RU2806913C1 - Способы получения биоконъюгатов для печень-специфической направленной модуляции протеома - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения конъюгата антитело-лиганд, в котором лиганд представляет собой молекулу, способную связываться с рецептором ASGPR. Способ включает стадии активации лиганда в процессе последовательного взаимодействия с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимидом в фосфатном или фосфатно-солевом буфере при рН 5,0-7,0 с образованием N-гидроксисульфосукцинимид-эфира лиганда и биоконъюгации, в процессе которой N-гидроксисульфосукцинимид-эфир лиганда взаимодействует с первичной аминогруппой антитела в фосфатном или фосфатно-солевом буфере при рН 7,2-7,4. Изобретение расширяет арсенал способов биоконъюгации. 4 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 3 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно, к получению биоконъюгатов для печень-специфической направленной модуляции протеома, которые могут быть использованы для терапии широкого спектра заболеваний, в основе которых лежит дисбаланс активности или концентрации белков. Получаемые биоконъюгаты вызывают печень-специфическую направленную деградацию нежелательных компонентов протеома. За счет этого они могут быть направлены, в частности, на повышение эффективности противоопухолевой терапии и на решение проблемы лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

Предшествующий уровень техники

Модулирование функций большинства белков обеспечивается направленным протеолизом и дальнейшей деградацией в протеасомах и лизосомах.

В 2020 году группой ученых во главе с К. Бертоцци описан вариант способа направить этот естественный процесс на решение медицинских задач, а именно метод направленной деградации мембранных белков с помощью гликоконъюгатов, получивший название LYTAC [Banik SM, Pedram K, Wisnovsky S, Ahn G, Riley NM, Bertozzi CR. Lysosome-targeting chimaeras for degradation of extracellular proteins. Nature. 2020 Aug;584(7820):291-297. doi: 10.1038/s41586-020-2545-9. Epub 2020 Jul 29. PMID: 32728216]

Терапевтическая ценность молекул вида антитело-линкер-лиганд, где антитело способно специфически связывать мишень, расположенную на поверхности клеток (например, клеточный рецептор), а лиганд представляет собой фрагмент, опосредующий транспортировку в лизосомы (в частности, лиганд к маннозо-6-фосфатному рецептору), потенциально очень высока. С помощью таких молекул можно подвергать деградации как мембранные (поверхностные), так и внеклеточные белки, ответственные за развитие разного рода заболеваний.

В 2021 году метод LYTAC был усовершенствован: был описан метод печень-специфической направленной деградации белков-мишеней посредством антител, конъюгированных с лигандами ASGPR1 рецептора [Ahn G, Banik SM, Miller CL, Riley NM, Cochran JR, Bertozzi CR. LYTACs that engage the asialoglycoprotein receptor for targeted protein degradation. Nat Chem Biol. 2021 Sep;17(9):937-946. doi: 10.1038/s41589-021-00770-1. Epub 2021 Mar 25. PMID: 33767387; PMCID: PMC8387313.]. Обе вариации LYTAC отражены в международной заявке компании Lycia Therapeutics WO 2021/142377.

Однако предлагаемые группой Бертоцци биоконъюгаты и схема их синтеза целесообразны для доказательства концепции направленной деградации белков посредством лизосом, но обнаруживают свою непригодность при переходе к синтезу минимальных промышленно значимых количеств биоконъюгатов.

Так, известно, что распространенной проблемой при синтезе лекарственных биоконъюгатов являются остаточные количества токсичных органических растворителей [https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0003267014010927]. При этом известно, что при биоконъюгации, описанной группой Бертоцци, присутствует диметилсульфоксид (ДМСО), токсичность которого хорошо известна.

Соответственно, требуется стадия очистки результирующего биоконъюгата. Однако даже она не решает проблемы денатурации белка, уже произошедшей при контакте с растворителем. Действительно, проводя синтез аналогично предлагаемому группой Берточчи, с использованием органических растворителей, мы столкнулись с низким выходом биоконъюгатов, предположительно связанным с тем, что антитела агрегируют и задерживаются на мембране фильтра.

В статье Zhou Y. et al. Development of Triantennary N-Acetylgalactosamine Conjugates as Degraders for Extracellular Proteins // ACS Cent. Sci. 2021, 7, 3, 499–506 описано получение конъюгатов тримерного GalNAc с антителом с образованием бифункциональных молекул, которые могут избирательно направлять внеклеточные белки в лизосомы клеток печени для деградации. Синтез, предложенный этой научной группой, требует отдельной стадии активации лиганда с карбокси-формой (PEG)4-линкера с помощью смеси N-гидроксисукцинимид (NHS) / 1,3-дициклогексилкарбодиимид (DCC) в среде диметилформамида (ДМФ). При этом не происходит освобождения активированного лиганда от непрореагировавших компонентов. Соответственно, целевое антитело в процессе конъюгации смешивают с раствором лиганда в органическом растворителе, что, как и в случае синтеза, предложенного группой Бертоцци, может влиять на конформацию и функциональность целевого антитела в процессе конъюгации, особенно при высоком молярном соотношении антитела к линкеру (в публикации используют соотношение 1:25, указывая, что чем выше это соотношение, тем более выраженный эффект воздействия на целевой белок). Кроме того, неиспользованный избыток карбодиимидного компонента, 1,3-дициклогексилкарбодиимида (DCC), в составе этой смеси способен активировать случайные карбоксильные группы в целевом антителе и вызывать внутримолекулярную или межмолекулярную сшивку, что, как известно, приводит к образованию нефункциональных форм конъюгатов и их агрегации в результате кросс-сшивки (https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/dicyclohexylcarbodiimide).

Раскрытие изобретения

Технической задачей изобретения является разработка способа получения молекул биоконъюгатов, способных вызывать направленную деградацию белков, вовлеченных в патологические процессы, обеспечивающего высокий выход получаемых биоконъюгатов с сохранением специфичности антитела в составе получаемого биоконъюгата.

Для этого предложен способ получения конъюгатов антитело-лиганд для печень-специфической модуляции протеома, в которых лиганд представляет собой молекулу, способную связываться с рецептором ASGPR, выбранную из группы, состоящей из

где n – целое число, выбранное из диапазона 3-12,

и

где R₁ представляет собой ,

R₂ и R₃ независимо выбраны из C₃-C₁₀-алкила или C₃-C₁₀-алкилоксида, имеющего от 1 до 5 атомов кислорода,

m – целое число, выбранное из диапазона 1-3;

включающий стадии:

- активации лиганда в процессе последовательного взаимодействия с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимидом в фосфатном или фосфатно-солевом буфере при рН 5.0-7.0 с образованием N-гидроксисульфосукцинимид-эфира лиганда;

- биоконъюгации, в процессе которой N-гидроксисульфосукцинимид-эфир лиганда взаимодействует с первичной аминогруппой антитела в фосфатном или фосфатно-солевом буфере при рН 7.2-7.4.

В некоторых вариантах изобретения антитело представляет собой моноспецифическое или биспецифическое антитело или фрагмент антитела, содержащий по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи, связывающееся с мишенью, выбранной из группы, состоящей из EGFR, VEGF-A, VEGFR2, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PDGFRα, HER2, LOXL2 и PCSK9. В некоторых частных вариантах изобретения антитело представляет собой цетуксимаб.

В некоторых вариантах изобретения лиганд представляет собой лиганд формулы (I), в котором n – целое число, выбранное из диапазона 5-9. В некоторых частных вариантах изобретения лиганд представляет собой лиганд формулы (I), в котором n=5 (36-[[2-(ацетиламино)-2-дезокси-β-D-галактопиранозил]окси]-21,21-бис[[3-[[3-[[5-[[2-(ацетиламино)-2-дезокси-β-D-галактопиранозил]окси]-1-окопентил]амино]пропил]амино]-3-оксопропокси]метил]-19,26,32-триоксо-4,7,10,13,16,23-гексаокса-20,27,31-триазагексатриаконтановую кислоту). Этот вариант лиганда далее обозначен как triGalNac.

В некоторых вариантах изобретения молярное соотношение антитела и лиганда составляет от 1:7.5 до 1:45.

В результате осуществления изобретения достигаются следующие результаты:

- разработан новый способ получения молекул конъюгатов, способных вызывать направленную деградацию белков, вовлеченных в патологические процессы;

- разработанный способ исключает использование органических растворителей, что существенно влияет на химическую чистоту и качество получаемых конъюгатов, поскольку использование органических растворителей, с одной стороны, может отрицательно влиять на конформацию и функциональность целевого антитела в процессе конъюгации, а во-вторых требует дополнительной очистки полученных конъюгатов, которая, тем не менее, не может полностью исключить поврежденные органическими растворителями формы антител и примеси;

- разработанный способ предполагает использование реагентов (как то: растворителей; реагентов, используемых для активации лиганда и для остановки синтеза, и пр.), в минимальной степени вызывающих денатурацию белковых молекул, что сводит к минимуму серьезные повреждениям участков антител, входящих в конъюгаты, ответственных за специфическое связывание белков-мишеней, к неспецифическому связыванию таких поврежденных антител и, соответственно, к связанным с этим побочным эффектам;

- разработанный способ обеспечивает высокий выход молекул биоконъюгатов с сохранением специфичности антитела в составе получаемого биоконъюгата;

- получаемые биоконъюгаты обладают высокой растворимостью, благодаря строению линкера (высокому содержанию гидрофильных групп), образующегося в результате синтеза, связывающему антитело и лиганд(-ы), входящие в биоконъюгат.

Определения и термины

Следующие термины и определения применяются в данном документе, если иное не указано явно. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Термин «лечение» означает излечение, замедление, остановку, либо реверсию прогрессирования заболевания или нарушения. В настоящем документе «лечение» также означает смягчение симптомов, ассоциированных с заболеванием или нарушением.

В рамках изобретения термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарственного (биологически активного) вещества, которое является нетоксичным, но достаточным для обеспечения желаемого терапевтического (профилактического) эффекта. Количество, которое является «эффективным», может варьировать в зависимости от конкретного лекарственного вещества или комбинации веществ, заболевания, тяжести состояния и тому подобного, как известно специалистам в данной области. Такое эффективное количество также может варьировать от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела, общего состояния индивидуума и др. При проведении лечения и/или профилактики введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, чаще в виде курсового введения на протяжении времени, достаточного для достижения терапевтического эффекта (от нескольких дней до недели, нескольких недель и до месяцев), при этом курсы введения лекарственного средства могут проводиться повторно. В частности, при среднетяжелых формах заболевания разовая доза, кратность и/или длительность введения конъюгатов по изобретению могут быть увеличены. Предпочтительно конъюгат по изобретению вводят пациенту в составе фармацевтической композиции, включающей, помимо активного компонента, фармацевтически приемлемые носители и/или наполнители.

Термины «субъект» и «пациент» охватывают любые виды млекопитающих, более предпочтительно, подразумевают человека.

Термин «антитело», в рамках изобретения, относится к моноспецифическому или биспецифическому антителу или фрагменту антитела, содержащему по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи. В частных вариантах термин «антитело» относится к моноклональному антителу (mAb), содержащему две тяжелые цепи и две легкие цепи, или к его антигенсвязывающему фрагменту, в котором присутствует по меньшей мере одна межцепьевая дисульфидная связь, например, фрагменту Fab, Fab’ или F(ab’)2 . Антитела по изобретению могут принадлежать любому изотипу, такому как антитела IgG, IgA или IgM. Предпочтительно, антитело представляет собой антитело IgG, более предпочтительно, антитело IgG1 или IgG2. Антитела могут являться химерными, гуманизированными или человеческими. Предпочтительно, антитела являются гуманизированными. Даже более предпочтительно, антитело представляет собой гуманизированное или человеческое антитело IgG, наиболее предпочтительно, гуманизированное или человеческое mAb IgG1. Антитело может иметь легкие цепи κ (каппа) или λ (лямбда), предпочтительно, легкие цепи κ (каппа), т.е., представлять собой гуманизированное или человеческое антитело IgG1-κ.

В гуманизированных антителах, антигенсвязывающие определяющие комплементарность области (CDR) в вариабельных областях HC и LC происходят из антител из не относящегося к человеку вида, обычно, мыши, крысы или кролика. Эти не относящиеся к человеку CDR могут быть помещены среди человеческих каркасных остатков (FR1, FR2, FR3 и FR4) из вариабельных областей HC и LC. Выбранные аминокислоты в человеческих FR можно заменять на соответствующие исходные аминокислоты из не относящегося к человеку вида для улучшения аффинности связывания, с сохранением в то же время низкой иммуногенности. Альтернативно, выбранные аминокислоты из исходных FR не относящегося к человеку вида заменяют на соответствующие им человеческие аминокислоты для уменьшения иммуногенности, в то же время сохраняя аффинность связывания антитела. Гуманизированные таким образомвариабельные области комбинируют с человеческими константными областями. Термины «моноклональное антитело» и «mAb», в рамках изобретения, относятся к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, т.е., индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Антитела можно получать посредством иммунизации животных смесью пептидов, представляющих желательный антиген. B-лимфоциты выделяют и сливают с клетками миеломы, или отдельные B-лимфоциты культивируют в течение нескольких суток в присутствии кондиционированной среды и фидерных клеток. Супернатанты миеломы или B-лимфоцитов, содержащие продуцированные антитела, тестируют для отбора подходящих B-лимфоцитов или гибридом. Моноклональные антитела можно получать из подходящих гибридом способом гибридомы, впервые описанным в Köhler et al., Nature, 1975, 256, 495-497. Альтернативно, РНК из подходящих B-клеток или лимфомы можно лизировать, можно выделять РНК, подвергать обратной транскрипции и секвенировать. Антитела можно получать способом рекомбинантной ДНК в клетках бактерий, эукариотических животных или растений (см., например, Патент США No. 4816567). «Моноклональные антитела» можно выделять также из фаговых библиотек антител с использованием способов, описанных в данной области, например, в Clackson et al., Nature 199, 1352, 624-628 и Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222, 581-597.

Термин «лиганд» в рамках изобретения – молекула, специфически связывающая асиалогликопротеиновый рецептор (ASGPR).

Термин «конъюгат антитело-лиганд» («конъюгат», «биоконъюгат»), в рамках изобретения, относится к антителу, как определено в настоящем описании выше, с которым конъюгированы один или более лигандов . Количество лигандов, конъюгированных с антителом, обычно обозначают как отношение лиганда (лекарственного средства) к антителу (DAR). Способами конъюгации, как правило, получают гетерогенную смесь различных молекул конъюгатов, т.е. различных вариантов конъюгатов, имеющих различные отношения лиганда к антителу. Таким образом, термин «конъюгат» относится также к таким смесям вариантов конъюгатов. Термин «среднее DAR» относится к среднему DAR популяции таких вариантов DAR. Как хорошо известно в данной области, распределение DAR и нагрузки лиганда можно определять, например, с использованием хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) или обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RPHPLC). HIC является особенно пригодной для определения среднего DAR. В некоторых вариантах изобретения конъюгат антитело–лиганд имеет среднее отношение лиганда к антителу (DAR) по меньшей мере 1,0. В некоторых других вариантах конъюгат антитело–лиганд имеет среднее отношение лиганда к антителу (DAR) по меньшей мере 25,0.

Функциональные части полифункциональных молекул (фрагменты) также могут быть использованы как части моно– и бифункциональных молекул, а также их изоформ и химически модифицированных вариантов.

Терминология использована только для описания функциональных частей молекулы, понимания механизма таргетирования белков-мишеней и не является лимитирующей, возможны другие названия молекул, описанных в данном патенте.

Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Краткое описание рисунков

Фиг.1 – упрощенная схема этапов синтеза активной формы лиганда (1) и конъюгации лиганда с целевым антителом (2).

Фиг.2 – подробная схема активации лиганда triGalNAC.

Фиг.3 – электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS PAGE) конъюгатов, полученных в результате биоконъюгации антитела (цетуксимаб) и лиганда (triGalNac) в реакции с различными молярными соотношениями и буферными системами: A – соотношение антитело:лиганд = 1:45, Б – соотношение антитело:лиганд = 1:15, В – соотношение антитело:лиганд = 1:7.5. Образцы в дорожках: 1) Оригинальный препарат эрбитукс (антитело цетуксимаб), 2) Препарат после ультрафильтрации/диафильтрации (UF/DF) в PBS, 3) Биоконъюгация в PBS при pH 7.4 в течение 1 часа, 4) Биоконъюгация в PBS при pH 7.4 в течение 3 часов, 5) Биоконъюгация в PBS при pH 7.4 в течение ночи, М) Маркер молекулярных масс PageRullerPlus, 6) Препарат после UF/DF в PBS (повтор образца 2), 7) Биоконъюгация в PBS при pH 8.1 в течение 1 часа, 8) Биоконъюгация в PBS при pH 8.1 в течение 3 часов, 9) Биоконъюгация в PBS при pH 8.1 в течение ночи

Фиг.4 – вестерн-блот: деградация EGFR после обработки клеток HepG2 полученной бифункциональной молекулой, содержащей в структуре цетуксимаб и triGalNac, в течение 48 часов. Слева – лизат контрольных клеток, справа – клеток после обработки биоконъюгатом.

Фиг.5 – пролиферативный тест (MTT тест): снижение пролиферации клеток гепатоклеточной карциномы HepG2 после обработки биоконъюгатом цетуксимаб-triGalNac.

Фиг.6 – пролиферативный тест (оценка клеточной плотности): снижение пролиферации клеток гепатоклеточной карциномы HepG2 после обработки биоконъюгатом цетуксимаб-triGalNac.

Фиг.7 - результаты ВЭЖХ: 1 (красный) - профиль ВЭЖХ антитела до модификации; 2-4 профили ВЭЖХ антитела после модификации: 2 (черный) - соотношение АТ : tri-GalNAc-СООН 1:3; 3 (голубой) - соотношение АТ : tri-GalNAc-СООН 1:12; 4 (синий) - соотношение АТ : tri-GalNAc-СООН 1:25.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к получению биоконъюгатов для печень-специфической направленной модуляции протеома, которые могут быть использованы для терапии широкого спектра заболеваний, в основе которых лежит дисбаланс активности или концентрации белков. Для этого предложен способ получения конъюгатов, включающих антитело против интересующей мишени, конъюгированное с лигандами рецептора ASGPR.

На поверхности гепатоцитов представлено порядка 0.5-1 млн. асиалогликопротеиновых рецепторов (ASGPR). Способность ASGPR переносить через мембрану гликозилированные белки, высокая степень экспрессии, быстрый цикл регенерации и преимущественное расположение на поверхности гепатоцитов и клеток гепатоклеточной карциномы делают его перспективной мишенью для адресной доставки биологически активных веществ при лечении заболеваний. ASGPR распознает гликопротеины, несущие лиганды D-галактозы (Gal) и N-ацетил-D-галактозамина (GalNAc), и интернализует их посредством клатрин-опосредованного эндоцитоза. После интернализации и эндосомального закисления ASGPR высвобождает GalNAc (или Gal) и рециркулирует обратно на плазматическую мембрану, в то время как гликопротеины направляются к лизосомам для дальнейшего разрушения в кислых условиях. Такой механизм обеспечивает возможность использования ASGPR как мишень для транспорта целевых соединений в гепатоциты и их дальнейшей деградации в лизосомах, в том числе для деградации внеклеточных белков, включая мембранные белки.

Таким образом, настоящее изобретение относится к методу специфического протеолиза белка-мишени с помощью бифункциональных биоконъюгатов, которые имеют сайт специфического связывания для белка-мишени и сайты связывания с рецепторами и/или корецепторами, опосредующими вовлечение белка-мишени в процесс протеолиза внутри внутриклеточной органеллы.

Настоящее изобретение может быть использовано для получения биоконъюгатов с целью их применения для коррекции патологических процессов разного рода, связанных с качественным и количественным дисбалансом белков, поскольку протеолитический процесс может быть направлен на белки-мишени, ассоциированные с мембраной клеткой, внутриклеточные белки, а также внеклеточные белки. Также в патенте описаны структуры и типы бифункциональных молекул, возможные белки-мишени для терапии и нозологические формы, для которых актуально таргетирование и протеолиз, при этом возможно применение схожих по структуре молекул и белков-мишеней (изоформ и химически модифицированных молекул).

Более конкретно, настоящее изобретение направлено на получение биспецифических конъюгатов, содержащих антитело против интересующей мишени, конъюгированное с лигандами рецептора ASGPR. Результатом связывания такого конъюгата с интересующей мишенью и его взаимодействия с рецептором ASGPR является целевая деградация указанной мишени; при этом мишень выбирается в зависимости от цели терапии.

В частности, предлагаются к лечению заболевания, указанные в Таблице 1, т.к. известно, что в этих случаях клетки участка органа, связанного с развитием патологии, или его микроокружения несут на поверхности ASGPR, который может быть использован для направления белка-мишени, участвующего в патогенезе заболевания, в лизосомы.

В особенности рекомендуются к лечению с использованием синтезируемых молекул те заболевания, при которых несут на поверхности ASGPR непосредственно клетки того участка органа, который связан с развитием патологии. К таким заболеваниям относится, например, гепатоцеллюлярная карцинома, т.к. при этом виде рака злокачественное перерождение испытывают непосредственно гепатоциты, а, как известно, они отличаются высоким уровнем экспрессии ASGPR.

В варианте гепатоцеллюлярной карциномы антитело, входящее в конъюгат согласно изобретению, направлено против белка-мишени, ответственного за рост, инвазию и миграцию клеток гепатоцеллюлярной карциномы. Примерами таких белков-мишеней могут быть рецептор эпидермального фактора роста EGFR; рецепторы, сопряжённые с G-белком (GPCR), включающие связывающие с простагландином Е2 (EP1, EP2, EP3, и EP4); C-C-рецепторы хемокинов (CCR1, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR9); CC-хемокины (например, CCL2, CCL21); нуклеолин; C-X-C рецептор хемокина (CXCR2, CXCR4, CXCR6, CXCR7, XCR1); лиганды рецепторов хемокинов (CXCL5, CXCL9, CXCL12, CXCL16, CX3CL1/CX3CR1); металлопротеазы (MMP2; MMP9; MMP10); трансформирующий фактор роста бета (TGF-β), но не ограничиваясь ими. В варианте других заболеваний антитело, входящее в конъюгат согласно изобретению, направлено против белка-мишени, ответственного за развитие такого заболевания.

В Таблице 1 приведены примеры известных антител, одобренных для лечения указанных заболеваний, или находящихся на поздних стадиях клинических испытаний, или же имеющих многообещающие исследования, свидетельствующие в пользу их эффективности в случае указанных патологий. Соответственно, ожидаемо, что конъюгаты этих антител (или биоаналогов этих антител, или антител, совпадающих по антигенспецифичности, с антителами согласно Таблице 1) с лигандами рецептора ASGPR (ASGPR1) могут иметь терапевтическую эффективность, существенно превосходящую таковую для антител, не конъюгированных с этими лигандами.

Очевидно, что в будущем могут быть разработаны и испытаны более эффективные терапевтические антитела против тех же антигенов, которые также могут быть преобразованы в предлагаемые согласно изобретению конъюгаты по предлагаемой схеме синтеза.

Таблица 1. Заболевания и молекулярные мишени для перспективного использования предлагаемых конъюгатов

Заболевание	Антитело	Белок-мишень (антиген)
Гепатоцеллюлярная карцинома	Нецитумумаб	EGFR
	Цетуксимаб	EGFR
	Панитумумаб	EGFR
	Нимотузумаб	EGFR
	Бевацизумаб	VEGF-A
	Рамуцирумаб	VEGFR2
	Ипилимумаб	CTLA-4
	Тремелимумаб	CTLA-4
	Пембролизумаб	PD-1
	Ниволумаб	PD-1
	Достарлимаб	PD-1
	Атезолизумаб	PD-L1
	Дурвалумаб	PD-L1
Холангиокарцинома	Ипилимумаб	CTLA-4
	Тремелимумаб	CTLA-4
	Пембролизумаб	PD-1
	Ниволумаб	PD-1
	Достарлимаб	PD-1
	Атезолизумаб	PD-L1
	Дурвалумаб	PD-L1
Ангиосаркома	Оларотумаб	PDGFRα
	Ипилимумаб	CTLA-4
	Тремелимумаб	CTLA-4
	Пембролизумаб	PD-1
	Ниволумаб	PD-1
	Достарлимаб	PD-1
	Атезолизумаб	PD-L1
	Дурвалумаб	PD-L1
Вторичный (метастатический) рак печени	Нецитумумаб	EGFR
	Цетуксимаб	EGFR
	Панитумумаб	EGFR
	Нимотузумаб	EGFR
	Трастузумаб	HER2
	Ипилимумаб	CTLA-4
	Пембролизумаб	PD-1
	Ниволумаб	PD-1
	Достарлимаб	PD-1
	Атезолизумаб	PD-L1
Фиброз печени	Симтузумаб	LOXL2
Гиперлипидемия, повышенный риск сердечно-сосудистых заболеваний	Эволокумаб	PCSK9
	Бокоцизумаб	PCSK9
	Алирокумаб	PCSK9

Согласно изобретению, предлагается способ получения бифункциональных биоконъюгатов, которые имеют сайт специфического связывания для белка-мишени и сайты связывания с рецепторами и/или корецепторами, опосредующими вовлечение белка-мишени в процесс протеолиза внутри внутриклеточной органеллы.

В более конкретных вариантах, настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата антитело-лиганд, включающему стадии (см. Фиг.1):

1) Этап №1 - активация лиганда.

На этой стадии происходит преобразование карбоксильной группы лиганда (1) в сульфо-NHS-активированную форму.

Для этого лиганд сначала взаимодействует с карбодиимидным агентом 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (EDC) с образованием сложного эфира лиганда и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида. Далее образовавшийся сложный эфир взаимодействует с сульфо-формой N-гидроксисукцинимидного агента (N-гидроксисульфосукцинимидом, сульфо-NHS) с образованием сложного эфира лиганда и N-гидроксисульфосукцинимида, представляющего собой активированный лиганд. Реакция активации с EDC и сульфо-NHS наиболее эффективна при рН 4.5-7.2 и комнатной температуре (порядка 15-25⁰С). Предпочтительно проведение реакции в фосфатном или фосфатно-солевом буфере с концентрацией от 10 до 100 мМ и pH от 5.0 до 7.0, т.к. это обеспечивает совместимость с последующей реакцией биоконъюгации сульфо-NHS-активированного лиганда с целевым белком. В частных вариантах реакция активации протекает в фосфатном буфере при рН 6.0

Этап №2 – биоконъюгация.

На втором этапе происходит пришивка сульфо-NHS-активированной формы лиганда (1) к целевому антителу. Пришивка активированного лиганда происходит по остаткам первичных аминов в белковой последовательности антитела, преимущественно N-терминальных аминов и аминов лизинов. В предпочтительных вариантах изобретения реакция протекает в фосфатном или фосфатно-солевом буфере при рН 7.2-7.4 и комнатной температуре (порядка 15-25⁰С). Для проведения реакции биоконъюгации целевой активированный эфир лиганда и целевое антитело должны быть предварительно растворены, либо переведены в реакционный буфер, как описано выше. Раствор целевого лиганда и раствор целевого антитела смешивают из расчета различного молярного соотношения антитело : лиганд. Оптимальным диапазоном молярных соотношений является от 1:7.5 до 1:45, причем при повышении доли лиганда в реакционной смеси увеличивается количество лигандов, введенных в молекулу целевого антитела. Химизм реакции биоконъюгации изображен на Фиг.1.

В качестве буферной системы для проведения реакции биоконъюгации могут быть использованы буферные растворы, не содержащие компонентов с карбоксильными и аминогруппами, во избежание инактивации компонентов реакции. Предпочтительными буферными системами для проведения реакции биоконъюгации являются фосфатный или фосфатно-солевой буфер в диапазоне концентраций от 10 мМ до 100 мМ и в диапазоне pH от 7.0 до 7.5, либо карбонатный буфер в диапазоне концентраций от 10 мМ до 100 мМ и в диапазоне pH от 7.5 до 8.0.

Таким образом, в предлагаемом методе активация лиганда и реакция биоконъюгации проводятся в водных растворах, что позволяет минимизировать контакт целевого антитела с органическими растворителями, способными повлиять на его функциональность. Часто подготовка лиганда или его активация проводится в органических растворителях, таких как диметилформамид (ДМФА) и диметилсульфоксид (ДМСО), способных влиять на конформацию белка (On the Structural Stability and Solvent Denaturation of Proteins III. DENATURATION BY THE AMIDES, https://www.jbc.org/article/S0021-9258(18)62563-3/pdf). Для снижения этого влияния процесс биоконъюгации проводили в водных растворах в описанных выше буферных системах.

Предлагаемый оптимизированный процесс синтеза биоконъюгатов позволяет осуществлять остановку одной из стадий синтеза с помощью протеиногенной аминокислоты глицина, которая присутствует в тканях и клетках в норме, не является токсичной и не повреждает белки.

Таким образом, предлагаемый способ синтеза биоконъюгатов проводится всего в две стадии, что приводит к наименьшим потерям молекул антител на этапе конъюгации. При этом в предлагаемом способе синтеза используют реагенты (растворители; реагенты, используемые для активации лиганда и для остановки синтеза, и др.), в минимальной степени вызывающие денатурацию белковых молекул (антител), что позволяет избежать серьезных повреждений их участков, ответственных за специфическое связывание белков-мишеней, а также избежать неспецифического связывания таких поврежденных антител и, соответственно, возможных побочных эффектов (которые при этом затруднительно оценить заранее, на этапе разработки; и которые могут сильно варьировать от партии к партии произведенного биоконъюгата, что несовместимо с современными требованиями к лекарственным молекулам) [On the Structural Stability and Solvent Denaturation of Proteins III. DENATURATION BY THE AMIDES https://www.jbc.org/article/S0021-9258(18)62563-3/pdf. Таким образом, предлагаемые условия синтеза биоконъюгатов решают задачу сохранения специфичности антитела в составе получаемого биоконъюгата.

Дополнительным преимуществом предлагаемого способа синтеза и получаемых конъюгатов является то, что в линкере после биоконъюгации не остается DBCO-группировка. Вместо этого линкер представлен небольшим фрагментом полиэтиленгликоля, ограниченным с двух сторон амидными связями, аналогичными по своей сути и по ожидаемой стабильности пептидным связям, уже присутствующим в живым системах, в том числе и в молекуле конъюгируемого антитела. Известно, что полиэтиленгликоль хорошо совместим с живыми системами, обладает исключительной гидрофильностью и за счет этого широко используется для решения проблемы биодоступности лекарств, - см., например, [https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/nr/d1nr02065j].

Возможность объективного проявления технического результата при осуществлении изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными ниже в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученные в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области.

Следует понимать, что приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Пример 1. Получение биоконъюгата цетуксимаб-triGalNac способом по изобретению

Антитело цетуксимаб выделяли из готового лекарственного препарата Эрбитукс. Для этого препарат очищали от вспомогательных веществ, способных интерферировать с реакцией биоконъюгации. Процедуру перевода целевого антитела из буферной системы хранения в реакционную (пригодную для конъюгации) буферную систему осуществляли с помощью ультрафильтрации. Для этого использовали центрифужные концентраторы UFC905024 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters Ultracel - 50K (MerkMillipore). Замену буфера проводили на фосфатно-солевой буфер, приготовленный из таблеток P4417-100TAB Phosphate buffered saline (Sigma) и деионизованной воды из расчета 1 таблетка на 200 мл воды.

2 мл препарата Эрбитукс распределяли по 1 мл в 2 пробирки Amicon 50K, проводили процесс ультрафильтрации/диафильтрации следующим образом: к 1 мл образца добавляли 9 мл буфера, проводили центрифугирование на центрифуге Termo Scientific SL16R, в бакет-роторе со вставками для 50 мл пробирок при 4С и 4000g (RCF) в течение 10 мин, повторяли процедуру концентрирования-разбавления трижды. Таким образом, при снижении содержания исходного буфера не менее, чем в 1000 раз, содержание интерферирующих веществ становится пренебрежимо мало. Полученный в результате концентрат в фосфатно-солевом буфере объединяли в 1 пробирке, доводили этим же буфером до объема 1.9-2 мл. Далее проводили спектрофотометрическое измерение концентрации c использованием кюветы для микрообъемов µCuvette G1.0 с длиной оптического пути 1 мм по поглощению при длине волны 280 нм на спектрофотометре Eppendorf Biospectrometer Kinetic. Потерь целевого белка (цетуксимаба) за счет агрегации и преципитации в процессе ультрафильтрации в реакционную буферную систему не наблюдалось. Ретентат остается прозрачным.

Для получения активного эфира лиганда, способного формировать амидные связи с первичными аминами целевого белка (антитела цетуксимаба) проводили реакцию активации карбоксильной группы с помощью карбодиимидного агента EDC (, Thermo Scientific, Product No. 22980) и сульфо-формы N-гидроксисукцинимидного агента (Thermo Scientific, Product No. 24510). Схема реакции приведена на Фиг.2. Реакцию конъюгации цетуксимаба и сульфо-NHS-эфира лиганда triGalNac проводили при различном значении pH, молярном соотношении антитело : лиганд и длительности инкубации. Варианты приведены ниже:

Таблица 2. Варианты применяемых параметров конъюгации

pH	Молярное соотношение
	1:7.5	1:15	1:45
pH 7.4	1 час	3 часа	ON (~17 часов)
pH 7.4	1 час	3 часа	ON (~17 часов)
pH 7.4	1 час	3 часа	ON (~17 часов)
pH 8.1	1 час	3 часа	ON (~17 часов)
pH 8.1	1 час	3 часа	ON (~17 часов)
pH 8.1	1 час	3 часа	ON (~17 часов)

ON – overnight, инкубация в течение ночи (~17 часов).

Оценку изменения молекулярной массы цепей антитела проводили с помощью восстанавливающего денатурирующего СДС-ПААГ (градиент 4-15%) электрофореза с окраской геля с помощью реагента на базе красителя кумасси синего. Проводили гель-документирование на приборе ThermoFisher Invitrogen iBright 1500 в режиме для кумасси синего. Результаты измерений приведены на Фиг.3.

Подтверждением образования ковалентной связи между белком и лигандом является наличие сдвига в область более высокой молекулярной массы тяжелой и легкой цепей биоконъюгата относительно немодифицированной формы антитела. На дорожках 3-5, где были нанесены биоконъюгаты цетуксимаб–triGalNac, виден сдвиг полосы вверх относительно контрольных дорожек 1-2, где нанесен оригинальный препарат цетуксимаб, что подтверждает успешность проведенной конъюгации (увеличение молекулярной массы за счет конъюгации антитела с triGalNac). Аналогичные результаты получены для препаратов, конъюгированных в буферном растворе с pH 8.1.

Пример 2. Оценка функциональной активности полученного биоконъюгата цетуксимаб-triGalNac

Белок EGFR экспрессирован в 60% случаев на поверхности клеток гепатоклеточной карциномы и обуславливает их пролиферацию, а такжебуфером Pierce™ Clear Milk (10X) мембрана была инкубирована с первичными антителами против EGFR, клон С4. Представленный на Фиг.4 Вестерн-блот имеет две дорожки, первая – контроль обработки (DMSO), вторая – обработка клеток бифункциональной молекулой, 30 нM. В качестве контроля house keeping белка был использован актин. Как следует из представленных данных, конъюгат цетуксимаб-triGalNac вызывает эффективную целевую деградацию EGFR.

2. Оценка функциональной активности биоконъюгата методом пролиферативного теста (МТТ-тест и тест оценки клеточной плотности).

Оценка пролиферативной активности спустя 96 часов после обработки молекулами биоконъюгата цетуксимаба и triGalNac (соотношение молярности 1:15) проводилась с помощью пролиферативного MTT теста и теста оценки клеточной плотности.

Клетки гепатоклеточной карциномы (HepG2) были разделены на несколько групп: 1. контрольная группа (клетки, обработанные DMSO); 2. клетки, обработанные Цетуксимабом (Ctx) в концентрациях 15 нМ; 3. клетки, обработанные биоконъюгатом цетуксимаб-triGalNac в концентрации 5 нМ; 4. клетки, обработанные биоконъюгатом цетуксимаб-triGalNac в концентрации 12.5 нМ.

Проведение MTT теста: Клетки высеяли в 96-луночный планшет с плотностью 175000 клеток/лунку и инкубировали в среде DMEM в течение 24 часов. Затем сменили среду на OptiMeM и инкубировали 24 ч. Далее в соответствующие лунки добавили DMSO, молекулы биоконъюгата цетуксимаб-triGalNaс различной концентрацией (5 нМ и 12.5 нМ) и инкубировали ещё 24 часа. После этого из каждой лунки отобрали по 100 мкл среды и добавили по 10 мкл 5 мг/мл 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромида (МТТ) и инкубировали в течение ночи. Утром добавили, предварительно растворённый в 1 мл HCl (0,01M), SDS из расчёта 100 мкл на каждую лунку и инкубировали в течение 4 часов при 37˚С. Измерение поглощения (А) считывали при 570 нм с помощью планшетного (спектро)фотометра Spark 10M. В данном методе принималось, что поглощение при 570 нм по завершении теста позволяет говорить о числе живых клеток в лунке планшета.

В результате MTT теста было показано снижение пролиферации клеток гепатоклеточной карциномы HepG2 после обработки биоконъюгатом цетуксимаб –triGalNac в концентрации 12.5 нМ (группа 4) по сравнению с контролем. Обработка клеток цетуксимабом (2) и обработка клеток цетуксимаб–triGalNac в концентрации 5 нМ (группа 3) не снижала пролиферацию клеток.

Тест оценки клеточной плотности: Клетки высеяли в 96-луночный планшет с плотностью 175000 клеток/лунку и инкубировали в среде DMEM в течение 24 часов. Затем сменили среду на OptiMeM. Далее в соответствующие лунки добавили DMSO, молекулы биоконъюгата цетуксимаб-triGalNaс различной концентрацией (5 нМ и 12.5 нМ) и инкубировали 48 часов. Автоматическую оценку конфлуэнтности (клеточной плотности) проводили на планшетном спектрофотометре Spark 10M. В результате было показано снижение пролиферации клеток гепатоклеточной карциномы HepG2 после обработки биоконъюгатом цетуксимаб–triGalNac в концентрации 12.5 нМ (группа 4) по сравнению с контролем (группа 1). Обработка клеток цетуксимабом (группа 2) и обработка клеток цетуксимаб–triGalNac в концентрации 5 нМ (группа 3) не влияла на пролиферацию клеток.

В обоих пролиферативных тестах полученный биоконъюгат показал существенное преимущество над цетуксимабом без конъюгированного лиганда, что свидетельствует об эффективном специфическом связывании и функциональной активности конъюгатов, полученных предлагаемым способом.

Пример 3. Получение биоконъюгата цетуксимаб-triGalNac способом, в соответствии с описанным в публикации Zhou Y. et al. Development of Triantennary N-Acetylgalactosamine Conjugates as Degraders for Extracellular Proteins // ACS Cent. Sci. 2021, 7, 3, 499–506

Экспериментальное антитело (цетуксимаб) растворили в 1 мл натрий-фосфатном буфере (PBS), отобрали 200 мкл. Концентрацию проверяли по поглощению на спектрофотометре Nabi в капле 5 мкл. Поглощение 0.152 О.Е. при 280 нм приняли соответствующим концентрации 1 мг/мл. Добавили 4 мл PBS и обессолили на центрифужном фильтре 10 кДа Amicon, сконцентрировав до объема 200 мкл. Концентрация по спектрофотометру не изменилась. Из 200 мкл раствора экспериментального антитела после промывки отбирали по 60 мкл в три реакции (по 0. 35 нмоль). Оставшиеся 20 мкл использовали для аналитики (SEC-HPLC).

Синтез эфира:

1 мг tr-GalNAc растворили в 40 мкл N,N-Диметилформамида (ДМФ), отобрали 4 мкл (58 нмоль).

1,3-дициклогексилкарбодиимид (DCC) (0.88 мг) растворили в 100 мкл ДМФ, отобрали 2 мкл (0.018 мг, 87 нмоль).

N-гидроксисукцинимид (NHS) (0.67 мг) растворили в 100 мкл ДМФ, отобрали 3 мкл (0.020 мг, 174 нмоль).

К раствору triGalNAc добавили раствор DCC, затем раствор NHS. Общий объем реакции составил 9 мкл. Реакцию выдержали 1 час при комнатной температуре.

Конъюгирование с антителом:

Реакционную смесь разбавили в 10 раз добавлением 81 мкл ДМФ и добавили в эппендорфы с антителом: по 2 мкл (1:3, 0.35 нмоль: 1.29 нмоль), 7 мкл (1:12 0.35 нмоль: 4.51 нмоль), 14 мкл (1:25 0.35 нмоль:9.02 нмоль). Инкубировали в течение ночи на ротаторе при поддерживаемой температуре 20°С.

Реакционные смеси промывали и концентрировали до 60 мкл на центрифужных фильтрах 10 кДа Amicon Ultra Ultracel-10 regenerated cellulose membrane, 0.5 мл (5 раз по 400 мкл PBS). Поглощение на спектрофотометре Nabi показало, что в последней реакции вещества мало (см. Таблицу 3).

Таблица 3. Результаты измерения поглощения

реакция 1:3		Ср.знач.	реакция 1:12		Ср.знач.	реакция 1:25		Ср.знач.
О.Е.	0.195		О.Е.	0.174		О.Е.	0.126
	0.195	0.195		0.173	0.1735		0.13	0.128
Концентрация, мг/мл		1.24			1.10			0.81

В промывке вещества не оказалось. Возможно, модифицированное экспериментальное антитело остается на мембране из-за своей структуры; или слишком большое содержание ДМФ в реакции негативно влияет на мембрану.

Для дополнительного анализа наличия в растворах конъюгата была проведена ВЭЖХ.

Условия ВЭЖХ:

Колонка BioSep™ 5 мкм SEC-s2000 145 Å, LC Column 300 x 4.6мм.

Скорость 0.5 мл/мин.

Пики с Rt 6.8 и Rt 8.2 – буфер PBS.

Результаты ВЭЖХ приведены на Фиг.7 (для наглядности все 4 полученные хроматограммы приведены на одном рисунке). Как видно из рисунка, данные ВЭЖХ коррелируют с данными, полученными на спектрофотометре.

Таким образом, как показали результаты эксперимента, выход конъюгата в результате проведенной реакции оказался крайне низок. Скорее всего, это связано с тем, что антитела в процессе конъюгации агрегируют и задерживаются на мембране фильтра. В связи с этим, известный способ получения конъюгатов антител и лигандов рецептора ASGPR имеет существенные ограничения для практического применения.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Claims (15)

1. Способ получения конъюгата антитело-лиганд, в котором

лиганд представляет собой молекулу, способную связываться с рецептором ASGPR, выбранную из группы, состоящей из

где n – целое число, выбранное из диапазона 3-12,

и

где R₁ представляет собой ,

R₂ и R₃ независимо выбраны из C₃-C₁₀-алкила или C₃-C₁₀-алкилоксида, имеющего от 1 до 5 атомов кислорода,

m – целое число, выбранное из диапазона 1-3;

включающий стадии:

- активации лиганда в процессе последовательного взаимодействия с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимидом в фосфатном или фосфатно-солевом буфере при рН 5.0-7.0 с образованием N-гидроксисульфосукцинимид-эфира лиганда;

- биоконъюгации, в процессе которой N-гидроксисульфосукцинимид-эфир лиганда взаимодействует с первичной аминогруппой антитела в фосфатном или фосфатно-солевом буфере при рН 7,2-7,4.

2. Способ по п.1, в котором антитело представляет собой моноспецифическое или биспецифическое антитело или фрагмент антитела, содержащий по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и легкой цепи, связывающееся с мишенью, выбранной из группы, состоящей из EGFR, VEGF-A, VEGFR2, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PDGFRα, HER2, LOXL2 и PCSK9.

3. Способ по п.1, в котором лиганд представляет собой 36-[[2-(ацетиламино)-2-дезокси-β-D-галактопиранозил]окси]-21,21-бис[[3-[[3-[[5-[[2-(ацетиламино)-2-дезокси-β-D-галактопиранозил]окси]-1-окопентил]амино]пропил]амино]-3-оксопропокси]метил]-19,26,32-триоксо-4,7,10,13,16,23-гексаокса-20,27,31-триазагексатриаконтановую кислоту.

4. Способ по п.3, в котором антитело представляет собой цетуксимаб.

5. Способ по п.1, в котором молярное соотношение антитела и лиганда составляет от 1:7,5 до 1:45.