CN117723663A - 一种多索茶碱糖浆有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，并使用辛烷磺酸钠作为缓冲盐，使用混合有机相，通过筛选不同pH值以及有机相比例，可实现酸、碱、高温破坏条件下辅料峰与降解杂质的有效分离，达到对多索茶碱糖浆质量的有效控制。
Description
1、技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种多索茶碱糖浆有关物质的检测方法。
2、背景技术
多索茶碱是甲基黄嘌呤的衍生物，是一种支气管扩张剂，可直接作用于支气管，通过抑制平滑肌细胞内的磷酸二酯酶，松弛支气管平滑肌，从而达到抑制哮喘的作用。其中多索茶碱的支气管扩张作用比氨茶碱、二羟丙茶碱强，起效较快，药效持续时间长。
多索茶碱最早由意大利Abc Farmaceutici SPA公司开发。1984年10月30日，多索茶碱首次以商品名Ansimar在意大利获批上市，获批剂型包括片剂(规格：0.4g)、注射液(规格：100mg/10ml)和颗粒(规格：0.2g)，获批适应症为用于支气管哮喘和伴有支气管痉挛的肺部疾病。1991年4月27日，多索茶碱糖浆(商品名：Ansimar，规格：100ml：2g)在意大利获批上市，用于支气管哮喘和伴有支气管痉挛的肺部疾病。
在中国，2000年由黑龙江福和制药集团股份有限公司开发上市了多索茶碱片剂、注射液，后来又陆续开发了颗粒和口服溶液，其中多索茶碱口服溶液(商品名：安赛玛，规格：10ml:0.2g；100ml:2g)于2004年04月12日在国内获批上市，用于支气管哮喘、喘息型慢性支气管炎及其它支气管痉挛引起的呼吸困难。除黑龙江福和制药集团股份有限公司外，国内陆续有多家企业开发多索茶碱，目前国内上市的剂型有片剂、注射液、粉针、胶囊、颗粒和口服溶液，其中多索茶碱注射液已有原研进口，其他剂型均为国产。
多索茶碱，CAS号：69975-86-6，化学名为7-(1,3-二氧戊环-2-基甲基)茶碱，结构式如下：
目前检索到的有关物质检测方法为原料药供应商注册标准及中国药典2020年版二部多索茶碱、多索茶碱片、多索茶碱胶囊、多索茶碱注射液标准中有关物质方法，其中中国药典2020年版二部多索茶碱片和多索茶碱胶囊有关物质方法与多索茶碱有关物质方法一致，多索茶碱注射液有关物质方法与多索茶碱有关物质方法流动相组成一致，仅比例略有差异，尚未检索到关于检测多索茶碱糖浆有关物质的检测方法。
多索茶碱糖浆辅料组成及种类较复杂，酸、碱、高温破坏条件下辅料均降解，在原料药供应商注册标准和中国药典2020年版二部多索茶碱标准有关物质色谱条件下，均干扰有关物质的检测。因此，建立一种稳定有效的多索茶碱糖浆有关物质的检测方法是非常必要的。
3、发明内容
本发明解决了现有技术中存在的问题，提供了一种稳定有效的多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，可实现酸、碱、高温破坏条件下辅料峰与降解杂质的有效分离，达到对多索茶碱糖浆质量的有效控制。
本发明提供了一种多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，包括以下步骤：分别取分离度溶液、供试品溶液进样，按高效液相色谱条件进行检测，记录色谱图；
所述色谱条件为：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为缓冲溶液和有机溶剂；所述缓冲溶液为流动相A；所述有机溶剂为流动相B；按下表进行梯度洗脱：
进一步地，梯度洗脱条件为：
其中，所述有关物质包括杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV或茶碱，其结构如下所示：
所述色谱条件还包括：
检测器：UV检测器；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃～35℃，优选30℃；
检测波长：273nm；
进样量：10μl；
运行时间：60分钟；
所述的色谱柱优选Phenomenex Gemini C18 4.6mm×250mm 5μm；
所述的流动相A，缓冲溶液为用酸性试剂调节pH值至2.8～3.2的盐水溶液；所述盐是辛烷磺酸钠，其浓度为0.2％w/v～0.3％w/v，优选0.24％w/v；所述酸性试剂选自冰醋酸、磷酸、甲酸中的一种或多种，优选冰醋酸；所述pH值优选3.0；
所述的流动相B，有机溶剂为乙腈和甲醇，其比例为2∶1；
所述分离度溶液的配制过程为：分别取杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV和茶碱的对照品各适量，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各杂质贮备液；取多索茶碱对照品适量，加溶剂适量，超声处理使溶解，加各杂质贮备液适量，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
所述供试品溶液的配制过程为：取多索茶碱糖浆适量，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
其中所述溶剂为乙腈：水＝15∶85。
本发明进一步提供了一种多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，包括以下步骤：分别取分离度溶液、供试品溶液进样，按高效液相色谱条件进行检测，记录色谱图；
所述色谱条件为：色谱柱：Phenomenex Gemini C18 4.6mm×250mm 5μm；流动相：流动相A：辛烷磺酸钠水溶液；流动相B：乙腈-甲醇；按下表进行梯度洗脱：
其中，所述有关物质包括杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV或茶碱，其结构如下所示：
所述色谱条件还包括：
检测器：UV检测器；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
检测波长：273nm；
进样量：10μl；
运行时间：60分钟；
所述的流动相A浓度为0.24％w/v，用冰醋酸调节pH值至3.0；流动相B中乙腈和甲醇的比例为2∶1；
所述分离度溶液的配制过程为：分别取杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV和茶碱的对照品各约1mg，分别置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各杂质贮备液；取多索茶碱对照品约37mg，置25ml量瓶中，加溶剂适量，超声处理使溶解，加各杂质贮备液各约0.75ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
所述供试品溶液的配制过程为：取多索茶碱糖浆约2.1g，精密称定，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；
其中所述溶剂为乙腈：水＝15∶85。
本发明进一步提供了多索茶碱糖浆有关物质的检测方法在多索茶碱糖浆质量控制中的用途。
本发明的有益技术效果为：
本发明采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，并使用辛烷磺酸钠作为缓冲盐，使用混合有机相，通过筛选不同pH值以及有机相比例，可实现酸、碱、高温破坏条件下辅料峰与降解杂质的有效分离，达到对多索茶碱糖浆质量的有效控制。
4、附图说明
图1为实施例1色谱条件选择中按ChP2020标准的有关物质检查方法选择重叠色谱图。
图2为实施例1色谱条件选择中按原料标准的有关物质检查方法选择重叠色谱图。
图3为实施例1色谱条件选择中柱温优化色谱图。
图4为实施例1色谱条件选择中流速优化色谱图。
图5为实施例1色谱条件选择中流动相优化色谱图。
图6为实施例1色谱条件选择中流动相优化色谱图。
图7为实施例1色谱条件选择中流动相优化色谱图。
图8为实施例1色谱条件选择中流动相优化色谱图。
图9为实施例1色谱条件选择中流动相优化色谱图。
图10为实施例2空白干扰试验中有关物质检查空白干扰试验叠加图。
图11为实施例3分离度试验中有关物质检查分离度溶液色谱图。
图12为实施例4破坏试验中有关物质检查破坏试验重叠图。
图13为实施例5线性试验中有关物质检查线性试验趋势图。
图14为实施例7精密度试验中有关物质检查精密度试验叠加图。
图15为实施例8溶液稳定性试验中有关物质检查溶液稳定性试验叠加图。
图16为实施例9回收率试验中有关物质检查加样回收率试验叠加图。
图17为实施例10耐用性试验中有关物质检查耐用性试验分离度溶液叠加图(柱温)。
图18为实施例10耐用性试验中有关物质检查耐用性试验分离度溶液叠加图(流动相pH值)。
5、具体实施方式
下面详细描述本发明的具体实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
仪器及色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪；
检测器：UV检测器；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，优选Phenomenex GeminiC184.6mm×250mm 5μm；
溶剂：乙腈-水(15∶85)；
进样体积：10μl；
检测波长：273nm；
运行时间：60分钟。
溶液配制：
各杂质贮备液的配制：分别取杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV和茶碱的对照品各约1mg，分别置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各杂质贮备液。
分离度溶液的配制：取多索茶碱对照品约37mg，置25ml，加溶剂适量，超声处理使溶解，加各杂质贮备液各约0.75ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的配制：取多索茶碱糖浆约2.1g，精密称定，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
实施例1色谱条件选择
多索茶碱糖浆辅料组成及种类较复杂，酸、碱、高温破坏条件下辅料均降解，在原料药供应商注册标准和中国药典2020年版二部多索茶碱标准有关物质色谱条件下，均干扰降解杂质I、杂质III、杂质IV和茶碱，如图1～2所示。
在上述仪器及色谱条件的基础上，继续筛选最适用的色谱条件。
取分离度溶液和酸破坏样品或高温破坏辅料溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。其中色谱条件中的流速、柱温及流动相选择见表1。
表1多索茶碱糖浆有关物质检查色谱条件的选择
实施例2空白干扰试验
仪器及色谱条件同上。
空白辅料溶液：称取多索茶碱糖浆空白辅料约2.1g，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
精密量取空白辅料溶液、分离度溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如图10所示，空白辅料不干扰有关物质检查。
实施例3分离度试验
取各杂质储备液及分离度溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如表2、图11所示，杂质Ⅳ、杂质Ⅰ、茶碱、杂质Ⅱ、多索茶碱与杂质Ⅲ依次出峰，各相邻色谱峰之间分离度均符合接受标准，系统适用性良好。
表2峰定位及分离度试验结果
实施例4破坏试验
按表3制备各破坏试验样品溶液，分别精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如表4～5、图12所示，各破坏条件下，杂质峰间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，分离良好；空白辅料均不干扰多索茶碱糖浆有关物质检查；主峰纯度角值均小于纯度阈值，主峰纯度良好。
表3破坏试验样品制备
表4破坏试验物料平衡及峰纯度考察结果
注*：物料回收率＝破坏后总峰面积×破坏前称样量/破坏前总峰面积×破坏后称样量
表5主要降解杂质归属结果(％)
注：N.D指未检出。
实施例5线性试验
茶碱贮备液的制备：称取茶碱对照品约6mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质I贮备液的制备：称取杂质I对照品约6mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质Ⅲ贮备液的制备：称取杂质Ⅲ对照品约6mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
杂质Ⅳ贮备液的制备：称取杂质Ⅳ对照品约6.2mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
多索茶碱贮备液的制备：称取多索茶碱工作对照品约6mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
线性贮备液的制备：精密量取茶碱贮备液、杂质Ⅰ贮备液、杂质Ⅲ贮备液、杂质Ⅳ贮备液与多索茶碱贮备液各2ml，置同一100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
定量限贮备液：精密量取茶碱贮备液0.4ml、杂质Ⅰ贮备液1ml、杂质Ⅲ贮备液2ml、杂质Ⅳ贮备液2ml、多索茶碱贮备液1ml，置同一100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
精密量取线性贮备液2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml，分别置4个不同的10ml量瓶中用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性2～线性5溶液。
定量限溶液：精密量取定量限贮备液2.5ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液。
精密量取上述系列溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积对浓度作曲线，用最小二乘法计算回归方程及相关系数。结果如表6、图13所示，结合定量限试验结果，多索茶碱及其四个杂质的线性均良好。
表6线性试验结果
| 样品名称 | 浓度范围(μg/ml) | 线性方程 | 相关系数 |
| 多索茶碱 | 0.372～5.954 | y＝20801.6997x-794.3065 | r＝1.0000 |
| 茶碱 | 0.149～5.946 | y＝34546.0044x-522.2511 | r＝1.0000 |
| 杂质I | 0.367～5.878 | y＝10575.0526x-50.5736 | r＝0.9999 |
| 杂质III | 0.759～6.073 | y＝16462.5073x-2647.4581 | r＝0.9999 |
| 杂质IV | 0.761～6.090 | y＝3073.8682x-147.7567 | r＝0.9999 |
实施例6定量限、检测限试验
取各杂质贮备液各10μl，注入液相色谱仪，至测得各样品的响应值约为噪音信号的10倍高和3倍高，即为相应样品的定量限和检测限。结果如表7、表8所示。
表7检测限结果表
表8定量限结果表
实施例7精密度试验
精密量取供试品溶液10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如表9、图14所示，6次测定结果各杂质均未检出。结果表明：精密度试验结果良好。
表9精密度试验结果
注：N.D指未检出。
实施例8溶液稳定性试验
取供试品溶液，于室温自然光下放置，分别于0、2、4、6、8、24小时时，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，与0小时比较，分别计算供试品溶液色谱图中各杂质含量的变化值，并报告有无大于报告限的新色谱峰。结果如表10、图15所示，供试品溶液在室温自然光条件下24小时内稳定。
表10溶液稳定性试验结果
注：N.D指未检出。
实施例9回收率试验
空白溶液：取多索茶碱糖浆约1.7g(约相当于多索茶碱30mg)，精密称定，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：取多索茶碱对照品约15mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质贮备液的制备：精密量取实施例3线性试验项下茶碱贮备液、杂质Ⅰ贮备液、杂质Ⅲ贮备液与杂质Ⅳ贮备液各4ml，置同一100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
定量限贮备液：取自实施例3线性试验项下。
回收率-定量限溶液：取多索茶碱糖浆约1.7g(约相当于多索茶碱30mg)，精密称定，置20ml量瓶中，精密加入定量限贮备液2.5ml，置同一20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
回收率-100％溶液：取多索茶碱糖浆约1.7g(约相当于多索茶碱30mg)，精密称定，置20ml量瓶中，精密加入杂质贮备液5.0ml，置同一20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
回收率-150％溶液：取多索茶碱糖浆约1.7g(约相当于多索茶碱30mg)，精密称定，置20ml量瓶中，精密加入杂质贮备液7.5ml，置同一20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份。
精密量取空白溶液、对照品溶液、回收率试验溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按加校正因子的主成分外标法计算各杂质的检出量，并以空白溶液校正，计算回收率，并计算结果的相对标准偏差。结果如表11、图16所示，在定量限、100％、150％三个浓度下，各杂质的加样回收率试验结果均良好。
表11加样回收率试验结果
实施例10耐用性试验
采用不同柱温、不同流动相pH值来测定多索茶碱糖浆的有关物质，考察方法的耐用程度。
对照品溶液：取多索茶碱对照品约15mg，精密称定，置50ml量瓶中，加溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
灵敏度溶液：精密量取对照品溶液5ml，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
空白辅料溶液：取空白辅料约2.1g，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。
精密量取分离度溶液、灵敏度溶液、供试品溶液、对照品溶液、空白辅料溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，在既定色谱条件的基础上，分别采用不同柱温、不同流动相pH值来测定多索茶碱糖浆的有关物质，比较测定结果，结果如表12～13、图17～18所示，采用柱温在25～35℃范围内，流动相A pH值在2.8～3.2范围内，分离度溶液中，各相邻峰之间的分离度均符合接受标准，灵敏度溶液中多索茶碱峰高S/N均＞10，均符合系统适用性要求；空白辅料均不干扰多索茶碱糖浆有关物质检查，与标准条件相比，各杂质均未检出，方法的耐用性良好。
表12耐用性试验结果(分离度)
注：*表示初始条件。
表13耐用性试验结果(杂质检出量)
注：*表示标准条件；N.D指未检出。
Claims (10)
1.一种多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：分别取分离度溶液、供试品溶液进样，按高效液相色谱条件进行检测，记录色谱图；
所述色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为缓冲溶液和有机溶剂，所述缓冲溶液为流动相A，所述有机溶剂为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
其中，所述有关物质包括杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV和茶碱，其结构如下所示：
2.据权利要求1所述的多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：
检测器：UV检测器；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃～35℃；
检测波长：273nm；
进样量：10μl；
运行时间：60分钟。
3.根据权利要求1所述的多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Phenomenex Gemini C18 4.6mm×250mm 5μm。
4.根据权利要求1所述的多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A的浓度为0.2％w/v～0.3％w/v。
5.根据权利要求1所述的多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A为用酸性试剂调节pH至2.8～3.2的盐水溶液；所述的酸性试剂选自冰醋酸、磷酸、甲酸中的一种或多种，所述的盐水溶液为辛烷磺酸钠溶液。
6.根据权利要求1所述的多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相B的有机溶剂为乙腈和甲醇，其比例为2∶1。
7.根据权利要求1所述的多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱条件为：
8.根据权利要求1所述的多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，其特征在于，所述分离度溶液的配制过程为：分别取杂质I、杂质II、杂质III、杂质IV和茶碱的对照品各适量，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得各杂质贮备液；取多索茶碱对照品适量，加溶剂适量，超声处理使溶解，加各杂质贮备液各适量，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；所述供试品溶液的配制过程为：取多索茶碱糖浆适量，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
9.根据权利要求8所述的多索茶碱糖浆有关物质的检测方法，其特征在于，所述溶剂为乙腈：水＝15∶85。
10.根据权利要求1～9任一项所述的多索茶碱糖浆有关物质的检测方法在多索茶碱糖浆质量控制中的用途。
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