CN117821547A - 一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法 - Google Patents
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，属于生物催化反应技术领域，包括步骤S1：载体构建与克隆；取磷酸化酶(PNP)核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到磷酸化酶‑pET28a SEQ ID NO.1‑pET28a；步骤S2：培养取种；步骤S3：验证；步骤S4：酶的表达和提取；步骤S5：纯化；步骤S6：反应；步骤S7：测量。解决了化学方法合成烟酰胺核糖分为好几个步骤，会产生很多中间体，存在中间体分离困难的问题，导致产率不高，生产效率低下的技术问题，主要应用于生物催化合成烟酰胺核糖方面。
Description
技术领域
本发明涉及属于生物催化反应技术领域，特别涉及一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法。
背景技术
烟酰胺核糖(NR)是维生素B3的衍生物，也被称为维生素B3。是一种重要辅酶的前体，是诺加因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体底物。摄入后可以增加NAD+水平。为白色或淡黄色结晶粉末，无臭、味苦，略有引湿性。这个辅酶就是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，也称辅酶Ⅰ)，是一种转递质子(更准确来说是氢离子)的辅酶，它出现在细胞很多代谢反应中。参与蛋白质、碳水化合物和脂肪等化合物的分解，人体的生命活动离不开这个辅酶。随着细胞的衰老或者病变，它的数量就会减少。所以，补充烟酰胺核糖，就能提高这个辅酶(NAD+)的含量，提高细胞的基本代谢活动，从而显著提高细胞活力，提高人体各方面的生理机能。
烟酰胺核糖第一次被人类记载是在1944年，当时被称为流感嗜血杆菌(Haemophilu步骤Sinfluenza)的生长因子，也被称为生长因子V。流感嗜血杆菌是生活在血液中并依赖血液生活的细菌。从血液中纯化出来的生长因子V有三种结构：NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸),NMN(烟酰胺单核甙酸)andNR(烟酰胺核糖)。后来发现只有烟酰胺核糖(NR)能快速促进这种细菌的生长，而以前被认为是NAD+前体的烟酸、烟酰胺、色氨酸和天冬氨酸没有此功能。
2000年，酵母步骤Sir2被发现是一种NAD+依赖的蛋白质赖氨酸去乙酰化酶，为调节寿命的基因和酶感知NAD+的代谢活动。令人惊异是，当NAD+合成酶(谷氨酰胺水解酶)从酵母细胞中被删除后，烟酰胺核糖能让酵母细胞生长。因此，科学家克隆了酵母和人类的烟酰胺核糖激动酶，而且在实验室和机体内都证明：通过烟酰胺核糖激动酶，烟酰胺核糖(NR)转化为烟酰胺单核甙酸(NMN)。也证实烟酰胺核糖在牛奶中天然存在，人类可以通过口服烟酰胺核糖，提高血液中NAD+的新陈代谢。此后，烟酰胺核糖的研究逐渐成为热点，科学家们发现烟酰胺核糖有许多生物学功能，如下：1.延缓衰老：恢复衰老细胞的功能，让虚弱的人体器官恢复活力，从而达到延缓衰老的目的。2.提高心血管健康：提高心肌细胞和血管细胞的功能，还能降低心血管系统中血脂水平。所以，能提高心血管功能。3.提高大脑健康：提高脑细胞和其他神经细胞的活力，提高整个神经系统的功能。因此，能提高大脑健康，对老年性痴呆症有较好的效果。4.提高脂肪代谢：减少人体对食物中脂类物质的吸收，提高脂肪细胞内脂肪的消耗，达到减肥的目的。5.提高人体对癌细胞的抵抗力：提高人体内各种免疫细胞的功能，增强对癌细胞的抵抗力，对癌症有辅助治疗的作用。6.戒毒作用：大剂量的服用，能解除毒瘾，有较好的戒毒作用。7.美容作用：提高表皮细胞功能，以及人体内其他细胞的功能，能让皮肤保持青春光彩。
烟酰胺核糖是一种重要的营养补充成分，能提高细胞活力，特别是提高衰老细胞的活力。这样，人体的新陈代谢、免疫力、大脑功能、心血管功能等都会得到提高，所以，它是通过整体提升人体机能能，让人体内所有细胞处于一种新的活跃状态，消除疾病，达到延缓衰老的效果。
化学方法合成烟酰胺核糖分为好几个步骤，会产生很多中间体，所以存在中间体分离困难的问题，从而导致产率不高，生产效率低下。
申请号:CN202010772689.5,公开了公开了一种尿苷磷酸酶突变体，其氨基酸序列为SEQI DNO:3，能够有效催化核糖-1-磷酸与烟酰胺反应生成烟酰胺核糖。该专利所采用的底物核糖-1-磷酸价格较高，不利于工业化生产，因此，我司提出一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法的研究。
发明内容
本发明目的之一是设计合理的酶催化反应合成路线用以工业化生产烟酰胺核糖，目的产物烟酰胺核糖结构式如下：
为实现发明目的，本发明采取的技术方案为：
腺苷(rA)或者肌苷(r I)与尼克酰胺在嘌呤核苷磷酸化酶PNPase的作用下一步反应生成目的产物烟酰胺核糖(NR)。
依照本发明工艺的反应路线，各反应物质的用量可以根据实际情况调整，为了最大效率化，本发明提供了如下各反应物质的浓度和用量：
腺苷/肌苷的底物浓度为5mM，缓冲液采用20mM PBS。PBS缓冲液购买自MCE。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：载体构建与克隆；
取磷酸化酶(PNP)核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到磷酸化酶-pET28a SEQ ID NO.1-pET28a；
步骤S2：培养取种；
对步骤S1连接载体进行培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含卡那霉素抗性的LB平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号；
步骤S3：验证；
将经过步骤S2的牙签置于已加入T7通用引物的20μlPCRMix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株；
步骤S4：酶的表达和提取；
将步骤S3得到的目标酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那霉素抗性的LB培养基中，于37℃下培养OD至0.9-1.1后加入终浓度0.1mM的IPTG，置于28℃诱导表达16h，然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体，倒掉上清培养基后按菌体重量：PBS溶液＝1g：5ml的比例用20mM PBS溶液将菌体重悬，将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得到目标酶的粗酶溶液；
步骤S5：纯化；
使步骤S4中含酶的上清液流经Ni柱，用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，再用不同梯度的盐溶液进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到目标酶的纯化的酶溶液；
步骤S6：反应；
在玻璃反应瓶中，先加入底物腺苷/肌苷、尼克酰胺，而后加入MgCl2，投入步骤S5得到的目标酶的纯化液，最后加入PBS溶液缓冲液，反应5-7h，反应液温度为30-40℃，用NaOH控制反应液pH在7.2-8.8。
步骤S7：测量；
步骤S6反应前，测量底物腺苷/肌苷、尼克酰胺的高效液相色谱图，目的产物烟酰胺核糖色谱图，取步骤S6反应步骤中的混合溶液，所得高效液相色谱图，可知底物反应消耗得到产品烟酰胺核糖。
进一步的，步骤S1中，所述磷酸化酶(PNP)核苷酸序列为磷酸化酶(PNP)P 01核苷酸序列、磷酸化酶(PNP)P 02核苷酸序列、磷酸化酶(PNP)P 03核苷酸序列中任意一种。
进一步的，步骤S1中，连接载体进行培育具体为取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60S，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗LB培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，随后涂在卡那霉素抗性的固体LB平板上37℃培育。
进一步的，步骤S3中，所述PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃保温5min。
进一步的，步骤S1中，所述磷酸化酶(PNP)核苷酸序列采用磷酸化酶(PNP)P 01核苷酸序列，步骤S3中得到含有目标酶序列的大肠杆菌菌株为SEQ ID NO.1-大肠杆菌。
进一步的，步骤S1中，所述磷酸化酶(PNP)核苷酸序列采用磷酸化酶(PNP)P 02核苷酸序列，步骤S3中得到含有目标酶序列的大肠杆菌菌株为SEQ ID NO.2-大肠杆菌。
进一步的，步骤S1中，所述磷酸化酶(PNP)核苷酸序列采用磷酸化酶(PNP)P 03核苷酸序列，步骤S3中得到含有目标酶序列的大肠杆菌菌株为SEQ ID NO.3-大肠杆菌。
进一步的，步骤S5中，所述不同梯度的盐溶液主要成分为KCl溶液。
进一步的，步骤S6中，所述底物腺苷/肌苷的量为5mM；所述尼克酰胺的量为15mM；所述MgCl的量为22mM，所述PBS溶液缓冲液的量为20mM。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
本发明的目的是提供一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法是采用酶法合成烟酰胺核糖的新型工艺，将腺苷与磷酸盐在磷酸化酶PNP的作用下生成D-核糖-1-磷酸，而后继续在该酶催化下和烟酰胺合成烟酰胺核糖。提供了三种可靠的磷酸化酶PNPK01K02K03序列及其生产方式,通过将连续步骤在一个反应容器中进行，避免了分离中间体的步骤，具有产率高、生产效率高的优点，本专利寻找到价格便宜且易得的腺苷(rA)或者肌苷(rI)为底物，与尼克酰胺反应生成烟酰胺核糖。更具经济价值，有利于工业化大生产。
附图说明
图1底物rA的液相色谱图；
图2底物rI的液相色谱图；
图3底物尼克酰胺的液相色谱图；
图4对照品NR的液相色谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例1
一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：载体构建与克隆；
取磷酸化酶(PNP)P 01核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到磷酸化酶-pET28a SEQ ID NO.1-pET28a；
步骤S2：培养取种；
对步骤S1连接载体进行培育，取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60S，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗LB培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，随后涂在卡那霉素抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含卡那霉素抗性的LB平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号；
步骤S3：验证；
将经过步骤S2的牙签置于已加入T7通用引物的20μlPCRMix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株：SEQ ID NO.1-大肠杆菌；
步骤S4：酶的表达和提取；
将步骤S3得到的目标酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那霉素抗性的LB培养基中，于37℃下培养OD至1.0后加入终浓度0.1mM的IPTG，置于28℃诱导表达16h，然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体，倒掉上清培养基后按菌体重量：PBS溶液＝1g：5ml的比例用20mM PBS溶液将菌体重悬，将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得到目标酶的粗酶溶液；
步骤S5：纯化；
使步骤S4中含酶的上清液流经Ni柱，用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCl)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到目标酶的纯化的酶溶液；
步骤S6：反应；
在50mL玻璃反应瓶中，先加入5mM底物腺苷/肌苷、15mM尼克酰胺，而后加入2mM的MgCl2，投入步骤S5得到的目标酶的纯化液，最后加入20mM PBS缓冲液。反应5-7h，反应液温度为37℃，用NaOH控制反应液pH在7.2-8.8。
步骤S7：测量；
步骤S6反应前，测量底物腺苷/肌苷、尼克酰胺的高效液相色谱图，目的产物烟酰胺核糖色谱图，取步骤S6反应步骤中的混合溶液，所得高效液相色谱图，可知底物反应消耗得到产品烟酰胺核糖。
实施例2
一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：载体构建与克隆；
取磷酸化酶(PNP)P 02核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到磷酸化酶-pET28a SEQ ID NO.1-pET28a；
步骤S2：培养取种；
对步骤S1连接载体进行培育，取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60S，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗LB培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，随后涂在卡那霉素抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含卡那霉素抗性的LB平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号；
步骤S3：验证；
将经过步骤S2的牙签置于已加入T7通用引物的20μlPCRMix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株：SEQ ID NO.2-大肠杆菌；
步骤S4：酶的表达和提取；
将步骤S3得到的目标酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那霉素抗性的LB培养基中，于37℃下培养OD至1.0后加入终浓度0.1mM的IPTG，置于28℃诱导表达16h，然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体，倒掉上清培养基后按菌体重量：PBS溶液＝1g：5ml的比例用20mM PBS溶液将菌体重悬，将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得到目标酶的粗酶溶液；
步骤S5：纯化；
使步骤S4中含酶的上清液流经Ni柱，用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCl)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到目标酶的纯化的酶溶液；
步骤S6：反应；
在50mL玻璃反应瓶中，先加入5mM底物腺苷/肌苷、15mM尼克酰胺，而后加入2mM的MgCl2，投入步骤S5得到的目标酶的纯化液，最后加入20mM PBS缓冲液。反应5-7h，反应液温度为37℃，用NaOH控制反应液pH在7.2-8.8。
步骤S7：测量；
步骤S6反应前，测量底物腺苷/肌苷、尼克酰胺的高效液相色谱图，目的产物烟酰胺核糖色谱图，取步骤S6反应步骤中的混合溶液，所得高效液相色谱图，可知底物反应消耗得到产品烟酰胺核糖。
实施例3
一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：载体构建与克隆；
取磷酸化酶(PNP)P 03核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到磷酸化酶-pET28a SEQ ID NO.1-pET28a；
步骤S2：培养取种；
对步骤S1连接载体进行培育，取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60S，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗LB培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，随后涂在卡那霉素抗性的固体LB平板上37℃培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含卡那霉素抗性的LB平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号；
步骤S3：验证；
将经过步骤S2的牙签置于已加入T7通用引物的20μlPCRMix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃保温5min，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株：SEQ ID NO.1-大肠杆菌；
步骤S4：酶的表达和提取；
将步骤S3得到的目标酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那霉素抗性的LB培养基中，于37℃下培养OD至1.0后加入终浓度0.1mM的IPTG，置于28℃诱导表达16h，然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体，倒掉上清培养基后按菌体重量：PBS溶液＝1g：5ml的比例用20mM PBS溶液将菌体重悬，将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得到目标酶的粗酶溶液；
步骤S5：纯化；
使步骤S4中含酶的上清液流经Ni柱，用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，再用不同梯度的盐溶液(主要成分为KCl)进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到目标酶的纯化的酶溶液；
步骤S6：反应；
在50mL玻璃反应瓶中，先加入5mM底物腺苷/肌苷、15mM尼克酰胺，而后加入2mM的MgCl2，投入步骤S5得到的目标酶的纯化液，最后加入20mM PBS缓冲液。反应5-7h，反应液温度为37℃，用NaOH控制反应液pH在7.2-8.8。
步骤S7：测量；
步骤S6反应前，测量底物腺苷/肌苷、尼克酰胺的高效液相色谱图，目的产物烟酰胺核糖色谱图，取步骤S6反应步骤中的混合溶液，所得高效液相色谱图，可知底物反应消耗得到产品烟酰胺核糖。
使用方法：
最终所得反应结果如下:
| 核糖激酶 | 转化率％ |
| SEQ ID NO.1 | ＞97％ |
| SEQ ID NO.2 | ＞92％ |
| SEQ ID NO.3 | ＞91％ |
如上表可知，选用核糖激酶SEQ ID NO.1的转化率更高，说明其有更好的反应活性。能够通过酶法高效合成烟酰胺核糖，更适用于工业化生产。本发明具体实施例中所使用的酶的相关信息参见表1:
表1PNP P01 P02 P03来源及序列
Claims (9)
1.一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：载体构建与克隆；
取磷酸化酶(PNP)核苷酸序列用无缝克隆方式将其与载体pET28a连接得到磷酸化酶-pET28a SEQ ID NO.1-pET28a；
步骤S2：培养取种；
对步骤S1连接载体进行培育，长出菌落后用高压灭菌的牙签挑取单菌落，先在含卡那霉素抗性的LB平板上画线保种用，将相应的菌和板子上的画线区做上对应的记号；
步骤S3：验证；
将经过步骤S2的牙签置于已加入T7通用引物的20μlPCRMix体系中搅和一下，进行PCR扩增，PCR扩增后进行电泳观察结果得阳性克隆，获得含有目标酶序列的大肠杆菌菌株；
步骤S4：酶的表达和提取；
将步骤S3得到的目标酶序列的大肠杆菌挑取到含卡那霉素抗性的LB培养基中，于37℃下培养OD至0.9-1.1后加入终浓度0.1mM的IPTG，置于28℃诱导表达16h，然后将菌液以7000g/min离心6min收集菌体，倒掉上清培养基后按菌体重量：PBS溶液＝1g：5ml的比例用20mM PBS溶液将菌体重悬，将重悬后的菌体经高压细胞破碎仪破碎得含酶裂解液，35000g/min离心30min后提取上清液，得到目标酶的粗酶溶液；
步骤S5：纯化；
使步骤S4中含酶的上清液流经Ni柱，用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，再使所得含酶量最高的Ni柱洗脱液流经Q柱，再用不同梯度的盐溶液进行洗脱，得到初步纯化的含酶溶液，将初步纯化的含酶溶液进行12h透析，得到目标酶的纯化的酶溶液；
步骤S6：反应；
在玻璃反应瓶中，先加入底物腺苷/肌苷、尼克酰胺，而后加入MgCl2，投入步骤S5得到的目标酶的纯化液，最后加入PBS溶液缓冲液，反应5-7h，反应液温度为30-40℃，用NaOH控制反应液pH在7.2-8.8。
步骤S7：测量；
步骤S6反应前，测量底物腺苷/肌苷、尼克酰胺的高效液相色谱图，目的产物烟酰胺核糖色谱图，取步骤S6反应步骤中的混合溶液，所得高效液相色谱图，可知底物反应消耗得到产品烟酰胺核糖。
2.根据权利要求1所述的一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，步骤S1中，所述磷酸化酶(PNP)核苷酸序列为磷酸化酶(PNP)P 01核苷酸序列、磷酸化酶(PNP)P 02核苷酸序列、磷酸化酶(PNP)P 03核苷酸序列中任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，步骤S1中，连接载体进行培育具体为取10μl连接产物加入冰浴的100μl大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，随后冰浴30min，42℃热激60S，再冰浴5min，向管中加入37℃无抗LB培养液300μl，37℃、200r摇床修复1h，随后涂在卡那霉素抗性的固体LB平板上37℃培育。
4.根据权利要求1所述的一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，步骤S3中，所述PCR反应条件为：95℃、15min，94℃变性15S，55℃退火15S，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃保温5min。
5.根据权利要求2所述的一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，步骤S1中，所述磷酸化酶(PNP)核苷酸序列采用磷酸化酶(PNP)P 01核苷酸序列，步骤S3中得到含有目标酶序列的大肠杆菌菌株为SEQ ID NO.1-大肠杆菌。
6.根据权利要求2所述的一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，步骤S1中，所述磷酸化酶(PNP)核苷酸序列采用磷酸化酶(PNP)P 02核苷酸序列，步骤S3中得到含有目标酶序列的大肠杆菌菌株为SEQ ID NO.2-大肠杆菌。
7.根据权利要求2所述的一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，步骤S1中，所述磷酸化酶(PNP)核苷酸序列采用磷酸化酶(PNP)P 03核苷酸序列，步骤S3中得到含有目标酶序列的大肠杆菌菌株为SEQ ID NO.3-大肠杆菌。
8.根据权利要求1所述的一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，步骤S5中，所述不同梯度的盐溶液主要成分为KCl溶液。
9.根据权利要求1所述的一种生物催化合成烟酰胺核糖的方法，其特征在于，步骤S6中，所述底物腺苷/肌苷的量为5mM；所述尼克酰胺的量为15mM；所述MgCl的量为22mM，所述PBS溶液缓冲液的量为20mM。
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