CN117794582A - 一种提高抗体药物偶联物产品质量的方法 - Google Patents

一种提高抗体药物偶联物产品质量的方法 Download PDF

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CN117794582A CN202280054509.7A CN202280054509A CN117794582A CN 117794582 A CN117794582 A CN 117794582A CN 202280054509 A CN202280054509 A CN 202280054509A CN 117794582 A CN117794582 A CN 117794582A
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Abstract

本申请涉及一种提高抗体药物偶联物产品质量的方法，包括将待偶联药物与抗体进行偶联，获得所述抗体药物偶联物；纯化所述抗体药物偶联物：向所述抗体药物偶联物中加入调节液，经柱层析流穿收集产物，产物经进一步超滤和/或渗滤浓缩后得产品质量提高的抗体药物偶联物。所得抗体药物偶联物纯度高，DAR均一，无溶剂残留，质量稳定，同时抗体预处理不采用超滤、渗滤等步骤，简化了抗体纯化方法，节约了生产成本。

Description

一种提高抗体药物偶联物产品质量的方法
本申请是以CN申请号为202111021482.5，申请日为2021年9月1日的申请为基础，并主张其优先权，该CN申请的公开内容在此作为整体引入本申请中。
技术领域
本申请涉及药物化学领域，具体涉及一种提高抗体药物偶联物产品质量的方法。
背景技术
随着抗体药物偶联物领域的发展，包含目标抗体的生物活性药物的纯化偶联生产工艺条件的开发显得尤为重要，对抗体的分离纯化工艺以及抗体药物偶联物的偶联工艺的开发与有效控制能够保证药物的产品质量，是抗体药物偶联物的工业化生产过程中的关键。
抗体分离纯化工艺路线的设计和参数的控制直接影响抗体药物偶联物的产品质量及收率。现有抗体药物偶联物抗体部分的纯化工艺路线往往需要包括超滤和/或渗滤步骤，使抗体达到偶联要求，但该步骤增加了抗体纯化的步骤和生产成本，影响抗体乃至最后偶联物的收率。
另一方面，药物偶联工艺对抗体药物偶联物的质量有重要的影响。目前，抗体药物偶联物常用的偶联方式包括：赖氨酸偶联、轻重链还原二硫键偶联和定点偶联。由于偶联位点和方式的多样性，无论是赖氨酸偶联、轻重链还原二硫键还是定点偶联工艺得到的抗体药物偶联物均会产生一定的非目标产物，甚至还会发生蛋白质聚集，影响抗体药物偶联物的药用安全性和有效性。抗体上连接的毒素的个数(Drug-antibody Ratio，DAR)决定了药品的均一性，如何能尽可能控制DAR均一的前提下，保证产品质量，是抗体药物偶联物产品生产工艺的难点。现有技术中，DAR值为3-4之间的抗体药物偶联物的偶联纯化工艺较为常见，因此，若能开发出高DAR(例如6-8)的抗体药物偶联物的纯化和偶联工艺，对于产品质量的提高、降低成本和安全风险具有重要意义。
发明内容
本申请的发明人对抗体药物偶联物的上游抗体纯化工艺和抗体药物偶联工艺进行了大量实验和反复摸索，对生产过程中各步骤反应条件和工艺参数等进行改进。该方法得到的抗体产品能够满足偶联需求，提高了最终抗体药物偶联物的产物纯度和质量，显著降低 有关物质的含量和潜在用药风险，产品质量稳定可靠，适合工业化连续放大生产。
本发明提供了一种提高抗体药物偶联物产品质量的方法，包括：
(1)提供抗体药物偶联物；
(2)纯化所述抗体药物偶联物：向所述抗体药物偶联物中加入调节液，经柱层析流穿收集产物，产物经进一步超滤和/或渗滤浓缩后得产品质量提高的抗体药物偶联物；
所述待偶联药物结构如式(I)所示：
D-[L 1-(L 2) m1-(L 3) m2-(L 4) m3-E]-G
式(I)
其中，
L 1为 其中，各R 1和R 2各自独立地为氢、卤素、羧酸基、磺酸基、氰基、C 1-6烷基、卤代C 1-6烷基、氰基取代的C 1-6烷基(例如-CH 2CN)、C 1-6烷氧基、C 2-10烯基或C 2-10炔基；Z 1为氨基酸或2-10个氨基酸组成的肽；x 1和x 2各自独立地为0、1、2、3、4、5或6；并且L 1的1位置处与D相连、L 1的2位置处与L 2相连；
L 2为 或不存在；其中，y 1为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且L 2的1位置处与L 1相连、L 2的2位置处与L 3相连；
L 3选自5-12元杂芳环或不存在；
L 4为 其中Z 2选自C 1-6亚烷基、C 2-10亚烯基、C 2-10亚炔基、C 3-8亚环烷基和5-6元杂芳基；R 3选自H和C 1-6烷基；Z 3不存在或者选自C 1-6亚烷基；或者，R 3与Z 3连同其所连接的氮原子形成4-8元杂环基；α为0、1、2、3、4、5或6，并且L 4的2位置处与E相连、L 4的1位置处与L 3相连；
E为 其中，各R 4独立地为氢，β为0、1或2，并且E的2位置处与G相连、E的1位置处与L 4相连；
m 1、m 2和m 3各自独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
D为生物活性分子片段；
G为亲核取代反应的离去基团；优选地，G选自卤素、磺酰基、磺酸酯基、或硝基。
在某些实施方案中，本发明提供了一种提高抗体药物偶联物产品质量的方法，其特征在于，向预处理的抗体中加入5-20mM的还原剂，混匀进行还原反应，然后加入待偶联药物，搅拌静置后加入酸性溶液；
向上述步骤的产物中加入调节液，经柱层析流穿收集产物，产物经进一步超滤和/或渗滤浓缩后得抗体药物偶联物；
所述待偶联药物的结构如上文所述式(I)所示。
在某些实施方案中，步骤(1)所述抗体药物偶联物通过以下方法获得：向经过预处理后的抗体中加入浓度为5-20mM的还原剂溶液，然后将待偶联药物加入反应体系，搅拌静置后加入酸性溶液，获得所述抗体药物偶联物。
在某些实施方案中，所述方法还包括除菌过滤的步骤。
在某些实施方案中，所述抗体在还原反应前进行除菌过滤步骤。
在某些实施方案中，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦。
在某些实施方案中，所述还原反应包括用所述还原剂处理所述抗体10min-2h，例如30min-1h。
在某些实施方案中，所述还原反应为在室温条件下用所述还原剂处理所述抗体；和/或，所述还原反应在4-37℃进行，例如18-26℃。在某些实施方案中，所述柱层析方法为疏水层析，优选地，所述疏水层析包括平衡和洗脱的步骤。
在某些实施方案中，所述疏水层析的平衡步骤为在pH 6-7条件下，采用20mmol/L的磷酸缓冲液-硫酸铵溶液作为平衡液，电导率控制在50-80mS/cm。
在某些实施方案中，所述疏水层析的平衡步骤为在pH 6-7条件下，采用20mmol/L的磷酸缓冲液-硫酸铵溶液作为平衡液，电导率控制在62-70mS/cm。
在某些实施方案中，所述疏水层析的洗脱步骤为在pH 6-7条件下，使用与平衡液相同的溶液作为洗脱液进行洗脱，电导率控制在22-30mS/cm。
在某些实施方案中，层析柱采用Butyl Sepharose High Performance填料。
在某些实施方案中，所述超滤和/或渗滤浓缩采用Pellicon 3Cassette Biomax膜。
在某些实施方案中，所述渗滤采用的置换溶液为10mmol/L组氨酸-盐酸组氨酸溶液，pH为5.7-6.3。
在某些实施方案中，将所述待偶联药物加入所述反应体系后搅拌5-15min，而后静置反应，优选地，静置1h-12h，例如1h-6h，1h-4h，1h-3h，1.5h-3h，1.5h-2.5h；
在某些实施方案中，所述搅拌时间为5-15min，所述静置的温度为4-37℃，例如18-26℃，静置时间1.5-3小时。
在某些实施方案中，所述待偶联药物为带连接臂的小分子化合物，优选的，所述小分子化合物选自DNA拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂或它们的衍生物。
在某些实施方案中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶I抑制剂，优选的，所述拓扑异构酶I抑制剂为喜树碱、SN-38、伊立替康、拓扑替康、贝洛替康、卢比替康或它们的衍生物。
在某些实施方案中，所述DNA拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶II抑制剂，优选的，所述拓扑异构酶II抑制剂为放线菌素D、阿霉素、多柔比星、多卡米星，柔红霉素、米托蒽醌、鬼臼毒素、依托泊苷或它们的衍生物。
在某些实施方案中，所述微管蛋白抑制剂为长春花生物碱类、长春新碱、长春碱、紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛或它们的衍生物。
有某些实施方案中，所述带连接臂的小分子化合物选自N-((S)-1-(((S)-1-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰氨基)-N,3-二甲基丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基氨基)-3-苯基丙酰胺基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧基丁烷-2-基)-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-5-己炔酰胺；
(S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基甲基磺酰胺)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4',6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基(4-((S)-42-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-4,8,37-三氧代-2-(3-脲基丙基)-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9,36-氮杂二十四烷-41-酰胺基)苄基)碳酸酯；
4-((S)-2-(4-氨基丁基)-42-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-4,8,37-三氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9,36-三氮杂四十二烷基-41-炔酰胺基)苄基-((S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基甲磺酰胺基)乙基)-3,14-二氧-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃酮[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯；
(S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基甲基磺酰胺)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-4-基-4-((2S,5S)-5-异丙基-2-甲基-38-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)基)己-5-炔酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,7,11-三氧代 -9,15,18,21,24,27,30,33,36-壬氧基-3,6,12-三氮杂三十烷酰胺基)苄基碳酸酯；
4–((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-炔酰胺)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基乙酰氨基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯；
4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-九氧杂-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基((S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基甲基磺酰胺基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯
4-((S)-2-(4-氨基丁酸)-35-(4-((2-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)-噁唑-4-甲酰氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基-((S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基甲基磺酰胺基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯；
N-((1-((6S,9S)-1-氨基-6-((4-(((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲氨基)-3-甲基丁酰胺)-N,3-二甲基丁酰胺)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰胺)-3-苯丙酰胺)甲基)苯基)氨基甲酰基)-9-异丙基-1,8,11,15-四氧基-13,19,22,25,28,31,34,37,40-九氧杂-2,7,10,16-四氮杂蒽烷-42-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)-6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-5-己炔酰胺；
4-((2S,5S)-5-异丙基-38-(4-((6-(2-(甲磺酰基)嘧啶-5-基)-5-己炔酰胺)甲基)-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)-4,7,11-三氧-2-(3-脲基丙基)-9,15,18,21,24,27,30,33,36-九氧杂-3,6,12-三氮杂四十二烷基)苄基-((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)(甲基)氨基甲酸酯；
(S)-2-((2R,3R)-3-((2S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-二甲基-2-((S)-3-甲基2-(甲基(((4-((S)-2-((S)-3-甲基-2-(32-(4-((6-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)己-5-氨基甲酰基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-壬氧基-6-氮杂三十烷酰胺基)丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)丁酰氨基)丁酰氨基)-3-甲氧基-5-甲基庚基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)-L-苯丙氨酸；
4-((S)-2-(4-氨基丁基)-35-(4-((4-(2-(甲基磺酰基)嘧啶-5-基)苯甲酰胺基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-4,8-二氧代-6,12,15,18,21,24,27,30,33-壬氧基-3,9-二氮杂三十五烷酰胺基)苄基 ((S)-4-乙基-11-(2-(N-异丙基甲基磺酰胺基)乙基)-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1H-吡喃并[3',4':6,7]中氮茚并[1,2-b]喹啉-4-基)碳酸酯中的一个。
在某些实施方案中，所述待偶联药物为带连接臂的小分子化合物，所述带连接臂的小分子化合物选自以下结构所示的化合物：
在某些实施方案中，所述抗体为Sacituzumab；所述待偶联药物为带连接臂的小分子化合物，其结构如下所示：
在部分实施方式中，所述抗体药物偶联物结构如下：
其中，γ为1-10；优选地，γ为5-8；优选地，所述连接臂与Sacituzumab的巯基连接。
在某些实施方案中，所述待偶联药物的投料浓度为10-70mM，优选50mM。
在某些实施方案中，所述三(2-羧乙基)膦溶液的pH值为7.0-8.0，例如7.4-8.0；
在某些实施方案中，所述酸性溶液选自枸橼酸或醋酸。
在某些实施方案中，所述酸性溶液将反应体系pH调节至酸性；优选地，所述酸性溶液将反应体系pH调节至6.0-7.0；进一步优选地，所述酸性溶液将反应体系pH调节至4.5-7.0。
在某些实施方案中，抗体预处理包括向抗体中加入依地酸二钠溶液，采用Tris溶液调节pH的步骤，优选地，所述依地酸二钠溶液的浓度为2-10mM，所述Tris溶液的浓度为1-3M；进一步优选地，所述依地酸二钠溶液的浓度为2-10mM，所述Tris溶液的浓度为2M。
在某些实施方案中，抗体预处理包括向抗体中加入依地酸二钠溶液，采用磷酸盐调节 pH的步骤，优选地，所述磷酸盐为磷酸钠盐；进一步优选地，所述磷酸钠盐为磷酸氢二钠；优选地，所述依地酸二钠溶液的浓度为2-10mM，所述磷酸氢二钠溶液的浓度为0.2-2M，优选1M。
在某些实施方案中，所述抗体为抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗Trop-2抗体。
在某些实施方案中，所述抗Her2抗体为Trastuzumab或Pertuzumab、抗EGFR抗体为Cetuximab或Nimotuzumab、抗PD-1单抗为Nivolumab或Pembrolizumab、抗PD-L1单抗为Atezolizumab或Durvalumab、抗Trop-2抗体为Sacituzumab或Datopotamab。
在某些实施方案中，所述还原反应中，抗体的投料浓度为10-25g/L。
在某些实施方案中，所述调节液选自硫酸铵。在某些实施方案中，在疏水层析步骤前，向抗体药物偶联物中加入所述调节液。
在某些实施方案中，所述调节液将抗体药物偶联物调节为高电导率；优选地，所述调节液将抗体药物偶联物的电导率调节为62-70mS/cm。
在某些实施方案中，所述抗体在预处理之前还经过纯化处理。
在某些实施方案中，所述纯化包括层析和过滤的步骤，所述层析选自亲和层析、阴离子交换层析和/或阳离子交换层析。
在某些实施方案中，所述纯化依次包括亲和层析、孵育、深层过滤、阴离子交换层析以及阳离子交换层析的步骤。
在某些实施方案中，所述纯化不包括超滤、渗滤等步骤。
在某些实施方案中，所述亲和层析的填料选自Cytiva Mabselect Sure LX、Cytiva MabSelect SuRe、Cytiva MabSelect PrismA、Merck Eshmuno A、Tosoh AF rProteinA-HC 650F。
在某些实施方案中，所述亲和层析还包括平衡、洗涤和洗脱的步骤，优选地，所述平衡步骤采用NaCl-磷酸盐缓冲液；优选地，所述洗涤可在pH为5.4-6.2的范围内进行一次、两次或多次洗涤，优选地，洗涤液选自磷酸盐缓冲液-NaCl和醋酸钠-醋酸溶液；优选地，洗脱采用醋酸钠-醋酸缓冲液。
在某些实施方案中，所述亲和层析的洗脱步骤需控制pH在3.5-3.7。
在某些实施方案中，所述孵育包括在室温、pH 3.6-3.8的条件下进行孵育。
在某些实施方案中，所述深层过滤选用Millipore X0HC。
在某些实施方案中，所述阴离子交换层析填料选自Cytiva Q Sepharose Fast Flow、 Thermo POROS 50HQ、Thermo POROS XQ、Bio-Rad Nuvia HP-Q。
在某些实施方案中，所述阴离子交换层析操作体系pH为5.5-6.5，优选为5.8-6.2。
在某些实施方案中，所述阳离子交换层析填料选自Tosoh Gigacap S 650M、Merck Eshmuno CPX、Thermo POROS 50HS、Thermo POROS XS、Bio-Rad Nuvia HP-S。
在某些实施方案中，所述阳离子交换层析操作体系pH为5.5-6.5，优选5.9-6.1。
在某些实施方案中，所述纯化还包括除病毒过滤和除菌过滤的步骤。
本发明的方法至少具有如下有益效果：
(1)本发明通过优化工艺步骤和反应参数细节，在偶联完成后使用疏水层析并优化参数，使得本发明获得的抗体药物偶联物纯度高，DAR值均一，产物中几乎检测不到残留溶剂，实现了产品质量的可控性及稳定性。
(2)本发明通过对抗体偶联物反应采用的偶联抗体进行纯化预处理，常规抗体的预处理步骤往往需要通过超滤和/或渗滤等操作，本发明省略了以上操作，并通过对层析、过滤等步骤的工艺参数进行控制，降低了工艺时间和成本，提高了抗体产品的整体收率。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，绝不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除特别说明以外，以下实施例采用的试剂均为市售产品，溶液的配制可以采用本领域常规技术。
实施例1抗体预处理
1.第一批次的抗体预处理
将亲和层析柱(填料Mabselect Sure LX)，采用pH为7.2的20mM磷酸盐缓冲液，150mM的NaCl溶液进行平衡。将含有Sacituzumab抗体的溶液进行上样，载量42.7g/L。结束后用pH为6.0的20mM PB，1M NaCl的溶液进行至少3个柱体积的洗涤，然后再用pH为5.5的20mM醋酸钠-醋酸缓冲液进行至少3个柱体积的第二次洗涤。洗涤结束后用pH为3.57的20mM的醋酸钠-醋酸溶液进行洗脱。
将收集的洗脱液在室温条件下，采用枸橼酸调节pH为3.7进行孵育，灭活2h后采用 2M的Tris中和得到的样品。将上述样品通过深层过滤进行澄清处理，载量1366g/m 2，膜材选用Millipore X0HC。处理完的样品先采用阴离子交换层析，载量108.5g/L，填料为Cytiva Q Sepharose Fast Flow，上样电导率为2.68mS/cm，pH为6.09，上样后收集流穿峰。流穿样品用填料为Gigacap S 650M的阳离子柱进行层析，载量49.2g/L，洗脱pH为6.02，洗脱液采用20mM PB+105mM氯化钠溶液进行洗脱，收集产物下一步使用。将收集产物预过滤后采用Millipore Viresolve Pro进行除病毒过滤及除菌过滤后得到最终的预处理抗体。
2.第二批次的抗体预处理
将亲和层析柱(填料Mabselect Sure LX)，采用pH为7.2的20mM磷酸盐缓冲液，150mM的NaCl溶液进行平衡。将含有Sacituzumab抗体的溶液进行上样，载量41.9g/L。结束后用pH为6.0的20mM PB，1M NaCl的溶液进行至少3个柱体积的洗涤，然后再用pH为5.5的20mM醋酸钠-醋酸缓冲液进行至少3个柱体积的第二次洗涤。洗涤结束后用pH为3.62的20mM的醋酸钠-醋酸溶液进行洗脱。
将收集的洗脱液在室温条件下，采用枸橼酸调节pH为3.69进行孵育，灭活2h后采用2M的Tris溶液中和得到的样品。将上述样品通过深层过滤进行澄清处理，载量1394.9g/m 2，膜材选用Millipore X0HC。处理完的样品先采用阴离子交换层析，载量107.7g/L，填料为GE Q Sepharose Fast Flow，上样电导率为2.71mS/cm，pH为6.07，上样后收集流穿峰。流穿样品用填料为Gigacap S 650M的阳离子柱进行层析，载量48.6g/L，洗脱pH为6.03，洗脱液采用20mM PB+105mM氯化钠溶液进行洗脱，收集产物下一步使用。将收集产物预过滤后采用Millipore Viresolve Pro进行除病毒过滤及除菌过滤后得到最终的预处理抗体。
3.第三批次的抗体预处理
将亲和层析柱(填料Mabselect Sure LX)，采用pH为7.2的20mM磷酸盐缓冲液，150mM的NaCl溶液进行平衡。将含有Sacituzumab抗体的溶液进行上样，载量43.2g/L。结束后用pH为6.0的20mM PB，1M NaCl的溶液进行至少3个柱体积的洗涤，然后再用pH为5.5的20mM醋酸钠-醋酸缓冲液进行至少3个柱体积的第二次洗涤。洗涤结束后用pH为3.58的20mM的醋酸钠-醋酸溶液进行洗脱。
将收集的洗脱液在室温条件下，采用枸橼酸调节pH为3.66进行孵育，灭活2h后采用2M的Tris溶液中和得到的样品。将上述样品通过深层过滤进行澄清处理，载量1447.8g/m 2，膜材选用Millipore X0HC。处理完的样品先采用阴离子交换层析，载量116g/L， 填料为GE Q Sepharose Fast Flow，上样电导率为2.69mS/cm，pH为6.06，上样后收集流穿峰。流穿样品用填料为Gigacap S 650M的阳离子柱进行层析，载量52.8g/L，洗脱pH为6.0，洗脱液采用20mM PB+105mM氯化钠溶液进行洗脱，收集产物下一步使用。将收集产物预过滤后采用Millipore Viresolve Pro进行除病毒过滤及除菌过滤后得到最终的预处理抗体。
对上述三个批次各步骤收集的样品采用离子交换色谱法进行IEC纯度检测，采用SEC-HPLC法进行SEC纯度检测，结果如下表所示。
表1纯度检测结果
由表1可见，采用本发明工艺生产的三个批次的抗体，各项纯度指标均符合要求，可以用于后续抗体药物偶联物的制备。
对上述三个批次各步骤收集的样品进行DNA残留和HCP残留检测，其中，残留DNA采用荧光定量PCR法检测，残留HCP采用ELISA法检测，结果如下表所示。
表2残留物质检测结果
由表2可见，采用本发明工艺生产的三个批次的抗体，DNA残留和HCP残留均符合要求，可以用于后续抗体偶联药物的制备。
实施例2抗体药物偶联物的制备
取Sacituzumab抗体用0.25mL含有20mM PB、150mM NaCl和5mM依地酸二钠的溶液(pH 7.6)稀释，调节pH至7.4，加入10mM TCEP作为还原剂，将待偶联药物与Sacituzumab抗体进行偶联，二者混匀后室温静置2h，完毕后加入半胱氨酸终止反应。最后采用G-25凝胶柱将缓冲液进行置换，得到偶联的产物。
该实施例中，分别采用如下结构所示的待偶联药物与Sacituzumab进行偶联得到抗体药物偶联物：
实施例3提高抗体药物偶联物的产品质量
将5mM依地酸二钠调节液添加至缓慢搅拌的经预处理的待偶联抗体(抗体参照实施例1的方法制备)中，采用2M Tris调节pH浓度至碱性。向抗体溶液中加入10mM的TCEP溶液并搅拌混匀，在23.3℃下反应35min后，向该反应体系中加入50mM的待偶联药物溶液，搅拌混匀，室温条件下静置，反应150min后，用1M枸橼酸调节pH为酸性(pH 6.0-7.0)，得目标产物。其中，待偶联药物结构式为
在目标产物中加入硫酸铵调节液，然后经疏水柱层析流穿收集产物，疏水层析柱填料为Butyl Sepharose High Performance，平衡液为pH 6.59的20mmol/L的磷酸缓冲液-硫酸铵溶液，电导66.51mS/cm。选择与平衡液相同的洗脱液进行洗脱，电导为26.93mS/cm。将疏水层析的产物经进一步超滤浓缩后得抗体药物偶联物。
收集上述制备各步骤中间体，用SEC-HPLC法进行检测纯度、用RP-HPLC法检测DAR、用RP-HPLC法检测游离毒素，根据《中国药典》2015年版通则1143凝胶法的规定细菌内毒素进行检测，结果如下表所示。
表3偶联中间体纯度、DAR、游离毒素和细菌内毒素检测结果
由表3可见，采用本发明偶联工艺生产的抗体药物偶联物纯度高，DAR值均一，游离毒素含量和内毒素被有效控制，明显提高了制备的抗体药物偶联物产品质量。
实施例4提高抗体药物偶联物的产品质量
将5mM依地酸二钠调节液添加至缓慢搅拌的经预处理的待偶联抗体(抗体参照实施 例1的方法制备)中，采用2M Tris调节pH浓度至碱性。向抗体溶液中加入10mM的TCEP溶液并搅拌混匀，在23.5℃下反应32min后，向该反应体系中加入50mM的待偶联药物溶液，搅拌混匀，室温条件下静置，反应2.5h后，用1M枸橼酸调节pH为酸性(pH6.0-7.0)，得目标产物。其中，待偶联药物结构式为
在目标产物中加入硫酸铵调节液，然后经疏水柱层析流穿收集产物，疏水层析柱填料为Butyl Sepharose High Performance(GE公司)，平衡液为pH 6.59的20mmol/L的磷酸缓冲液-硫酸铵溶液，电导66.69mS/cm。洗脱液与平衡液相同，电导为27.16mS/cm。将疏水层析的产物经进一步超滤浓缩后得抗体药物偶联物。
对上述制备各步骤中间体的纯度、DAR、游离毒素以及细菌内毒素进行检测(检测方法同实施例3)，结果如下表所示。
表4偶联中间体纯度、DAR、游离毒素和细菌内毒素检测结果
由表4可见，采用本发明偶联工艺生产的抗体药物偶联物纯度高，DAR值均一，游离毒素含量和内毒素被有效控制，明显提高了制备的抗体药物偶联物产品质量。
实施例5提高抗体药物偶联物的产品质量
将5mM依地酸二钠调节液添加至缓慢搅拌的经预处理的待偶联抗体(抗体参照实施例1的方法制备)中，采用2M Tris调节pH至碱性。向抗体溶液中加入10mM的TCEP溶液，搅拌混匀，在22.3℃下反应35min后，向该反应体系中加入50mM的待偶联药物 溶液，搅拌混匀，室温条件下静置，反应153min后，用1M枸橼酸调节pH为酸性(pH 6.0-7.0)，得目标产物。其中，待偶联药物结构式为
在目标产物中加入硫酸铵调节液，然后经疏水柱层析流穿收集产物，疏水层析柱填料为Butyl Sepharose High Performance(GE公司)，平衡液为pH 6.51的20mmol/L的磷酸缓冲液-硫酸铵溶液，电导66.66mS/cm。洗脱液与平衡液相同，电导为26.98mS/cm。将疏水层析的产物经进一步超滤浓缩后得抗体药物偶联物。
对上述制备各步骤中间体的纯度、DAR、游离毒素以及细菌内毒素进行检测(检测方法同实施例3)，结果如下表所示。
表5偶联中间体纯度、DAR、游离毒素和细菌内毒素检测结果
由表5可见，采用本发明偶联工艺生产的抗体药物偶联物纯度高，DAR值均一，游离毒素含量和内毒素被有效控制，明显提高了制备的抗体药物偶联物产品质量。
以上所述仅为本发明得较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明得精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。另外各实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础；当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

Claims (16)

  1. 一种提高抗体药物偶联物产品质量的方法，包括：
    (1)将待偶联药物与抗体进行偶联，获得所述抗体药物偶联物；
    (2)纯化所述抗体药物偶联物：向所述抗体药物偶联物中加入调节液，经柱层析流穿收集产物，产物经进一步超滤和/或渗滤浓缩后得产品质量提高的抗体药物偶联物；
    所述待偶联药物结构如式(I)所示：
    D-[L 1-(L 2) m1-(L 3) m2-(L 4) m3-E]-G
    式(I)
    其中，
    L 1为 其中，各R 1和R 2各自独立地为氢、卤素、羧酸基、磺酸基、氰基、C 1-6烷基、卤代C 1-6烷基、氰基取代的C 1-6烷基(例如-CH 2CN)、C 1-6烷氧基、C 2-10烯基或C 2-10炔基；Z 1为氨基酸或2-10个氨基酸组成的肽；x 1和x 2各自独立地为0、1、2、3、4、5或6；并且L 1的1位置处与D相连、L 1的2位置处与L 2相连；
    L 2为 或不存在；其中，y 1为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且L 2的1位置处与L 1相连、L 2的2位置处与L 3相连；
    L 3选自5-12元杂芳环或不存在；
    L 4为 其中Z 2选自C 1-6亚烷基、C 2-10亚烯基、C 2-10亚炔基、C 3-8亚环烷基和5-6元杂芳基；R 3选自H和C 1-6烷基；Z 3不存在或者选自C 1-6亚烷基；或者，R 3与Z 3连同其所连接的氮原子形成4-8元杂环基；α为0、1、2、3、4、5或6，并且L 4的2位置处与E相连、L 4的1位置处与L 3相连；
    E为 其中，各R 4独立地为氢，β为0、1或2，并且E的2位置处与G相连、E的1位置处与L 4相连；
    m 1、m 2和m 3各自独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
    D为生物活性分子片段；
    G为亲核取代反应的离去基团；优选地，G选自卤素、磺酰基、磺酸酯基、或硝基。
  2. 一种提高抗体药物偶联物产品质量的方法，其特征在于，向预处理的抗体中加入浓度为5-20mM的还原剂，混匀进行还原反应，然后加入待偶联药物，搅拌静置后加入酸性溶液；向上述步骤的产物中加入调节液，经柱层析流穿收集产物，产物经进一步超滤和/或渗滤浓缩后得产品质量提高的抗体药物偶联物；
    所述待偶联药物的结构如权利要求1中的式(I)所示。
  3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待偶联药物选自如下所示的化合物：
  4. 权利要求1-3任一项所述的方法，所述柱层析为疏水层析；
    优选地，所述疏水层析包括平衡和洗脱的步骤；优选地，所述平衡步骤为在pH为6-7条件下，采用20mmol/L的磷酸缓冲液-硫酸铵溶液平衡，电导率控制在50-80mS/cm。
  5. 权利要求4任意一项所述的方法，所述柱层析为疏水层析；
    优选地，所述疏水层析包括平衡和洗脱的步骤；优选地，所述平衡步骤为在pH为6-7条件下，采用20mmol/L的磷酸缓冲液-硫酸铵溶液平衡，电导率控制在62-70mS/cm。
  6. 权利要求1-5任一项所述的方法，所述洗脱步骤为在pH 6-7条件下，使用与平衡液相同的溶液作为洗脱液，电导率控制在22-30mS/cm。
  7. 权利要求1-6任一项所述的方法，所述调节液为硫酸铵溶液。
  8. 权利要求1-7任一项所述的方法，步骤(1)所述抗体药物偶联物通过以下方法获得：向经过预处理后的抗体中加入浓度为5-20mM的还原剂溶液，然后将待偶联药物加入反应体系，搅拌静置后加入酸性溶液，获得所述抗体药物偶联物。
  9. 权利要求8所述的方法，其特征在于下述的一项或多项：
    1)所述还原剂为TCEP(三(2-羧乙基)膦)；
    2)用所述还原剂处理所述抗体10min-2h，例如30min-1h；
    3)在室温条件下用所述还原剂处理所述抗体；和/或所述反应在4-37℃进行，例如18-26℃；
    4)将所述待偶联药物加入所述反应体系后搅拌5-15min，而后静置反应，优选地，静置1h-12h，例如1h-6h，1h-4h，1h-3h，1.5h-3h，1.5h-2.5h；
    5)所述酸性溶液为枸橼酸溶液或醋酸溶液，用所述酸性溶液调节所述反应体系pH至酸性；优选地，所述酸性溶液调节所述反应体系pH至4.5-7.0；进一步优选地，所述酸性溶液调节所述反应体系pH至6.0-7.0；
    6)所述还原反应中，抗体的投料浓度为10-25g/L；
    7)所述待偶联药物的投料浓度为10-70mM，优选50mM。
  10. 权利要求8或9所述的方法，所述抗体预处理步骤包括向抗体中加入依地酸二钠溶液，采用Tris溶液调节pH的步骤，
    优选地，所述依地酸二钠溶液的浓度为2-10mM，Tris溶液的浓度为1-3M。
  11. 权利要求8或9所述的方法，所述抗体预处理步骤包括向抗体中加入依地酸二钠溶液，采用Tris溶液调节pH的步骤，所述依地酸二钠溶液的浓度为2-10mM，Tris溶液的浓度为2M。
  12. 权利要求8或9所述的方法，所述预处理步骤包括向所述抗体中加入依地酸二钠溶液，采用磷酸盐调节pH的步骤；
    优选地，所述磷酸盐为磷酸钠盐；进一步优选地，所述磷酸钠盐为磷酸氢二钠；
    优选地，所述依地酸二钠溶液的浓度为2-10mM，所述磷酸氢二钠溶液的浓度为0.2-2M，优选1M。
  13. 权利要求1-12任一项所述的方法，所述抗体在预处理之前还经过纯化处理，所述纯化包括层析和过滤的步骤，所述层析选自亲和层析、阴离子交换层析和/或阳离子交换层析；
    优选地，所述纯化依次包括亲和层析、孵育、深层过滤、阴离子交换层析以及阳离子交换层析，不包括超滤或渗滤步骤。
  14. 权利要求1-13任一项所述的方法，所述抗体为抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗Trop-2抗体；优选的，所述抗Her2抗体为Trastuzumab或Pertuzumab，抗EGFR抗体为Cetuximab或Nimotuzumab，抗PD-1单抗为Nivolumab或Pembrolizumab，抗PD-L1单抗为Atezolizumab或Durvalumab，抗Trop-2抗体为Sacituzumab或Datopotamab。
  15. 权利要求1-14任一项所述的方法，所述待偶联药物为带连接臂的小分子化合物，所述小分子化合物选自DNA拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白抑制剂或它们的衍生物；优选的，所述拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂；优选的，所述拓扑异构酶I抑制剂为喜树碱、SN-38、伊立替康、拓扑替康、贝洛替康、卢比替康或它们的衍生物；优选的，所述拓扑异构酶II抑制剂为放线菌素D、阿霉素、多柔比星、多卡米星，柔红霉素、米托蒽醌、鬼臼毒素、依托泊苷或它们的衍生物；优选的，所述微管蛋白抑制剂为长春花生物碱类、长春新碱、长春碱、紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛或他们的衍生物。
  16. 权利要求1-15任意一项所述的方法，所述抗体为Sacituzumab；所述待偶联药物结构如下所示：
    优选地，所述抗体药物偶联物结构如下：
    其中，γ为1-10；优选地，γ为5-8；优选地，所述连接臂与Sacituzumab的巯基连接。
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