CN117843577A - 分离恩扎卢胺和/或恩扎卢胺z3中1-26种杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种分离恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中1‑26种杂质的方法。该方法为：以十八烷基硅烷键合硅胶填充剂为固定相，以三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈/甲醇/四氢呋喃的混合溶液为流动相B，进行梯度洗脱。该方法具有时间短、专属性强、灵敏度高、耐用性高、重现性好、出峰峰型对称且无溶剂效应的特点，可在75分钟内将供试品主峰及供试品中可能存在的除杂质Z2d和杂质Z1外的26个已知杂质有效分离，解决了现有技术未能解决的恩扎卢胺Z3/成品与可能存在的杂质的分离测定问题。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种分离恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中1-26种杂质的方法。
背景技术
恩扎卢胺(enzalutamide，商品名为Xtandi)，化学名为4-{3-[4-氰基-3-(三氟甲基)苯基]-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫酮咪唑-1-基}-2-氟-N-甲基苯酰胺，结构式如式Ⅰ所示；属于口服类雄激素受体拮抗剂，是一种针对雄激素受体(AR)信号传导通路的新型药物，适应证为转移性去势抵抗性前列腺癌。查询相关药典和资料发现，恩扎卢胺在中国药典(ChP)、欧洲药典(EP)和美国药典(USP)、英国药典(BP)、日本药典(JP)中均无收载，仅在恩扎卢胺软胶囊进口注册标准(标准号：JX20190132)提及检测方法。
恩扎卢胺Z3为恩扎卢胺精制前的中间体，其结构式与恩扎卢胺相同，如式Ⅰ所示；化学名为：4-{3-[4-氰基-3-(三氟甲基)苯基]-5,5-二甲基-4-氧代-2-硫酮咪唑-1-基}-2-氟-N-甲基苯酰胺，分子式为：C21H16F4N4O2S。
本专利研究发现，在恩扎卢胺Z3和成品中研究和检测共计28个杂质，包括杂质I、杂质J、杂质Xa、杂质Xf、杂质Z1、杂质A、Z2c、杂质Z2d、杂质Z2g、杂质Z2h、杂质Z3a、杂质B、杂质C、杂质Z3d、杂质Z3e、杂质Z3f、杂质G、杂质H、杂质D、杂质Z3k、杂质E、杂质F、杂质Z3n、杂质Z3o、杂质K、杂质L、杂质M、杂质N，但是，恩扎卢胺软胶囊进口注册标准的有关物质分析方法仅分离其中21个杂质，且多个杂质有重合、杂质与杂质间分离度不符合要求、主峰位置包裹杂质，制剂软胶囊进口注册标准的有关物质分析方法远远无法满足我司检测要求。
申请号为CN202210305500.0的发明专利公开了一种恩扎卢胺的纯化方法，具体为将恩扎卢胺反应混合物溶解于良溶剂中，加入不良溶剂，降温析晶；良溶剂至少包括甲醇或乙醇；不良溶剂至少包括正己烷、正庚烷和环己烷中任一种。该方法可有效去除聚合杂质(本发明的杂质E)，但是该技术方案与本发明的的技术方案完全不同，且该发明无法实现恩扎卢胺/恩扎卢胺Z3及其相关26个已知杂质的有效分离和检测。
因此，亟需一种分离效果更好、灵敏度和耐用性更高的方法，以满足恩扎卢胺相关物质的检测要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种从如式Ⅰ所示的恩扎卢胺和/或如式Ⅱ所示的恩扎卢胺Z3中分离1-26种杂质的方法，该方法可在75分钟内将恩扎卢胺/恩扎卢胺Z3及其恩扎卢胺/恩扎卢胺Z3中的26个已知杂质有效分离。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
从恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中分离1-26种杂质的方法，所述恩扎卢胺和所述恩扎卢胺Z3的结构式如式Ⅰ所示；所述杂质包括如式Ⅱ所示的杂质A、如式Ⅲ所示的杂质B、如式Ⅳ所示的杂质C、如式Ⅴ所示的杂质D、如式Ⅵ所示的杂质E、如式Ⅶ所示的杂质F、如式Ⅷ所示的杂质G、如式Ⅸ所示的杂质H、如式Ⅹ所示的杂质I、如式Ⅺ所示的杂质J、如式Ⅻ所示的杂质K、如式XIII所示的杂质L、如式XIV所示的杂质M、如式XV所示的杂质N、如式XVI所示的杂质Xa、如式XVII所示的杂质Xf、如式XVIII所示的杂质Z2c、如式XIX所示的杂质Z2g、如式XX所示的杂质Z2h、如式XXI所示的杂质Z3a、如式XXII所示的杂质Z3d、如式XXIII所示的杂质Z3e、如式XXIV所示的杂质Z3f、如式XXV所示的杂质Z3k、如式XXVI所示的杂质Z3n和如式XXVII所示的杂质Z3o中的任一种或多种；所述方法为：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂为固定相，以三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈/甲醇/四氢呋喃的混合溶液为流动相B，进行梯度洗脱；采用所述方法同时分离26种杂质时，在75分钟内完成分离；
后期杂质Z2d作为潜在杂质研究、杂质Z1有溶剂效应，因此本发明未对其进行研究。
进一步，所述梯度洗脱的程序为：
在0分钟，设置流动相A体积分数为75％，流动相B体积分数为25％；
在5分钟，设置流动相A体积分数为75％，流动相B体积分数为25％；
在20分钟，设置流动相A体积分数为57％，流动相B体积分数为43％；
在30分钟，设置流动相A体积分数为50％，流动相B体积分数为50％；
在45分钟，设置流动相A体积分数为25％，流动相B体积分数为75％；
在55分钟，设置流动相A体积分数为25％，流动相B体积分数为75％；
在56分钟，设置流动相A体积分数为75％，流动相B体积分数为25％；
在65分钟，设置流动相A体积分数为75％，流动相B体积分数为25％。
进一步，所述流动相B中乙腈、甲醇和四氢呋喃的体积比为69～71：29～31：4～6
进一步，所述流动相B中乙腈、甲醇和四氢呋喃的体积比优选为70：30：5。
进一步，所述三氟乙酸水溶液的体积分数为0.04～0.06％。
更进一步，所述三氟乙酸水溶液的体积分数优选为0.05％。
进一步，所述三氟乙酸水溶液配制方法如下：量取水1000ml，加入三氟乙酸0.5ml。
进一步，所述流动相的流速为1.0±0.1ml/min。
更进一步，所述流动相的流速优选为1.0ml/min。
进一步，所述色谱柱柱箱温度为35±2℃。
更进一步，所述色谱柱柱箱温度优选为35℃。
本发明的目的之二在于提供一种定性鉴别恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中1-26种杂质的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
定性鉴别恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中1-26种杂质的方法，包括以下步骤：
(1)利用权利要求1-4任一所述方法分离恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中式Ⅱ-式XXVII杂质中的任一种或多种；
(2)分离后进入波长为260nm和/或234nm的检测器进行检测。
进一步，在步骤(1)前，配制供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液和/或杂质定位溶液。
进一步，以乙腈为溶剂/稀释液配制供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液和/或杂质定位溶液。
进一步，优选方案，在流速1.0ml/min、柱温35℃、检测器波长为260nm、流动相和流动相B初始比例为75：25的条件下，若保留时间为36.737±1min时，判定为含有恩扎卢胺；若保留时间为9.013±1min时，判定为含有杂质Z2g；若保留时间为14.950±1min时，判定为含有杂质A；若保留时间为17.597±1min时，判定为含有杂质Z2c；若保留时间为19.100±1min时，判定为含有杂质Z2h；若保留时间为20.177±1min时，判定为含有杂质C；若保留时间为21.623±1min时，判定为含有杂质I；若保留时间为22.863±1min时，判定为含有杂质Z3e；若保留时间为26.773±1min时，判定为含有杂质Z3d；若保留时间为28.647±1min时，判定为含有杂质Z3n；若保留时间为29.120±1min时，判定为含有杂质M；若保留时间为29.920±1min时，判定为含有杂质Z3f；若保留时间为33.140±1min时，判定为含有杂质H；若保留时间为34.033±1min时，判定为含有杂质Z3a；若保留时间为34.893±1min时，判定为含有杂质G；若保留时间为37.817±1min时，判定为含有杂质D；若保留时间为38.350±1min时，判定为含有杂质Z3o；若保留时间为39.097±1min时，判定为含有杂质B；若保留时间为41.553±1min时，判定为含有杂质J；若保留时间为44.193±1min时，判定为含有杂质Z3k；若保留时间为44.877±1min时，判定为含有杂质K；若保留时间为45.490±1min时，判定为含有杂质Xa；若保留时间为46.073±1min时，判定为含有杂质N；若保留时间为47.277±1min时，判定为含有杂质L；若保留时间为48.703±1min时，判定为含有杂质F；若保留时间为49.130±1min时，判定为含有杂质Xf；若保留时间为50.037±1min时，判定为含有杂质E。
本发明的目的之三在于提供一种定量测定恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中1-26种杂质的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
定量测定恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中1-26种杂质的方法，包括以下步骤：
(1)分离：利用权利要求1-4任一所述方法分离恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中式Ⅱ-式XXVII杂质中的任一种或多种；
(2)检测：利用权利要求5-6任一所述方法定性鉴别恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中式Ⅱ-式XXVII杂质中的任一种或多种；
(3)计算含量：根据步骤(2)检测得到的所述恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3和/或其任一杂质的峰面积，采用加校正因子的主成分自身对照法计算各杂质含量。
进一步，步骤(3)中，计算各杂质含量的公式为：
式中：Ai—供试品溶液中某一已知杂质的峰响应值；
AS—自身对照溶液中主峰的峰响应值；
RRF—已知杂质校正因子。
进一步，所述杂质A的校正因子为1.5；所述杂质B的校正因子为1.2；所述杂质C的校正因子为1.6；所述杂质D的校正因子为1.3；所述杂质E的校正因子为1.0；所述杂质F的校正因子为1.0；所述杂质G的校正因子为1.0；所述杂质H的校正因子为1.0；所述杂质I的校正因子为1.5；所述杂质J的校正因子为2.3；所述杂质K的校正因子为2.5；所述杂质L的校正因子为1.6；所述杂质N的校正因子为1.3；所述杂质M的校正因子为0.71；所述杂质Z3n的校正因子为1.2；所述杂质Xa的校正因子为2.0；所述杂质Z3k的校正因子为1.6；所述杂质Z2g的校正因子为1.0；所述杂质Z2c的校正因子为1.0；所述杂质Z2h的校正因子为3.6；所述杂质Z3e的校正因子为1.6；所述杂质Z3d的校正因子为1.6；所述杂质Z3f的校正因子为1.7；所述杂质Z3a的校正因子为0.87；所述杂质Z3o的校正因子为1.1；所述杂质Xf的校正因子为1.3。
本发明的有益效果在于：
本专利提供的HPLC方法具有时间短、专属性强、灵敏度高(0.02％)、耐用性高、重现性好、出峰峰型对称且无溶剂效应的特点，可在75分钟内将供试品主峰及供试品中可能存在的除杂质Z2d和杂质Z1外的26个已知杂质有效分离，解决了现有技术未能解决的恩扎卢胺Z3/成品与可能存在的杂质的分离测定问题。
附图说明
图1为专属性-混合溶液色谱图(检测波长为260nm)；
图2为专属性-混合溶液色谱图(检测波长为234nm)；
图3为检测限色谱图(检测波长为260nm)；
图4为检测限色谱图(检测波长为234nm)；
图5为耐用性-混合溶液色谱图(检测波长为260nm)；
图6为耐用性-混合溶液色谱图(检测波长为234nm)；
图7为耐用性-流速1.1色谱图(检测波长为260nm)；
图8为耐用性-流速1.1色谱图(检测波长为234nm)；
图9为耐用性-流速0.9色谱图(检测波长为260nm)；
图10为耐用性-流速0.9色谱图(检测波长为234nm)；
图11为耐用性-柱温33℃色谱图(检测波长为260nm)；
图12为耐用性-柱温33℃色谱图(检测波长为234nm)；
图13为耐用性-柱温37℃色谱图(检测波长为260nm)；
图14为耐用性-柱温37℃色谱图(检测波长为234nm)；
图15为耐用性-26％有机相色谱图(检测波长为260nm)；
图16为耐用性-26％有机相色谱图(检测波长为234nm)；
图17为耐用性-24％有机相色谱图(检测波长为260nm)；
图18为耐用性-24％有机相色谱图(检测波长为234nm)；
图19为耐用性-甲醇29色谱图(检测波长为260nm)；
图20为耐用性-甲醇29色谱图(检测波长为234nm)；
图21为耐用性-甲醇31色谱图(检测波长为260nm)；
图22为耐用性-甲醇31色谱图(检测波长为234nm)；
图23为耐用性-乙腈69色谱图(检测波长为260nm)；
图24为耐用性-乙腈69色谱图(检测波长为234nm)；
图25为耐用性-乙腈71色谱图(检测波长为260nm)；
图26为耐用性-乙腈71色谱图(检测波长为234nm)；
图27为耐用性-四氢呋喃4色谱图(检测波长为260nm)；
图28为耐用性-四氢呋喃4色谱图(检测波长为234nm)；
图29为耐用性-四氢呋喃6色谱图(检测波长为260nm)；
图30为耐用性-四氢呋喃6色谱图(检测波长为234nm)；
图31为耐用性-0.04％TFA色谱图(检测波长为260nm)；
图32为耐用性-0.04％TFA色谱图(检测波长为234nm)；
图33为耐用性--0.06％TFA色谱图(检测波长为260nm)；
图34为耐用性--0.06％TFA色谱图(检测波长为234nm)。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
以下实施例中，恩扎卢胺成品：含有杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质L、杂质M、杂质N和其他单个杂质；恩扎卢胺系统适用性对照品：含有恩扎卢胺、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质K、杂质L、杂质M和杂质N；恩扎卢胺Z3系统适用性对照品：含有恩扎卢胺、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质K、杂质L、杂质M、杂质N、杂质Xa、杂质Z3k。
实施例1
(1)待测样品：
供试品溶液的配制：取恩扎卢胺成品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液。
对照品溶液的配制：精密量取供试品溶液1.5ml，置100ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液的配制：取恩扎卢胺系统适用性对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液。
本专利严格按照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)进行测定。
(2)色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(YMC-Triart C18 4.6mm×150mm，3μm或效能相当的色谱柱)，以0.05％三氟乙酸水溶液(量取水1000ml，加入三氟乙酸0.5ml)为流动相A，以乙腈-甲醇-四氢呋喃(体积比＝70:30:5)为流动相B，按照表1进行线性梯度洗脱；流速为1.0ml/min；柱温为35℃；检测波长为260nm、234nm；进样体积10μl。
表1.梯度洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 75 | 25 |
| 5 | 75 | 25 |
| 20 | 57 | 43 |
| 30 | 50 | 50 |
| 45 | 25 | 75 |
| 55 | 25 | 75 |
| 56 | 75 | 25 |
| 65 | 75 | 25 |
系统适用性要求：在260nm波长下记录的系统适用性溶液色谱图中，恩扎卢胺峰与杂质D峰之间的分离度应符合要求。
测定：精密量取供试品溶液和对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中，除空白溶剂峰和梯度洗脱峰外，按加校正因子的主成分自身对照法计算，各杂质含量应符合表2的规定，杂质总量不得过1.0％。供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积三分之一的色谱峰忽略不计(0.05％)。
表2
注：表2的相对保留时间仅供参考，以系统适用性溶液的色谱图对各峰定位。
实施例2
供试品溶液、对照溶液配制、色谱条件除检测波长为260nm外均与实施例1相同。
杂质定位溶液：取杂质Z3n、杂质Xa对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg的混合溶液。
系统适用性要求：在260nm波长下记录的杂质定位溶液中，杂质Z3n、杂质Xa依次出峰。
测定方法：精密量取供试品溶液和对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
限度：供试品溶液色谱图中，除空白溶剂峰和梯度洗脱峰外，按加校正因子的主成分自身对照法计算，各杂质含量应符合表3的规定。
表3
| 主成分与杂质 | 相对保留时间(RRT) | 校正因子 | 杂质限度 | 检测波长 |
| 杂质Z3n | 0.78 | 1.2 | 0.10％ | 260nm |
| 杂质Xa | 1.24 | 2.0 | 0.10％ | 260nm |
实施例3
(1)待测样品
供试品溶液的配制：取恩扎卢胺Z3适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液。
对照品溶液的配制：精密量取供试品溶液1.5ml，置100ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液的配制：称取杂质J和恩扎卢胺Z3系统适用性对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含杂质J1μg和恩扎卢胺Z3系统适用性对照品0.5mg的混合溶液。
本实施例严格按照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)进行测定。
(2)色谱条件：同实施例1。
系统适用性要求：在260nm波长下记录的系统适用性溶液色谱图中，恩扎卢胺峰与杂质D峰之间的分离度应不小于1.5。
测定方法：精密量取供试品溶液和对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中，除空白溶剂峰和梯度洗脱峰外，按加校正因子的主成分自身对照法计算，各杂质含量应符合表4的规定，杂质总量不得过6.0％。供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积三分之一的色谱峰忽略不计(0.05％)。
表4
注：表4的相对保留时间供参考，以系统适用性溶液的色谱图对各峰定位。
实施例4
供试品溶液、对照溶液配制、色谱条件除检测波长为260nm外均与实施例3相同。
杂质定位溶液：取杂质Z2c、杂质Z2g、杂质Z2h、杂质Z3a、杂质Z3d、杂质Z3e、杂质Z3f、杂质Z3o、杂质Xf对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含各杂质1μg的混合溶液。
系统适用性要求：在260nm波长下记录的杂质定位溶液中，杂质Z2g、杂质Z2c、杂质Z2h、杂质Z3e、杂质Z3d、杂质Z3f、杂质Z3a、杂质Z3o、杂质Xf依次出峰。
测定方法：精密量取供试品溶液和对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中，除空白溶剂峰和梯度洗脱峰外，按加校正因子的主成分自身对照法计算，各杂质含量应符合表5的规定。
表5
| 主成分与杂质 | 相对保留时间(RRT) | 校正因子 | 杂质限度 | 检测波长 |
| 杂质Z2g | 0.25 | 1.0 | 0.1％ | 260nm |
| 杂质Z2c | 0.48 | 1.0 | 0.1％ | 260nm |
| 杂质Z2h | 0.52 | 3.6 | 0.1％ | 260nm |
| 杂质Z3e | 0.62 | 1.6 | 0.1％ | 260nm |
| 杂质Z3d | 0.73 | 1.6 | 0.1％ | 260nm |
| 杂质Z3f | 0.81 | 1.7 | 0.1％ | 260nm |
| 杂质Z3a | 0.93 | 0.87 | 0.1％ | 260nm |
| 杂质Z3o | 1.04 | 1.1 | 0.1％ | 260nm |
| 杂质Xf | 1.34 | 1.3 | 0.1％ | 260nm |
实施例5.专属性
恩扎卢胺成品/Z3可能存在的其他杂质：杂质I、杂质J、杂质Xa、杂质Xf、杂质Z1、杂质A、杂质Z2c、杂质Z2d、杂质Z2g、杂质Z2h、杂质Z3a、杂质B、杂质C、杂质Z3d、杂质Z3e、杂质Z3f、杂质G、杂质H、杂质D、杂质Z3k、杂质E、杂质F、杂质Z3n、杂质Z3o、杂质K、杂质L、杂质M、杂质N共计28个杂质。由于后期杂质Z2d作为潜在杂质研究、杂质Z1有溶剂效应，因此单独建立方法对其进行研究。
分别取空白溶剂、其他杂质定位溶液、供试品溶液、混合溶液各10μl，依法进样，记录色谱图，测定结果如表6～7和图1～2所示，其积分结果如表8～9所示。图1中各编号对应化合物如下，1：杂质Z1；2：杂质Z2g；3：杂质A；4：杂质Z2c；5：杂质Z2h；6：杂质C；7：杂质I；8：杂质Z3e；9：杂质Z3d；10：杂质Z3n；11：杂质M；12：杂质Z3f；13：杂质H；14：杂质Z3a；15：杂质G；16：恩扎卢胺；17：杂质D；18：杂质Z3o；19：杂质B；20：杂质J；21：杂质Z3k；22：杂质K；23：杂质Xa；24：杂质N；25：杂质L；26：杂质F；27：杂质Xf；28：杂质E。图2中，部分编号对应化合物均如下所示，14：恩扎卢胺；15：杂质D；19：杂质Z3k。结果显示，空白溶液不干扰各杂质测定；主峰与邻近杂质峰间的分离度均大于1.5，各已知杂质峰间、已知杂质与主峰间的分离度均大于1.5。
表6.专属性试验测定结果(波长260nm)
表7.专属性试验测定结果(波长234nm)
表8.混合溶液积分结果表(波长260nm)
表9.混合溶液积分结果表(波长234nm)
/>
实施例6.检测限
取检测限溶液连续进样3次，计算主峰峰高与噪声的比值(信噪比)。试验结果如表10～11所示；检测限色谱图如图3～4所示，其积分结果如表12～13所示。图3中各编号对应化合物如下，1：杂质Z2g；2：杂质A；3：杂质Z2c；4：杂质Z2h；5：杂质C；6：杂质I；7：杂质Z3e；8：杂质Z3d；9：杂质Z3n；10：杂质M；11：杂质Z3f；12：杂质H；13：杂质Z3a；14：杂质G；15：恩扎卢胺；16：杂质D；17：杂质Z3o；18：杂质B；19：杂质J；20：杂质Z3k；21：杂质K；22：杂质Xa；23：杂质N；24：杂质L；25：杂质F；26：杂质Xf；27：杂质E。图4中，部分编号对应化合物如下所示，18：恩扎卢胺；19：杂质D；23：杂质Z3k。
表10.检测限测定结果(波长260nm)
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/>
表11.检测限测定结果(波长234nm)
表12.检测限积分结果表(波长260nm)
/>
表13.检测限积分结果表(波长234nm)
/>
实施例7.色谱条件耐用性
取实施例1中的混合溶液，分别使用正常色谱条件，预定测试的不同柱温、柱流速、流动相起始比例、流动相中有机相不同配制比例(±10％)，待仪器系统稳定后分别测试，记录色谱图，考察各组分峰间的分离度变化情况。试验结果如表14～15和图5～34所示。
图5、图7、图9、图11、图13、图15、图17、图19、图21、图23、图25、图27、图29、图31和图33中，各编号对应化合物均如下所示，1：杂质Z1；2：杂质Z2g；3：杂质A；4：杂质Z2c；5：杂质Z2h；6：杂质C；7：杂质I；8：杂质Z3e；9：杂质Z3d；10：杂质Z3n；11：杂质M；12：杂质Z3f；13：杂质H；14：杂质Z3a；15：杂质G；16：恩扎卢胺；17：杂质D；18：杂质Z3o；19：杂质B；20：杂质J；21：杂质Z3k；22：杂质K；23：杂质Xa；24：杂质N；25：杂质L；26：杂质F；27：杂质Xf；28：杂质E。图6、图10、图12、图16、图22、图24、图26、图30和图34中，部分编号对应化合物均如下所示，14：恩扎卢胺；15：杂质D；19：杂质Z3k。图8、图14、图18和图32中，部分编号对应化合物均如下所示，15：恩扎卢胺；16：杂质D；20：杂质Z3k。图20和图28中，部分编号对应化合物均如下所示，16：恩扎卢胺；17：杂质D；21：杂质Z3k。
表14.色谱条件变化试验各组分分离度测定结果(波长260nm)
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表15.色谱条件变化试验各组分相对保留时间测定结果(波长234nm)
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Claims (10)
1.从恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中分离1-26种杂质的方法，其特征在于，所述恩扎卢胺和所述恩扎卢胺Z3的结构式如式Ⅰ所示；所述杂质包括如式Ⅱ所示的杂质A、如式Ⅲ所示的杂质B、如式Ⅳ所示的杂质C、如式Ⅴ所示的杂质D、如式Ⅵ所示的杂质E、如式Ⅶ所示的杂质F、如式Ⅷ所示的杂质G、如式Ⅸ所示的杂质H、如式Ⅹ所示的杂质I、如式Ⅺ所示的杂质J、如式Ⅻ所示的杂质K、如式XIII所示的杂质L、如式XIV所示的杂质M、如式XV所示的杂质N、如式XVI所示的杂质Xa、如式XVII所示的杂质Xf、如式XVIII所示的杂质Z2c、如式XIX所示的杂质Z2g、如式XX所示的杂质Z2h、如式XXI所示的杂质Z3a、如式XXII所示的杂质Z3d、如式XXIII所示的杂质Z3e、如式XXIV所示的杂质Z3f、如式XXV所示的杂质Z3k、如式XXVI所示的杂质Z3n和如式XXVII所示的杂质Z3o中的任一种或多种；所述方法为：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂为固定相，以三氟乙酸水溶液为流动相A，以乙腈/甲醇/四氢呋喃的混合溶液为流动相B，进行梯度洗脱；采用所述方法同时分离26种杂质时，在75分钟内完成分离；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：
在0分钟，设置流动相A体积分数为75％，流动相B体积分数为25％；
在5分钟，设置流动相A体积分数为75％，流动相B体积分数为25％；
在20分钟，设置流动相A体积分数为57％，流动相B体积分数为43％；
在30分钟，设置流动相A体积分数为50％，流动相B体积分数为50％；
在45分钟，设置流动相A体积分数为25％，流动相B体积分数为75％；
在55分钟，设置流动相A体积分数为25％，流动相B体积分数为75％；
在56分钟，设置流动相A体积分数为75％，流动相B体积分数为25％；在65分钟，设置流动相A体积分数为75％，流动相B体积分数为25％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相B中乙腈、甲醇和四氢呋喃的体积比为69～71：29～31：4～6。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三氟乙酸水溶液的体积分数为0.04～0.06％。
5.定性鉴别恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中1-26种杂质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用权利要求1-4任一所述方法分离恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中式Ⅱ-式XXVII杂质中的任一种或多种；
(2)分离后进入波长为260nm和/或234nm的检测器进行检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(1)前，配制供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液和/或杂质定位溶液。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在流速1.0ml/min、柱温35℃、检测器波长为260nm、流动相和流动相B初始比例为75：25的条件下，若保留时间为36.737±1min时，判定为含有恩扎卢胺；若保留时间为9.013±1min时，判定为含有杂质Z2g；若保留时间为14.950±1min时，判定为含有杂质A；若保留时间为17.597±1min时，判定为含有杂质Z2c；若保留时间为19.100±1min时，判定为含有杂质Z2h；若保留时间为20.177±1min时，判定为含有杂质C；若保留时间为21.623±1min时，判定为含有杂质I；若保留时间为22.863±1min时，判定为含有杂质Z3e；若保留时间为26.773±1min时，判定为含有杂质Z3d；若保留时间为28.647±1min时，判定为含有杂质Z3n；若保留时间为29.120±1min时，判定为含有杂质M；若保留时间为29.920±1min时，判定为含有杂质Z3f；若保留时间为33.140±1min时，判定为含有杂质H；若保留时间为34.033±1min时，判定为含有杂质Z3a；若保留时间为34.893±1min时，判定为含有杂质G；若保留时间为37.817±1min时，判定为含有杂质D；若保留时间为38.350±1min时，判定为含有杂质Z3o；若保留时间为39.097±1min时，判定为含有杂质B；若保留时间为41.553±1min时，判定为含有杂质J；若保留时间为44.193±1min时，判定为含有杂质Z3k；若保留时间为44.877±1min时，判定为含有杂质K；若保留时间为45.490±1min时，判定为含有杂质Xa；若保留时间为46.073±1min时，判定为含有杂质N；若保留时间为47.277±1min时，判定为含有杂质L；若保留时间为48.703±1min时，判定为含有杂质F；若保留时间为49.130±1min时，判定为含有杂质Xf；若保留时间为50.037±1min时，判定为含有杂质E。
8.定量测定恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中1-26种杂质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分离：利用权利要求1-4任一所述方法分离恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中式Ⅱ-式XXVII杂质中的任一种或多种；
(2)检测：利用权利要求5-6任一所述方法定性鉴别恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3中式Ⅱ-式XXVII杂质中的任一种或多种；
(3)计算含量：根据步骤(2)检测得到的所述恩扎卢胺和/或恩扎卢胺Z3和/或其任一杂质的峰面积，采用加校正因子的主成分自身对照法计算各杂质含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，计算各杂质含量的公式为：
式中：Ai—供试品溶液中某一已知杂质的峰响应值；
AS—自身对照溶液中主峰的峰响应值；
RRF—已知杂质校正因子。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述杂质A的校正因子为1.5；所述杂质B的校正因子为1.2；所述杂质C的校正因子为1.6；所述杂质D的校正因子为1.3；所述杂质E的校正因子为1.0；所述杂质F的校正因子为1.0；所述杂质G的校正因子为1.0；所述杂质H的校正因子为1.0；所述杂质I的校正因子为1.5；所述杂质J的校正因子为2.3；所述杂质K的校正因子为2.5；所述杂质L的校正因子为1.6；所述杂质N的校正因子为1.3；所述杂质M的校正因子为0.71；所述杂质Z3n的校正因子为1.2；所述杂质Xa的校正因子为2.0；所述杂质Z3k的校正因子为1.6；所述杂质Z2g的校正因子为1.0；所述杂质Z2c的校正因子为1.0；所述杂质Z2h的校正因子为3.6；所述杂质Z3e的校正因子为1.6；所述杂质Z3d的校正因子为1.6；所述杂质Z3f的校正因子为1.7；所述杂质Z3a的校正因子为0.87；所述杂质Z3o的校正因子为1.1；所述杂质Xf的校正因子为1.3。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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