CN115175980A - 从固体中连续重构工艺材料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了按需重构固体工艺材料的系统和方法。所述系统包括用于连续给料所述固体工艺材料的给料设备、混合容器、可选地储罐、可选地一个或多个混合反应器和可选地无菌过滤单元，其中所述系统配置为连续运行。

Description

从固体中连续重构工艺材料

说明

技术领域

本发明涉及连续重构工艺材料的系统和方法。

背景技术

例如细胞培养基、缓冲液、基质、储备溶液、营养素、盐、聚合物、化学品或添加剂的工艺材料在化学、生物技术和食品工业中至关重要。

这种工艺材料通常由液体(如储备溶液)重构而成。然而，液体需要大的存储空间和/或储罐尺寸，并且保质期有限，例如这是由于溶解化合物的稳定性或光敏性。因此，必须定期订购液体，并且液体优选在特殊条件下存储，例如制冷。此外，液体的运输成本很高，而且其搬运需要大量劳动力。

为了减少存储空间和/或储罐尺寸，可以使用浓缩储备溶液。然而，储备溶液浓度受待溶解化合物的溶解度限制。

为了优化供应链，购买固体形式的工艺材料是有益的，因为固体(例如粉末或颗粒)价格较低，保质期较长，并且需要较少的存储空间。然而，固体工艺材料需要重构成液态，并且通常需要灭菌，例如用于生物技术。

固体工艺材料的重构通常需要几个步骤，包括添加溶剂、调整例如浓度、PH值、添加剂等参数，并且最后对重构后的工艺材料进行灭菌。对生物技术中的重构工艺材料进行灭菌是特别重要的，例如通过将液体通过无菌过滤器进行灭菌。

通常，固体工艺材料以分批方式重构，并以分批方式或通过在线混合系统添加至相应的反应器中。

WO2017087040A1公开了用于重构粉末细胞培养基的混合装置，该装置以分批模式运行。

当前的趋势，例如生物制药行业朝着产物的连续生产方向发展，导致对相应工艺材料的需求不断增加。工艺材料的大规模分批重构会导致较高的存储成本和劳动力成本，而少量的重复分批重构可能会由于例如人为错误或工艺材料质量的变化而导致较差的再现性。特别是，分批工艺材料重构需要在将材料转移至反应器之前为重构材料设置储罐。储罐在成本、占地面积和缺少灵活性方面限制了工艺发展，尤其是在连续工艺中。

因此，需要连续重构工艺材料的方法。这种方法仍然处于初级阶段。WO2019007786A1描述了在反应介质中连续溶解固体的工艺，其中固体以固定床的形式提供，该工艺旨在溶解化学工业中使用的难溶性添加剂。

WO2013056469A1公开了以分批模式制备细胞培养皿培养基和细胞培养皿的系统。US5362642A公开了细胞培养皿容纳系统，其中将粉末细胞培养基和其他成分引入混合袋中，在混合袋中混合，然后从混合袋输送至正在灭菌的存储袋中。CN108893406A公开了微生物发酵定量生产系统和方法。

然而，仍然需要方便且易于操作的系统，以允许连续重构固体工艺材料，例如固体生物工艺材料。

发明内容

本发明的目的是提供连续重构工艺材料的系统和方法。

该目的由所要求保护的主题解决，并在此进一步公开。

本发明提供按需重构固体工艺材料的系统，包括

a.给料设备，用于连续给料所述固体工艺材料；

b.混合容器；

c.可选地，储罐；

d.可选地，一个或多个混合反应器；

e.可选地，无菌过滤单元；和

其中，所述系统配置为连续运行。

给料设备的技术效果是向混合容器中连续添加固体工艺材料。混合容器的技术效果是提供其中添加有固体工艺材料的液体，用于重构工艺材料。储罐的技术效果是提供液体，并将液体添加至混合容器中。混合反应器的技术效果是改善工艺材料的重构。无菌过滤单元的技术效果是对重构的工艺材料进行灭菌。

在本文描述的一个实施方案中，通过调节步骤b)的所述给料设备，可以在运行期间直接调节给料速度。

在本文描述的一个实施方案中，所述系统连接至反应器。在一个方面，反应器是生物反应器，具体地是以分批模式、补料分批模式或连续模式运行的发酵生物反应器。在另一个方面，所述反应器是用于存储重构的工艺材料的储罐。在又一个方面，所述反应器是反应容器，优选用于下游处理的反应容器。

根据一个方面，所述固体工艺材料是有机或无机材料或其组合。根据具体的方面，所述固体工艺材料选自由细胞培养基、缓冲液、营养素、添加剂、基质、盐、聚合物、化学品和/或散装材料(bulk material)或其任何组合组成的组。在另一个方面，所述固体工艺材料是细胞培养基或化学定义的细胞培养基或基本化学定义的细胞培养基。具体地，所述化学定义的细胞培养基可包含碳水化合物、氨基酸、维生素、脂肪酸、无机盐、生长因子、微量元素、蛋白质、肽、核酸、聚合物和/或有机盐中的任何一种或多种。

在本文描述的另一个实施方案中，所述固体工艺材料是缓冲液，例如用于生物处理的缓冲液，或用于化学处理的缓冲液。具体地，所述缓冲液可包含磷酸盐、硫酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、丙二酸、甲酸、丁二酸、丙二酸、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷、氨基甲烷、HEPES MES、MOPS、HEPPS BICINE、组氨酸、谷氨酸精氨酸、琥珀酸盐、柠檬酸盐、N-甲基哌嗪、哌嗪、咪唑、三乙醇胺、二乙醇胺、乙醇胺、1,3-二氨基丙烷、哌啶或其任何组合、或任何其他合适的矿物酸或有机酸缓冲液中的任何一种或多种。

根据本发明的一个方面，所述固体工艺材料以粉末、浆液、晶体、有机聚合物、无机聚合物或颗粒的形式提供。在一个方面，所述固体工艺材料是粉末或颗粒。

在本文描述的一个实施方案中，所述给料设备选自包括螺旋输送机、挤出机、板式输送机、气动输送机、辊式输送机、带式输送机、造粒机、复合机、重力给料机、声学和超声波振动输送机、旋转输送机、电磁输送机、垂直输送机的组。所述固体工艺材料由所述给料设备通过任何机制添加至所述混合容器中，所述任何机制为例如重力、声振动、超声波振动、脉冲惯性力、声辐射力、电磁力、真空力、重量、挡板、皮带、滚筒、旋转、垂直运动或其任何组合。

在另一个实施方案中，给料斗连接至所述给料设备。

在另一个实施方案中，所述给料设备由电机驱动，并且所述给料速度由所述电机调节，其中所述电机包括直流电机、交流电机和其他电机，例如步进电机、无刷电机、磁阻电机、通用电机。

在本文描述的系统的一个实施方案中，所述给料设备包括在封闭环境中。

在本文描述的系统的另一个实施方案中，所述封闭环境被具有过压或没有过压的气体冲洗。

根据一个方面，本文描述的系统包括一个或多个作为混合反应器的管式反应器。优选地，所述系统包括一个或两个彼此连接且连续运行的管式反应器。所述管式反应器的技术效果是提供具有塞流剖面且无移动部件的混合设备，该混合反应器可堆叠，因此可伸缩，与非管式反应器相比，可缩短重构时间，缩短工艺持续时间。

在一个实施方案中，本文描述的所述系统包括一个或多个用于评估一个或多个工艺参数的集成传感器。所述一个或多个集成传感器的技术效果是允许在线评估一个或多个工艺参数。在一个方面，所述一个或多个工艺参数选自包括温度、PH、液体流速、重构工艺材料的流速、所述给料设备的给料速度、重构工艺材料的浓度、重构工艺材料的光谱特性、液体的电导率、重构工艺材料的电导率、氧化还原电位、压力、空气湿度和生物量的组。

具体地，所述集成传感器选自包括温度传感器、PH传感器、流速传感器、浓度传感器、荧光传感器、红外光传感器、单色光非弹性散射传感器、电导率传感器、氧化还原电位传感器、压力传感器、空气湿度传感器和生物量传感器，或其任何组合的组。在一个方面，所述系统还包括一个或多个用于控制和调整工艺参数的单元，例如温度控制单元、PH控制单元、流速控制单元或压力控制单元。

在一个实施方案中，本文描述的所述系统是一次性和/或一次性使用的系统。一次性和/或一次性使用的系统的技术效果是，由于避免灭菌、清洁和维护步骤带来的工艺时间、劳动力和成本的减少，减少污染风险，并与一次性生产系统(例如生物制药行业)兼容。

本发明还提供了在连续模式下按需重构工艺材料的方法，包括以下步骤：

a.提供如本文描述的系统；

b.以连续模式向所述混合容器中添加固体工艺材料；

c.以连续模式向所述混合容器中添加液体；

d.使所述固体工艺材料在所述混合容器中溶解在所述液体中和/或与所述液体混合，以提供重构的工艺材料；和

e.以连续模式将所述重构的工艺材料转移至所述反应器。

在一个方面，所述液体选自包括水、溶解或部分溶解在溶剂中的缓冲液、溶解或部分溶解在溶剂中的化学定义的介质和/或回收的工艺物料流，其中所述液体由储罐或反应器提供。根据一个具体方面，所述液体是水，并且由储罐提供。根据另一个具体方面，所述液体是溶解或部分溶解在水中的缓冲液，并且由储罐提供。根据又一个具体方面，所述液体是由反应器提供的工艺物料流，本文所述系统连接至所述反应器。在一个方面，这种反应器是生物反应器，优选为发酵生物反应器。在另一个方面，所述反应器为用于存储所述重构的工艺材料的储罐。在又一个方面，所述反应器是反应容器，优选为用于下游处理的反应容器。

在本文描述的方法的一个实施方案中，所述固体工艺材料是有机或无机材料，或其组合。根据一个具体方面，所述固体工艺材料选自包括细胞培养基、缓冲液、营养素、添加剂、基质、盐、聚合物、化学品和/或散装材料或其任何组合的组。在一个方面，所述固体工艺材料是细胞培养基，或化学定义的细胞培养基、或基本化学定义的细胞培养基。具体地，所述化学定义的细胞培养基可包含碳水化合物、氨基酸、维生素、脂肪酸、无机盐、生长因子、微量元素、蛋白质、肽、核酸、聚合物和/或有机盐中的任何一种或多种。在本文描述的方法的另一个优选实施方案中，所述固体工艺材料为缓冲液，例如用于生物处理的缓冲液，或用于化学处理的缓冲液。具体地，所述缓冲液可包含磷酸盐、硫酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、丙二酸、甲酸、丁二酸、丙二酸、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷、氨基甲烷、HEPESMES、MOPS、HEPPS BICINE、组氨酸、谷氨酸精氨酸、琥珀酸盐、柠檬酸盐、N-甲基哌嗪、哌嗪、咪唑、三乙醇胺、二乙醇胺、乙醇胺、1,3-二氨基丙烷、哌啶或其任何组合，或任何其他合适的矿物酸或有机酸缓冲液中的任何一种或多种。

根据本文描述的方法的一个方面，所述固体工艺材料以粉末、浆液、晶体、有机聚合物、无机聚合物或颗粒的形式提供。在一个方面中，所述固体工艺材料是粉末或颗粒。

根据本文描述的方法的另一个方面，所述连续运行模式执行至少12小时。

根据本文描述的另一种方法，避免了分批生产工艺介质。

在本文描述的一个实施方案中，所述反应器是生物反应器，所述生物反应器包括哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类或酵母；所述生物反应器生产产物。具体地，所述产物为肽、蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸、蛋白质缀合物、细胞代谢物、病毒、病毒样颗粒、外显子、微生物、细胞或组织。

在一个具体的实施方案中，所述生物反应器包含哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类或酵母中的任何一种，其中所述哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、藻类或酵母产生发酵产物，所述发酵产物选自包括肽、蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸、蛋白质缀合物和细胞代谢物的组。在一个方面，所述发酵产物是蛋白质，例如抗体或单克隆抗体。

在另一个具体实施方案中，所述生物反应器包括哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类或酵母，其中所述哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、藻类或酵母用作产品，例如用于细胞治疗。

在本文描述的一个具体方面中，所述工艺材料是化学定义的细胞培养基，所述生物反应器是包含产生发酵产物的哺乳动物细胞的发酵生物反应器。例如，所述哺乳动物细胞是CHO细胞，所述发酵产物是蛋白质，例如抗体或单克隆抗体。

附图说明

图1：用于重构固体工艺的系统，该系统显示了：包括储存罐和/或料斗的螺旋输送机，作为向混合容器中添加固体工艺材料的固体给料设备；连接至混合容器的储罐或WFI，用于向混合容器供应液体；混合容器，用于在液体中重构固体工艺材料；作为混合反应器的管式反应器，其连接至混合容器，用于改善工艺材料的重构；过滤单元，用于对重构工艺材料进行灭菌；和反应器，例如生物反应器、反应容器或储罐，重构工艺材料转移到反应器中。

图2：50、150、300和450rpm下固体介质给料的校准曲线。

图3：分批和连续重构基础培养基的PH(A)和渗透压(B)图谱。箭头表示通过移液增加体积，从而降低渗透压。

图4：存活细胞密度(VCD)(A)、存活率(B)、累积细胞总数(cIVCD，C)和指数期平均生长率(D)的图谱。误差条表示分批培养的生物四胞胎(quadruplet)(n＝4)以及连续培养的生物四胞胎(n＝2)。

图5：Glc(A)、渗透压(B)和Lac的最终浓度以及抗体浓度(D)的浓度图谱。误差条表示分批培养的生物四胞胎(n＝4)以及连续培养的生物四胞胎(n＝2)。

图6：连续或分批重构后非必需AA(A)和必需AA(B)的氨基酸(AA)图谱。误差条表示分批培养的生物四胞胎(n＝4)以及连续培养的生物四胞胎(n＝2)。

图7：第7天培养结束时非必需氨基酸(A)和必需氨基酸(B)的浓度图谱。误差条表示分批培养的生物四胞胎(n＝4)以及连续培养的生物四胞胎(n＝2)。

图8：化学定义的介质在12小时内的连续按需重构的pH值(▲)、电导率(■)、UV吸收率(280nm，●)的监测。虚线框表示由于封闭环境内相对湿度升高而导致系统暂时失效。由于可视化目的，数据点的数量减少了(n＝29108个数据点)。

图9：固体培养基长期给料的校准曲线和线性回归。为了说明，减少了数据点的数量(n＝727)。

图10：长期连续按需和分批重构培养基中单个非必需氨基酸(A)和必需氨基酸(B)的相对丰度。长期重构和稀释分批培养基(C、D)后的单个氨基酸谱浓度。

图11：(A)活细胞密度、(B)存活率、(C)葡萄糖和(D)乳酸的图谱(n＝2)。

图12：收获连续按需或分批培养的CHO-K1细胞当天非必需AA(A)和必需AA(B)的AA图谱。

图13：完整mAb的无鞘CE-MS。(A)连续按需重构样本和(B)分批重构样本的反褶积质谱，这些样本来自无鞘CE-MS分离后的受控环境。插图显示了两个样本的基峰电泳图。(C)使用连续按需重构培养基(黑色)或分批重构培养基(白色)生产的mAb糖型的相对丰度。

图14：五种不同缓冲液在不同电机转速(A)下的重构和氯化钠在五种不同电机转速下的重构。

图15：直接从固体缓冲液组分原位制备盐梯度，用于分离两种蛋白质。

图16：由设备(黑色)和常规色谱工作站

(虚线)执行的不同长度的盐洗脱梯度，用于在1mL(A、C、D)和10mL CV(B)下分离两种蛋白质。

图17：设备(黑色)和常规色谱工作站

(虚线)使用咪唑执行的阶梯洗脱梯度，用于蛋白质(A)的色谱纯化和咪唑(B)的洗脱曲线。

具体实施方式

本发明涉及用于连续重构工艺材料的系统和方法。

除非另有指示或定义，否则本文中使用的所有术语都具有其在本领域的通常含义，这对技术人员来说是清楚的。

本文中使用的术语“重构(reconstitute)”和“重构(reconstitution)”是指通过添加液体并混合液体和固体以将固体材料转化为液体形式的过程。术语“重构(reconstituted)”描述通过重构产生的材料。本文使用的术语“固体(solid)”指脱水材料。本文使用的术语“液体(liquid)”指能够溶解、分配、悬浮、胶体悬浮、乳化或以其他方式混合固体材料的任何流体材料。例如，液体可包括水、溶剂(例如水)中溶解或部分溶解的缓冲液、溶剂(例如水)中溶解或部分溶解的化学定义介质和/或回收的工艺物料流。

一旦重构，固体材料可以是溶解、分散、悬浮、胶体悬浮、乳化或以其他方式混合在液体基质中的一种或多种。因此，所得重构材料可以以溶液、分散液、悬浮液、胶体悬浮液、乳液或均质混合物，或其任何组合为特征。

本文中使用的术语“连续的(continuous)”或“连续地(continuously)”是指在连续流基础上运行的过程，即与分批、间歇或顺序过程相比，在任何定义的时间段内未发生的过程。连续过程的产物通常也会从过程中连续取出。分批处理过程与通常在指定时间段内进行的连续过程形成对比，在分批处理过程之后，产物才从过程中取出。在本发明的实施方案中，术语“连续的(continuous)”、“连续地(continuously)”等可表示为在混合容器中以这样的方式重构固体工艺材料的模式，以便在本文描述的系统中连续生产重构工艺材料，并将重构工艺材料连续转移出混合容器。

本文中使用的术语“工艺材料”理解为用于化学和/或生物工艺中的材料。例如，工艺材料可包括有机和/或无机材料，或其任何组合。术语“有机材料”应指包含有机碳分子的材料或由有机碳分子组成的材料。有机材料的非限制性实例包括醇、酮、醛、脂肪酸、酯、羧酸、醚、碳水化合物、氨基酸、肽、蛋白质、脂质、单糖、低聚糖、多糖、核酸、有机盐和有机聚合物，例如热塑性体、弹性体或树脂。术语“无机材料”通常指不是有机化合物或有机材料的材料。无机材料的非限制性实例包括矿物、盐、金属和无机聚合物。

具体地，工艺材料选自包括细胞培养基、缓冲液、营养物、添加剂、基质、盐、聚合物、化学品和/或散装材料或其组合的组。在优选实施方案中，工艺材料是细胞培养基，甚至更优选为化学定义的细胞培养基。术语“细胞培养基”在本文中被理解为用于培养含有碳/能量源，和维持细胞存活率、支持增殖、生长和/或发酵产物生产(例如通过碳源的生物转化)的营养素的细胞的培养基。本文中使用的术语“细胞培养基”还包括浓缩的细胞培养基(“给料培养基”)。术语“化学定义的细胞培养基”是指由不含动物源性成分组成的细胞培养基。化学定义的细胞培养基可包含以下任意适当组合：碳水化合物(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖和果糖)、氨基酸、维生素、脂肪酸、无机盐、生长因子、微量元素、蛋白质、肽、核酸、聚合物和/或有机盐。

在另一个实施方案中，工艺材料是缓冲液，本文理解为通过其共轭酸-碱范围的作用抵抗PH变化的溶液。这种缓冲液包括强酸或弱酸或强碱或弱碱的盐、带电氨基酸或胺和/或两性离子缓冲液(Good's buffers)，本文理解为用于生物化学和生物应用的缓冲液。一些缓冲成分在室温下可能是固体。含有钠、铵和钾离子的盐通常用于制备缓冲液。合适缓冲液的非限制性实例包括磷酸盐、硫酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、丙二酸、甲酸、丁二酸、丙二酸、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷、氨基甲烷、HEPES MES、MOPS、HEPPSBICINE、组氨酸、谷氨酸精氨酸、琥珀酸盐、柠檬酸盐、N-甲基哌嗪、哌嗪、咪唑、三乙醇胺、二乙醇胺、乙醇胺、1,3-二氨基丙烷、哌啶，或其任何组合，或任何其他合适的矿物酸或有机酸缓冲液。所述缓冲液用于控制PH值。

在另一个实施方案中，工艺材料是添加剂，本文理解为以相对少量添加至生物技术或化学工艺中的物质或物质混合物，例如，为了赋予或改善所需性质或抑制所需性质，或产生相变。添加剂可用作蛋白质沉淀和结晶或絮凝的沉淀剂。添加剂的非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)、二价离子、锌、钙、硫酸铵、硫酸钾、糖和其他多元醇。

在本文描述的一个方面中，固体工艺材料以粉末、浆液、晶体、有机聚合物、无机聚合物或颗粒的形式提供。优选地，固体工艺材料为粉末或颗粒。粉末在本文中被理解为可流动材料，优选密度在0.02g/mL至3g/mL范围内，更优选密度在0.1g/mL至0.7g/mL范围内。

本文中描述的用于连续重构工艺材料的系统包括固体工艺材料、给料设备、混合容器、可选地储罐、可选地一个或多个混合反应器和可选地无菌过滤单元。根据本发明的系统配置为连续运行。

本文描述的系统包括至少一个给料设备。所述给料设备位于系统中，以便将固体工艺材料转移至混合容器中。给料设备可例如位于混合容器上方，也可(或不可以)与混合容器直接(物理的)接触。合适的给料设备的非限制性实例包括分配器、螺旋输送机、挤出机、板式输送机、气动输送机、辊式输送机、带式输送机、造粒机、复合机、重力给料机、声学和超声波振动输送机、旋转输送机、电磁输送机、垂直输送机。给料设备允许固体工艺材料通过任何机制进行连续移动，机制例如重力、声振动、超声波振动、脉冲惯性力、声辐射力、电磁力、真空力、重量、挡板、皮带、滚筒、旋转、垂直移动或其任何组合。在一个方面，给料设备是螺旋输送机。在本文描述的具体实施方案中，如图1所示，给料设备是位于混合容器上方但未直接连接至混合容器的螺旋输送机，并且材料通过重力转移至混合容器。

混合容器允许在液体中重构固体工艺材料，混合容器可包含选自由机械搅拌器、电磁搅拌器、潜水搅拌器和生物搅拌器组成的组中的一个或多个混合元件。合适的混合容器的体积可在0.04L至8000L之间。非限制性实例包括0.04L、0.1L、0.5L、1L、5L、10L、50L、70L、100L、200L、300L、400L、500L、1000L、1500L、2000L、3000L、4000L、5000L、6000L、7000L或8000L的体积。

具体地，本文描述的系统包括一个或多个泵，用于将重构的工艺材料从混合容器中连续输送出来。合适的泵的非限制性实例包括蠕动泵、活塞泵、真空泵、螺杆泵、齿轮泵和偏心螺杆泵。

具体地，将重构的工艺材料的液体连续转移至混合容器。具体地，液体可在范围为每天0.1至4个混合容器体积交换的流速下转移，或在每天50个混合容器体积交换的流速下转移。液体可从储罐或本文描述的系统连接的反应器供应。如果液体由反应器供应，则所述液体优选为回收的工艺物料流。

在一个实施方案中，本文描述的系统包括储罐，该储罐包含液体，工艺材料将在该液体中被重构。例如，所述液体可包括水、溶解或部分溶解于溶剂(例如水)中的缓冲液，或溶解或部分溶解于溶剂(例如水)中的化学定义介质。所述储罐例如通过一个或多个合适的管道连接至混合容器。通过一个或多个合适的管道将储罐与混合容器连接起来对技术人员而言是显而易见的。在一个方面，所述储罐的体积在0.1L至1000L的范围内。非限制性实例包括0.1L、0.5L、1L、2L、5L、10L、50L、100L、150L、200L、300L、400L、500L、600L、700L、800L、900L或1000L的体积。具体地，系统还可额外包括一个或多个泵，用于将所述液体连续输送至混合容器。

本文描述的系统可选地包括一个或多个连续运行的混合反应器，其中第一混合反应器连接至混合容器，并且任何其他混合反应器彼此连接并成排放置。混合容器与第一混合反应器之间的连接和/或混合反应器之间的连接例如由一个或多个合适的管道提供。可通过一个或多个泵将重构的工艺材料从混合容器转移至第一混合反应器和任何其他混合反应器，优选在每天0.1至4个容器交换的流速范围进行。所述一个或多个混合反应器可以是管式反应器、连续搅拌槽式反应器或其组合。所述一个或多个混合反应器允许工艺材料的完全重构，例如在重构难溶性工艺材料的情况下。这种混合反应器的体积通常在0.04L至200L的范围内。非限制性实例包括0.04L、0.1L、0.5L、1L、5L、10L、20L、30L、40L、50L、75L、100L、125L、150L、175L或200L的体积。

参考图1，根据本文描述的具体实施例的系统包含作为混合反应器的管式反应器。管式反应器的优点是塞流剖面和避免移动部件，从而降低了技术复杂性的风险。管式反应器可缩短重构时间，并且缩短工艺持续时间，并实现更好的混合。在本文描述的具体实施方案中，管式反应器是可堆叠的，并且因此可根据用户需求进行伸缩，与传统重构工艺相比，允许减少运行占地面积。

根据本发明的系统可通过包括但不限于3D打印、增材制造、减影制造、注塑或其任何组合的任何方法制造。本文描述的系统的每个部分可包括或由任何材料组成，材料包括但不限于金属、合金(例如不锈钢)、塑料、玻璃、陶瓷或其组合。优选地，如本文描述的系统包括不锈钢。

在另一个实施方案中，本文描述的系统是一次性和/或一次性使用的系统，其由一次性材料组成，一次性材料为例如聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、硅树脂或乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)，或其任何组合，或任何其他一次性材料。一次性系统的优点包括避免了灭菌、清洁和维护步骤，由于生产率的提高，减少了工艺时间，减少了劳动时间、成本和材料，例如避免了用大量的水进行清洁。一次性系统还需要更少的空间，降低污染风险，并与一次性生产系统兼容，例如在生物制药行业。

本文描述的系统可选地包括用于对重构的工艺材料进行灭菌的无菌过滤单元。所述过滤单元可以作为膜或过滤器提供，包括选自聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)、聚醚砜(PES)或任何其他合适材料的组中一种或多种材料。具体地，所述过滤单元可位于混合容器之后，并通过例如管道连接至混合容器。在另一个实施方案中，所述无菌过滤单元可放置在一个或多个混合反应器之后，并连接至混合反应器(例如通过管道)，例如如图1中的具体实施例所示。

在一个方面，根据本发明的系统包括一个或多个用于评估工艺参数的集成传感器。术语“集成的”传感器指集成在本文描述的系统内或其一部分的传感器。具体地，集成传感器可位于混合容器内部，储罐内部和/或可选的位于混合反应器之前、之后、下方或内部和/或可选的位于过滤单元之前或之后。集成传感器可方便地在线评估工艺参数。本文使用的术语“在线”是指与离线分析(包括为外部分析提取样本)相比，在不提取样本的情况下连续测量工艺参数的可能性。集成传感器的非限制性实例包括温度传感器、PH传感器、流速传感器、浓度传感器、荧光传感器、红外光传感器、单色光非弹性散射传感器(例如拉曼探针)、电导率传感器、氧化还原电位传感器、压力传感器、空气湿度传感器和生物质传感器。集成传感器允许评估工艺参数，例如温度、PH、液体的流速、重构的工艺材料流速、给料设备的给料速度、重构的工艺材料的浓度、重构的工艺材料的光谱特性、液体的电导率、重构的工艺材料的电导率、氧化还原电位、压力、空气湿度和生物质。

本文使用的术语“评估(assessment)”或“评估(assessing)”是指测量、分析和对确定的工艺参数作出反应。在一个方面，系统还包括一个或多个用于控制和调整工艺参数的单元，例如温度控制单元、PH控制单元、流速控制单元或压力控制单元。所述用于控制和调整工艺参数的一个或多个单元可以连接至所述集成传感器。

在一个实施方案中，如本文描述的系统连接至工业生物技术或化学工艺中使用的反应器，或可选地连接至多个反应器，该工艺可以是分批、补料分批或连续工艺。在一个方面，从所述反应器至本文描述的系统的混合容器还有一个连接，用于将回收的工艺物料流从反应器连续转移至混合容器，从而允许在所述回收的工艺物料流中重构工艺材料。

在一个实施方案中，所述反应器是用于生产例如肽、蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸、蛋白质缀合物、细胞代谢物、病毒、病毒样颗粒、外显子、微生物、细胞或组织的产物的生物反应器。具体地，所述生物反应器的典型体积范围为1L至50000L。非限制性实例包括1L、2L、3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L、10L、15L、20L、25L、30L、40L、50L、60L、70L、80L、90L、100L、150L、200L、250L、300L、350L、400L、450L、500L、550L、600L、650L、700L、750L、800L、850L、900L、950L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L、3500L、4000L、4500L、5000L、6000L、7000L、8000L、9000L、10000L、15000L、20000L和/或50000L的体积。

根据一个方面，生物反应器是发酵生物反应器，也称为“发酵器”或“发酵单元”，用于生产发酵产物，其中发酵生物反应器以分批、补料分批或连续模式运行。在发酵工艺的上下文中，术语“分批模式”在本文被理解为细胞培养工艺，通过该工艺，将少量细胞培养液添加至培养基中，并且在培养期间细胞无需添加额外培养基或排出培养液即可生长。发酵工艺中的“补料分批模式”是指从分批阶段的细胞生长开始，然后是“补料”阶段的培养技术，在“补料”阶段，细胞培养处于连续模式，其中细胞培养基连续添加(“补料”)至生物反应器中。发酵工艺中的“连续模式”是细胞培养工艺，其中在培养过程中不断添加和排出培养基。连续模式工艺的实例包括灌注和恒化器工艺。

根据本文描述的一个方面，所述发酵生物反应器包括产生发酵产物的哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类或酵母。发酵产物的非限制性实例可包括肽、蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸、蛋白质缀合物和细胞代谢物。在一个方面，发酵产物是蛋白质，例如抗体或单克隆抗体。

在具体实施方案中，本文描述的系统和方法用于连续重构细胞培养基或缓冲液，细胞培养基或缓冲液被连续转移至包含产生发酵产物的细胞的发酵生物反应器。在如实施例部分所述的具体实施例中，所述细胞培养基是基本化学定义的细胞培养基，并且所述生物反应器是包含产生单克隆抗体(例如免疫球蛋白G1)的CHO细胞的补料分批生物反应器。术语“基础”是指化学定义的细胞培养基，其设计用于支持生长，但不富含例如氨基酸。

根据另一方面，所述生物反应器是包含哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类或酵母的生物反应器，其中所述哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、藻类或酵母用作产物，例如用于细胞治疗。具体地，所述生物反应器是用于生产生物质(例如细胞、微生物、病毒、病毒样颗粒、外质体或组织)的生物反应器。在具体的实施方案中，本文描述的系统和方法用于连续重构细胞培养基或缓冲液，将细胞培养基或缓冲液连续转移至生物反应器中用于生物质生产。

在本文描述的另一个实施方案中，所述反应器是用于存储的重构工艺材料的储罐。所述储罐的体积可在0.02L至1000L之间的范围内。非限制性实例包括0.02L、0.05L、0.1L、0.5L、1L、5L、10L、20L、50L、70L、100L、150L、200L、300L、400L、500L、600L、700L、800L、900L或1000L的体积。

在具体的实施方案中，本文描述的系统和方法用于连续重构细胞培养基、缓冲液或储备溶液，细胞培养基或缓冲液被连续转移至储罐。

在另一个实施方案中，所述反应器是用于下游处理的反应容器。本文使用的术语“下游处理”是指在反应器中生产产物后进行的工艺步骤，以纯化或修饰所述产物。下游处理的非限制性实例是连续色谱或连续超滤或透析过滤、连续沉淀、絮凝、结晶或病毒灭活。在具体的实施方案中，本文描述的系统和方法用于连续重构缓冲液，该缓冲液连续转移至反应容器以进行下游处理。具体地，用于下游处理的反应容器是填充床(柱色谱)或搅拌槽反应器，例如与过滤器-透析过滤组合。

在另一个实施方案中，所述反应器是用于食品生产的反应容器。在具体的实施方案中，本文描述的系统和方法用于连续重构营养素或添加剂，该营养素或添加剂被连续转移至用于食品生产的反应容器中。

本发明提供了用于连续重构工艺材料的方法，包括以下步骤，提供如本文描述的系统，向如本文描述的混合容器中连续添加固体工艺材料，向如本文描述的混合容器中连续添加液体，持续使所述固体工艺材料在混合容器中与所述液体混合，以提供如本文描述的重构的工艺材料，以及可选地将重构的工艺材料连续转移至如本文描述的反应器中。

在一个方面，本文描述的方法还包括使用如本文描述的一个或多个集成传感器和/或控制单元评估和控制一个或多个工艺参数。

具体地，本文描述的系统和方法允许通过改变一个或多个参数，例如给料设备的给料速度、液体的流速、另一种工艺材料的给料速度、混合速度、温度和/或混合容器中液体的体积，而在连续重构期间改变工艺材料的组成。

在另一个方面中，料斗连接至本文呈现的本发明的给料设备。这种料斗可以添加至本文提供的给料设备中，以存储和添加用于按需重构的固体加工材料。

在另一个方面中，给料设备由电机驱动，给料速度可由所述电机调节。所述电机的非限制性实例可包括直流电机、交流电机和其他电机，例如步进电机、无刷电机、磁阻电机、通用电机。

在另一个方面中，本文使用的术语“给料速度”定义为每时间单位添加至混合容器中的工艺材料量，如果没有另行说明，则以单位g min^-1描述。

在另一个方面中，给料设备包括在封闭环境中。封闭环境可使用具有过压或没有过压的气体冲洗。这种封闭环境可以是本领域已知的任何材料和形状，用于为可被气体冲洗的设备提供封闭环境。这种封闭环境的非限制性实例可以是立方体或长方体塑料盒或任何其他材料和形状的封闭环境。

本发明的一个实施方案涉及如本文描述的方法，其中连续运行模式执行至少12小时。进一步设想的是，本发明的连续运行方法可执行至少2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周，或至少一个月。

本发明方法的另一个优点是避免了工艺介质的分批生产，从而降低了资本成本，减少了单个单元运行的占地面积。

根据实施例部分中描述的具体实施例，公开了由固体给料设备、混合容器、储罐和管式反应器组成的系统，用于直接从固体连续制备介质或缓冲液。这种设置的优点是，可以通过改变介质成分来实现例如连续工艺过程中重构材料成分的逐渐变化，并且因此可以防止溶解度、可用性和稳定性方面的限制。此外，直接从固体中促进材料的重构，因此，也可以通过减少缓冲液制备的占地面积来最小化环境影响。此外，通过使用工艺分析技术(PAT)和设计质量(QbD)，可以在线监测和控制工艺材料的重构。连续介质重组的另一优点是改进和优化了工艺，有可能提高产物质量。根据实施例部分中描述的具体实施方案，分批重构和连续重构基本化学定义的细胞培养基，并对产生两种不同单克隆抗体免疫球蛋白G1的两种CHO细胞系的工艺性能进行比较。选择中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，因为CHO细胞用于生产生物制药行业(如单克隆抗体)中的治疗性物种(TP-S)。

实施例

下面的实施例旨在帮助理解本发明，但其目的不是，也不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。这些实施例不包括常规方法的详细描述。这些方法为本领域普通技术人员所熟知。

实施例1-重构化学定义的细胞培养基的材料和方法

细胞系和培养基

使用表达不同单克隆抗体(mAb)免疫球蛋白G1(IgG1)的CHO-K1和CHO-S细胞系(抗体实验室股份有限公司，奥地利)。对于预培养和N-阶段，使用补充有4mM L-谷氨酰胺(Gln)和1％抗凝剂的商用培养基Dynamics^TMAGT^TM

预培养

解冻后，用新制备的基础培养基在180g(5min，23℃)下清洗细胞。丢弃上清液，将细胞重新悬浮在添加有1％G148和8mM Gln的新鲜基础培养基中。所有细胞系均在125mL、250mL和500mL厄仑美厄摇瓶(Erlenmeyer shake flasks)(康宁，美国)中生长。细胞培养基在34.5℃，5％CO₂，70％湿度，200rpm的条件下，在MaxQ 2000 CO2(赛默菲世尔，美国)19mm轨道振动筛中生长，并以3天的节奏连续传代4代。

补料分批实验

在接种当天，细胞在180g(5min，23℃)下离心。为了确保相同的启动条件，将细胞悬浮并浓缩在废培养基中。每次接种分别以1:10的分流比例添加相同的体积。此外，在培养基平衡之前，Gln和抗凝剂分别以4mM和1％的浓度加入。使用旋转管(

生物反应器50，TPP)进行了为期7天的补料分批实验。工作体积(wv)设定为15mL，所有实验均在生物四胞胎中进行。培养基在36.5℃下平衡2h。对于补料分批实验，接种细胞的接种细胞密度(SCD)为7×10⁵细胞mL^-1。如果测定的葡萄糖浓度<3g L^-1，则通过大剂量添加浓缩葡萄糖储备溶液(400g L^-1)将葡萄糖水平维持在3g L^-1以上。温度保持在36.5℃，轨道振动筛速度设置为300rpm。值得注意的是，为了防止掩蔽效应，没有引入浓缩饲料培养基。

表1：在旋转管补料分批培养的每组实验。使用分批或连续重构的基础培养基，每组在四胞胎中进行。

参数评估

指数阶段的增长率定义为Eq.(1)：

d dtCxv＝μEXP Cxv

其中Cxv是生物反应器中活细胞的浓度，μEXP是指数阶段的平均细胞比生长率(d^-1)。重新整理Eq.(1)，积分并应用自然对数会得到两个时间点(t_i+1-t_i)之间的μEXP Eq.(2)：

通过使用线性回归绘制活细胞密度(cIVCD)与生产/消耗总量的累积积分，计算(q_MX；pg细胞^-1天^-1)的平均细胞比生产/消耗率。负值表示消耗，正值表示生产。

过程内分析

每天抽取样本，分析细胞存活率、葡萄糖和代谢物浓度。分别在培养第7天(旋转管)和第9天(生物反应器)结束时测定产物浓度。使用Vi152 Cell^TM(贝克曼库尔特(Beckman-Coulter))在预培养和分批实验期间测量细胞浓度和活性，使用台盼蓝排斥法。每日葡萄糖水平通过血糖监测系统Contour X(拜耳)进行分析。使用单154样本微渗透压计

(先进仪器公司(Advanced Instruments)，美国)测量渗透压，并通过蛋白A亲和HPLC(赛默飞世尔科技公司，美国)测量抗体浓度。由于Cys的不稳定性，半胱氨酸以二聚体((Cys)₂)的形式进行分析。使用Cedex生物分析仪(Roche,巴塞尔,瑞士)测量氢氧化铵水平。样本被送往实验室进行碳水化合物和氨基酸定量。

重构化学定义细胞培养基的给料设备的实验设置

图1示出了用于重构固体工艺材料的基本系统，如关于重构培养基的实施例中所用。实施例中使用的系统包括作为给料设备的螺旋输送机、储罐或注射用水的供应(WFI)、混合容器、管式反应器、过滤单元以及作为运行单元的生物反应器、旋转柱或连续搅拌罐式反应器(CSTR)，重构的工艺材料被转移至该反应器。在重构之前，在不同转速(rpm)下对螺旋输送机进行了多次标定。因此，将来自商用基础细胞培养基(动态AGT，赛默飞世尔科技公司，美国)的固体放入给料设备的料斗中，并进行校准实验。在5次技术重复运行中，以50、150、300和450rpm给料固体2min，然后称量给料固体的重量。

校准实验使用连接至Raspberry Pi 3的

精密天平(Sartorius，哥廷根，德国)进行数据采集。从图2可以看出，随着rpm的增加，分配的准确性降低。使用

单样本渗透压计(先进仪器公司，诺伍德，美国)确认渗透压。使用简单的数据记录器软件(Smartlux SARL，博恩，卢森堡)在线收集数据。对于连续按需重构，固体被送入带有磁力搅拌器和底部出口的小型连续搅拌釜式反应器(CSTR)。根据制造商的建议对培养基进行重构，并根据建议的混合时间对连续重构中的停留时间进行调整。

实施例2-分批细胞培养基重构和连续细胞培养基重构的比较

分批培养基按照供应商提供的手册进行重构。对于连续重构培养基，使用混合容器、螺旋输送机和管式反应器的组合。因此，如图1所示，蠕动泵向混合容器重新供应注射用淡水(WFI)，另一台泵通过管式反应器输送介质。

通过将磁力搅拌器设置为400rpm，在混合容器中进行混合并通过手动调节给料泵将体积(VLM)恒定设置为40.7mL。将两台泵的流速设置为8.7mL min^-1，使得在混合容器中的混合时间为5min，在管式反应器中的混合时间为30min，这等于供应商建议的培养基分批重构的最小混合时间。螺旋输送机配有使用齿轮的步进电机，并由单板计算机树莓派(Raspberry Pi)3和python脚本控制。通过螺旋输送机以0.202g min^-1(±0.02)的平均给料速率从顶部输送介质粉末(图1)。在此概念验证中测试的连续重构总运行时间为2.9h。在40min的加速(ramp-up)阶段后，在离心管中收集40mL等分的连续重构介质。分析样本的PH值和渗透压(见过程内分析)，并将其与在相同条件下以分批模式重构的培养基进行比较。重要的是，在加速阶段后，观察到V_LM下降(图3)。因此，手动调节给料速率，以确保体积恒定。此外，在66min后通过移液管增加体积，这导致整个过程中VLM降低。然而，在66分钟和88分钟之间出现轻微波动后，体积达到相对恒定。因此，在恒定渗透压和pH曲线期间，使用0.8μm

注射器过滤器(赛多利斯(Satorius)，德国)将等分样本(图3中用圆圈表示)汇集并无菌过滤，并在7℃下储存。

实施例3-在补料分批实验中使用重构细胞培养基

本实验的目的是评估和比较实施例1-2的分批和连续重构的化学定义的细胞培养基在用两种不同CHO细胞系(CHO-K1和CHO-S)产生的抗体的在补料分批发酵中的性能。

补料分批实验

从图4可以清楚地看出，无论化学定义培养基(CDM)的重构模式如何，两种细胞系在补料分批实验期间都会产生类似的生长曲线。重要的是，使用连续重构培养基的两种细胞系中的两个生物复制品在4天和6天后被污染，因此终止。尽管如此，剩余的培养物(复制品)在整个过程中持续，与使用分批重构培养基的培养物相比，其培养性能略优。对于CHO-K1细胞系，连续培养基的平均最大活细胞密度(MVCD)为23.50(±0.06)×10⁶细胞mL^-1，分批培养基的平均最大活细胞密度(MVCD)为20.25(±1.22)×10⁶细胞mL^-1。然而，CHO-S细胞培养产生12.59(±0.69)×10⁶细胞mL^-1和14.25(±0.275)×10⁶细胞mL^-1。此外，对于两种CHO-K1，几乎所有培养物在培养结束时的存活率都在89％以上。相反，CHO-S细胞系的培养物在存活率低于82％下降更快。有趣的是，与分批设置相比，CHO-K1细胞系的细胞在经历连续生产的培养基后，产生的总细胞数更高，而CHO-S设置无法观察到这一点。此外，无论基础培养基的生产模式如何，两种细胞系的Glc浓度曲线都具有可比性。此外，最终滴度在分批和连续重构培养基之间没有差异(图5)。

此外，还分析了重构后和补料分批实验结束时的氨基酸图谱(图6)。不同重构模式之间的氨基酸图谱表明，就非必需氨基酸(NEAA)和必需氨基酸(EAA)而言，AA图谱几乎相当。如图7(A，B)所示，最后一次培养的氨基酸图谱也显示了EAA和NEAA中相对可比的氨基酸图谱。

实施例4-直接从固体中连续、按需和长期重构化学定义的培养基，用于发酵过程

实施例4展示了在12小时的持续时间内，直接从固体中连续按需重构化学定义的培养基。

给料设备包括螺旋输送机、给料料斗和能够产生原位梯度的控制单元。CDM的这种持续按需重构能够大幅缩减连续上游生产所需的辅助缓冲液和介质罐，如灌注系统。毫无疑问的是，CDM的粉末特性和流动特性与生物制药行业中常用的缓冲物种有很大不同，这仅仅是因为它们的配方和制造更为复杂。因此，通过重新设计几何形状、功率转换和螺杆设计，该装置适应了粉末流动行为的差异。

所开发的系统的核心单元是3D打印粉末给料机，该给料机在具有入口和出口的连续搅拌罐反应器中连续加入干粉介质(图1)。

对于长期重构来说，建立了简单的控制单元回路，以确保混合容器中的工作体积恒定(45mL)，并将设备集成至带有干燥处理空气的轻微过压的封闭环境中，以防止水分积聚。该设备将固体颗粒送入混合容器，固体颗粒然后在管式反应器中进行混合。在管式反应器的末端，现在的液体介质经过无菌过滤，然后输送至生物反应器或储罐中。与Arduino相连的蠕动泵向搅拌容器重新供应新鲜RO-水，

系统的一台双活塞泵设置为6.9mL min^-1，通过管式反应器输送介质，如图1所示。干介质粉末的剂量为0.171g min^-1。

系统的流道设置为旁路，用于在线监测pH、UV和电导率。

在50min的加速阶段后，连续按需重构进入稳定状态，如UV、电导率和PH测量信号所示(图8)。两小时和六小时后(图8，黑色虚线框)，料斗内出现拱起和水分积聚，这可以通过手动移除拱部和增加进入封闭环境的处理空气流量来解决，从而将重构恢复到稳定状态。因此，实现了在12h的持续时间内按需连续重构化学定义的介质。。

CSTR体积的这种轻微波动以及单个组分的不同溶解动力学很可能是电导率(±3.27％)和UV信号(±2.97％)稳定部分中观察到波动的最可能原因。对12h内给料准确度和精确度随重量变化的分析表明，除了两个偏差外，该设备在这种小给料率(+/-5％)的预期准确度范围内，与预期给料率0.171g min^-1(-5％)相比，给料率略低但准确度为0.162gmin^-1。通过跟踪CDM的给料量(按重量算)，进一步证明了该设备在粉末给料期间的稳定性(图9)。建议的是，额外实施重量在线监测和CDM给料控制回路，以及液体给料进入系统的控制回路。在重构的稳定部分，按需收集介质的渗透压测量结果为276mOsm Kg^-1和280mOsmKg^-1。然而，对传统重构介质的分析结果表明，差异为7％，导致296mOsm Kg^-1，这无疑是由于连续重构检测到的给料率略低所致。因此，为了确保相同的启动条件，(+7％)使用RO-水将分批重构介质稀释至相同的渗透压。为了强调由于与分批重组相比CDM的不均匀溶解可能产生的任何不一致性(例如，非均匀的氨基酸溶解留下一种或多种为固体的成分)，分析了重构后和在接种连续按需重构介质当天的氨基酸组成(图10；A，B)。如图10所示，在连续按需接种后，单个氨基酸的相对丰度(A，B)和接种当天的浓度(C，D)显示出与传统重构培养基相当的曲线图。

实施例5-生物反应器实验

在受控生物反应器条件下进行了大规模细胞培养实验，以研究长期连续按需和分批重构培养基之间的潜在差异。对于该实验，使用DASGIP生物反应器(n＝2)在受控条件下使用CHO-K1细胞系。对于生物反应器实验，使用了

平行生物反应器系统(艾本德股份公司(Eppendorf)，汉堡，德国)。溶解氧(DO)水平设置为50％，并且通过使用

模块释放CO₂并添加碳酸氢钠，将pH控制在7.0。工作体积分别设置为0.7L。生物反应器实验在生物复制品中进行。介质在36.5℃的工艺条件下平衡6h，搅拌器速度设定为150rpm。对于所有补料分批实验，以接种细胞密度为6.5×10⁵细胞mL^-1接种细胞，在新鲜培养基中以1:10稀释废培养基。对于生物反应器实验，如果葡萄糖浓度<2g*L^-1，则通过每日大剂量添加浓缩葡萄糖储备溶液(200g*L^-1)，将葡萄糖水平维持在4g*L^-1以上。值得注意的是，为了防止掩蔽效应，未引入浓缩的给料培养基。根据需要添加1％的消泡C乳液溶液。

过程分析

同样，在旋转管实验中，两种培养基重构方法的达到的性能相同(图11)。连续按需重构培养基的集合培养基(按需_1，按需_2)可获得11.53×10⁶细胞mL^-1和11.32×10⁶细胞mL^-1的最大活细胞密度(MVCD)，并且在分批重构培养基中生长的培养物的MVCD分别为12.19×10⁶细胞mL^-1和10.43×10⁶细胞mL^-1(图11)。

几乎所有的培养物在收获当天的存活率都在80％左右。值得注意的是，培养物批次_1的活性略低。对收获当天的最终滴度分析也导致按需_1、按需_2、批次_1和批次_2的可比性能分别为0.193、0.239、0.235.0.228g*L^-1。此外，在收获当天对必需氨基酸和非必需氨基酸的分析得出了可比较的曲线图(图12)。

产物质量

使用制备蛋白A色谱法捕获抗体。采用HPLC蛋白A亲和层析法测定抗体浓度。为了评估产物纯度，进行了尺寸排除色谱。抗体纯度根据280nm信号计算为单体峰面积(保留时间21.2min)与所有峰面积之和的比率。使用无鞘CE-MS进行完整蛋白质分析。因此，使用Sciex CESI 8000仪器分析完整的抗体样本，该仪器通过XYZ阶段连接至Impact qTOF-MS(布鲁克·道尔顿(Bruker Daltonics)，不来梅，德国)。

使用无鞘CE-MS分析产物质量，并比较使用分批和按需重构培养基获得的抗体的翻译后修饰(PTM)。图13显示了对mAb样本进行CE-MS分析后获得的结果。图13显示了连续按需重构样本(图13A)和分批重构样本(图13B)的反褶积质谱，这些样本来自无鞘CE-MS分离后的受控环境。插图显示了两个样本的基峰电泳图。图13C显示了使用连续按需重构培养基或分批重构培养基生产的mAb糖型的相对丰度。在基峰电泳图中未观察到其他片段(图13)。此外，例如在赖氨酸变体或蛋氨酸氧化的存在的常见修饰方面没有观察到差异。连续按需和分批重构之间的糖基化模式仅显示出在预期批次间变化范围内的细微差异。重要的是，两种情况下的无糖基化水平没有显著差异，表明无糖基化具有可比性(图13)。关于其他PTM，两种评估条件之间未观察到差异。

实施例6-用于酵母发酵的化学定义培养基的连续重构

另一个实施例是使用恒化器工艺连续重构酵母发酵培养基以生产柠檬酸。因此，化学定义的发酵培养基被重构并通过0.2μm过滤器进行过滤，该发酵培养基包含NH₄Cl、葡萄糖、NH₄Cl、KH₂PO₄、MgSO₄、MnSO₄、FeSO₄、CuSO₄、ZnSO₄、CoSO₄、H₃BO₃、CaCl、NaCl、柠檬酸、Na₂MoO₄硫胺–HCl、生物素、吡哆醇–HCl、Ca-D-泛酸盐和烟酸。因此，将培养基引入恒化器培养。可通过使用本专利提及的发明，直接从固体中重构该培养基，从而大幅减少培养基所需的储罐，并扩大恒化器生产过程中可能的控制选项。

实施例7-缓冲液连续重构的精度、准确度和稳定性

从固体中连续重构工艺材料的另一个实施例是将固体用作缓冲液制备单元，而不需要大型缓冲罐来存储所述缓冲液。实施例7中描述了五种不同的缓冲液在不同电机转速下的重构以及NaCl在三种不同电机转速下的重构。

实验设置

给料设备为3D打印，并且包含由步进电机驱动的螺旋输送机(Stepheronline，南京，中国)。该设备由微型计算机树莓派3(树莓派基金会，剑桥，英国)控制，该计算机使用Python(Python软件基金会，威明顿，美国)编程。为了进行稳定性、精度和准确度试验，料斗的设计在几何形状方面进行了优化。将固体化合物放入给料设备的存储罐中，并对氯化钠(NaCl)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、柠檬酸钠一水合物、聚乙二醇6000(PEG 6000)和醋酸钠(NaAc)进行校准实验。使用与树莓派3相连的

精密天平(赛多利斯(Sartorius)，哥廷根，德国)进行校准实验。使用简单的数据记录器软件(Smartlux SARL，博恩，卢森堡)在线收集数据。

精度、准确度和稳定性

以氯化钠、tris、乙酸钠、柠檬酸钠一水合物、PEG 6000和咪唑(均为晶体形式)，在不同给料速度下通过重量评估固体给料的精度和准确度。给料机的速度在20-120rpm之间变化。对于氯化钠，范围从1-120rpm增加，以评估长期给料。受试化学品之间的实际给料范围(gmin^-1)不同。因此，给料速度的范围取决于固体的种类，可能是由于不同的粒径尺寸、颗粒粗糙度和其他物理特性，给料机的速度需要根据晶体的种类进行调节，以达到相同的重量给料速率。图14-(A)显示，对于除了咪唑以外的所有组分，所有测试的给料机速度的标准偏差均低于5％。此外，要注意的是，以克/转为单位的给料速度在很大程度上取决于吸湿特性和料斗中形成的架桥形成，从而限制了螺旋输送机本身拾取的晶体数量。这导致难以执行咪唑和柠檬酸钠一水合物的校准曲线。为了避免这一限制，python脚本中实现了闭环控制，通过测量料斗和给料机系统的重量，控制给料机在运行期间自动重新调整螺旋输送机的速度。对于柠檬酸钠一水合物，定期手动敲击料斗解决了架桥形成的问题，并实现了精确且稳定的给料速度(图14-A)。本文中，所研究的缓冲液组分的给料速率存在显著差异。虽然对于咪唑，有必要进行额外的重量控制，但对于任何其它化合物，没有必要包括额外的控制系统。由于校准实验使各种缓冲液的性能具有可比性，因此使用氯化钠对三种不同电机转速下重复批次(g min^-1，n＝50)的给料准确度和精密度系统进行了测试。如图14-(B)所示，在不同电机转速下进行的所有批次均在初始目标给料速率的±5％范围内。最后，为了证明长期稳定性，在0.05g min^-1的极低给料速率下进行24h给料，以评估使用氯化钠的系统稳定性，并显示固体给料流的稳定性。在给料期间使用95％的置信区间进行线性回归。标准误差非常小(<5％)，与之前在24h内进行的较短给料时间相当。因此，可以得出结论，本文提出的发明在短期和长期内提供了精确和准确的性能，因此适用于缓冲液的重构、单个色谱运行的梯度生成以及连续长期运行。

实施例8-直接从固体缓冲液组分进行色谱应用的线性盐梯度洗脱的原位制备方法

离子交换色谱的缓冲液在运行过程中需要调节盐含量，目前通过混合两种不同浓度的缓冲液来创建不断变化的盐梯度。使用本文描述的根据本发明的系统和方法，通过添加更多或更少的盐来连续生成缓冲溶液，可以替换该复杂组件。直接从固体中重构具有不同盐浓度的缓冲液，避免了储存两种不同盐浓度的缓冲液所需的任何储罐，并可直接从水源中使用，以产生必要的梯度。实施例8描述了通过应用线性盐梯度从离子交换树脂中洗脱溶菌酶和细胞色素c这两种物质的色谱分离。

实验设置

给料设备为3D打印，并包含步进电机驱动的螺旋输送机(Stepheronline，南京，中国)。该设备由微型计算机树莓派3(树莓派基金会，剑桥，英国)控制，该计算机使用Python(Python软件基金会，威明顿，美国)编程。固体被送入带有磁力搅拌器和底部出口的小型连续搅拌罐式反应器(CSTR)。该反应器与装有静态混合器的短管反应器相连，并进一步与

净化系统相连。使用

系统的传感器测量UV吸光度和电导率。使用离线MC226电导率仪(梅特勒-托利多(Mettler Toledo)，哥伦布，美国)和

单样本渗透压计(先进仪器公司，诺伍德，美国)确认电导率和渗透压。预先调整线性梯度缓冲溶液的pH值，并在运行结束时手动确认。

线性梯度洗脱

在小规模色谱实验中，通过线性梯度在1mL阳离子交换器上分离细胞色素c和溶菌酶组成的二元蛋白质混合物。作为放大，使用了10mL阳离子交换器。固体给料设备安装在与

纯色谱工作站相连的小型动态混合器顶部。样本施用后，通过向液体中连续添加晶体形式的盐来执行梯度洗脱，以达到10CV的梯度长度。更具体地，使用Eshmuno CP-FT树脂(默克集团(Merck KGaA)，达姆施塔特，德国)进行盐梯度洗脱实验。使用体积为1mL的预包装Minichrom Eshmuno CP-FT树脂进行小规模实验。为了扩大规模，使用Tricorn TM10housing(思拓凡(Cytiva)，乌普萨拉，瑞典)和最终柱体积为10mL的Eshmuno CP-FT树脂。平衡、清洗和洗脱缓冲液为pH值为6.9的50mM磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液为补充有500mM氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液。加载前，用5CV对色谱柱进行平衡。使用循环体积为100μL的脉冲注射完成柱的加载。给料浓度为5mg*mL^-1溶菌酶和细胞色素c，溶菌酶和细胞色素c分别溶解在添加50mM氯化钠的平衡缓冲液中。所有缓冲液均由目前的固体缓冲液制备设备采用分批制备，或采用在线调节制备，随后根据渗透压、电导率和最终pH比较缓冲液。在280nm处测量溶菌酶和在405nm处测量细胞色素C的洗脱部分吸光度。对于直接从固体进行的在线制备，将氯化钠直接加入工作体积为100mL的磷酸盐缓冲液(不含额外盐)的烧杯中。一旦开始在线制备，通过根据梯度的持续时间设置给料速度来实现线性。

进一步评估设备执行稳定和线性梯度的能力，因此，梯度连续重复五次。根据溶菌酶和细胞色素c的洗脱峰、电导率以及最终渗透压评估稳定性(图15)。目前的方法形成的梯度具有很高的重复性。这可以通过最大峰值电导率的平均值和标准偏差来表示。对于细胞色素c的洗脱，在405nm处测得的最大峰值平均电导率为16.3±0.29mS cm^-1；在280nm处测得16.4±0.35mS cm^-1。这产生的变异系数分别为1.7％和1.8％。溶菌酶的变异系数为1.3％(最大峰值洗脱电导率为31.9±0.41mS cm^-1)。此外，测量了梯度末端的渗透压，并观察到1.9％的变异系数(947±18.2mOsm kg^-1)。

为了进行比较，还使用两个预制备的缓冲液进行了常规运行，并通过泵和在线混合器产生梯度，最终渗透压为957±1.2mOsm kg^-1。然后，在1mL和10mL柱中测试用于执行不同长度(5、10和20CV)梯度的设备。给料速率根据梯度长度和柱体积进行调节。

和内置混合器的两个系统泵产生的盐梯度在梯度开始时略有不同(图16)。固体缓冲液组分原位混合产生的梯度线性与传统缓冲液制备相当(图16)。

实施例9–直接从固体缓冲液组分进行色谱应用的阶梯梯度洗脱的原位制备方法

实施例9描述了通过本文描述的发明产生用于色谱纯化的阶梯梯度的方法。更具体地，使用金属亲和层析树脂纯化His-标记的蛋白质，其中该蛋白质通过包含咪唑的缓冲液从柱中洗脱。咪唑是金属螯合色谱中非常常见的缓冲液，因此我们选择这种缓冲液作为模型来演示我们的原位梯度形成系统。因此，直接从固体缓冲液组分开发了阶梯梯度洗脱。

实验设置

给料设备为3D打印，并且包含由步进电机驱动的螺旋输送机(Stepheronline，南京，中国)。该设备由小型计算机树莓派3(树莓派基金会，剑桥，英国)控制，该计算机使用Python(Python软件基金会，威明顿，美国)编程。固体被送入带有磁力搅拌器和底部出口的小型连续搅拌罐式反应器(CSTR)。该反应器与装有静态混合器的短管反应器相连，并进一步与

净化系统相连。使用

系统的传感器测量UV吸光度和电导率。使用离线MC226电导率仪(梅特勒-托利多，哥伦布，美国)和

单样本渗透压计(先进仪器公司，诺伍德，美国)确认电导率和渗透压。预先调整阶梯梯度缓冲溶液的pH值，并在运行结束时手动确认。

阶梯梯度洗脱

给料设备安装在装有碱性缓冲液的容器上，碱性缓冲液用于平衡和固定的金属亲和色谱柱的样品应用。对于阶梯梯度洗脱实验，使用固定的金属亲和树脂Ni-Sepharose 6Fast Flow树脂(思拓凡，乌普萨拉，瑞典)。阶梯梯度实验在Tricorn TM 10housing(思拓凡，乌普萨拉，瑞典)中进行，柱体积为2.1mL。平衡和洗涤缓冲液为补充有10mM咪唑和300mM氯化钠的pH为8.0的50mM磷酸盐缓冲液。用咪唑补充洗脱缓冲液以达到500mM的浓度。加载前，用5CV平衡色谱柱，并在加载步骤后用2CV清洗色谱柱。使用循环体积为100μL的脉冲注射完成柱的加载。His-标记的绿色荧光蛋白(GFP)在平衡缓冲液中的给料浓度为2.2mg mL^-1。所有缓冲液均由目前的固体缓冲液制备设备采用分批或在线制备，并根据渗透压、电导率和最终pH比较缓冲液。对于GFP，在488nm处测量洗脱部分的吸光度，并且对于空白梯度实验，在240nm处测量洗脱部分的吸光度。为了在线制备平衡缓冲液，根据刻度将咪唑加入烧杯中，以达到10mM咪唑的平衡缓冲液浓度。将样本装载至柱上后，将额外的咪唑加入烧杯中，以达到500mM咪唑的目标浓度。平衡后，通过脉冲注射将His-标记的GFP溶液装载至柱上。为了产生阶梯梯度，以最大速度(200rpm)将咪唑注入缓冲储液罐，以尽可能快地达到500mM咪唑。给料按重量进行，以确保由于咪唑的吸湿性，洗脱梯度陡峭。给料期间(10分钟)，

暂停。

通过使用在线混合器的

和从固体缓冲液组分原位制备的设备进行的阶梯梯度产生了几乎相同的色谱图(图17-A)。平衡的最终渗透压(674.0±3.28mOsm kg^-1从固体缓冲液组分原位形成设备vs.670.50±14.41mOsm kg^-1

)和洗脱缓冲液(1160±19.55mOsm kg^-1从固体缓冲液组分原位形成设备vs.1190.52±1.70mOsm kg^-1)进一步支持了这些发现。由于咪唑可以很容易地通过UV吸光度进行测量，因此在不使用蛋白质溶液的情况下进行了比较(图17-B)。

Claims (23)

1.一种按需重构固体工艺材料的系统，包括：

a.给料设备，用于连续给料所述固体工艺材料；

b.混合容器；

c.可选地，储罐；

d.可选地，一个或多个混合反应器；

e.可选地，无菌过滤单元；和

其中，所述系统配置为连续运行。

2.根据权利要求1所述的系统，其中，通过调节步骤b)的给料设备，可以在运行过程中直接调节给料速度。

3.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中所述系统连接至反应器。

4.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中所述固体工艺材料选自包括细胞培养基、缓冲液、营养素、添加剂、基质、盐、聚合物、化学品和/或散装材料或其任何组合的组。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中所述固体工艺材料为有机和/或无机材料，并且其中所述工艺材料的形式为粉末、浆液、晶体、有机聚合物、无机聚合物或颗粒。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中所述给料设备选自由螺旋输送机、挤出机、板式输送机、气动输送机、辊式输送机、带式输送机、造粒机、复合机、重力给料机、声学和超声波振动输送机、旋转输送机、电磁输送机和垂直输送机组成的组。

7.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中给料斗连接至所述给料设备。

8.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中所述给料设备由电机驱动。

9.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中所述给料设备包含在封闭环境中。

10.根据权利要求9所述的系统，其中所述封闭环境被具有过压或没有过压的气体冲洗。

11.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，还包括一个或多个作为混合反应器的管式反应器。

12.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，还包括一个或多个用于评估工艺参数的集成传感器。

13.根据权利要求12所述的系统，其中所述一个或多个传感器选自由温度传感器、PH传感器、流速传感器、浓度传感器、荧光传感器、红外光传感器、单色光非弹性散射传感器、电导率传感器、氧化还原电位传感器、压力传感器、空气湿度传感器和生物量传感器组成的组。

14.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中所述反应器是生物反应器，优选是以分批模式、补料分批模式或连续模式运行的发酵生物反应器。

15.根据前述权利要求中的任一项所述的系统，其中所述系统为一次性和/或一次性使用的系统。

16.一种在连续模式下按需重构工艺材料的方法，包括以下步骤：

a.提供根据权利要求1-15中的任一项所述的系统；

b.以连续模式向所述混合容器中添加固体工艺材料；

c.以连续模式向所述混合容器中添加液体；

d.使所述固体工艺材料在所述混合容器中与所述液体混合，以提供重构的工艺材料；和

e.以连续模式将所述重构的工艺材料转移至所述反应器。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述液体选自包括水、溶剂中的溶解缓冲液、溶剂中的溶解化学定义的介质和/或回收的工艺物料流的组。

18.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述液体由储罐或反应器提供。

19.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述固体工艺材料选自包括细胞培养基、缓冲液、营养素、添加剂、基质、盐、聚合物、化学品和/或散装材料或其任何组合的组，并且其中所述固体工艺材料的形式为粉末、浆液、晶体、有机聚合物、无机聚合物或颗粒。

20.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述连续运行模式至少执行12小时。

21.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中避免了分批生产工艺介质。

22.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述反应器是生物反应器，所述生物反应器包括哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类或酵母；所述生物反应器生产产物。

23.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中所述产物为肽、蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸、蛋白质缀合物、病毒、病毒样颗粒、外显子、微生物、细胞或组织。

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