CN1177301A - 锗酵母人膳食营养添加剂 - Google Patents

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Abstract

已知当人体摄入含锗化合物时,含锗化合物具有一定的包括化学治疗性能和免疫系统的兴奋作用在内的治疗和预防性能。本发明公开了含有可被新陈代谢形式的含锗酵母的人膳食添加剂,以及其制备方法和用途。尽管已知一些锗化合物是有毒的,但在本发明的营养添加剂中所用的锗酵母产品是更纯的,低毒的和更易被人体新陈代谢的形式。

Description

锗酵母人膳食营养添加剂
相关申请的相互参考文献
本申请为1995年11月8日提交的共同未决暂时系列申请No.60/006,339的部分继续申请。
发明领域
本发明涉及人膳食添加剂，更具体地说，涉及含有含大量细胞内锗的酵母的人膳食添加剂。
背景
众所周知，含锗的化合物摄入人体时具有治疗和预防性能。例如，使用一种特殊的锗化合物羧乙基锗倍半氧化物(GecD6H12O7)来补充人饮食显示出化学治疗价值。[Asai，K.，奇迹治疗：有机锗，(Miracle Cure：Organic Germanium)，Japan Publications Inc.，东京(1980)(“下文引作Asai”)]。人们还知道羧乙基锗倍半氧化物能使人体抗普通的感冒。[见Nakao Ishida等人的US 4,595,882]。羧乙基锗倍半氧化物还用作治疗高血压的膳食添加剂。[见Asai，US 3,793,455]。激发人免疫系统，特别是促进干扰素的产生也认为是羧乙基锗倍半氧化物的重要作用。[见Asai]。
用一些形式的锗作为食品增补剂或化学治疗剂的一个缺点是无机锗化合物如二氧化锗(GeO2)和金属锗的固有毒性。与这些形式的锗相反，羧乙基锗倍半氧化物对人体无毒，其LD50值超过5g/kg。
现有技术的羧乙基锗倍半氧化物作为膳食的应用存在两个缺点。首先，得到纯态的化合物是困难的。由于羧乙基锗倍半氧化物完全是一个合成化合物，并且由于大多数合成都是从对人体有毒的锗开始的，特别是在大量生产时合成产品羧乙基锗倍半氧化物的最终纯度是所要考虑的。其次，用公知技术制备的羧乙基锗倍半氧化物需要大剂量使用。膳食添加剂羧乙基锗倍半氧化物的有效剂量一般为15毫克/天～超过1克/天。(见Asai，P55-65)。由于既然人们不知道被人体实际同化并合成代谢利用的羧乙基锗倍半氧化物的量有多少，人们就认为化合物的这些高剂量是必需的。人们通常相信相当大的剂量对于最大益处是重要的，并建议一种人体未曾使用过的被吸收锗的适宜用量。
由于来源于酵母的这些形式锗更易被人体利用，因此人们认为这些形式的锗作为膳食添加剂或治疗剂具有较大的价值。由于来源于酵母的锗比其它形式的锗更易于被代谢，因此只需要吸收较少的锗即可实现锗的预期的保健效益。
含有金属离子的酵母制剂并不是新的。已报导了一种制备来源于酵母的可新陈代谢的铬的方法。[见，如Skogerson，US 4,348,483]。铬酵母的有益方面以及其与无机形式的锗相比的较高的营养性质已经得到确认。[见，如Shepard，生物微量元素研究(Biol.Trace Elem.Res.)，32：109-113(1992)，其中报导了铬酵母在小鼠adipocytes中用来增强胰岛素作用的用途]。金属锡以无机形式如SeQ3Na2施药时一般毒性较大，但作为来源于酵母的物质被消化时则表现出较高的营养价值。[见，如Baerwald，Gordian，94(11)：169-173(1994)]。
Komatsu在JP 77-46138770420中介绍了一种制备来源于酵母的锗的方法。但这种方法涉及用毒性大的形式的锗GeO2作为接种酵母、培养酵母的锗源来制备锗酵母。Komatsu的这种方法的主要缺陷在于由这种方法制得的酵母中含有大量的高毒性、不能新陈代谢的锗，因此不能用作人体膳食添加剂。
本领域中需要一种制备锗酵母的改进方法，其中：(1)酵母产品对人体基本无毒；和(2)由锗酵母制得的锗的化学形式易被人体新陈代谢，因此，对于人类饮食的营养添加剂和用于化学治疗用途来说，它是一种有用的并且明显改进的试剂。
发明概述
本发明克服了现有技术中的缺陷并提供了一种用于制备含有大量细胞内锗的酵母的方法。如前所述，这种可新陈代谢的，基本无毒形式的锗作为膳食添加剂是有用的，并且具有一定的治疗和预防性能。
因此，首先，本发明提供了一种制备锗含量丰富的酵母的方法。
另一方面，本发明提供了一种可被人体新陈代谢的高活性形式的锗的制备方法。
另一方面，本发明提供了一种培养富集锗的啤酒酵母的方法，以及一种对人体基本无毒的来源于酵母的富集锗的产品的制备方法。
另一方面，本发明提供了一种锗含量丰富且基本不含二氧化锗或锗金属的啤酒酵母的制备方法。
另一方面，本发明提供了经过如下加工处理的天然存在的啤酒酵母组合物，即与羧乙基锗倍半氧化物和营养生长培养基反应，从而在酵母中聚集锗。本发明还提供了一种锗活性高、对人体基本无毒并且可被人体大量吸收的干酵母。发明详述
本发明的上述目的是通过由本发明所述的方法制得的、细胞内有机结合的可吸收的锗含量高的本发明之锗酵母而达到的。用本方法制得的本发明的锗酵母产物以一种新型的易被人体新陈代谢的，故作为膳食添加剂更有效验的非合成锗来克服现有技术中由于合成羧乙基锗倍半氧化物的高剂量而产生的前述缺陷。人们认为摄入本发明的含来源于锗的酵母的膳食添加剂时，本发明的膳食添加剂具有锗的营养益处。
制备本发明锗酵母产品的方法一般包括将活酵母细胞在控制酸性条件下的(pH值大于4)悬浮水溶液中与含有非抑制量的羧乙基锗倍半氧化物的水溶液以及适宜的生长培养基相接触以确保酵母的健康生长。然后将酵母培养，分离，巴氏杀菌并干燥，得到含有细胞内锗的干酵母产品。制备所需锗酵母的另一种方法包括下述附加步骤：在生长阶段之前将酵母与羧乙基锗倍半氧化物共同培养一小段时间。
更具体地说，本发明广义地包括一种用于制备锗酵母的方法，包括：
1.将活酵母细胞与羧乙基锗倍半氧化物水溶液接触；
2.将该悬浮液培养约5分钟-约30分钟；
3.加入生长培养基引起生长，并将酵母培养足够的时间令其生长；
4.从水性生长培养基中将酵母细胞分离，并浓缩；
5.洗涤回收到的酵母细胞以除去细胞外锗的悬液液，和
6.将含有大量细胞内锗离子的洗涤过的酵母细胞巴氏杀菌并干燥。
本发明的另一制备方法与上述方法相似，只是除去了步骤(2)。
本发明方法中所用酵母优选食品级或可食用酵母，更优选啤酒酵母(Baker’s yeast)。这些酵母可由市场上购得，如啤酒酵母[红星]。其它可用的酵母包括产蛋白圆酵母和啤酒酵母，卡尔斯伯酵母或其优选名称为葡萄汁酵母[红星]。
用来处理酵母的锗是羧乙基锗倍半氧化物，其浓度为约100ppm-约30,000ppm，更优选为约500ppm-约25,000ppm，和最优选为约1,000ppm-约20,000ppm。Arnold在美国专利US 5,386,046(下文称为“Arnold”)中介绍了一种纯羧乙基锗倍半氧化物的制备方法，在此引入作为参考。本发明所用的羧乙基锗倍半氧化物如Arnold所介绍的，优选来自纯的来源。
该锗是用来制备羧乙基锗倍半氧化物水溶液的。在羧乙基锗倍半氧化物的pH4-7的水溶液中锗的浓度为约100ppm-约20,000ppm。用在水溶液中的羧乙基锗倍半氧化物可在生长培养基或净化水中被稀释。然后将酵母加入水溶液中吸收锗。
然后培养含酵母及羧乙基锗倍半氧化物的溶液。该培养步骤持续约5-约60分钟，更优选为约5-约30分钟，以使酵母吸收锗。在水溶液存在的情况下培养酵母约5分钟-30分钟，使酵母在生长培养基中增长约4-7倍。
然后将生长培养基加入水溶液中，培养酵母约4-约50小时，使其充分生长。生长培养基的营养素包括，但不限于，碳水化合物源如糖蜜。生长培养基中的其它营养盐的实例为氯化钾、硫酸镁和氮，以及磷源如磷酸二氢铵、氨和磷酸。
生长营养基的pH值基本在酸性范围内，特别为约4-约7，或更优选为约4.5-约6，和最优选为约5-约6。可以通过加碱，如NaOH或加酸如硫酸来调节pH。例如，当将三氧化二锗溶于水中时，可用20％的NaOH调节pH。另一个实例是，当在生长培养基中使用糖蜜时，可用硫酸来调节pH。对于某些培养基来说，如麦芽提取物，则不需要调节pH值。本领域技术人员能将pH值调整到规定范围内。生长培养基的温度为20-40℃，更优选为约25℃-约35℃，和最优选为28℃-约32℃。
酵母生长阶段所需的时间应使酵母的细胞内锗含量达到显著水平。意味着酵母细胞繁殖增加至少约1倍(增长100％)-约7倍，优选增加约4倍。酵母生长或发酵的时间一般为至少约4-约50小时，以达到所需的生长程度。
在生长阶段中酵母细胞经繁殖生产出具有所需细胞内锗浓度的酵母细胞后，回收酵母，用离心或其它等效的方法浓缩，并连续用水洗涤以除去细胞外羧乙基锗倍半氧化物以及其它可溶物。所得的经洗涤的酵母细胞的酵母乳的细胞内锗含量较高，然后进行巴氏杀菌并干燥以杀死酵母。用于干燥酵母的方法包括转鼓干燥以及本领域中的其它公知技术。干酵母中的细胞内锗的优选浓度为约800μg-约4,000微克锗/克干酵母固形物。然后将所得的酵母粉可用作有机结合的、可吸收的锗的膳食添加剂。
为了制备或者用作膳食添加剂或者用作治疗剂的本发明的酵母组合物，用常规的复合技术，将干酵母作为紧密混合物中的活性组分与适合的载体结合。根据不同施药形式，如口服、舌下服，鼻服或非肠道服用所需的制剂型式，载体可以是各种形式的。
在制备口服剂型的组合物中，可以用任何常规的药物介质。对于口服液体制剂(如悬浮液、酏剂和溶液)，可以使用的介质包括，如水、油、醇、风味剂、防腐剂、着色剂等。可以使用用于制备口服固体(如粉剂、胶囊、丸剂和片剂)的载体如淀粉、糖稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。也可用控制释放形式。由于他们施药容易，故片剂、丸剂和胶囊代表了最有益的口服剂型，在这种情况下使用的是固体药物载体。如果需要的话，可用常规技术将片剂包上糖衣或肠衣。
用于肠胃外产品的载体尽管还包括其它组分，例如，以助于溶解或用于防腐，但一般包括无菌水。也可制备可注射的悬浮液，在这种情况下可以用适合的液体载体、悬浮剂、辅剂等。
当不经胃肠的施药量为约50微克锗/组合物剂量(1剂量/约75kg体重)至约200微克锗/组合物剂量时，本发明的组合物一般是有效的。这相当于约5毫克/含干酵母锗产品剂量-1克/含干酵母锗产品剂量。当口服时，本发明组合物的用量与本发明不经胃肠施药的组合物的用量大致相同便有效。锗酵母组合物这些剂量的功效使得锗酵母组合物特别适于加工成片剂口服。上述剂量范围对人的用药时间是不同的，如一天两次至至少每周5次。但用量最终将根据使用者具体需要而定。
下面的实施例用来说明本发明的优选实施方案。实施例仅仅是说明性的，并不限制本发明的范围。实施例1.
在这个实施例中，用含20,000ppm的羧乙基锗倍半氧化物[锗试铁灵，Westar Nutrition]的1.0升糖蜜生长培养基(也可用麦芽浸出汁液体培养基)在pH5.2的条件下培养啤酒酵母[红星](固形物1％)。在29℃下培养48小时。在4,000rpm下将混合物离心15分钟，用200mL去离子水洗涤酵母团5次，然后用0.22微米的乙酸纤维素膜[科尔宁瓶顶填料]过滤分离。在80℃气流烘箱中干燥酵母团6小时，得到6.8g浓度为780微克/克酵母的干酵母。锗浓度是用ICP技术测得的。
ICP技术包括以比例200毫克生物质：1.6毫升H2SO4/HClO4/HNO3(3∶1∶1，v/v/v)消化酸将干生物质(即干锗酵母产物)溶解，并消化约20分钟。如果溶解不完全，再加入另外的0.8mL消化酸直到得到澄清的溶液。然后将样品在等离子400顺序感应耦合等离子发射光谱仪(Plasma400 Sequential Inductively Coupled Plasma Emission Spectroscopymachine)[Perkin Elmer]上检测，以含锗的标准物作参照，测得样品中锗的浓度。实施例2.
在200rpm下搅拌的同时，通过加热80℃并持续加热30分钟，使二羧基锗倍半氧化物[Westar Nutrition](2g)在985mL去离子水中溶解。然后将15g的pH4.7的麦芽浸出汁液体培养基(DIFCO)加入三氧化二锗去离子水溶液中。在121℃下将所得混合物压煮15分钟。向其中加入10克活啤酒酵母[红星]，将所得混合物在轻微搅动(200rpm)的条件下培养30小时。将此混合物在4,000rpm下离心15分钟，并用200mL去离子水将酵母团洗涤5次，然后用0.22微米的乙酸纤维素膜[科尔宁瓶顶填料]过滤、分离。在80℃气流烘箱内将酵母团干燥6小时，得到锗浓度为629微克/克酵母的4.5g干酵母团，锗浓度是用实施例1所述的ICP技术测得的。实施例3.
在200rpm下搅拌的同时，通过加热到80℃并持续加热30分钟，使二羧基锗倍半氧化物[Westar Nutrition](1g)在985mL去离子水中溶解。向其中加入pH4.7的152g糖蜜、0.34g KCl、0.34g MgSO4·7H2O和3.36gNH4H2PO4。将所得混合物在121℃下压煮15分钟。向其中加入10克活啤酒酵母[红星]，在轻微搅动(200rpm)的条件下将所得混合物培养30小时。将混合物在4,000rpm下离心15分钟，用200mL去离子水将酵母团洗涤5次，然后用0.22微米的乙酸纤维素膜[科尔宁瓶顶填料]过滤、分离。在80℃气流烘箱内将酵母团干燥6小时，得到5.7g锗浓度为1500微克/克酵母的干酵母团，锗浓度是用实施例1所述的ICP技术测得的。实施例4.
在200rpm下搅拌的同时，通过加热到80℃并持续加热30分钟，使二羧基锗倍半氧化物[Westar Nutrition](1.5g)在985mL去离子水中溶解。在pH5.1的条件下向其中加入24g马铃薯糊精液体培养基[DIFCO]，并将所得混合物在121℃压煮15分钟。向其中加入7.5克啤酒酵母[红星]，在(200rpm)轻微搅动下将所得混合物培养30小时。将混合物在4,000rpm下离心15分钟，用200mL去离子水将酵母团洗涤5次，然后用0.22微米的乙酸纤维素膜[科尔宁瓶顶填料]过滤、分离酵母团。在80℃气流烘箱中将酵母团干燥6小时，得到8.6g锗浓度为980微克/克酵母的干酵母，锗浓度是用实施例1所述的ICP技术测得的。实施例5.
在200rpm下搅拌的同时，通过加热到80℃并持续加热30分钟，使二羧基锗倍半氧化物[Westar](1.0g)在500mL去离子水中溶解。将这种第一混合物在121℃下压煮15分钟。在pH约为5.2的条件下向500mL去离子水中加入24g马铃薯糊精液体培养基[DIFCO]制备用于生长培养基的500mL溶液，将所得的第二混合物在121℃下压煮15分钟。向第一混合物中加入10g啤酒酵母[红星]，并将所得混合物在30℃下培养30分钟，然后加入100mL第二混合物，并在200rpm轻微搅动的条件下将所得混合物培养2小时。2小时后，另加入150mL第二混合物，在29℃下将此混合物搅动2小时。最后加入剩下的250mL生长培养基，在200rpm下再搅动所得混合物11小时。在4,000rpm下将所得混合物离心离心15分钟，用200mL去离子水洗涤酵母团5次，然后用0.22微米的乙酸纤维素膜[科尔宁瓶顶填料]过滤、分离酵母团。在80℃气流烘箱内将酵母团干燥6小时，得到56.3g锗浓度为1875微克/克酵母的干酵母团，锗浓度是用实施例1所述的ICP技术测得的。实施例6.
作为另一个实施例，本发明还包括制备一种含有锗的营养液体培养基，将酵母加入其中并生长制得锗酵母产物。将10.0g羧乙基锗倍半氧化物[Westar Nutrition]加入500mL蒸馏水中来制备含锗的营养液体培养基。然后在搅拌下将溶液加热至60℃-70℃，使锗溶解。用25％NaOH将pH调至6.8。然后将22.5g麦芽浸出汁液体培养基[DIFCO]加入锗溶液中，并加入蒸馏水使溶液总体积达1.0升。然后在110℃下将溶液压煮15分钟。所得的麦芽浸出汁液体培养基中含10,000ppm可溶锗。优选在加入酵母之前立即制备该含锗的营养液体培养基。
在这个实施例中，酵母在加入营养酵母液体培养基之前便已生长成熟。在本实施例中用成熟酵母作酵母种子培养物。酵母种子培养物是通过在pH4.5的条件下向麦芽浸出汁琼脂中加入啤酒酵母并在30℃下培养1-2天制得的。然后将一斜面酵母加入100mL麦芽浸出汁液体培养基(pH 4.5)中，在30℃下培养1天。
向上述1.0升含锗麦芽浸出汁液体培养基中加入100mL酵母种子培养物，使酵母吸收锗。将混合物在室温下培养约1小时，然后在150rpm摇动及30℃的条件下使酵母生长1-2天。
然后通过在3900rpm下离心5分钟回收酵母。回收的酵母细胞然后用50毫升0.01M Na2HPO4和0.1M EDTA溶液洗涤一次，然后在5000rpm下离心15分钟。用50mL蒸馏水重复洗涤酵母细胞3次，每次洗涤之间在5000rpm下离心15分钟。
最后，将回收的湿酵母乳在约100℃下常规干燥2-3小时，得到4.1克锗浓度为967微克/克酵母的干酵母，锗含量是用实施例1所述的ICP技术测得的。
本发明的许多改进和变更包括在上述的说明书中，并且对本领域技术人员来说是显而易见的。本发明还包括该组合物和方法的改进和变化，用这些改进和变化可实现他们的所附权利要求及其等价物范围之内的请求权利保护的用途。

Claims (23)

1.一种用于制备富含锗的干酵母产品的方法，包括下列步骤：
将活酵母细胞与含三氧化二锗的水溶液相接触；在生长培养基
中培养所述的酵母细胞；
分离所述的酵母细胞；
洗涤所述的经分离的酵母细胞，除去细胞外锗；和
干燥所述的酵母细胞。
2.权利要求1的方法，其中三氧化二锗选自羧乙基锗倍半氧化物和二羧基锗倍半氧化物。
3.权利要求1的方法，其中所述的接触步骤持续约5-约60分钟。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的水溶液包含稀释在纯净水中的三氧化二锗。
5.权利要求1的方法，其中含三氧化二锗的水溶液的pH值为约4-约7。
6.权利要求1的方法，其中含三氧化二锗的水溶液的pH值为约4.5-约6。
7.权利要求1的方法，其中含三氧化二锗的水溶液的pH值为约5-约6。
8.权利要求1的方法，其中三氧化二锗的浓度为约100ppm-约30,000ppm。
9.权利要求1的方法，其中三氧化二锗的浓度为约500ppm-约25,000ppm。
10.权利要求1的方法，其中三氧化二锗的浓度为约1,000ppm-约20,000ppm。
11.权利要求1的方法，其中所述水溶液中所含的三氧化二锗基本是纯的。
12.权利要求1的方法，其中所述的酵母细胞是可食用的。
13.权利要求12的方法，其中所述的酵母选自啤酒酵母、产蛋白圆酵母和葡萄汁酵母。
14.权利要求1的方法，其中所述生长培养基包括选自糖蜜、麦芽浸出汁液体培养基、马铃薯糊精液体培养基、氯化钾、硫酸镁、氮、磷酸二氢铵、氨和磷酸的营养素。
15.权利要求1的方法，其中所述的培养步骤持续约4-约50小时。
16.权利要求1的方法，其中所述的培养步骤在约20℃-约40℃的温度下进行。
17.权利要求1的方法，其中所述的培养步骤在约25℃-约35℃的温度下进行。
18.权利要求1的方法，其中所述的培养步骤在约28℃-约32℃的温度下进行。
19.一种由权利要求1的方法制得的含锗干酵母产品。
20.权利要求19的干酵母产品，其细胞内锗的浓度为约500微克-3,000微克锗/克干酵母固体。
21.一种含有在适宜载体中的权利要求19之干酵母产品的膳食添加剂。
22.一种补充人膳食的方法，包括施用有效量的在适宜载体中的权利要求19之干酵母产品。
23.权利要求22的方法，其中干酵母产品的有效量为约50微克/剂量-约200微克/剂量。
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