CN117844687A - 一种高活力高稳定性戊糖片球菌冻干菌粉的制备方法 - Google Patents

一种高活力高稳定性戊糖片球菌冻干菌粉的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生态制剂生产技术领域，公开了一种高活力高稳定性戊糖片球菌冻干菌粉的制备方法，具体公开了一种冻干保护剂，包括以下成分：蛋白、糖醇和糊精。通过使用本发明提供的冻干保护剂，可有效提高戊糖片球菌冻干菌粉的活力及稳定性，减缓货架期活菌数衰减速度，为戊糖片球菌固体饮料、压片糖果、乳制品发酵剂等相关产品的开发提供了基础。

Description

一种高活力高稳定性戊糖片球菌冻干菌粉的制备方法
技术领域
本发明属微生态制剂生产技术领域，具体涉及一种高活力高稳定性戊糖片球菌冻干菌粉的制备方法。
背景技术
戊糖片球菌是人体肠道内一种常见菌株，具有抑制肠道有害菌、调节肠道菌群平衡、抗氧化、改善代谢障碍、抑制炎症等多种重要生理功能，在食品和医疗领域应用广泛，市场需求巨大。但目前戊糖片球菌菌粉活菌数低、货架期活菌数衰减快、生产成本高等问题严重制约了戊糖片球菌菌剂的进一步应用和发展，因此，开发一种高稳定戊糖片球菌菌粉的制备方法，提高戊糖片球菌菌粉活菌数对于戊糖片球菌产品的应用和发展具有重要意义。
高密度发酵和真空冷冻干燥是菌粉生产的重要环节。高密度发酵提供菌株生长所需的充足营养元素和适宜的生长环境，菌株得以大量增殖，为下游真空冷冻干燥工序提供菌体半成品原料。
真空冷冻干燥是目前市场上戊糖片球菌菌粉生产采用的主流生产工艺，冷冻干燥过程中水分冻结产生的冰晶和胞内溶质浓缩不可避免地造成细胞损伤，导致冻干后戊糖片球菌菌粉活菌数偏低和货架期期间菌粉活菌数快速衰减。因此需要研究一种高效的冻干保护剂减少真空冷冻干燥过程不利因素对细胞的损伤，提高戊糖片球菌冻干粉的活菌数并减缓货架期活菌数的衰减速度。
发明内容
本发明旨在解决现有技术存在的戊糖片球菌冻干粉活菌数低、货架期活菌数衰减快等问题，提供一种戊糖片球菌真空冷冻干燥保护剂，有效提高戊糖片球菌冻干菌粉的活力及稳定性，减缓货架期活菌数衰减速度；还提供一种高活力高稳定性戊糖片球菌菌粉的制备方法，使用该培养基培养戊糖片球菌可获得大量菌体，为高活力高稳定性戊糖片球菌菌粉的制备提供菌体来源。
本发明第一方面的目的，在于提供一种冻干保护剂。
本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的冻干保护剂在制备冻干菌粉中的应用。
本发明第三方面的目的，在于提供一种冻干菌粉的制备方法。
本发明第四方面的目的，在于提供一种冻干菌粉。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括如下重量百分含量的组分组成：9％～20％蛋白、4％～10％糖醇、5％～15％糊精。
在本发明一些优选实施方式中，所述冻干保护剂包括如下重量百分含量的组分组成：9％～14％蛋白、4％～9％糖醇、5％～10％糊精。
在本发明一些实施方式中，所述蛋白包括脱脂奶、乳清蛋白、酪蛋白中的一种或多种。
在本发明一些实施方式中，所述糖醇包括海藻糖、蔗糖、山梨醇中的一种或多种。
在本发明一些实施方式中，所述冻干保护剂包括脱脂奶、酪蛋白、山梨醇和糊精。
在本发明一些实施方式中，所述冻干保护剂由如下重量百分含量的组分组成：9％～11％脱脂奶、4％～6％酪蛋白、4％～7％山梨醇和6％～10％糊精、余量为水。
在本发明一些优选实施方式中，所述冻干保护剂由如下重量百分含量的组分组成：10.5％脱脂奶、5％酪蛋白、5％山梨醇、9％糊精、余量为水。
本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的冻干保护剂在制备冻干菌粉中的应用。
本发明的第三个方面，提供一种冻干菌粉的制备方法，包括以下步骤：
将戊糖片球菌接种至戊糖片球菌高密度发酵培养基中，发酵，固液分离，得到菌泥；
菌泥与本发明第一方面的冻干保护剂混合，冷冻干燥，即得到冻干菌粉。
在本发明一些实施方式中，所述戊糖片球菌高密度发酵培养基包括葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸粉、磷酸氢二钾、柠檬酸铵、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰和吐温。
在本发明一些实施方式中，所述戊糖片球菌高密度发酵培养基包括10～50g/L葡萄糖、3～25g/L酵母浸粉、5～55g/L蛋白胨、5～25g/L大豆蛋白胨、4～5g/L牛肉浸粉、2～5g/L磷酸氢二钾、2～5g/L柠檬酸铵、4～6g/L乙酸钠、0.2～0.5g/L硫酸镁、0.05～0.1g/L硫酸锰、1～2g/L吐温。
在本发明一些优选实施方式中，所述戊糖片球菌高密度发酵培养基包括30～50g/L葡萄糖、20～25g/L酵母浸粉、50～55g/L蛋白胨、20～25g/L大豆蛋白胨、4～5g/L牛肉浸粉、2～5g/L磷酸氢二钾、2～5g/L柠檬酸铵、4～6g/L乙酸钠、0.2～0.5g/L硫酸镁、0.05～0.1g/L硫酸锰、1～2g/L吐温。
在本发明一些更优选实施方式中，所述戊糖片球菌高密度发酵培养基包括45g/L葡萄糖、23g/L酵母浸粉、53g/L蛋白胨、24.5g/L大豆蛋白胨、5g/L牛肉浸粉、2g/L磷酸氢二钾、2g/L柠檬酸铵、5g/L乙酸钠、0.2g/L硫酸镁、0.05g/L硫酸锰、1g/L吐温。
在本发明一些实施方式中，所述戊糖片球菌接种前使用MRS培养基活化、扩培。
在本发明一些实施方式中，所述发酵的条件为35～39℃、转速20～55rpm的条件下发酵12～18h。
在本发明一些优选实施方式中，所述发酵的条件为36～38℃、转速40～55rpm的条件下发酵12～18h。
在本发明一些实施方式中，所述发酵过程中控制pH至5～6。
在本发明一些实施方式中，所述发酵过程中不需要通气。
在本发明一些实施方式中，所述戊糖片球菌工作种子液的接种量为发酵体积的5％～10％。
在本发明一些实施方式中，所述戊糖片球菌为戊糖片球菌A21243，保藏编号为GDMCC NO:63749。
在本发明一些实施方式中，所述菌泥与所述冻干保护剂的质量比为1:1～5。
在本发明一些实施方式中，所述菌泥与所述冻干保护剂的质量比为1:1～2。
在本发明一些实施方式中，所述菌泥在与所述冻干保护剂混合前用无菌生理盐水洗涤，除去残留培养基和发酵代谢物。
在本发明一些实施方式中，所述冷冻干燥的条件为-50～-40℃预冻3～5h，降温速度为1～3℃/min，真空度5～40Pa，冷冻干燥20～30h。
在本发明一些实施方式中，所述冷冻干燥的条件为：-50～-45℃预冻4.5h，降温速度为1℃/min，冷冻干燥24～28h。
采用本发明中的高密度发酵培养基、高密度发酵方法、高活力高稳定性冻干保护剂及冻干工艺大大提高了戊糖片球菌菌粉的活力和稳定性，制备得到的戊糖片球菌冻干菌粉活菌数高，货架期稳定性好，存活率高，适用于戊糖片球菌菌粉工业化生产。
本发明的第四个方面，提供一种冻干菌粉，由本发明第三方面的制备方法制备得到。
在本发明一些实施方式中，所述冻干菌粉中活菌数为1～9×1011CFU/g。
本发明的有益效果是：
通过使用本发明提供的冻干保护剂，可有效提高戊糖片球菌冻干菌粉的活力及稳定性，减缓货架期活菌数衰减速度，为戊糖片球菌固体饮料、压片糖果、乳制品发酵剂等相关产品的开发提供了基础。
采用本发明的戊糖片球菌高密度发酵工艺和高活力高稳定冻干工艺制备得到的戊糖片球菌冻干菌粉活力高，菌粉活菌数高达6.0×1011CFU/g以上。
采用本发明的戊糖片球菌高密度发酵工艺和高活力高稳定性冻干工艺制备得到的戊糖片球菌冻干菌粉货架期稳定性好，活菌数衰减慢，在37℃货架期高温加速条件下存放1周后存活率仍保持在86.8％。
本发明工艺所用物质均为食品级原料，安全性高，且生产操作步骤简单，易于规模化扩大生产。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细地说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
戊糖片球菌A21243来自广西爱生生命科技有限公司，该菌株命名为Pediococcuspentosaceus A21243，于2023年8月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:63749。
实施例1
一种高活力高稳定性戊糖片球菌冻干菌粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)工作种子液制备：用无菌接种环蘸取少量菌种保藏管中的菌液，划线于MRS固体平板上，平板置于37℃条件下培养24～48h。挑取单菌落，再次划线于MRS固体平板上，平板置于37℃条件下培养24～48h。挑取单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃培养8～12h得到种子液。将活化种子液按2％接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养8～12h，OD值达到7.000时结束培养得到工作种子液。
(2)戊糖片球菌高密度发酵培养基配制：配方为45g/L葡萄糖、23g/L酵母浸粉、53g/L蛋白胨、24.5g/L大豆蛋白胨、5g/L牛肉浸粉、2g/L磷酸氢二钾、2g/L柠檬酸铵、5g/L乙酸钠、0.2g/L硫酸镁、0.05g/L硫酸锰、1g/L吐温80。戊糖片球菌高密度发酵培养基在121℃灭菌15min后将培养基冷却至37.5℃备用。
(3)高密度发酵：按发酵体积的6％接种量接入工作种子液，调节搅拌转速为50rpm，发酵过程中用浓度为30％的食品级氢氧化钠溶液控制pH为5.5，发酵过程不需通气，发酵14h后结束发酵。高密度发酵结束后将发酵液冷却，在4℃条件下进行离心收集菌泥，菌泥用无菌生理盐水进行洗涤，除去残留的培养基和发酵代谢物。
(4)配制戊糖片球菌高活力高稳定性冻干保护剂，配方由如下重量百分含量的组分组成：10.5％脱脂奶、5％酪蛋白、5％山梨醇、9％糊精、余量为水，保护剂灭菌后冷却至4℃，备用。
(5)将菌泥和稳定性冻干保护剂按照质量比1:2的比例混合，乳化45min得到乳化液。将乳化液装入冻干盘进行真空冷冻干燥。冻干参数设置为-47℃预冻4.5h，降温速度为1℃/min，真空度5～30Pa，冻干时间27h。冻干后得到戊糖片球菌高活力高稳定性冻干菌粉。
根据国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》的方法进行戊糖片球菌活菌数检测，结果显示其活菌数为6.0×1011CFU/g。
实施例2
一种高活力高稳定性戊糖片球菌冻干菌粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)工作种子液制备，同实施例1。
(2)戊糖片球菌高密度发酵培养基配制：配方为31g/L葡萄糖、20g/L酵母浸粉、50g/L蛋白胨、21g/L大豆蛋白胨、5g/L牛肉浸粉、2g/L磷酸氢二钾、2g/L柠檬酸铵、5g/L乙酸钠、0.2g/L硫酸镁、0.05g/L硫酸锰、1g/L吐温80。戊糖片球菌高密度发酵培养基在121℃灭菌15min后将培养基冷却至37.5℃。
(3)高密度发酵：按发酵体积的10％接种量接入工作种子液，调节搅拌转速为50rpm，发酵过程中用浓度为30％的食品级氢氧化钠溶液控制pH为6.0，发酵过程不需通气，发酵时间为16h。高密度发酵结束后将发酵液冷却，在4℃条件下进行离心收集菌泥，菌泥用无菌生理盐水进行洗涤，除去残留的培养基和发酵代谢物。
(4)配制戊糖片球菌高活力高稳定性冻干保护剂，配方由如下重量百分含量的组分组成：10.5％脱脂奶、5％蔗糖、10％山梨醇、6％糊精、余量为水，保护剂灭菌后冷却至4℃。
(5)将菌泥和稳定性冻干保护剂按照质量比1:2的比例混合，乳化45min得到乳化液。将乳化液装入冻干盘进行真空冷冻干燥。冻干参数设置为-45℃预冻4.5h，降温速度为1℃/min，真空度5～30Pa，冻干时间25h。冻干后得到戊糖片球菌高活力高稳定性冻干菌粉。
根据国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》的方法进行戊糖片球菌活菌数检测，结果显示其活菌数为6.04×1011CFU/g。
实施例3
一种高活力高稳定性戊糖片球菌冻干菌粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)工作种子液制备，同实施例1。
(2)戊糖片球菌高密度发酵培养基配制：同实施例1。
(3)高密度发酵：按发酵体积的10％接种量接入工作种子液，调节搅拌转速为50rpm，发酵过程中用浓度为30％的食品级氢氧化钠溶液控制pH为5.5，发酵过程不需通气，发酵时间为14h。高密度发酵结束后将发酵液冷却，在4℃条件下进行离心收集菌泥，菌泥用无菌生理盐水进行洗涤，除去残留的培养基和发酵代谢物。
(4)配制戊糖片球菌高活力高稳定性冻干保护剂，配方由如下重量百分含量的组分组成：10.5％脱脂奶、5％蔗糖、10％山梨醇、6％糊精、余量为水，保护剂灭菌后冷却至4℃。
(5)将菌泥和稳定性冻干保护剂按照质量比1:2的比例混合，乳化60min得到乳化液。将乳化液装入冻干盘进行真空冷冻干燥。冻干参数设置为-45℃预冻4.5h，降温速度为1℃/min，真空度5～30Pa，冻干时间24h。冻干后得到戊糖片球菌高活力高稳定性冻干菌粉。
根据国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》的方法进行戊糖片球菌活菌数检测，结果显示其活菌数为6.26×1011CFU/g。
实施例4
一种戊糖片球菌冻干菌粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)工作种子液制备，同实施例1。
(2)戊糖片球菌高密度发酵培养基配制：同实施例1。
(3)高密度发酵：同实施例1。
(4)配制冻干保护剂(非高活力高稳定性冻干保护剂)，其配方由如下重量百分含量的组分组成：5％脱脂奶、15％蔗糖、9％糊精、余量为水，保护剂灭菌后冷却至4℃，备用。
(5)将菌泥和冻干保护剂按照质量比1:2的比例混合，乳化45min得到乳化液。将乳化液装入冻干盘进行真空冷冻干燥。冻干参数设置为-47℃预冻4.5h，降温速度为1℃/min，真空度5～30Pa，冻干时间27h。冻干后得到戊糖片球菌冻干菌粉。
根据国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》的方法进行戊糖片球菌活菌数检测，结果显示其活菌数为5.97×1011CFU/g。
对比例1
一种戊糖片球菌冻干菌粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)工作种子液制备，同实施例1。
(2)普通发酵：将MRS液体培养基在121℃灭菌15min后将培养基冷却至37.5℃，按发酵体积的6％接种量接入工作种子液，调节搅拌转速为50rpm，发酵过程中用浓度为30％的食品级氢氧化钠溶液控制pH为5.5，发酵过程不需通气，发酵14h后结束发酵。发酵结束后将发酵液冷却，在4℃条件下进行离心收集菌泥，菌泥用无菌生理盐水进行洗涤，除去残留的培养基和发酵代谢物。
(3)配制普通冻干保护剂，其配方由如下重量百分含量的组分组成：12％脱脂奶、12％海藻糖、10％壳聚糖、1％海藻酸钠、余量为水，冻干保护剂灭菌后冷却至4℃，备用。
(4)将菌泥和冻干保护剂按照质量比1:2的比例混合，乳化45min得到乳化液。将乳化液装入冻干盘进行真空冷冻干燥。冻干参数设置为-47℃预冻4.5h，降温速度为1℃/min，真空度5～30Pa，冻干时间27h。冻干后得到戊糖片球菌冻干菌粉。
根据国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》的方法进行戊糖片球菌活菌数检测，结果显示其活菌数为4.8×1011CFU/g。
效果实施例
将实施例1～4得到的戊糖片球菌冻干菌粉和对比例1得到的戊糖片球菌冻干菌粉分别用食品级铝箔袋分装后密封后在37℃培养箱中放置7天进行高温条件下货架期加速实验，7天后取出样品，按照国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》的方法进行戊糖片球菌活菌数检测并计算货架期存活率，货架期存活率计算方法为：
表1戊糖片球菌冻干粉的货架期存活率
结果如表1所示，采用实施例1～3的方法制备得到的戊糖片球菌冻干菌粉货架期存活率(73.3％～86.8％)明显高于采用对比例1得到的戊糖片球菌冻干菌粉(6.9％)。根据货架期检测结果可知，戊糖片球菌发酵工艺和冻干保护剂对戊糖片球菌冻干粉活力及货架期稳定性具有重大影响。对比例1使用了常规MRS液体培养基对戊糖片球菌进行培养发酵并在真空冷冻干燥过程中使用了普通冻干保护剂，由于菌株起始密度低，保护剂对菌株的保护效果有限，结果其冻干粉活力只有4.8×1011CFU/g，低于实施例的6.0×1011CFU/g以上的冻干粉活力；并且其货架期稳定性差，货架期存活率只有6.8％，远远低于实施例1～3。
实施例1～3使用了戊糖片球菌高密度发酵工艺和高活力高稳定性冻干保护剂，菌株起始密度高，保护剂对菌株的保护效果好，在真空冷冻干燥过程中有效保护菌株，降低了冰晶、脱水等不利因素对菌株的影响，稳定细胞结构及活力，冻干粉活力可达到6.0×1011CFU/g以上，且货架期存活率高、稳定性好。其中，实施例1使用的高密度发酵工艺和高活力高稳定性冻干保护剂可获得较高冻干粉活力和最优的货架期稳定性，货架期存活率达到86.8％。
实施例3与实施例1相比，虽然使用了相同的高密度发酵培养基配方，但增加了发酵接种量、变更了发酵pH，使用了不同配方的高活力高稳定性冻干保护剂，最终得到的冻干粉活力和货架期稳定性也有所差别。
实施例4与实施例1相比，二者使用了同样的高密度发酵培养基和高密度发酵培养方法，菌株起始密度高，因此冻干获得了较高活力的冻干粉；但是实施例4使用的是非高稳定性冻干保护剂，因此冻干粉的稳定性差，货架期存活率较低。实施例4使用的冻干保护剂与戊糖片球菌高活力高稳定性冻干保护剂虽然在成分种类上一样，但是各成分的用量配比不同，其中蛋白含量低于9％～14％的范围、糖醇含量高于4％～9％的范围，因此该冻干保护剂对戊糖片球菌不具有突出的保护能力。
综上所述，本发明的制备方法只有高密度发酵培养基配方、高活力高稳定性冻干保护剂配方和各主要工艺参数协同配合作用才能取得最佳的菌粉高活力高稳定性效果。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括如下重量百分含量的组分：包括9％～20％蛋白、4％～10％糖醇、5％～15％糊精。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述蛋白包括脱脂奶、乳清蛋白、酪蛋白中的一种或多种；和/或，所述糖醇包括海藻糖、蔗糖、山梨醇中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括如下重量百分含量的组分：9％～14％蛋白、4％～9％糖醇、5％～10％糊精。
4.权利要求1～3中任一项所述的冻干保护剂在制备冻干菌粉中的应用。
5.一种冻干菌粉的制备方法，包括以下步骤：
将戊糖片球菌接种至戊糖片球菌高密度发酵培养基中，发酵，固液分离，得到菌泥；
菌泥与权利要求1～3中任一项所述的冻干保护剂混合，冷冻干燥，即得到冻干菌粉。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述戊糖片球菌高密度发酵培养基包括葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸粉、磷酸氢二钾、柠檬酸铵、乙酸钠、硫酸镁、硫酸锰和吐温。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述菌泥与所述冻干保护剂的质量比为1:1～5；和/或，所述冷冻干燥的条件为-50～-40℃预冻3～5h，降温速度为1～3℃/min，冷冻干燥20～30h。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的条件为35～39℃、转速20～55rpm的条件下发酵12～18h；和/或，所述发酵过程中控制pH至5～6；和/或，所述发酵过程中不需要通气。
9.根据权利要求5～7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述戊糖片球菌为戊糖片球菌A21243，保藏编号为GDMCC NO:63749。
10.一种冻干菌粉，由权利要求5～9中任一项所述的制备方法制备得到。
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