CN117866106A

CN117866106A - 一种小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN117866106A
Application number: CN202311640719.7A
Authority: CN
Inventors: 宋晓晖; 孙雨; 张朝明; 齐鲁; 温海京; 李鸿儒; 翟新验
Original assignee: China Animal Disease Control And Prevention Center (agricultural And Rural Department Slaughter Technology Center)
Current assignee: China Animal Disease Control And Prevention Center (agricultural And Rural Department Slaughter Technology Center)
Priority date: 2023-12-01
Filing date: 2023-12-01
Publication date: 2024-04-12

Abstract

本发明提供了一种小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白及其应用。本发明提供的小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白为小反刍兽疫病毒的H蛋白和N蛋白功能区串联的融合蛋白。本发明还提供了基于该小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白的ELISA检测试剂盒，以用于检测感染小反刍兽疫病毒的动物或免疫的动物。该检测试剂盒具有检测方便、高效的特点，便于在动物养殖业中广泛应用。

Description

一种小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白及其应用

技术领域

本申请属于基因工程领域，具体涉及一种基于小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白、其制备方法和应用。更具体地，本申请涉及一种包括基于小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白的双抗原夹心ELISA检测方法，其试剂盒，以及其在感染小反刍兽疫病毒的动物或免疫动物的新鲜血液检测中的应用。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Pestedes petits ruminant virus，PPRV)引起的家养或野生小反刍动物的一种急性、烈性传染病。PPR的主要临床症状包括发热、坏死性口炎和肺炎、以及腹泻和脱水甚至死亡。PPR的发病率可高达100％，严重暴发时死亡率可达100％。

PPRV是有囊膜的负链RNA病毒，基因组大约16kb，内含有6个基因，排列顺序为3’-N-P-M-F-H-L-5’，分别编码6个结构蛋白核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)和大蛋白(L)，其中N基因编码核衣壳蛋白，其与RNA紧密结合保护病毒基因组，在病毒的复制和转录中起主要作用。P基因还编码2个非结构蛋白C和V蛋白。M蛋白形成病毒囊膜内层，与核蛋白壳和病毒表面的糖蛋白连接，其与病毒的成熟、释放有关。F蛋白能够诱导产生细胞溶血素、促进细胞融合以及启动病毒感染细胞的生物学活性。L蛋白为多聚酶蛋白，由三个高度保守区域构成，其发挥着多聚酶活性、以及甲基化和多腺苷酸化等活性。H蛋白构成病毒粒子表面的糖蛋白纤突，其在致病和刺激宿主免疫中发挥重要作用，是病毒刺激机体产生中和抗体的主要抗原成分，也是小反刍兽疫鉴别诊断的可靠标记。PPRV的N蛋白是是PPRV中含量最高的蛋白，具有较强的免疫原性，也常用于血清学诊断试剂的研发。

近几年来随着抗体诊断技术的发展，高特异性和高灵敏度的抗体检测试剂盒的研发在PPRV这类烈性疫病的诊断中愈来愈凸显其重要的作用。目前对小反刍兽疫病毒进行检测的方法主要包括对单独的蛋白及编码其的基因的检测，如针对PPRV H蛋白(参见，例如，CN111751553A)，M蛋白(参见，例如，CN106086240A)、F蛋白(参见，例如，CN115975015A)抗体的检测方法，或提及用基于H蛋白和N蛋白的融合蛋白进行检测(参见，例如，CN115785288A)，但由于这种检测方法中采用的抗原表位数量较少，并且在与微孔板结合时容易造成表位被不利地包埋而不能与待测抗体有效结合，容易造成漏检和错检。并且所采用的直接ELISA方法仅适用于检测特定小分子的待测物，检测灵活度较差。因此，对捕获抗原及检测方法进行创新，获得更灵敏，更高效的检测方法是当前研发的大势所趋。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白，该重组融合蛋白包括衍生自小反刍兽疫病毒的N蛋白的第一片段和衍生自H蛋白的第二片段以解决现有技术中在检测感染小反刍兽疫病毒的动物或免疫动物的新鲜血液中的小反刍兽疫病毒抗体的问题，如由抗原表位有限和无法有效结合抗体导致的漏检和错检的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白，该重组融合蛋白包括衍生自N蛋白的第一片段和衍生自H蛋白的第二片段。在本发明中，小反刍兽疫病毒的N蛋白和H蛋白可以是源自任何小反刍兽疫病毒毒株的N蛋白和H蛋白。在一些实施方式中，N蛋白的氨基酸序列可以如SEQ ID No.1所示。在一些实施方式中，H蛋白的氨基酸序列可以如SEQ ID No.2所示。但本发明对此不做特别限制。

在一些实施方式中，所述第一片段具有选自200～450个氨基酸的长度并且是所述N蛋白的氮端片段。在一些实施方式中，所述第一片段具有选自200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450个或其间任意值数量的氨基酸的长度。在一些实施方式中，所述第一片段是衍生自N蛋白的完整片段，也就是说，不是衍生自N蛋白的任意片段的任意组合。

在一些实施方式中，所述第一片段包括选自如下的一种或多种抗原决定簇：PDINGSK(62-68)、DVSIR(96-100)、RGADLDNE(119-126)、DMYFST(128-133)、FENREII(147-153)、IIDIEVQ(152-158)、QQLGEVAPY(304-312)、SSVIAAELG(377-385)、LGITAEEAK(384-392)、RQAQVSFL(413-420)、AEALF(492-496)，如下表1所示。在一些实施方式中，所述第一片段包括选自如下的一种或多种抗原决定簇：PDINGSK(62-68)、DVSIR(96-100)、RGADLDNE(119-126)、DMYFST(128-133)、FENREII(147-153)、IIDIEVQ(152-158)、QQLGEVAPY(304-312)。

表1

在一些实施方式中，所述第一片段包括选自以下中任一者的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO：1；或者

(b)与(a)中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与(a)中任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或者优选地，与SEQ ID NO：1相比较具有1～3个氨基酸的保守性替换的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述第二片段具有选自150～400个氨基酸的长度。在一些实施方式中，所述第二片段具有选自150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400个或其间任意值数量的氨基酸的长度。在一些实施方式中，所述第二片段是衍生自H蛋白的完整片段，也就是说，不是衍生自H蛋白的任意片段的任意组合。

在一些实施方式中，所述第二片段包括选自如下的一种或多种抗原决定簇：INA(8-10)、RLNTNIKL(73-80)、IDHQT(84-88)、IIGDEVGIRI(98-107)、EEGLFGRT(224-231)、KDDEANW(359-365)、VPSTDV(367-372)、VRDLQ(372-376)、VEACKTR(383-389)、FLGMINT(463-470)、VMPHILT(478-484)、VDDDIK(504-509)和TDEEVHT(590-596)，如下表2所示。在一些实施方式中，所述第二片段包括选自如下的一种或多种抗原决定簇：IIGDEVGIRI(98-107)、EEGLFGRT(224-231)、KDDEANW(359-365)、VPSTDV(367-372)、VRDLQ(372-376)、VEACKTR(383-389)。

表2

在一些实施方式中，所述第二片段包括选自以下中任一者的氨基酸序列：

(c)SEQ ID NO：2；或者

(d)与(c)中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与(c)中任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或者优选地，与SEQ ID NO：1相比较具有1～3个氨基酸的保守性替换的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述第一片段包括N蛋白第1-400位、或者第1-385位、或者第1-370位或者第1-339位氨基酸的区域中任选的一个或多个抗原决定簇。在一些实施方式中，第一片段包括N蛋白第1-339位氨基酸的全长区域。在一些实施方式中，所述第二片段包括H蛋白第1-500位、第80-480位、或者第100-399位氨基酸的区域中任选的一个或多个抗原决定簇。在一些实施方式中，第二片段包括H蛋白第100-399位氨基酸的全长区域。

在一些实施方式中，所述重组融合蛋白还可以包括连接肽，如图1所示。在一些实施方式中，连接肽为由小的非极性氨基酸(如甘氨酸)或者极性氨基酸(如丝氨酸或苏氨酸)组装成的小的柔性连接肽。所述柔性连接肽可依据目标蛋白的结构、性质等进行选择。在一些实施方式中，柔性连接肽是由甘氨酸和丝氨酸残基伸展组成的GS连接肽。在一些实施方式中，柔性连接肽为(GGGGS)_n，其中n＝0～8。在一些实施方式中，柔性连接肽的序列可为GGGG、SGGSGGS、GSGGSGGGSGGSGGG、(GGGGS)₈、(GGGGS)₆、(GGGGS)₄、(GGGGS)₃、(GGGGS)₂、GGGGS、GSGGSG或GSGGSGGGSGGSGGG等。如果连接肽序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果连接肽序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为连接肽序列本身就是新的抗原。在一些实施方式中，连接肽为包括3至30个甘氨酸残基的肽片段。在一些实施方式中，该肽片段为包括30个甘氨酸残基的连接肽。

根据本发明的又一方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括根据本发明所述的小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白。在一些实施方式中，该试剂盒在免疫检测方法中使用，包括，但不限于，化学发光免疫分析法、免疫比浊、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹、抗原微阵列、免疫沉淀和放射免疫测定。在一些实施方式中，该试剂盒为用于酶联免疫吸附测定的试剂盒。在一些实施方式中，该试剂盒包括根据本发明所述的重组融合蛋白作为捕获抗原，以及具有可检测标记的抗原作为检测抗原，优选地，所述可检测标记为酶标记、放射性标记、发光标记、显色标记、半抗原、金属络合物或金属。优选地，所述酶标记为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记，及类似物。优选地，所述半抗原为地高辛、异硫氰酸荧光素或生物素，及类似物。优选地，所述金属为胶体金。

根据本发明的又一方面，提供了一种核酸分子，该核酸分子编码根据本发明所述的重组融合蛋白。优选地，该核酸分子包括与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％或更高的序列同一性的核苷酸序列。更优选地，所述核酸分子由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列组成。

根据本发明的再一方面，提供了一种表达载体，其包含根据发明所述的编码本发明的重组融合蛋白的核酸分子。

根据本发明的另一方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据本发明所述的核酸分子或如上所述的表达载体。在一些实施方式中，该宿主细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、里氏木霉、黑曲霉、昆虫或哺乳动物细胞，优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。

根据本发明的另一方面，提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的如上根据本发明所述的重组融合蛋白和药学上可接受的载体。典型的“药学上可接受的载体”包括其本身不会诱导对接受所述疫苗组合物的个体有害的抗体的产生的任何载体。合适的载体通常是大的、缓慢地代谢的大分子诸如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳糖和脂质聚集体。

根据本发明的又一方面，提供了一种制备小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白的方法，该方法包括培养如上所述的宿主细胞，并且表达和分离所述重组融合蛋白。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于检测针对小反刍兽疫病毒的抗体的方法，所述方法包括使用本发明所述的小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白作为捕获抗原，或者使用如上所述的试剂盒。在一些实施方式中，所述方法用于检测小反刍兽疫病毒阳性样品，或者用于判断接受小反刍兽疫病毒疫苗的动物对所述疫苗的响应，其中，使用来自健康动物或者未接受小反刍兽疫病毒疫苗的动物的阴性样品作为对照，根据公式计算界限值，其中/>为阴性样品检测结果的平均值，SD为标准差，当OD_450nm＞界限值时，判定样品为小反刍兽疫病毒阳性或者对所述疫苗有积极响应；当OD_450nm≤界限值时，判定样品为小反刍兽疫病毒阴性或者对所述疫苗无响应。

本发明提供的小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白及使用其进行检测的试剂盒具有高效、灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化等优势，在动物的养殖和防疫中具有良好的应用性能。

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

定义

本文所使用的表述“约”是如本领域的普通技术人员所理解的，并且根据其使用的背景而在一定范围内变化。如果本领域的普通技术人员根据其使用的上下文对该术语的使用不了解，则“约”将意味着特定值至多加上或减去10％。

如本文所用的，本发明所用的术语“疫苗”、“疫苗组合物”是指含有小反刍兽疫的重组融合蛋白的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强容易感染小反刍兽疫病毒的动物如山羊、绵羊、美国白尾鹿中的免疫反应。

如本文所用的，术语“抗体片段”或“抗体结合结构域”是指含有抗原结合结构域，即，完整抗体的抗原决定可变区的抗体的至少一部分，或其重组变体，其足以使抗体片段识别并特异性结合靶标，如抗原及其指定表位。抗体片段的实例包括但不限于，Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv片段、单链(sc)Fv(“scFv”)抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)，及由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用的，术语“免疫检测”是指通过免疫学原理来检测、鉴别、表征、或量化样品中的氨基酸靶标。免疫检测例如包括使用诸如放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、抗原微阵列、蛋白质印迹、化学发光免疫分析法、免疫比浊等技术的直接或竞争性结合测定。免疫检测通常使用抗体或抗体片段，但还可以使用以高特异性结合靶分子的结合蛋白或载体蛋白。在一种实施方式中，免疫检测是酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一种实施方式中，免疫检测是例如使用固定于固相载体上的第一特异性结合剂和与待测样品中的抗体结合的第二特异性结合剂的一种夹心ELISA测定，所述第二特异性结合剂是酶标记的，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。

如本文所用的，术语“捕获抗体”表示用于夹心ELISA形式以结合(即捕获)样品中存在的靶标物质，以用于检测的抗体。然后，第二抗体(即检测抗体)与经捕获的靶标结合，形成由抗体-靶标-抗体组成的“夹心”并且允许检测这种抗体-靶标-抗体-复合物。

如本文所用的，术语“检测抗体”表示携带可视化或定量手段的抗体。此类手段通常为酶(在添加合适的底物后催化生成有色或荧光反应产物)，诸如例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶和脲酶。在一些实施例中，检测抗体针对目标抗原。在一些实施例中，检测抗体为抗物种抗体。在一些实施例中，检测抗体与可检测标记物如生物素、荧光标志物或放射性同位素偶联，并且利用该标记物进行检测和/或定量。

术语“抗原”或“Ag”是指能够被抗体特异性结合，或以其它方式激发免疫反应的分子。这一免疫反应可能涉及抗体产生，或特定免疫活性细胞的活化，或两种。

如本文所用的，术语“表位”或“抗原决定簇”可互换使用，并且是指抗原分子中决定免疫应答特异性的特殊化学基团，是抗原与T/B细胞抗原受体(TCR/BCR)或抗体特异性结合的最小结构与功能单位。表位通常由5-15个氨基酸残基组成，也可由多糖残基或核苷酸组成。单个抗原可具有一个以上的表位。因此，不同的抗体可与抗原的不同区域结合并可具有不同的生物效应。表位可根据其中氨基酸的空间结构特点而分为顺序表位和构象表位。顺序表位由连续线性排列的氨基酸构成，又称线性表位；而构象表位由不连续排列但在空间上彼此接近形成特定构象的若干氨基酸组成。抗体(或抗原结合片段)所结合的表位可以使用本领域中已知的任何表位定位技术来鉴别。

如本文所用的，术语“肽”、“多肽”及“蛋白质”可互换使用指代氨基酸残基的聚合物。该术语涵盖包含通过肽键彼此键合的两个或更多个氨基酸的氨基酸聚合物、其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物及非天然存在的氨基酸聚合物。该术语包括例如生物活性片段、实质上同源的多肽、寡肽、均二聚体、杂二聚体、多肽变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白以及其他物质。该术语也包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。除非另有指示，否则具体多肽序列也隐含地涵盖其保守性修饰的变体。

如本文所用的，术语“重组”蛋白是指使用重组技术，例如通过表达重组核酸而制成的蛋白质(例如抗体)。

如本文所用的，术语“同源”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子，诸如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚单元序列同一性。当两个分子中的亚单元位置均由相同单体亚单元占据时，例如当两个DNA分子中每一者中的位置均由腺嘌呤占据时，则其在该位置处为同源或同一的。两个序列之间的同源性与匹配或同源位置的数目直接相关。例如，如果两个序列中一半(例如长度为十个亚单元的聚合物中的五个位置)位置为匹配或同源的，则两个序列为50％同源的；如果90％的位置(例如9/10)为匹配或同源的，则两个序列为90％同源的。本文公开的产品和方法包括具有指定序列或与其相同或相似的序列的多肽和多核苷酸，例如，与指定序列具有至少约80％或95％序列同一性的序列。在氨基酸序列的上下文中，术语″至少80％序列同一性″在本文中指的是第一种氨基酸含有足够或最少数量的氨基酸残基，这些氨基酸残基与第二氨基酸序列中对齐的氨基酸残基i)相同，或者ii)是其保守性替换，从而使得第一和第二氨基酸序列能够具有共同的结构域和/或共同的功能活性。在核苷酸序列的上下文中，术语″至少80％序列同一性″在本文中指的是第一核酸序列包含足够或最少数量的核苷酸，这些核苷酸与第二核酸序列中对齐的核苷酸相同，从而使得第一和第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽，或编码共同的多肽结构域。

如本文所用的，术语“健康动物”是指未感染小反刍免疫病毒或实验前经其它手段检测为小反刍免疫病毒呈阴性的动物。

附图说明

图1显示了本发明的重组N-H蛋白的示意图。

图2显示了采用镍柱纯化的N-H重组蛋白经SDS-PAGE检测的检测结果。

图3显示了纯化后的PPRV N-H蛋白的Western Blot鉴定结果，图中示出在73KD左右出现的目的条带。

图4显示了采用Western Blot方法对纯化后的重组PPRVN-H蛋白进行特异性鉴定的实验结果。其中，泳道1～7分别代表如下的样品：1：PPRV标准阳性血清，2：牛瘟病毒阳性血清，3：口蹄疫疫苗阳性血清，4：灭活蓝舌病阳性血清，5：灭活鹿流行性出血热病阳性血清，6：灭活犬瘟热阳性血清，7：PPRV阴性血清。

图5显示了重组PPRV N-H蛋白的免疫原性分析结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

实施例1小反刍兽疫病毒重组N-H蛋白的制备与鉴定

1.材料和方法

1.1菌种

大肠杆菌感受态DH5a、DH10Bac购自北京全式金生物技术有限公司，pCMV载体、pFastbac1载体、sf9细胞由中国动物疫病预防控制中心提供。

1.2血清

经0.3％TNBP和1％triton X-100灭活的小反刍兽疫阳性血清由本实验室保存。牛瘟病毒阳性血清，口蹄疫疫苗阳性血清，灭活蓝舌病阳性血清，灭活鹿流行性出血热病阳性血清，灭活犬瘟热阳性血清由本实验室保存。已知来源的500份临床羊血清及阴性血清也均由本实验室提供。

1.3试剂

SMM 293-TI培养基购自北京义翘神州生物技术有限公司，Ni-NTA琼脂糖凝胶树脂、质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；RPMI1640培养基及胎牛血清购自Gibico公司；EcoRI/XholI限制性内切酶、T4连接酶、TaKaRa LA PCR^TMKit购自TaKaRa公司，DNA提取试剂盒DNeasy Blood and Tissue Kit购自Qiagen公司，胶回收试剂盒Agarose Gel DNA Purification Kit、质粒提取试剂盒PlasmidMini Kit购自Omega公司，IPTG、X-gal、氨苄霉素购自北京全式金生物技术有限公司。

1.4仪器

ABI公司的普通PCR仪(AB Applied Biosystems)，sigma公司的台式离心机(3-18k)，恒温振荡培养箱(HZQ-F100)，荧光显微镜(ZEISS，AXIO)，六一电泳仪，双红外激光扫描成像系统(Proteinsimple)。

2.重组H-N蛋白的表达

2.1 H-N重组质粒的构建

根据GenBank中公布的小反刍兽疫PPRV-FY毒株(KX354359.1)的H基因(1830bp)和N基因的全长序列(1578bp)，利用生物信息学技术ExPASy、SOMPA、PSIPRED Server、DNASTAR、Phyre、ABCpred Prediction、Scratch、NetCTL及IEDB等对N蛋白和H蛋白进行理化性质、二级结构、三级结构分析以及B淋巴细胞表位的预测，最后选择N端优势抗原表位区域，然后通过约30个甘氨酸组成的连接子将N蛋白第1-339位的功能区与H蛋白第100-399位的功能区进行连接，并对该重组蛋白的核酸进行密码子优化，具体序列如SEQ ID NO：3所示。将该基因序列插入到真核表达载体中以表达产生本申请所需的重组融合蛋白。

上述基因序列由北京擎科生物科技有限公司人工合成，在序列两端分别引入EcoRI和Xho I酶切位点，通过两酶切位点将序列N端再引入10个His和3个Flag的N-H序列插入到pCMV载体中构建成pCMV-N-H重组质粒，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板过夜培养。次日挑取阳性克隆进行测序，测序正确的阳性菌液加入甘油保菌后，-80℃保存备用。

2.2重组质粒的转染

用SMM 293-TI培养基和5％CO₂在37℃下悬浮培养HEK-293F细胞。利用12mg转染试剂PEI将2mg pCMV-N-H质粒共同转染1L密度为2×10⁶细胞/mL的293F细胞。

2.3 PPRV-N-H重组蛋白的表达与纯化

293F细胞转染48h后，以1000×g离心20min收集转染细胞，用pH7.4的含有20mMhepes的缓冲液，300mM的NaCl和PMSF蛋白酶抑制剂的重悬缓冲液重悬细胞沉淀，在冰上超声3min。16000rpm，4℃离心20min，取上清液用0.22μm的滤器去除杂质，向上清液中加入抗flag标签的亲和珠子结合，结合蛋白用重悬缓冲液洗涤两次，然后用洗脱缓冲液(0.1mg/mL3×flag肽，20mM HEPES和300mM NaCl，pH 7.4)洗脱目标蛋白。洗脱液进一步用Superdex200 10/300GL预装柱进行纯化，采用含20mM咪唑的缓冲液(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM咪唑，pH7.5)洗脱杂蛋白，用200mM咪唑(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，200mM咪唑，pH7.5)洗脱目标蛋白，收集重组蛋白峰的洗脱液，每管洗脱液取适量样品进行SDS-PAGE检测。用10KD超滤浓缩管浓缩目的蛋白，纯度达到要求后，采用BCA法测定蛋白浓度，分装后-20℃保存备用。

采用镍柱纯化N-H重组蛋白，收集目的蛋白峰的洗脱液，对每管洗脱液取适量样品进行SDS-PAGE检测，检测结果如图2所示，在73KD左右有一条带，符合预期目的条带大小。BCA法测定的蛋白浓度为2.2mg/mL。

3.重组N-H蛋白的鉴定

3.1表达产物的SDS-PAGE分析

从洗脱的重组蛋白取样进行SDS-PAGE电泳。

(1)12％分离胶配制：5.1ml纯化水，6.0mL30％丙烯酰胺贮存液，3.8mL Tris-HCl(1.5moL/L，pH8.8)，150μL10％SDS，150μL10％过硫酸铵，5μL TEMED，用ddH₂O补足至15mL。将分离胶各组份混匀，在安装好的玻璃平板中，立即加入分离胶溶液至距离玻璃板顶端约1.5cm，轻轻在分离胶溶液上覆盖水层封顶，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。室温(15～25℃)静置约30min，待凝胶聚合完成后会出现一条非常明显的分界面，此时可倒掉上层封顶的水层，用滤纸尽可能吸干多余液体。

(2)5％浓缩胶配制：1.0mL 30％丙烯酰胺贮存液，750μL Tris-HCl(1moL/L，pH6.8)，60μL 10％SDS，60μL 10％过硫酸铵，6μL TEMED，用ddH₂O补足至6mL。将浓缩胶各组份混匀，立即加入浓缩胶溶液至玻璃板顶端，迅速小心插入梳子，避免产生气泡。待室温(15～25℃)静置约30min浓缩胶聚合后，小心拔出梳子。

(3)电泳：在电泳槽中加入Tris-甘氨酸缓冲液。取适量的重组蛋白样品，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，混匀，水浴煮沸5min，上样20μL，用80V电压电泳至溴酚兰进入分离胶，将电压提高到120V，继续电泳至溴酚兰到达凝胶底部。

(4)染色：电泳结束后，取下凝胶用纯化水冲洗，用5倍凝胶体积的考马斯亮兰染色液(45mL甲醇：45mL水：10mL冰醋酸中溶解0.25g考马斯亮兰)浸泡凝胶，置于脱色摇床上在室温(15～25℃)下染色2h。

(5)脱色：用纯水冲洗染色的凝胶后，将其置于30％甲醇和10％冰乙酸的混合液中，振摇脱色，其间更换脱色液3～4次。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入纯水中终止脱色。3.2表达产物的Western-blot分析

取纯化的重组PPRVN-H蛋白样品进行SDS-PAGE，结束后，取出凝胶，按下列顺序制备聚丙烯酰胺凝胶-膜“三明治”：滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸。用干净的玻棒轻轻滚过凝胶-膜“三明治”，以消除各层之间的气泡。海绵垫和滤纸、PVDF膜预先在转移缓冲液中浸泡平衡10min。将固定好的滤纸-凝胶-膜“三明治”放置到电转仪中，凝胶侧朝向负极，PVDF膜侧朝向正极，并接好冷却装置，200mA恒流转移1h。转移完毕后取下PVDF膜，进行如下操作：

(1)洗膜I：转移完毕后取下PVDF膜，放入大小适当的玻璃平皿中，用TBST缓慢震荡洗膜3次，每次5min；

(2)封闭：将PVDF膜放入大小适当的玻璃平皿中，用5％脱脂奶粉37℃封闭作用1h；

(3)洗膜II：弃去封闭液，用TBST在缓慢振摇下洗膜3次，每次5min；

(4)加一抗：加入封闭液稀释的抗His标签单克隆抗体(鼠源∶工作浓度1∶2000稀释)，室温缓慢振摇1h；

(5)洗膜III：弃去一抗，用TBST在缓慢振摇下洗膜3次，每次5min；

(6)加二抗：加入封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(工作浓度1∶10000倍稀释)，室温缓慢振摇1h；

(7)洗膜IV：弃去二抗，用TBST在缓慢振摇下洗膜3次，每次5min；

(8)显色：将PVDF膜放入化学发光底物溶液中，避光显色，在凝胶成像仪上成像拍照。

采用抗His标签单克隆抗体，对纯化后的PPRV N-H蛋白做Western Blot鉴定，在73KD左右出现目的条带，结果如图3所示。

3.3重组蛋白特异性鉴定

采用Western Blot方法对重组N-H蛋白的特异性进行鉴定。其中一抗分别为灭活的牛瘟病毒阳性血清，口蹄疫疫苗阳性血清，灭活蓝舌病阳性血清，灭活鹿流行性出血热病阳性血清，灭活犬瘟热阳性血清，羊阴性血清，二抗为HRP标记的IgG二抗。具体操作步骤参照3.1和3.2。

采用Western Blot方法，对纯化后的重组PPRV N-H蛋白进行特异性鉴定，结果如图4所示。从图中可以看出，PPRV N-H蛋白仅与灭活的小反刍兽疫疫苗阳性反应，而与灭活的牛瘟病毒阳性血清，口蹄疫疫苗阳性血清，灭活蓝舌病阳性血清，灭活鹿流行性出血热病阳性血清，灭活犬瘟热阳性血清，羊阴性血清均未发生交叉反应，证明该重组蛋白具有良好的特异性。

3.4重组蛋白N-H的免疫原性

将100μg重组PPRV N-H蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混匀后，采用肌肉注射的方式免疫8周龄BALB/c小鼠2只，同时用弗氏完全佐剂与PBS乳化后免疫阴性小鼠2只；14天后进行第二次免疫，用弗氏不完全佐剂与100μg PPRV N-H蛋白等体积乳化后免疫阳性组小鼠，阴性组小鼠同样处理；再过28天第三次免疫，取100μg重组PPRV N-H蛋白免疫阳性组小鼠，阴性组小鼠用PBS免疫。首免和二免后分别采集小鼠血清，三免14天后采集小鼠血液，收集血清。

将纯化的重组PPRV N-H蛋白稀释至1mg/mL，每孔100μL包被酶标板，4℃包被过夜；用PBS洗涤3次，每次2～3min，以5％BSA于37℃封闭2h；PBS洗涤3次，每次2～3min；PPRV N-H一免、二免、三免后获得的抗血清用5％BSA进行1∶100稀释，分别加入对应的蛋白孔，37℃孵育1h，阴性血清做同样处理；PBST洗涤5次，每次2～3min；加入用5％BSA稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(稀释比1∶5000)，37℃孵育1h；PBST洗涤5次，每次2～3min，每孔加入100μL TMB显色液，避光显色15min，加入2mol/L H₂SO₄终止反应并检测OD₄₅₀值。

采用间接ELISA测定免疫小鼠一免、二免、三免后血清中的特异性抗体效价。如图5所示，与对照组相比，重组PPRV N-H蛋白免疫小鼠后诱导产生了特异性抗体，且免疫组小鼠血清的效价随时间的延长而升高，三免后血清的OD450_nm值可达到1.5左右，而对照组的OD450_nm值在0.1以下。

实施例2基于PPRV N-H重组抗原的双抗原夹心ELISA方法的建立及应用

1.材料和方法

1.1试剂配制

(1)包被液：0.05mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液。

(2)洗涤液：pH7.4，0.1M PBS，0.05％Tween-20。

(3)封闭液：以洗涤液配制5％BSA溶液。

(4)稀释液：使用封闭液作为稀释液。

(5)TMB：A液：0.02％H₂O₂，用pH5.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠溶液稀释；

B液：0.4‰ TMB-HCl，用50mM pH2.8的柠檬酸钠溶液溶解。分别取50μL A液、B液混合避光保存，备用。此步骤还可使用商品化的TMB显色液。

(6)终止液：2M H₂SO₄溶液。

1.2样品

PPRV标准阳性血清、300份2009-2016年间采集的免疫了小反刍兽疫疫苗的羊血清样品和100份小反刍兽疫阴性血清，由本实验室保存。

2.小反刍兽疫双抗原夹心ELISA抗原检测试剂盒的建立

2.1最佳捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度的确定

根据实施例1中确定的包被抗原为N-H重组抗原，酶标抗原为N-H重组抗原，建立双抗原夹心ELISA方法，对阳性血清中的抗体进行检测，同时设立阴性对照，采用棋盘滴定法确定捕获抗体的包被浓度和酶标抗体的稀释度，检测结束后计算P/N值结果见表3，选择P/N值最高的，确定捕获抗原N-H的最佳包被浓度为1μg/mL，每孔100μL，检测抗原的最佳稀释度为1∶500。

表3最佳捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度的确定

2.2最佳封闭条件的确定

根据已确定的最佳条件，分别以1％BSA、5％BSA、5％马血清、5％脱脂乳作为封闭液，每种封闭液均设立30min、60min、90min、120min的时间梯度，每组设3个重复，进行双抗原夹心ELISA检测，读取OD_450nm值，计算P/N值。结果见表4，选择P/N值最高的，确定最佳封闭液为5％BSA，最佳封闭时间为60min。

表4最佳封闭液和封闭时间的确定

2.3酶标抗原孵育时间的确定

根据已确定的最佳条件，对酶标抗原的孵育时间设立30min、60min、90min、120min的时间梯度，每组各做3个重复，进行双抗原夹心ELISA检测，读取OD_450nm值，计算P/N值，结果见表5，选择P/N值最高的，确定酶标抗原的最佳孵育时间为60min。

表5酶标抗原最佳孵育时间的确定

2.4显色时间的确定

根据已确定的最佳条件，对底物显色时间设立为5min、10min、15min、20min的梯度，每组各做3个重复，进行双抗原夹心ELISA检测，读取OD_450nm值，计算P/N值，结果见表6，选择P/N值最高的，确定底物最佳显色时间为15min。

表6最佳显色时间的确定

2.5判定标准的确定

根据已确定的最佳条件，检测100份已经确定为阴性的羊血清样品，计算OD_450nm的平均值(X)和标准差(SD)，根据公式即可确定阳性判定标准。

根据检测结果，计算cut-off value＝0.128+3×0.043＝0.257，即当OD_450nm＞0.257时，则判定样品为PPRV阳性，当OD_450nm＜0.257时，则判定样品为PPRV阴性。

2.6双抗原夹心ELISA检测标准曲线的绘制

将PPRV标准阳性血清样品从1∶1开始2倍倍比稀释至1∶256，采用上述优化的最佳双抗原夹心ELISA程序检测不同稀释度的OD值，重复检测6次，通过计算每个浓度的平均值、标准差，并进行差异显著性分析(t检验)，从而确定该方法的最低检测限为1∶256倍稀释；再以不同浓度稀释度的标准品所对应的OD值作为横坐标，以标准品的不同浓度作为纵坐标建立标准曲线，利用Excel软件中的LINEST函数进行线性回归分析，推导回归方程。结果如以下表7所示。

表7不同稀释度的PPRV标准品的OD值

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2.7重复性与稳定性试验

使用倍比稀释的疫苗血清标准品作为检测样品，以上述实施例1中所述的重组的N-H抗原作为包被抗原以包被平板，同一批制备的酶标抗原作为二抗，每个血清稀释度设置3个重复，进行双抗原夹心ELISA检测，计算该方法的批内重复性试验变异系数。用不同批次制备的抗原包被平板、不同批次制备的酶标抗原作为二抗进行双抗原夹心ELISA检测倍比稀释的标准阳性血清，计算该方法的批间重复性试验变异系数。结果显示于以下的表8中，批内变异系数为1.61％～4.78％，批间变异系数为2.06％～8.41％，批内和批间变异系数均小于10％。表明该方法的重复性较好，稳定性较高。

表8双抗原夹心ELISA重复性试验结果

2.8特异性试验

采用所建立的双抗原夹心ELISA检测牛瘟病毒阳性血清，口蹄疫疫苗阳性血清，灭活蓝舌病阳性血清，灭活鹿流行性出血热病阳性血清，灭活犬瘟热阳性血清，同时设立阴性对照，进行特异性检测。结果显示(表9)，其余病毒均无交叉反应，表明该双抗原夹心ELISA方法特异性较好。

表9双抗原夹心ELISA特异性检测结果

2.9样品检测

采用所建立的双抗原夹心检测方法对本实验室保存的150份羊血清进行检测，检测结果见以下的表10。同时将该ELISA检测结果与世界动物卫生组织(OIE)推荐的中和抗体检测方法进行比较，两种检测方法的符合率可达到98.9％。

表10临床样品的双抗原夹心ELISA和中和抗体检测方法比较的检测结果

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白包括衍生自小反刍兽疫病毒的N蛋白的第一片段和衍生自其H蛋白的第二片段。

2.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述第一片段具有选自200～450个氨基酸的长度并且是所述N蛋白的氮端片段，特别地，所述第一片段包括选自SEQ ID NO：5～15的一种或多种抗原决定簇；优选地，所述第一片段包括选自SEQ ID NO：5～11的一种或多种抗原决定簇；还优选地，所述第一片段包括选自以下中任一者的氨基酸序列：(a)SEQID NO：1；或者(b)与(a)中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述第二片段具有选自150～400个氨基酸的长度并且包括选自如下的一种或多种抗原决定簇：INA、SEQ ID NO：16～27；

优选地，所述第二片段包括选自SEQ ID NO：18～23的一种或多种抗原决定簇；

还优选地，所述第二片段包括选自以下中任一者的氨基酸序列：(c)SEQ ID NO：2；或者(d)与(c)中任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述重组融合蛋白还包括连接肽，所述连接肽连接所述第一片段和所述第二片段；

优选地，所述重组融合蛋白从氮端开始依次包括第一片段、连接肽和第二片段；

优选地，所述连接肽为柔性连接肽(GGGGS)_n，其中n＝0～8，或者包括3至40个，优选25-35个甘氨酸残基。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求1-4中任一项所述的重组融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为用于选自以下的检测方法的试剂盒：化学发光免疫分析法、免疫比浊、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹、抗原微阵列、免疫沉淀和放射免疫测定，优选为用于酶联免疫吸附测定的试剂盒，还优选地，所述试剂盒包括根据权利要求1-4中任一项所述的重组融合蛋白作为捕获抗原，以及具有可检测标记的抗原作为检测抗原。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述可检测标记为酶标记、放射性标记、发光标记、显色标记、半抗原、金属络合物或金属，优选地，所述酶标记为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记，并且/或者，所述半抗原为地高辛、异硫氰酸荧光素或生物素，并且/或者，所述金属为胶体金。

8.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码根据权利要求1-4中任一项所述的重组融合蛋白，优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，更优选地，所述核酸分子由SEQID NO：3所示的核苷酸序列组成。

9.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含根据权利要求8所述的核酸分子。

10.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含根据权利要求8所述的核酸分子或根据权利要求9所述的表达载体，优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、枯草芽孢杆菌、里氏木霉、黑曲霉、昆虫或哺乳动物细胞。

11.一种疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括免疫量的根据权利要求1-4中任一项所述的重组融合蛋白和药学上可接受的载体。

12.一种制备小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括培养根据权利要求10所述的宿主细胞、表达和分离所述重组融合蛋白。

13.一种用于检测针对小反刍兽疫病毒的抗体的方法，其特征在于，所述方法包括使用根据权利要求1-4中任一项所述的小反刍兽疫病毒的重组融合蛋白作为捕获抗原，或者使用根据权利要求5-7中任一项所述的试剂盒。

14.根据权利要求13所述的方法，其用于检测小反刍兽疫病毒阳性样品，或者用于判断接受小反刍兽疫病毒疫苗的动物对所述疫苗的响应，

其中，使用来自健康动物或者未接受小反刍兽疫病毒疫苗的动物的阴性样品作为对照，根据公式计算界限值，其中/>为阴性样品检测结果的平均值，SD为标准差，

当OD_450nm＞界限值时，判定样品为小反刍兽疫病毒阳性或者对所述疫苗有积极响应；

当OD_450nm≤界限值时，判定样品为小反刍兽疫病毒阴性或者对所述疫苗无响应。