CN117866824A - 一种可同时高效降解氨氮和亚硝酸盐的复合益生菌制剂及其在水产养殖上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及氨氮和亚硝酸盐降解技术领域，尤其涉及一种可同时高效降解氨氮和亚硝酸盐的复合益生菌制剂及其在水产养殖上的应用。复合益生菌制剂由一种特定的斯图泽里单胞菌属细菌和一种特定的假单胞菌属细菌组成；上述的两种细菌功能类型相同，混合后通过亚硝化作用、硝化作用和反硝化作用降解氨氮和亚硝酸盐，使其最终降解为氮气。本发明所含的两种细菌为功能相同的不同物种菌，由其混合制备得到的复合益生菌制剂即可完成从亚硝化作用到反硝化作用的一系列反应，无需在使用时进行不同类型细菌间的平衡。具有在较短时间内大幅降解养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的能力。
Description
技术领域
本发明涉及氨氮和亚硝酸盐降解技术领域，尤其涉及一种可同时高效降解氨氮和亚硝酸盐的复合益生菌制剂及其在水产养殖上的应用。
背景技术
水产养殖中普遍存在水体氨氮与亚硝酸盐过高的问题，是基本所有的水产养殖都要面对的难题。水体氨氮与亚盐过高通常是由于养殖过程中未被食用的饲料积累，或是因为养殖的水生动物的排泄物及尸体经过微生物的分解，产生大量的氨氮和亚硝酸盐而造成。水体的pH值与温度增加还会造成氨氮和亚硝酸盐的毒性增加，进而对养殖水生生物的健康造成极大危害。
目前，现有的水产养殖塘降氨氮/亚硝酸盐的方法主要有：
方法1、养殖池塘大面积大体量换水:频繁大量换水会刺激所养殖的水生生物，使生物应激，有可能造成不正常的生理现象如甲壳动物蜕壳异常等，导致生物体发育不良或死亡。同时换水所排出的大量废水不易处理，直接排放入自然环境会对环境造成危害，在环保方面给养殖带来诸多限制与不便。
方法2、使用增氧机或增氧剂增加水体溶氧量：增加水中溶氧量虽可帮助自然中降解氨氮和亚硝酸盐的微生物如硝化细菌等生长，但实际效果对于整体养殖需要而言过于微弱，效率极低，而且有可能会导致养殖水体中的浮游生物生长过量，进而与养殖生物争抢氧气。长时间增加水中溶氧量还会造成对虾偷死的问题。
方法3、在水中放入沸石粉、活性炭、麦饭石等吸附材料:吸附材料会令有毒物沉积于养殖塘底，时间一长造成塘底环境恶劣，如不定期将其捞出弃置，最终毒素仍会释放回水体中，导致前功尽弃，但频繁打捞又会影响养殖水生物的正常生长及增加操作成本，同时毒物沉积还会造成养殖塘泛底、缺氧、养殖生物中毒、免疫力低、生物发病等问题，因此该方法难以频繁和大范围使用。
方法4、往水中加入氧化剂:氧化剂有可能会杀死水体中的藻类和菌类，还可能会引发对虾黑鳃问题。水体污染过重的时候可能会因不完全氧化而产生中间毒素，导致更严重的水生生物缺氧或中毒。
方法5、在养殖水体中植入水生植物/单胞藻/水草:水生植物和藻类如果大量繁殖，会极大消耗水体中的氧气，给对虾造成缺氧问题甚至是窒息而导致死亡，同时还会大大降低水体透明度和减弱水体接收到的光照强度，给水生生物的觅食和生长带来不良影响。在水体中大量存在的藻类还会破坏水体化学平衡，进而造成水质恶化，导致养殖生物免疫力降低，从而更易得病。水植法受自然天气影响严重，在我国南方等地常年阴雨天居多，光照少，植物不易生长和进行光合作用，导致氨氮和亚盐降解效果差，效率低。同时，因缺少能够在海水中生长的降解氨氮和亚硝酸盐的有益植物，水植法在海水养殖方面基本不可进行。
方法6、使用微生物制剂处理水体:现有制剂中的微生物如果大量繁殖，会严重消耗水体氧气，导致水生生物缺氧；一些微生物如兼性芽孢杆菌繁殖周期过慢，无法在短时间内发挥足够的降氨氮能力；而另外一些微生物如光合细菌则受天气影响太大，逢阴雨天便容易效果差甚至无效。一般的微生物制剂用量少则效果较差、用量多又容易造成水体缺氧、浑浊或倒藻等水体质量问题，用量不好控制。此外传统的微生物制剂遵循“亚硝化菌+硝化菌”的复合形式，使用功能完全不同的这两类菌分别完成氨氮到亚盐和亚盐到硝酸盐这两种转化。由于是功能不同的细菌，因此必须考虑加入的菌群在水体中如何达到平衡状态，例如要加入多少硝化菌才能对亚硝化菌降解氨氮所产生的亚盐进行适当处理。比例平衡若有不慎，便会出现亚盐过多或氨氮无法被有效降解的问题。同时，一般的亚硝化菌/硝化菌在自然环境下的生长速度极慢，因此在水产养殖应用上的效率实际极差，效果甚微。
发明内容
针对背景技术中存在的问题，本发明提出一种可同时高效降解氨氮和亚硝酸盐的复合益生菌制剂，复合益生菌制剂包括一种的斯图泽里单胞菌属(Stutzerimonas sp.)细菌和的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌；优选为斯图泽里单胞菌属菌中的A12-2和单胞菌属菌属中的A14-2。
上述的A12-2的菌种保藏信息如下：保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2023年12月01日；保藏编号：CCTCC NO：M20232424；分类名称：Stutzerimonas sp。
上述的A14-2的菌种保藏信息如下：保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2023年12月01日；保藏编号：CCTCC NO：M20232423；分类名称：Pseudomonas sp。
上述的两种细菌功能类型相同，混合后通过亚硝化作用、硝化作用和反硝化作用降解氨氮和亚硝酸盐，使其最终降解为氮气。
对优选的细菌品种进行测序和BLAST基因序列比对，未找到关于上述优选的斯图泽里单胞菌属(Stutzerimonas sp.)细菌和的假单胞菌属(Pseudomonassp.)细菌的相关记载，证明其为以往未被发现过的新品种细菌。
本发明又提出一种由上述优选品种细菌组成的可同时高效降解氨氮和亚硝酸盐的复合益生菌制剂在水产养殖上的应用，应用过程中，上述的斯图泽里单胞菌属(Stutzerimonas sp.)细菌和的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌无需在投放前进行人工平衡菌群比例。
与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：本发明所含的两种不同种类的细菌为功能类型相同的细菌，通过混合这两种细菌而制备得到的复合益生菌制剂可完成从亚硝化作用到反硝化作用的一系列反应，无需在使用时人工进行不同类型细菌菌群间的比例平衡，具有在较短时间内大幅降解养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的能力。在降解水体中氨氮和亚硝酸盐时不会造成水中溶氧量过高的问题，避免了浮游生物过量繁殖、对虾偷死等问题。不会留有中间有毒物质，无需额外搭配解毒剂或解毒手段使用，不会导致毒素积累在塘底或被释放回水中。不会杀死养殖水体中的天然菌类和藻类，也不会造成对虾黑鳃病问题。不会大量消耗水中氧气，也不会对水体光照造成不良影响。应用时对养殖水从的刺激小，对环境造成影响或污染小。
具体实施方式
实施例一
本发明提出一种可同时高效降解氨氮和亚硝酸盐的复合益生菌制剂，复合益生菌制剂包括一种特定的新品种斯图泽里单胞菌属(Stutzerimonas sp.)细菌和一种特定的新品种假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌。上述两种细菌发现自采集南美白对虾养殖塘水后对硫酸铵平板进行涂板，30℃培养7天后产生的可挑取菌落样本。两株细菌样本的实验编号分别为A12-2(斯图泽里单胞菌属菌)和A14-2(假单胞菌属菌)。经实验验证后，确认这两株细菌皆有在短时间内大幅降解南美白对虾养殖水体中过高氨氮和亚硝酸盐的能力。经测序和BLAST比对序列后，发现两株细菌为两种以往从未被发现过的新品种细菌。相较于传统的降氨氮/亚盐菌剂，本发明中的可同时高效降解氨氮和亚硝酸盐的复合益生菌制剂虽含有两种不同品种的细菌，但细菌的功能类型相同，每种细菌都既可降解氨氮，又可降解亚硝酸盐，细菌通过完成亚硝化作用、硝化作用和反硝化作用同时对氨氮和亚硝酸盐进行高效降解，使其最终降解为氮气。因此在投放前无需再人工平衡不同功能类型如单一降解氨氮和单一降解亚盐细菌间的菌群比例。降解反应过程如下：
亚硝化作用(氨氮→亚硝酸盐)：2NH4 ++3O2→2NO2 -+2H2O+4H+；硝化作用(亚硝酸盐→硝酸盐)：2NO2 -+O2→2NO3 -；反硝化作用(硝酸盐→氮气)：2NO3 -+10e-+12H+→N2+6H2O。
传统菌剂遵循“亚硝化菌+硝化菌”的复合形式，通过不同功能类型的细菌分别完成氨氮到亚盐和亚盐到硝酸盐这两种转化。由于是不同功能类型的细菌，因此必须考虑它们在水体中如何达到比例平衡状态，例如要加入多少硝化菌才能对亚硝化菌降解氨氮所产生的亚盐进行适当处理。平衡若有不慎，便会出现亚盐过多或氨氮无法被有效降解的问题。同时，一般的亚硝化菌/硝化菌在自然环境下的生长速度极慢，因此在水产养殖应用上的效率实际极差，效果甚微。本发明的菌剂中所含细菌的功能类型相同，每种细菌都同时具备“亚硝化菌+硝化菌”二类细菌的功能，因此无需再人工进行不同功能类型细菌间的比例平衡调整，极大方便了使用。
实施例二
本实施例中通过一系列的实验，对复合益生菌制剂中的斯图泽里单胞菌属(Stutzerimonas sp.)细菌和的假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌进行研究和验证。
1.菌株的发现和培养
将取自南美白对虾养殖水塘的塘水涂板于硫酸铵平板，于30℃培养7天后观察生长情况，挑取单菌落按照1％转入10mL的LB培养基中，30℃、150rpm过夜摇菌，对成功培养的菌株进行保菌。最终从A平板中分离出8株菌株，分别标记为：A11-1、A11-2、A12-1、A12-2、A14-1、A14-2、A15-1、A15-2。将上述8株菌株按照1％转接于500uL的LB培养基中，30℃、150rpm过夜摇菌，进行进一步的培养。
2.菌株的降氨氮和亚硝酸盐实验及优选
将培养出的8株菌株转接入添加了氨氮和亚硝酸盐的液体培养基中摇菌，比较摇菌前后溶液中的氨氮和亚硝酸盐浓度，以便从中筛选出性能最好的降解氨氮和亚硝酸盐细菌。实验步骤如下：
S1、取1L的南美白对虾养殖塘塘水，加入0.5％蔗糖，灭菌，加入抽滤后的2mg/L氯化铵和0.7mg/L亚硝酸钠，调整溶液的氨氮和亚硝酸盐浓度，摇匀，分装于灭菌的小三角瓶制成液体培养基，每瓶体积为40mL左右。
S2、将培养的菌液4000rpm、5min离心，弃上清。加入500uL的0.9％生理盐水清洗两边。最后加入200uL的0.9％生理盐水，混匀。
S3、将200uL的生理盐水菌液转接入步骤1中的液体培养基中，摇匀，立即取10mL用于0h的氨氮/亚硝酸盐浓度(原始浓度)测量。
S4、所有液体培养基在摇匀48h后再取样10mL进行氨氮和亚硝酸盐浓度的测量,在摇匀96h后也同样取样10mL进行测量。
氨氮和亚硝酸盐降解实验结果如下表，其中表1为0h的A11-1、A11-2、A12-1、A12-2、A14-1、A14-2、A15-1、A15-2的氨氮/亚硝酸盐浓度测量结果，表2为48h的A11-1、A11-2、A12-1、A12-2、A14-1、A14-2、A15-1、A15-2的氨氮/亚硝酸盐浓度测量结果；表3为96h的A11-1、A11-2、A12-1、A12-2、A14-1、A14-2、A15-1、A15-2的氨氮/亚硝酸盐浓度测量结果，表4为48h和96h的A11-1、A11-2、A12-1、A12-2、A14-1、A14-2、A15-1、A15-2的氨氮/亚硝酸盐浓度测量对比结果：
0h
| 编号 | 氨氮吸光度 | 氨氮浓度(mg/L) | 亚硝酸盐吸光度 | 亚硝酸盐浓度(mg/L) |
| 空白对照 | 0.335 | 1.56 | 0.645 | 0.86 |
| A11-1 | 0.338 | 1.57 | 0.623 | 0.84 |
| A11-2 | 0.349 | 1.62 | 0.615 | 0.83 |
| A12-1 | 0.344 | 1.60 | 0.627 | 0.84 |
| A12-2 | 0.345 | 1.60 | 0.635 | 0.85 |
| A14-1 | 0.364 | 1.67 | 0.591 | 0.79 |
| A14-2 | 0.343 | 1.59 | 0.602 | 0.81 |
| A15-1 | 0.349 | 1.62 | 0.613 | 0.82 |
| A15-2 | 0.340 | 1.58 | 0.632 | 0.85 |
表1
48h
| 编号 | 氨氮吸光度 | 氨氮浓度(mg/L) | 亚硝酸盐吸光度 | 亚硝酸盐浓度(mg/L) |
| 空白对照 | 0.341 | 1.58 | 0.631 | 0.85 |
| A11-1 | 0.087 | 0.61 | 0.614 | 0.82 |
| A11-2 | 0.049 | 0.47 | 0.538 | 0.73 |
| A12-1 | 0.059 | 0.51 | 0.006 | 0.05 |
| A12-2 | 0.067 | 0.54 | 0.852 | 1.13 |
| A14-1 | 0.078 | 0.58 | 0.757 | 1.01 |
| A14-2 | 0.078 | 0.58 | 0.359 | 0.50 |
| A15-1 | 0.074 | 0.56 | 0.772 | 1.03 |
| A15-2 | 0.055 | 0.49 | 0.008 | 0.05 |
表2
96h
| 编号 | 氨氮吸光度 | 氨氮浓度(mg/L) | 亚硝酸盐吸光度 | 亚硝酸盐浓度(mg/L) |
| 空白对照 | 0.337 | 1.57 | 0.689 | 0.92 |
| A11-1 | 0.071 | 0.55 | 0.648 | 0.87 |
| A11-2 | 0.064 | 0.53 | 0.692 | 0.92 |
| A12-1 | 0.007 | 0.31 | 0.158 | 0.24 |
| A12-2 | -0.018 | 0.21 | 0.015 | 0.06 |
| A14-1 | -0.003 | 0.27 | 0.180 | 0.27 |
| A14-2 | -0.009 | 0.25 | 0.017 | 0.06 |
| A15-1 | 0.057 | 0.50 | 0.715 | 0.95 |
| A15-2 | 0.044 | 0.45 | 0.025 | 0.07 |
表3
48h和96h的氨氮、亚硝酸盐的浓度变化，参照0h，以百分比形式表示
表4
基于上述的实验结果可见，菌株A11-1、A11-2和A15-1只能降低水体的氨氮浓度，无法有效降低亚硝酸盐的浓度；菌株A12-1、A12-2、A14-1、A14-2、A15-2可以同时降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的浓度，其中A12-2在加入水体中后亚硝酸盐浓度出现了迅速上升(48h，132.9％)后迅速下降(96h，7.1％)的情况。综合实验结果，8株菌株中同时降解氨氮和亚硝酸盐效果最好的为菌株A12-2和A14-2，二者在放入养殖水体96h后可使其中氨氮浓度低于原始浓度的20％，亚硝酸盐浓度低于原始浓度的10％。当A12-2被放置在养殖水体中48小时后，氨氮浓度降至原始浓度的33.8％，亚硝酸盐浓度上升至原始浓度的132.9％，96小时后氨氮浓度降至原始浓度的13.1％，亚硝酸盐浓度降至原始浓度的7.1％；当A14-2被放置在养殖水体中48小时后，氨氮浓度降至原始浓度的36.5％，亚硝酸盐浓度降至原始浓度的61.7％，96小时后氨氮浓度降至原始浓度的15.7％，亚硝酸盐浓度降至原始浓度的7.4％，证明这两株细菌都具有在较短时间内大幅降解养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的能力，因此优选为菌剂制备用菌。
3.A12-2和A14-2菌株的基因测序
为了解所挑选的菌株A12-2和A14-2的物种信息，将两株细菌的基因通过PCR法扩增，然后进行测序。PCR法扩增体系、扩增条件及扩增步骤如下：
3.1PCR扩增体系见表5
| 10×PCR buffer | 2.5ul |
| 2.5mM dNTP | 2ul |
| 27F引物 | 1ul |
| Taq酶 | 0.125ul |
| 模板 | 1ul |
| ddH2O | 补齐至25ul |
表5
3.2PCR扩增条件件表6
94℃、5min。
94℃、30s，43℃、30s，72℃、1min，10个循环。
94℃、30s，50℃、30s，72℃、1min，30循环。
72℃、7min。
4℃、30s。
表6
3.3PCR扩增步骤
S1、取200uL的培养的菌液加入1.5mL的EP管中，14000rpm、5min离心，弃上清。
S2、向菌体沉淀中加入30uL的1XTE(PH8.0)，混匀。100℃、5min，然后-20℃、5min。重复三次。然后再次离心，留上清(DNA)。
S3、将DNA稀释到10-20ng/uL作为模板，按上述PCR体系配置后进行PCR扩增。
3.4基因测序
对得到的PCR产物进行测序，得到如下序列；然后对序列进行BLAST检索，比对序列，得到其所属物种的大致信息：
A12-2基因测序序列(细菌通用引物27F)如下：
AATTGCGGCGGCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCCTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTCTCCAAAGGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAAGTCAGATTACCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTGCGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAACCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGGAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGAAGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCTTTCAGAACTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGATGGTGGTGGAATTACCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAAGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGAGCTAATACTGACACTGAGGTGCTGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAAATACCCTGGGTAGTCCAACGCCGTAAACGATGTCGACTAGACGATTGAGCTCCATGAGAGCTTAGTGGTCGCAGCCTAACGCAGTTAGCATCGACCGCCATGGAGAGTACGGCCGTCGAGGATTACAACTCAAATGACTTTGACGTGGGGCGCAGCTACACGCGGGTGGCCAGCATG
A14-2基因测序序列(细菌通用引物27F)如下：
TCGGGGGGGCGGCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCCTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTCTCGAAAGGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTGCGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGAAGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCTTTCAAAACTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGCTCCTTGAGAGCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGA
将上述测序结果的序列进行序列比对后，未发现关于此二序列及所属菌有任何公开发表的菌种发现记录或发明专利申请，因此可将二株细菌视为从未被发现过的新品种细菌。
将测序结果进行序列比对后，发现A12-2菌株为属于斯图泽里单胞菌属下一种新品种细菌，而A14-2菌株为属于假单胞菌属下的一种新品种细菌。菌株所属物种信息见表7。
| 样品编号 | 对比结果 |
| A12-2 | 斯图泽里单胞菌属(Stutzerimonas sp.) |
| A14-2 | 假单胞菌属(Pseudomonas sP.) |
表7
根据降解实验结果可知，A12-2和A14-2这两种细菌皆可通过亚硝化作用→硝化作用→反硝化作用这一系列作用来彻底降解氨氮和亚硝酸盐，每种细菌都具有复合降解氨氮和亚硝酸盐的功能，而传统的亚硝化菌只能进行单一的亚硝化作用，硝化菌只能进行单一的硝化作用。
在确定菌种的氨氮和亚硝酸盐降解能力以及物种信息后，需对菌种进行毒性检测实验，以证明其对水产养殖的生物没有任何毒害效果，所挑选进行实验的水产养殖生物为南美白对虾。
4.A12-2和A14-2菌种的毒性测试
分别对A12-2菌和A14-2菌进行毒性测试实验：用LB培养基将菌扩增后，再对所挑选的养殖南美白对虾进行接菌1％，观察接菌后对虾是否死亡，以检测细菌是否对对虾产生毒害作用。实验步骤如下：
S1、将细菌按照1％转入100mL的LB培养基中，30℃、150rpm过夜摇菌扩增。
S2、取50mL的扩增菌液放入干净的离心管，4000rpm、5min离心，弃上清。再往离心管加入50mL的0.9％浓度的生理盐水，翻转摇晃管体7-8次清洗沉淀菌体，4000rpm、5min离心，弃上清。重复清洗步骤1次。然后使用50mL的0.9％浓度的生理盐水浸泡菌体。
S3、准备两只水桶，每只桶加入5L的南美白对虾养殖塘塘水，然后各加入6到8只生长状态良好，比较活跃的虾，将水桶分别编号1号、2号。
S4、1号桶不做任何处理，为空白对照。2号桶加入步骤2中的50mL菌液(0.9％浓度生理盐水)。
S5、每天向1、2号桶投喂等量虾饲料，平均每只虾1-2粒。
S6、每天观察并检查1、2号桶的每只虾是否存活。
实验结果为A12-2和A14-2菌毒性实验中共四组虾在饲养72h后全部存活，没有虾在实验中显示出异常表征，证明A12-2菌和A14-2菌对水产养殖生物没有致病性，也不会产生其他毒性。
实施例三
本实施例中提出A12-2和A14-2菌株在实际水产养殖中的应用，将A12-2和A14-2菌株混合，制为复合菌剂，将菌剂掺入到南美白对虾饲料中，使用该饲料对20万尾南美白对虾苗进行三个月的养殖实验(南美白对虾从虾苗到长成需要三个月)，观察养殖效果。
实验结果如下：养殖过程中所有对虾正常生长且健康状况良好，无不良表征，养殖水体未出现明显不良表征。养殖经3个月后产出的成虾个头大，肉质好，外观无明显质量问题，收成时单造最高亩产达4500公斤，远高于一般南美白对虾养殖的收成。(投放20万尾虾苗的理想收成虽为亩产4000-5000公斤，但在现实环境中，大多数的南美白对虾养殖都会受到水体不良状况的影响，实际收成要远远低于理想量。)
上面对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于此，在所属技术领域的技术人员所具备的知识范围内，在不脱离本发明宗旨的前提下还可以作出各种变化。
Claims (2)
1.一种可同时高效降解氨氮和亚硝酸盐的复合益生菌制剂，其特征在于，复合益生菌制剂包括一种斯图泽里单胞菌属(Stutzerimonas sp.)细菌和假单胞菌属(Pseudomonassp.)细菌；
优选为斯图泽里单胞菌属菌中的A12-2和单胞菌属菌属中的A14-2；
上述的A12-2的菌种保藏信息如下：保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2023年12月01日；保藏编号：CCTCC NO：M20232424；分类名称：Stutzerimonas sp；
上述的A14-2的菌种保藏信息如下：保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2023年12月01日；保藏编号：CCTCC NO：M20232423；分类名称：Pseudomonas sp；
上述的两种细菌功能类型相同，混合后通过亚硝化作用、硝化作用和反硝化作用降解氨氮和亚硝酸盐，使其最终降解为氮气。
2.权利要求1所述的可同时高效降解氨氮和亚硝酸盐的复合益生菌制剂在水产养殖上的应用。
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| GR01 | Patent grant |