仪器例如测定单元30取得并传送至控制单元10。控制单元10可以保存被检样本的凝固时间、T(X)、用于R的计算、Pe的检测的各种参数(例如，用于R的计算的计算式等)。另外，控制单元10也可以保存用于检测凝固反应异常的基准值(例如，上述阈值Th等)。或者，控制单元10也可以在分析时获取保存于外部设备或网络上的该参数、基准值。

以上的本分析可以通过用于进行本发明的方法的程序来实施。因此，控制单元10可以具备用于进行本发明的凝固反应异常的检测方法的程序。

控制单元10中的分析结果被传送至输出单元40并输出。输出可以采取在画面上显示、发送至主机并打印等任意形态。来自输出单元的输出信息可以包含凝固反应曲线的数据、凝固反应结束点Pe、凝固时间、T(X)、指标R、凝固反应异常的检测结果等。来自输出单元的输出信息的种类可以由本发明的程序进行控制。

实施例

以下，举出实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于这些实施例。以下的实施例中的凝固反应测量按照APTT测定的步骤进行。

方法

1)凝固反应测量

对于测定用试剂，使用作为APTT测定用试剂的Coagpia APTT－NAPTT试剂(积水医疗株式会社制)作为第1试剂，使用Coagpia APTT－N氯化钙液(25mM氯化钙液，积水医疗株式会社制)作为第2试剂。包含样本的试样的凝固反应测量使用凝血自动分析装置CP3000(积水医疗株式会社制)进行。将样本50μL在试管内以37℃加温45秒后，添加约37℃的第1试剂50μL，进而经过171秒后添加第2试剂50μL开始凝固反应。反应在37℃下进行。凝固反应的测量是对试管照射以LED为光源的波长660nm的光，以0.1秒的间隔测量90度侧方散射光的散射光量。测量时间为360秒。

2)凝固反应曲线的取得

对来自各样本的测光数据进行包含噪声除去的平滑化处理后，以测光开始时刻的散射光量为0的方式进行调零处理而制成凝固反应曲线P(i)。

3)凝固反应结束点Pe的检测和APTT的确定

检测凝固反应曲线P(i)的累积比Z(i)(参照PCT/JP2020/048676)小于累积比阈值Zs的最早时刻的P(i)作为凝固反应结束点Pe。累积比阈值Zs使用1.001或1.010。算出P(i)达到Pe的50％的时刻T(50)，确定为APTT。时刻i的累积比Z(i)如下算出：

累积比Z(i)＝Pb(i)/Pa(i)

Pa(i)＝从P(i－20)到P(i－1)的和

Pb(i)＝从P(i+1)到P(i+20)的和

实施例1

1)样本

根据上述方法1)～2)，进行人的血液样本(加入柠檬酸的血浆)的凝固反应测量，取得凝固反应曲线P。正常的反应曲线P为具有曲线缓慢开始上升的“反应初期”、曲线急剧上升并包含拐点的“反应进行期”、曲线上升变缓而进入平台期(平坦化)的“反应后期”这3个区间的S形状。反应曲线P正常(S形状)的样本中，分别选择显示为不同APTT(Zs＝1.001时的T(50)从20秒到180秒以约10秒差异)的17个样本，作为正常样本组(样本1～17)。

2)Pe的检测

根据上述方法3)对正常样本组检测设定为Zs＝1.001和Zs＝1.010时的凝固反应结束点Pe。将直到检测出的Pe为止的反应曲线P分别示于图5A和图5B。图的横轴为将第2试剂(氯化钙液)添加时设为零的反应时间，纵轴为P，由散射光量(经调零后的散射光量)表示。以下的附图中也有时将P由散射光量表示。

3)APTT的计算

图6A示出正常样本组(样本1～17)的P达到Pe的时间tPe，图中的标绘点表示将反应曲线P的最大值Pmax设为Pe时的tPe(PmaxT：〇)、以及相对于Zs＝1.001和Zs＝1.010时根据上述方法3)检测到的Pe的tPe(分别为Zs＝1.001：+和Zs＝1.010：×)。图6B示出针对样本1～17的APTT，图中的标绘点表示P达到图6A中示出的各个Pe的50％的时刻T(50)。

根据图6A和B可知：在3种Pe(图6A中示出的PmaxT、Zs＝1.001、Zs＝1.010)之间，所算出的APTT几乎没有差异。Zs＝1.001和Zs＝1.010时的APTT与PmaxT时的APTT之差分别最大为0.5％和2.8％。

4)T(X)的计算

对17个样本基于下述式算出反应曲线P达到由2)检测到的Pe的X％的时间T(X)。X从1到100以1为刻度设定100个，算出T(1)～T(100)。应予说明，X＝50时的T(50)相当于APTT。

P(T(X))＝Pe×X％

图7中的A和图8中的A表示Zs＝1.001(图7中的A)和Zs＝1.010(图8中的A)时的到Pe为止的反应曲线P(分别与图5中的A和B相同)，图7中的B和图8中的B表示基于图7中的A和图8中的A的T(X)曲线。17个样本的T(X)曲线的纵轴上的位置根据P的上升时间或APTT而不同。正常样本中的T(X)曲线均在X从0到5附近之间急剧上升，X从10～15附近到约80上升变得缓慢而接近直线状，X在90附近以后再次大幅上升。

对17个样本算出T(X)比。图7中的C和图8中的C分别示出图7中的B和图8中的B所示的T(X)之比[T(X)/T(50)](X＝1～100)。图7中的D和图8中的D是将图7中的C和图8中的C在纵轴方向放大而成的图，图中的点划线和双点划线分别表示17个样本的T(X)/T(50)的平均值+3SD和平均值－3SD(SD为标准偏差)。17个样本的T(X)/T(50)虽然在X为5～50的区间比较接近，但X在小于5和超过50的区间存在有波动的趋势。

实施例2

1)样本

准备反应曲线P异常的3个血液样本(样本18、19、20)。样本18、19为人的加入柠檬酸的血浆。样本18在刚开始测量后立即观察到反应(初期反应异常)，并且反应直接单调上升(参照图9中的A)。样本19观察到初期反应异常，反应以双阶段上升(参照图9中的B)。样本20为凝血因子VIII缺乏血浆(Factor VIIIDeficient；George King Bio-Medical,Inc.，FVIII活性值小于1％)，从刚开始测量后经过一定时间的时刻开始反应(即无初期反应异常)，反应从开始初期起以直线状上升，然后缓慢平坦化，但反应曲线并未达到平台期(参照图9中的C)。

2)凝固反应测定

根据上述方法1)～3)，取得异常样本(样本18～20)的反应曲线P，检测凝固反应结束点Pe。与实施例1同样地算出T(X)(X＝1～100，以1为刻度)。

将样本18～20的直到Pe(Zs＝1.001时)为止的反应曲线P与正常样本组的数据一起分别示于图9中的A～C。另外，将样本18～20的直到Pe(Zs＝1.010时)为止的反应曲线P与正常样本组的数据一起分别示于图10中的A～C。各图中，样本18～20的数据用虚线表示。

如图10中的A～C所示，Zs＝1.010时的Pe与Zs＝1.001相比更早。另外，Zs＝1.001时，样本18～20的APTT(T(50))分别为52秒、53秒和112秒，但Zs＝1.010时，样本18～20的APTT(T(50))分别为36秒、52秒和103秒，与Zs＝1.001时相比变短。异常样本中，与实施例1中示出的正常样本组不同，APTT有时受到Zs的影响。这表明异常样本的反应曲线的形状与正常样本不同，可能是反应初期、反应进行期和反应后期没有明确出现的反应曲线。

3)反应异常的检测－1

与实施例1同样地算出异常样本的[T(X)/T(50)]。将样本18～20的Zs＝1.001时的[T(X)/T(50)]与正常样本组的数据一起分别示于图9中的D～F。另外，将样本18～20的Zs＝1.010时的[T(X)/T(50)]与正常样本组的数据一起分别示于图10中的D～F。各图中，样本18～20的数据用虚线表示，点划线和双点划线分别表示17个正常样本的[T(X)/T(50)]的平均值+3SD和平均值－3SD。

样本18、20的T(X)/T(50)偏离正常样本组的平均值±3SD的范围(图9中的D、F和图10中的D、F)。另外，样本19的T(X)/T(50)在X小于15％附近时偏离正常样本组的平均值±3SD的范围(图9中的E和图10中的E)。因此，表明能够以T(X₁)/T(X₂)为指标来检测异常样本。应予说明，显然该指标的分母T(X₂)无需为T(50)。例如，如图11所示，可以为T(40)、T(60)等。另外，如图9～11所示，异常样本的T(X₁)/T(X₂)在X₁＞X₂时超过正常样本组的平均值+3SD，在X₁＜X₂时小于正常样本组的平均值－3SD。

根据以上结果，表明T(X)比[T(X₁)/T(X₂)]能够作为用于检测凝固反应异常的指标使用，而且该指标的针对正常样本组的平均值±3SD能够作为用于检测异常的阈值使用。

4)反应异常的检测－2

针对实施例1的17个的正常样本组和3个异常样本，求出T(X)的区间变化率[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)]。图12的上列是Zs＝1.001时的T(X)的区间变化率[(T(90)－T(10))/T(50)]相对于APTT进行标绘而得的，下列是Zs＝1.010时的T(X)的区间变化率[(T(90)－T(10))/T(50)]相对于APTT进行标绘而得的。各图中，正常样本组用×记号表示，异常样本用●(样本18)、▲(样本19)和■(样本20)记号表示，另外，虚线表示17个正常样本组的值的平均+3SD，将其作为用于检测凝固反应异常的阈值。

图12中，3个异常样本(样本18～20)均超过了阈值(图中的虚线)。表明可以通过T(X)的区间变化率来检测凝固反应异常。

图12中示出的指标[(T(90)－T(10))/T(50)]可以表示为[(T(90)/T(50))－(T(10)/T(50))]。如图13所示，该式由T(X)/T(50)曲线中的X＝90时的(T(X)/T(50))的值与X＝10时的(T(X)/T(50))的值之差W表示。应予说明，图13是改变图9F的纵轴的刻度而得的图。如图13所示，反应曲线P为S形状的正常样本中，在P急剧上升的反应进行期，T(X)/T(50)几乎没有变化，因此W为较小的值。另一方面，反应曲线P不为S形状的异常样本中，W变大。

根据以上结果，表明T(X)的区间变化率[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)]可以作为用于检测凝固反应异常的指标使用。应予说明，如图11所示，显然该指标的分母T(X₂)无需为T(50)。

5)指标的优化

作为指标，使用R(X)＝T(X)/T(Y)(X＝1～100，Y＝10、40、50、60或90)。求出正常样本组(样本1～17)的R(X)的平均值M(X)和标准偏差SD(X)、以及来自3个异常样本(样本18～20)的R(X)，算出SDI(X)＝[(R(X)－M(X))/SD(X)]。

在图14中的A～E中示出3个异常样本(样本18～20)的SDI(X)。各图中，实线表示样本18，虚线表示样本19，长虚线表示样本20。异常样本的SDI在X＜Y时为负，在X＞Y时为正，在X＝Y时为零，在X＝1附近和X＝100附近存在接近零的趋势。

随着Y变大而存在SDI的绝对值降低的趋势，SDI的绝对值的最大值超过了5。这表明异常样本的指标R(X)相对于正常样本组的平均值有时最大偏离大于5SD。另一方面，Y＝10和Y＝90时，SDI在各样本中存在很大波动。因此，表明：使用T(X)比[T(X₁)/T(X₂)]或T(X)的区间变化率[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)]作为用于检测凝固反应异常的指标时，分母X₂只要在10～90的范围即可，优选为40～60的范围。另一方面，X₁和X₃只要以SDI的绝对值变大的方法根据X₂进行设定即可。

应予说明，在如样本19那样因初期反应而使反应曲线显示为双阶段的样本中，有时SDI(X)与正常不同(例如SDI(X)的绝对值为5以上)的部分仅在比与凝固时间对应的X更小的区间(例如，APTT为T(50)时在X＜50的区间)出现。可以认为这样的样本中，凝固反应异常不影响凝固时间的计算。因此，以算出凝固时间为目的的情况下，不一定需要将如样本19那样的双阶段曲线判定为异常曲线。

实施例3

1)凝固反应测定

将APTT落入23秒～267秒的范围内的988个样本(包含人的加入柠檬酸的血浆、正常和异常样本)作为对照样本组。根据上述方法1)～3)，取得对照样本组的反应曲线P和凝固反应结束点Pe(Zs＝1.001或Zs＝1.010)，与实施例1同样地算出T(X)(X＝1～100，以1为刻度)。

2)利用指标R来检测凝固反应异常

2－1)[T(X₁)/T(X₂)]

求出3个异常样本(样本18～20)和对照样本组的指标R＝[T(X₁)/T(X₂)]。图15中A～D表示Zs＝1.010时的[T(X₁)/T(X₂)](X₁为20～100，X₂为10～14)相对于APTT标绘而成的图。各图中，对照样本组用+记号表示，异常样本用●(样本18)、▲(样本19)和■(样本20)表示，另外，虚线表示作为阈值的对照样本组的值的平均+5SD。3个异常样本(样本18～20)的R均超过了阈值。

2－2)[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)]

接下来，求出3个异常样本(样本18～20)和对照样本组的指标R＝[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)]。图16中的A～H表示Zs＝1.010时的[(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)](X₁为65～90，X₂为40～60，X₃7～13)相对于APTT标绘而成的图。各图中，对照样本组和异常样本的记号与图15相同，虚线表示对照样本组的值的平均+5SD。3个异常样本(样本18～20)的R均超过了阈值。

2－3)CV[T(X₁):(T(X₂)]

求出实施例2的3个异常样本(样本18～20)和实施例3的对照样本组的指标R＝CV[T(X₁):(T(X₂)]。图17中的A～C表示Zs＝1.010时的CV[T(X₁):(T(X₂)](X₁为10，X₂为14～90)相对于APTT标绘而成的图。各图中，对照样本组和异常样本的记号与图15相同，虚线表示作为阈值的对照样本组的值的平均+5SD。3个异常样本(样本18～20)的R均超过了阈值。

比较例1

对异常样本(样本18～20)和对照样本组求出作为指标R的[T(X₁)－T(X₂)](Zs＝1.001)。图18表示[T(X₁)－T(X₂)]相对于APTT标绘而成的图，这里，X₁＝50+a，X₂＝50－a，a在图18的A～C中依次设定为5、10、40。各图中，对照样本组和异常样本的记号与图15相同，另外，虚线表示对照样本组的值的平均+5SD，并将其作为阈值。该指标R依赖于APTT而增加，因此不仅是异常样本，就连在对照样本组中APTT延迟的样本也有时超过阈值，认为难以利用该指标R来检测异常样本。

实施例4

作为代表性的反应异常的种类(异常种)，有在实施例2中使用的、如样本18那样存在初期反应异常且从测量开始后反应曲线单调上升的异常(以下记为“异常种1”)、如样本19那样的存在初期反应异常且反应曲线以双阶段上升的异常(以下记为“异常种2”)、如样本20那样的没有初期反应异常但反应从反应开始初期就以直线状上升的异常(以下记为“异常种3”)。使用实施例3的样本，对按照前述步骤B～C(表1－B～1－C)来实施异常种辨别的可能性进行验证。

1)通过步骤B来辨别异常种

根据图19～20所示的结果，暗示了能够利用步骤B(R1＝(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)和R2＝(T(X₄)－T(X₆))/T(X₅))来辨别异常种1～3的可能性。例如，设定R1＝(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)(X₁为99～100，X₂为50～80，X₃为5～12)、R2＝(T(X₄)－T(X₆))/T(X₅)(X₄为70～80，X₅为40～60，X₆为20～30)。如果R1小于阈值且R2为阈值以上，则可以辨别为异常种3，如果R2小于阈值且R1为阈值以上，则可以辨别为异常种2，如果R1和R2都为阈值以上，则可以辨别为异常种1。属于由该步骤检测到的异常种3的样本20为凝血因子VIII缺乏血浆。以往，凝血因子缺乏一般通过存在凝固时间延长的样本的交叉混合试验来辨别。与此相对，本发明中，能够以更简便的步骤在与被检样本的凝固时间的测定的同时辨别由凝血因子缺乏引起的凝固能异常。应予说明，图19中，虽然对照样本的一部分超过了阈值，但确认了这些样本的凝固反应曲线存在具有与样本19(异常种2)相似的形状的趋势。

2)通过步骤C来辨别异常种

如图9所示，正常样本组的反应曲线P的变化在反应初期和反应后期缓慢，在反应进行期陡峭。如果将该特征作为T(X)的变化量用d(X)＝[T(X)－T(X－1)]表示，则会成为图21中的A～C。即，反应进行期(X＝约15～80)的d(X)虽然在正常样本中变小，但在异常样本中有时会根据异常的形状而一部分或整体变大。

图22分别示出3个异常样本(样本18～20)和实施例3的对照样本组的CV[T(X₁):(T(X₂)](X₁为20～66，X₂为24～70，(X₂－X₁)＝4～80)相对于APTT标绘而成的图。各图中，对照样本组和异常样本的记号与图15相同，另外，虚线表示对照样本组的值的平均+5SD，作为用于检测反应异常的阈值。图22中示出的全部CV按照样本18(异常种1)、样本20(异常种3)、样本19(异常种2)的顺序降低。因此，显示出例如根据R1＝(T(90)－T(10))/T(50))从正常样本中检测到异常样本后，将其根据R2＝CV[T(20):T(70)]进行分类，由此能够辨别异常种1～3。

Claims

1.一种凝血反应异常的检测方法，包括：

1)检测被检血液样本的凝固反应曲线的凝固反应结束点Pe；

2)算出T(X)，其中，T(X)表示该凝固反应曲线达到Pe的X％的测量点或时间，X是大于0且为100以下的变量；

3)根据T(X)来检测该被检血液样本的凝血反应异常。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述3)包括：根据T(X)算出指标R，根据该指标R来检测所述被检血液样本有无凝血反应异常。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述指标R为选自给定X范围内的T(X)之比、给定X范围内的T(X)的变化率、以及给定X范围内的T(X)的变动系数中的至少1者。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述给定X范围内的T(X)之比为T(X₁)/T(X₂)；

所述给定X范围内的T(X)的变化率为(T(X₃)－T(X₅))/T(X₄)；

所述给定X范围内的T(X)的变动系数为X₆～X₇的范围内的T(X)的变动系数。

5.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，包括：通过将所述指标R与给定阈值进行比较来检测所述被检血液样本有无凝血反应异常。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，根据由样本集团取得的指标R来确定所述阈值。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，在以下情况下，检测到所述被检血液样本的凝血反应异常：

所述阈值为由正常样本集团取得的指标R的平均值+2×标准偏差以上、并且所述被检血液样本的指标R为该阈值或大于该阈值时，或者

所述阈值为由正常样本集团取得的指标R的平均值－2×标准偏差以下、并且所述被检血液样本的指标R为该阈值或小于该阈值时。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述3)包括：根据T(X)算出指标R1和R2，根据该指标R1和R2来检测所述被检血液样本的凝血反应异常的种类。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述指标R1为第1给定X范围内的T(X)的变化率，

所述指标R2为以下的第2给定X范围内的T(X)的变化率、或者给定X范围内的T(X)的变动系数。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述第1给定X范围内的T(X)的变化率为(T(X₁)－T(X₃))/T(X₂)；

所述第2给定X范围内的T(X)的变化率为(T(X₄)－T(X₆))/T(X₅)；

所述给定X范围内的T(X)的变动系数为X₇～X₈的范围内的T(X)的变动系数。

11.根据权利要求9或10所述的方法，包括：

将所述R1与阈值Th1进行比较，将所述R2与阈值Th2进行比较；以及

根据该R1和R2是否达到各自的阈值来检测所述被检血液样本的凝血反应异常的种类；

该R1为所述第1给定X范围内的T(X)的变化率，该R2为所述第2给定X范围内的T(X)的变化率。

12.根据权利要求9或10所述的方法，包括：

将所述R1与阈值Th1进行比较，在该R1达到Th1的情况下，检测为所述被检血液样本具有凝血反应异常；

将检测为具有凝血反应异常的该被检血液样本的所述R2与阈值Th2和Th3进行比较；以及

根据该R2是否分别达到Th2和Th3来检测所述被检血液样本的凝血反应异常的种类；

该R1为所述第1给定X范围内的T(X)的变化率，该R2为所述给定X范围内的T(X)的变动系数。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，根据由样本集团取得的指标R1来确定所述阈值Th1，根据由该样本集团取得的指标R2来确定所述阈值Th2。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，根据由样本集团取得的指标R1来确定所述阈值Th1，根据由该样本集团取得的指标R2来确定所述阈值Th2和Th3。

15.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：算出所述被检血液样本的凝固时间。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，与所述被检血液样本的凝固反应曲线的取得平行地进行Pe的检测，如果检测到Pe则结束凝固反应曲线的取得。

17.一种程序，用于实施权利要求1所述的方法。

18.一种装置，用于实施权利要求1所述的方法。