CN117815383A - 一种亚微米至纳米级粒径可调氢氧化铝佐剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及氢氧化铝佐剂制备技术领域，特别是一种亚微米至纳米级粒径可调氢氧化铝佐剂的制备方法，包括以下步骤：步骤一：准备并清洗实验器具，灭菌后降温至室温待用；步骤二：称取固体Na0H，置于烧杯中并配制成0.1～0.3mol/L的溶液，备用，称取AlCl3，置于烧杯中并配制成0.1～0.15mol/L的溶液，备用；本发明中的铝佐剂本由于具有极佳的悬浮稳定性，易于分散，结构蓬松，保证了其在疫苗生产应用过程中得到均一性更好的产品，本发明通过改变滴加顺序，不同于上述专利将氢氧化钠滴加入三氯化铝的顺序，采取了将三氯化铝滴加入氢氧化钠溶液中，避免了氢氧化钠滴加过量溶解氢氧化铝的问题。
Description
技术领域
本发明涉及氢氧化铝佐剂制备技术领域，特别是一种亚微米至纳米级粒径可调氢氧化铝佐剂的制备方法。
背景技术
佐剂是能够非特异性增强或改变机体对抗原免疫应答的物质；具有佐剂效应的物质很多，但目前仅有少数被批准用于人用疫苗；铝佐剂是常见的免疫增强剂，主要有氢氧化铝和磷酸铝，其中氢氧化铝使用最广泛，已经有近百年的使用历史；
氢氧化铝佐剂为弱晶型勃姆石(poorly-crystalline boehmite，PCB)，是两性化合物，在生理pH值情况下使用时带正电荷；通过静电引力、疏水等作用力与抗原结合；氢氧化铝佐剂颗粒均匀细小，比表面积大，吸附率很高；其制备方法通常是向铝盐溶液中加入碱液，生成细小的铝化合物颗粒相互聚集、沉淀而成；在氢氧化铝佐剂颗粒配制过程中，受到反应体系的温度、pH值、反应物滴加速度等因素影响，使生产产物形成勃姆石结构，勃姆石又称软水铝石，结构为斜方板状，其结构的氢氧化铝颗粒比较适合用来吸附抗原颗粒；
疫苗制品不断发展，对疫苗所需佐剂的质量也提出了更高的要求；现有技术将氢氧化钠溶液滴加入氯化铝溶液中，滴加氢氧化钠时候，需要准确把握反应终点，氢氧化钠滴加过量会造成氢氧化铝溶解的问题，氢氧化钠滴加不够会使得产品最终pH过低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种亚微米至纳米级粒径可调氢氧化铝佐剂的制备方法，解决以上问题。
为达到以上目的，提供以下技术方案：
一种亚微米至纳米级粒径可调氢氧化铝佐剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：准备并清洗实验器具，灭菌后降温至室温待用；
步骤二：称取固体Na0H，置于烧杯中并配制成0.1～0.3mol/L的溶液，备用，称取AlCl3，置于烧杯中并配制成0.1～0.15mol/L的溶液，备用；
步骤三：将Na0H溶液加入三口烧瓶中，打开机械搅挫器并调节转速为200r/min，均匀搅拌Na0H溶液，保持Na0H溶液的温度在60±2℃；
采用多点滴加装置向三口烧瓶中多点滴加三氯化铝溶液，滴加速度为1～2mL/min，同时检测混合液pH的变化，当混合液pH达到8.0～8.5时，降低三氯化铝的滴加速度，当混合液pH达到7.0～7.5时暂停滴加，搅拌三口烧瓶中混合液半小时后继续滴加三氯化铝溶液，当混合液pH值达到6.5～7.0时，停止滴加，保温搅拌混合液；
步骤四：维持三口烧瓶中混合液反应体系在60±2℃，保持搅拌速度并保温搅拌2小时后，升温至80℃，陈化2小时，停止加热自然降温至室温后，静置至混合液分层；
步骤五：分离混合液上层清液，将下层液体放入透析袋，用纯化水流水透析2天，透析过程中每日揉和透析袋3次，混匀袋中的氢氧化铝；
步骤六：将透析后的物料利用高压均质机进行均质，采用500～600bar均质，控制粒径大小，检测达到预期粒径后停止均质，转移物料至烧瓶中；
步骤七：将物料控制在50～60℃减压浓缩，根据投料量计算铝元素含量，将物料浓缩至目标浓度后在搅拌速度为300rpm的条件下搅拌60min，搅拌后将物料分装至容器内，在121℃下进行30min湿热灭菌，得到特定粒径的氢氧化铝佐剂，无菌分装保存备用。
优选地，所述多点滴加装置包括：沿其表面贯穿开设有滴加孔的盘体、定位柱以及滴加管路，所述定位柱的一端对应固定连接于盘体的中部位置，所述定位柱的另一端缩径设置，并沿盘体表面外法线的方向向外延伸，所述滴加孔以定位柱为轴心环设于盘体上。
本发明的有益效果为：
(1)本发明中的铝佐剂本由于具有极佳的悬浮稳定性，易于分散，结构蓬松，保证了其在疫苗生产应用过程中得到均一性更好的产品，本发明通过改变滴加顺序，不同于上述专利将氢氧化钠滴加入三氯化铝的顺序，采取了将三氯化铝滴加入氢氧化钠溶液中，避免了氢氧化钠滴加过量溶解氢氧化铝的问题，同时采用均质后处理，可控制粒径大小，经过浓缩后可得到期望的浓度，适用不同的抗原需求，解决了反应终点控制的难点，使粒子的粒径可控，使其粒径均一性好，降低粒径参数PDI，产品浓度可控，最高至10.0mg/mL左右，且理化参数不受影响；
(2)本发明仅涉及一个自制的多点喷嘴，使反应更充分，pH控制即时性好，且对生产成本无增加，本发明所配制的佐剂颗粒粒径可为纳米级别，同时可进行调整可以有效提高不同抗原的免疫原性，本发明均质浓缩后配制的佐剂性质稳定，能在较宽的pH范围内保持其颗粒稳定性。
附图说明
图1为本发明的流程示意图；
图2为多点滴加装置的结构示意图；
图3为20230901批次产品粒径测定结果图；
图4为20230902批次产品粒径测定结果图；
图5为20230903批次产品粒径测定结果图；
图6为20230904批次产品粒径测定结果图；
图7为20230901-20230904批次铝佐剂与丹麦铝佐剂(InvivoGen铝佐剂)动物实验结果对比图；
图中：
1-盘体，101-滴加孔，2-定位柱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1-7所示，一种亚微米至纳米级粒径可调氢氧化铝佐剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：准备并清洗实验器具，灭菌后降温至室温待用；
步骤二：称取固体Na0H，置于烧杯中并配制成0.1～0.3mol/L的溶液，备用，称取AlCl3，置于烧杯中并配制成0.1～0.15mol/L的溶液，备用；
步骤三：将Na0H溶液加入三口烧瓶中，打开机械搅挫器并调节转速为200r/min，均匀搅拌Na0H溶液，保持Na0H溶液的温度在60±2℃；
采用多点滴加装置向三口烧瓶中多点滴加三氯化铝溶液，滴加速度为1～2mL/min，同时检测混合液pH的变化，当混合液pH达到8.0～8.5时，降低三氯化铝的滴加速度，当混合液pH达到7.0～7.5时暂停滴加，搅拌三口烧瓶中混合液半小时后继续滴加三氯化铝溶液，当混合液pH值达到6.5～7.0时，停止滴加，保温搅拌混合液；本发明中的铝佐剂本由于具有极佳的悬浮稳定性，易于分散，结构蓬松，保证了其在疫苗生产应用过程中得到均一性更好的产品，本发明通过改变滴加顺序，不同于上述专利将氢氧化钠滴加入三氯化铝的顺序，采取了将三氯化铝滴加入氢氧化钠溶液中，避免了氢氧化钠滴加过量溶解氢氧化铝的问题，同时采用均质后处理，可控制粒径大小，经过浓缩后可得到期望的浓度，适用不同的抗原需求，解决了反应终点控制的难点，使粒子的粒径可控，使其粒径均一性好，降低粒径参数PDI，产品浓度可控，最高至10.0mg/mL左右，且理化参数不受影响；
步骤四：维持三口烧瓶中混合液反应体系在60±2℃，保持搅拌速度并保温搅拌2小时后，升温至80℃，陈化2小时，停止加热自然降温至室温后，静置至混合液分层；
步骤五：分离混合液上层清液，将下层液体放入透析袋，用纯化水流水透析2天，透析过程中每日揉和透析袋3次，混匀袋中的氢氧化铝；
步骤六：将透析后的物料利用高压均质机进行均质，采用500～600bar均质，控制粒径大小，检测达到预期粒径后停止均质，转移物料至烧瓶中；
步骤七：将物料控制在50～60℃减压浓缩，根据投料量计算铝元素含量，将物料浓缩至目标浓度后在搅拌速度为300rpm的条件下搅拌60min，搅拌后将物料分装至容器内，在121℃下进行30min湿热灭菌，得到特定粒径的氢氧化铝佐剂，无菌分装保存备用；
在一些实施例中，多点滴加装置包括：沿其表面贯穿开设有滴加孔101的盘体1、定位柱2以及滴加管路，定位柱2的一端对应固定连接于盘体1的中部位置，定位柱2的另一端缩径设置，并沿盘体1表面外法线的方向向外延伸，滴加孔101以定位柱2为轴心环设于盘体1上，本发明仅涉及一个自制的多点喷嘴，使反应更充分，pH控制即时性好，且对生产成本无增加，本发明所配制的佐剂颗粒粒径可为纳米级别，同时可进行调整可以有效提高不同抗原的免疫原性，本发明均质浓缩后配制的佐剂性质稳定，能在较宽的pH范围内保持其颗粒稳定性；
实施例1：
1.实验目的：颠倒滴加底物合成氢氧化铝佐剂，利用动物实验进行免疫效果比对；
2.实验批号：20230901-20230904
3.实验原料：无水三氯化铝(国药集团化学试剂有限公司)批号：20220106、氢氧化钠(国药)批号：20220120、丹麦铝佐剂(InvivoGen)
4.实验仪器及设备：三口烧瓶、温度计(0-100℃)、四氟搅拌桨、玻璃棒、通风柜；
悬臂式机械搅拌器(常州润华)、集热式磁力搅拌器(巩义予华)、多参数测试仪(METTLER TOLEDO)、旋转蒸发器(上海亚荣)、高压均质机(ATS-AH-1500)、双人双面洁净工作台(苏净安装SW-CJ-2F)、灭菌柜(立式压力蒸汽灭菌器-YXQ-100G)、电热鼓风干燥箱(上海博讯-GZX-9246MBE)蠕动泵(MILLIPORE)；
电子天平(METTLER TOLEDO)ME204-T
5.实验步骤：
5.1.开展20230901批次试验，将需在小试种使用的三口烧瓶、烧杯及药勺等干热灭菌，温度计、搅拌桨、滴加管泡碱处理，临用前用纯化水洗涤待用；
5.2.称取1.2015g氢氧化钠于烧杯中，少量纯化水溶解后加水稀释至100ml，混合均匀放凉后备用；
5.3.称取1.3311g无水氯化铝于烧杯中，于通风柜内少量水溶解，溶解过程中有白烟及放热现象，后加水稀释至100ml，混和均匀放凉后转入三口烧瓶中，升温至60±2℃，开启搅拌200r/min；
5.4.将氢氧化钠溶液利用蠕动泵泵入滴加管(提前对管路打孔，使其滴加分布均匀)进行匀速滴加，滴加速度约为2ml/min，反应温度60±2℃，搅拌200r/min；根据反应温度调整滴加速度，使反应温度保持60±2℃，随着滴加进行，溶液逐渐出现白色浑浊，逐渐增多，利用PH试纸进行PH检测，待其PH值约为5.0～6.0时，降低其滴加速度，利用多参数测试仪进行PH测定，当PH值为7.0时，停止滴加保持60℃搅拌30min，再次进行PH值测定，PH值6.8，再次缓慢滴加氢氧化纳溶液至PH值为7且停止滴加搅拌30min且PH值不变后，维持反应体系在60±2℃，保持搅拌速度、保温搅拌2小时后，升温至80℃陈化2小时后，停止加热自然降温至室温后静置过夜；
5.5.同时开展20230902批次试验，称取1.2175g氢氧化钠，1.3091g无水氯化铝按5.1-5.4中操作进行；
5.6.另开展20230903批次试验，称取1.3216g无水氯化铝至于烧杯中，少量纯化水溶解后加水稀释至100ml，混合均匀放凉后备用；
5.7.称取1.2099g氢氧化钠于烧杯中，少量水溶解后加水稀释至100ml，放凉后转入三口烧瓶中，升温至60±2℃，开启搅拌200r/min；
5.8.将无水氯化铝溶液利用蠕动泵泵入滴加管(提前对管路打孔，使其滴加分布均匀)进行匀速滴加，滴加速度约为2ml/min，反应温度60±2℃，搅拌200r/min；观察反应温度调整滴加速度，使其保持60±2℃，随着滴加进行，溶液逐渐出现白色浑浊，逐渐增多，进行PH监控，待其PH值为8.0～8.5时，降低其滴加速度，继续监测当PH值为7时，停止滴加搅拌30min后PH值不变后，维持反应体系在60±2℃，保持搅拌速度、保温搅拌2小时后，升温至80℃陈化2小时后，停止加热自然降温至室温后静置过夜；
5.9.同时开展20230904批次，称取1.2075g氢氧化钠，1.2998g无水氯化铝按5.6-5.8中操作；
5.10.次日对上述分离上层清液；将下层液体放入透析袋，用纯化水流水透析，透析过程中每日揉和透析袋3次，混匀袋中的氢氧化铝，进行透析2天；
5.11.透析后的20230901、20230903摇匀后，利用高压均质机进行匀质压力500bar，均质五次，测定产品粒径后转移物料至烧瓶中，测定结果分别如图3和图4所示；
5.12.透析后的20230902、20230904摇匀后，利用高压均质机进行匀质压力600bar，均质五次后，测定产品粒径后转移物料至烧瓶中；测定结果分别如图5和图6所示；
5.13.将20230901、20230902、20230903、20230904物料控制在60℃减压浓缩，根据投料量预估铝元素含量，浓缩至目标体积后检测铝元素含量，以搅拌速度为300rpm条件下搅拌60min，搅拌后将氢氧化铝溶液分装至容器内，121℃、30min湿热灭菌保存备用；
5.14.动物实验开展：实验动物SPF级4周龄的NIH小鼠，22～24g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，实验动物处置符合动物伦理学原则；
5.15.免疫效果评价：
疫苗制备：抗原浓度为40μg/ml，氢氧化铝凝胶佐剂浓度为1.00mg/ml；将不同氢氧化铝佐剂分组与新冠抗原配制成疫苗，4℃冷藏备用；
取用NIH小鼠，分为6组，分别用于20230901、20230902、20230903、20230904、丹麦铝佐剂(InvivoGen)以及空白对照批次，按照0周免疫一次、2周免疫一次，免疫时长共4周后，采血分离血清，elisa法测抗体；
结果分析：如图7所示，通过实验对比20230901、20230902批次采用三氯化铝溶液作为底物滴加氢氧化钠溶液进行合成氢氧化铝佐剂，粒径检测的PDI值与动物实验检测OD平均值均逊于20230903、20230904批次采用作氢氧化钠溶液为底物滴加三氯化铝溶液进行合成的氢氧化铝佐剂，同时与丹麦铝佐剂(InvivoGen)进行比较，可以发现20230903、20230904铝佐剂免疫效果相当且各数据平均行较好。
Claims (2)
1.一种亚微米至纳米级粒径可调氢氧化铝佐剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：准备并清洗实验器具，灭菌后降温至室温待用；
步骤二：称取固体Na0H，置于烧杯中并配制成0.1～0.3mol/L的溶液，备用，称取AlCl3，置于烧杯中并配制成0.1～0.15mol/L的溶液，备用；
步骤三：将Na0H溶液加入三口烧瓶中，打开机械搅挫器并调节转速为200r/min，均匀搅拌Na0H溶液，保持Na0H溶液的温度在60±2℃；
采用多点滴加装置向三口烧瓶中多点滴加三氯化铝溶液，滴加速度为1～2mL/min，同时检测混合液pH的变化，当混合液pH达到8.0～8.5时，降低三氯化铝的滴加速度，当混合液pH达到7.0～7.5时暂停滴加，搅拌三口烧瓶中混合液半小时后继续滴加三氯化铝溶液，当混合液pH值达到6.5～7.0时，停止滴加，保温搅拌混合液；
步骤四：维持三口烧瓶中混合液反应体系在60±2℃，保持搅拌速度并保温搅拌2小时后，升温至80℃，陈化2小时，停止加热自然降温至室温后，静置至混合液分层；
步骤五：分离混合液上层清液，将下层液体放入透析袋，用纯化水流水透析2天，透析过程中每日揉和透析袋3次，混匀袋中的氢氧化铝；
步骤六：将透析后的物料利用高压均质机进行均质，采用500～600bar均质，控制粒径大小，检测达到预期粒径后停止均质，转移物料至烧瓶中；
步骤七：将物料控制在50～60℃减压浓缩，根据投料量计算铝元素含量，将物料浓缩至目标浓度后在搅拌速度为300rpm的条件下搅拌60min，搅拌后将物料分装至容器内，在121℃下进行30min湿热灭菌，得到特定粒径的氢氧化铝佐剂，无菌分装保存备用。
2.根据权利要求1所述的亚微米至纳米级粒径可调氢氧化铝佐剂的制备方法，其特征在于：所述多点滴加装置包括：沿其表面贯穿开设有滴加孔的盘体、定位柱以及滴加管路，所述定位柱的一端对应固定连接于盘体的中部位置，所述定位柱的另一端缩径设置，并沿盘体表面外法线的方向向外延伸，所述滴加孔以定位柱为轴心环设于盘体上。
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