CN117715620A - 夏枯草提取物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于靶向导致皮肤和毛发状况恶化的心理情绪应激的夏枯草的地上部分的提取物。优选地，本发明涉及包含夏枯草的地上部分或由夏枯草的地上部分组成的组合物的用途，旨在预防和/或治疗心理情绪应激相关的障碍和/或皮肤和毛囊上的损伤。

Description

夏枯草提取物及其用途
技术领域
本发明涉及夏枯草(Prunella vulgaris)的提取物用于靶向导致皮肤和毛发状况恶化的心理情绪应激的用途。特别地，本发明涉及包含夏枯草的地上部分的至少一种提取物的组合物的化妆品用途，该组合物旨在抵抗或减轻应激诱导的感觉神经元的兴奋，用于调节至少一种健康激素的分泌，用于潜在地释放至少一种健康激素，或用于它们的两种或多种。此外，本发明涉及包含这样的提取物作为用于毛发护理和用于皮肤护理的抗应激活性成分的化妆品或药物组合物。
背景技术
应激是指代身体为适应扰动或挑战的适应性反应的术语。它是一种对体内平衡的真实或感知威胁的状态，可以是急性的如攻击，也可以是慢性的，并且可以是生理的，也可以是心理的。
当人们处于精神或情绪压力下时产生的心理情绪应激(PES)在大脑中由下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴密切控制，该轴介导应激反应介质如皮质醇、神经生长因子(NGF)、组胺和P物质(SP)的产生。
在感受到应激时，下丘脑神经元分泌促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)，该激素被转运至垂体，在垂体中与CRH受体结合并刺激阿黑皮素原(POMC)衍生的神经肽，包括α-促黑激素(α-MSH)、β-内啡肽和促肾上腺皮质激素(ACTH)的分泌。ACTH转而在肾上腺皮质中通过血流运输，并刺激糖皮质激素(GC)，包括皮质醇、皮质酮和组胺的产生。
皮质醇是人类主要的应激激素，调节广泛的应激反应。此外，当身体察觉到作为威胁的刺激时，下丘脑激活HPA轴，皮质醇的释放使得身体继续保持高度警惕。
应激事件在日常生活中是不可避免的，但急性和慢性应激之间凸显重要差异。
在急性应激下，HPA轴通过反馈机制受到严格调节。糖皮质激素反馈抑制在调节糖皮质激素释放的幅度和持续时间中起突出作用。急性应激可以诱导淋巴细胞从血液到皮肤的明显重新分布，导致增强的皮肤免疫力和成功的应激适应。皮质醇可以调节控制血糖水平，或其也可以调节新陈代谢。这些功能使皮质醇成为保护整体健康、提供适应功能、促进生存或激励成功的关键激素。
与急性应激相反，慢性应激没有生理学意义。应激反应系统的长期激活以及随之而来的皮质醇和其他应激激素的过度暴露可能扰乱几乎所有身体过程。
因此，该情形使身体处于许多健康问题的增加的风险之下，包括体重增加、痤疮、皮肤变薄、脸红、睡眠问题、严重疲劳等。
皮肤、头皮和毛囊也发展了它们自身的功能性外周HPA系统，其中CRH、ACTH及其受体在皮肤细胞和毛囊内产生。
在皮肤内，最显著的内分泌和神经内分泌活性似乎位于皮肤的主要附件中，如毛囊(HF)，其已被认为是至关重要的独立外周(神经)内分泌器官。
由于皮肤是高度神经支配的，所以外周皮肤神经纤维可以通过分泌因子如神经肽(例如：SP)和神经营养因子(如：NGF)影响皮肤健康。它们充当局部应激反应者，介导神经源性炎症，也称为负性生物级联反应。NGF有助于应激诱导的皮肤神经过度支配，促进神经源性炎症，并影响变应性炎症的所有标志和SP上游的皮肤应激反应性。
PES增加毛囊和皮肤细胞产生NGF和糖皮质激素。这种加剧的合成诱导肥大细胞脱颗粒和/或感觉神经元的兴奋。感觉神经元转而分泌P物质和神经营养素，如降钙素基因相关肽(CGRP)和NGF，它们增强肥大细胞激活，并随后增强炎症分子的释放。由激活的肥大细胞分泌的蛋白酶如类胰蛋白酶，通过PAR依赖性途径诱导炎性神经肽如SP的释放，导致肥大细胞激活随后产生NGF的自分泌和/或旁分泌恶性循环机制。
若干研究和临床观察强调了PES对毛发生长和应激诱导的脱发症的负面影响。其中，若干应激模型证明了对毛发细胞的生存力和增殖以及毛囊生长的负面影响。事实上，SP和NGF被招募为应激诱导的毛发生长抑制作用的关键介质。
例如在小鼠中，已证明啮齿动物中的皮质醇应激激素当量调节毛囊干细胞(HFSC)静止和毛发生长。皮质酮是HFSC活性的全身性抑制剂，已被证明可将毛囊维持在延长的静息期，并且消除这样的抑制驱动了这些细胞进入频繁的再生周期，这是毛发生长的必要条件。
另一项研究证明，应激招致加速毛发斑白。事实上，通过使用暴露至不同应激源的动物，已证明了通过神经过度激活释放的部分应激相关神经递质对黑素细胞干细胞耗竭和毛发斑白的影响。
还已知毛囊循环与皮肤灌注的显著变化有关。此外，毛发生长初期毛囊的上皮毛球显示出血管生成性质，毛囊毛乳头可以产生血管生成因子。HF相关的血管系统在毛发生长初期阶段期间经历大规模扩张，在毛发生长中期退行期阶段经历快速退化。事实上，研究证明，血管内皮生长因子(VEGF)-A的产生在毛发生长初期期间被上调，其在抗血管生成治疗期间被阻断，导致更稀疏的HF。
上述教导证明PES导致应激诱导的脱发症和毛发斑白。皮肤及其附属物中糖皮质激素的过度合成、外周皮肤神经元的过度激活以及通过肥大细胞激活引起的皮肤炎症的增加，在恶性循环中共同作用，诱导毛发生长停滞和延长的静息期或脱发。此外，外周皮肤神经纤维的过度激活与毛囊中黑色素含量的减少有关。
在外周神经系统(PNS)中，神经递质β-内啡肽通过在突触前和突触后神经末梢与阿片受体(特别是μ亚型)结合而产生镇痛作用。当结合时，级联的相互作用导致抑制参与疼痛传递的SP的释放。归因于其强大的镇痛能力，β-内啡肽是身体和心理应激的调节剂，并在情绪、情感和行为的调节中发挥作用。此外，毛囊被认为是神经激素和神经肽的靶点和来源，特别是对于β-内啡肽而言。此外，当在毛囊内(在毛发基质和毛囊黑素细胞中)合成时，β-内啡肽调节毛囊黑素细胞增殖和黑素生成(Paus等人，2014年，Review CellPress，第20卷，第10期，第559-570页)。因此，刺激毛囊中β-内啡肽的产生可能会防止过早的毛发斑白。
催产素因其在分娩期间的乳汁分泌和子宫收缩中的作用而闻名，并在生理、行为、抗应激、抗抑郁、社交和健康方面显示出意义。细胞对催产素的反应包括调节神经突起生长、细胞活力和增加细胞存活率。此外，催产素系统被认为是人类皮肤稳态中的一种新的神经内分泌介质，并且在临床上与应激的皮肤状况相关。
已揭示了CRF和催产素都由调节HPA轴的相同脑区分泌，并且血浆催产素水平与HPA反馈机制的完整性正相关。因此，已提出皮质醇诱导的催产素增加可能参与HPA轴的反馈调节，并且皮质醇介导的应激和催产素介导的依恋之间可能存在重要的相互作用(TopsM.等人，2012，Frontiers in Psychiatry，第3卷，Article 43)。
夏枯草是属于唇形科的植物。它是一种多年生草本和世界性植物，生长在世界各地。已知它例如被用作抗菌剂、抗利尿剂和抗炎剂。
来自夏枯草的提取物在化妆品领域是已知的。事实上，JPS-A6293217公开了衍生自夏枯草的花提取物的皂苷通过特异性抑制还原酶活性作为头发滋养剂。皂苷属于异质的糖苷。
X-J Gu等人，2007年，Helvetica Chimica Acta，第90卷(第72-78页)教导了夏枯草的穗状花序的水乙醇提取物含有三萜皂苷。
US-A 5624673教导了夏枯草的地上部分的提取物或其皂苷内容物作为活性成分。通过使用选自水、醇(C1至C4碳)或其混合物的溶剂获得提取物。实施例示出了包含夏枯草叶的甲醇提取物或夏枯草叶的水提取物的制剂，后者用于防止与年龄相关的脱发。然而，该文件没有提及含有皂苷的提取物中的干含量的量。
JPH-A 0710722教导了一种由含有α-香树精三萜的东北夏枯草(Prunellaasiatica Nakai)穗状花序的乙醇提取物组成生发剂。
KR-B 101864720教导了夏枯草提取物通过特异性抑制酶11β-HSD1的活性，然后抑制皮质醇的产生来预防皮肤萎缩。该提取物可通过使用水、醇(C1-C4)或其混合物获得。然而，该文献没有提及所使用的植物部分。此外，夏枯草的地上部分的水提取物抑制酶11β-HSD1的表达，该酶催化无活性的可的松细胞内转化成活性皮质醇。(K-B Roh等人，2018年，Research Article，Article ID 1762478)。所述提取物还抑制可的松介导的胶原含量减少，以维持皮肤完整性及其体内平衡，防止皮肤萎缩。最后，尽管提到所述提取物中所含有的迷迭香酸显示出11β-HSD1的独立抑制活性，但仍需要进一步的活性成分鉴定研究来了解皮质醇相关的皮肤疾病。CN-A 106727928公开了夏枯草的茎和叶的水乙醇和水甲醇浓缩提取物，其包含咖啡酸和迷迭香酸。该提取物可用于治疗阿尔茨海默病。CN-B 108272858公开了含有迷迭香酸和咖啡酸的来自夏枯草的果穗的提取物。该提取物具有抗氧化活性。
前述夏枯草的提取物具有若干技术缺陷。所实现的化妆品或药物有益效果主要归因于它们所含有的皂苷，需要进一步的提取步骤和额外的资源。另一方面，虽然使用夏枯草的主要提取物，但相关的有益效果仅针对皮肤或头发，而不是同时针对两者。此外，上述提取物或夏枯草都不能解决同时至少部分影响皮肤和头发的健康或状况的心理情绪应激缺陷。
显然，在应激条件下，调节神经免疫兴奋及其分泌，特别是健康激素和免疫细胞的分泌，可能是预防或限制皮肤炎症的相关手段，特别是通过控制肥大细胞脱颗粒。
因此，仍然存在未满足的需求：借助于植物提取物来缓解皮肤细胞和皮肤主要附属物如毛囊细胞内的至少应激诱导的敏感神经元兴奋和/或神经源性炎症，以通过促进至少一种健康激素的释放来获得健康感觉。
还存在另一未满足的需求：借助于植物提取物来缓解应激诱导的敏感神经元兴奋和/或神经源性炎症，更一般地缓解心理情绪应激相关的障碍和/或皮肤和毛囊上的损伤。
这些目的通过使用夏枯草的地上部分的提取物来保护皮肤和毛囊免受心理情绪应激缺陷影响而实现。特别是用于保护皮肤免受皮肤炎症和/或神经源性炎症，用于在受试者中提供健康和减压感觉或舒缓效果，或用于这两种或多种。此外还用于保护毛囊免受应激诱导的毛发斑白、限制应激诱导的脱发、限制应激诱导的头发生长停滞、限制应激诱导的头发变薄或稀疏，或其两种或多种。
发明内容
令人惊讶地，已发现用方便的溶剂提取夏枯草的地上部分可以得到一种提取物，该提取物具有缓解皮肤和毛发二者中与心理情绪应激相关的障碍和/或损伤的特别性质，因此，更普遍地用于改善皮肤和毛发状况二者。
因此，本发明涉及夏枯草的包括叶、茎和花(或由叶、茎和花组成)的地上部分的提取物，该提取物通过在选自水或者水与醇的混合物的溶剂中的固/液提取来获得，其中：
i)其包含1至15重量％，优选2至12重量％，更优选3至10重量％的一种或多种多酚，基于提取物的干含量的总重量计；
ii)其包含小于0.1重量％，优选小于0.01重量％，更优选小于0.001重量％，特别是0重量％的皂苷，基于提取物的干含量的总重量计；
iii)提取物的干含量占至少10g/L(重量/溶剂体积)，优选至少15g/L，甚至更优选至少20g/L。
因此，本发明还涉及用于制备夏枯草的(任选经干燥的)包括叶、茎和花(或由叶、茎和花组成)的地上部分提取物的方法，包括以下步骤：
i)在水或水醇溶剂中进行所述地上部分的固/液提取，其中：
a.在水中的提取在80至150℃，优选在100至130℃，甚至更优选在85至130℃，特别是在90至120℃进行15分钟至10小时，优选进行30分钟至8小时，更优选进行1小时至6小时，最优选进行1.5至5小时；或
b.在水醇中的提取在50至120℃，优选在60至115℃，更优选在70至110℃，特别是在80至105℃进行15分钟至10小时，优选进行30分钟至8小时，更优选进行1小时至6小时，最优选进行1.5至5小时；
(ii)将步骤(i)的固体残余物与提取物分离；
(iii)通过除去至少一种溶剂或其部分而浓缩提取物。
本发明还涉及包含作为活性成分的上文描述的地上部分的提取物(或由作为活性成分的上文描述的地上部分的提取物组成)的组合物的(任选的化妆品)用途，旨在预防和/或治疗心理情绪应激相关的障碍和/或皮肤和毛囊上的损伤和通过产生至少一种健康激素促进健康感觉。优选地，该用途用于改善经受心理情绪应激的皮肤和毛发状况。
因此，本发明还涉及化妆品或药物组合物，其包含：
(A)夏枯草的地上部分的提取物作为活性成分；和
(B)不同于夏枯草的提取物的至少一种另外的化妆品和/或药学上可接受的成分，
其中该组合物为局部用组合物，选自溶液、悬浮液、乳液、乳膏、糊剂、凝胶、洗液、粉末、皂、含表面活性剂的水、油、洗发剂和喷雾剂；和/或其中该组合物是口服施用的营养保健组合物。
本发明还涉及一种组合物，其包含如上文描述的夏枯草的地上部分的提取物(或由上文描述的夏枯草的地上部分的提取物组成)作为抗应激活性成分用于治疗或预防心理情绪应激相关的障碍和/或皮肤和毛囊上的损伤的方法中。
本发明的另一方面涉及化妆品非治疗方法，其旨在通过向有需要的皮肤和透皮上施用有效量的包含如上文描述的夏枯草的地上部分的提取物(或由上文描述的夏枯草的地上部分的提取物组成)的组合物来预防和/或治疗受试者的皮肤中和毛囊中的应激诱导的障碍和/或损伤。
附图说明
图1示出了用于测定根据本发明的夏枯草的提取物中总皂苷含量的校准曲线。
图2A和2B示出了测量本发明的夏枯草提取物对皮质醇激发(应激激素)后分别在2h和24h之后感觉神经元释放降钙素基因相关肽(CGRP)的作用的结果。图2C和2D示出了本发明的夏枯草提取物对组胺激发后分别在2h和24h之后感觉神经元释放CGRP的作用的定量。
在图3A和3B中，测量了本发明的夏枯草提取物分别在皮质醇和组胺激发后在2h之后对感觉神经元释放催产素的影响。
图4示出了在本发明的夏枯草提取物存在下、采用或不采用心理情绪应激分子(可的松)处理的情况下测量毛囊毛乳头细胞(HFDPC)增殖的结果。
图5示出了在本发明的夏枯草提取物存在下，采用或不采用可的松处理，测量通过HFDPC的血管内皮生长因子(VEGF)分泌的结果。
图6示出了本发明的夏枯草提取物随时间推移对人毛囊生长对抗皮质醇的增强作用。
图7示出了测量本发明的夏枯草提取物在没有皮质醇激发或在皮质醇激发下对毛囊结构的可见效果的结果。
图8示出了测量本发明的夏枯草提取物对皮质醇激发后增殖或凋亡毛细胞数量的影响的结果。
图9示出了测量本发明的夏枯草提取物在基础(无应激条件)或皮质醇激发下对毛囊色素沉着的可见效果的结果。
图10示出了通过嗜碱性细胞(RBL-2H3)定量夏枯草提取物对β-己糖胺酶活性的影响的结果。
图11A至11D示出了测量本发明的夏枯草提取物对具有应激诱导的脱发的应激志愿者的84天的可见效果的临床结果。图11A示出了毛囊随时间的长度。图11B示出了毛囊在毛发生长初期阶段随时间的比例。图11C示出了毛囊在毛发生长终期/休止期(telogen)阶段随时间的比例。图11D示出了毛囊随时间的毛发生长初期/毛发生长终期比率。
具体实施方式
本发明的第一方面涉及夏枯草的包括叶、茎和花(或由叶、茎和花组成)的地上部分的提取物，该提取物通过在选自水或者水与醇的混合物的溶剂中的固/液提取来获得，其中：
i)其包含1至15重量％，优选2至12重量％，更优选3至10重量％的一种或多种多酚，基于提取物的干含量的总重量计；
ii)其包含小于0.1重量％，优选小于0.01重量％，更优选小于0.001重量％，特别是0重量％的皂苷，基于提取物的干含量的总重量计；
iii)提取物的干含量占至少10g/L(重量/溶剂体积)，优选至少15g/L，甚至更优选至少20g/L。
在一个实施方案中，地上部分的提取物由夏枯草的叶、茎和花组成。将要理解的是，在由夏枯草的提取物组成的组合物中，该组合物是提取物。
如本公开内容通篇中所使用，本发明的夏枯草的地上部分的提取物也被称为“提取物”或夏枯草提取物的其缩写“PVE”。
如本文中所使用，术语“地上部分”可以理解为本领域通常理解的最广泛的意义。它可以由叶、茎和花组成，花附着至穗状花序。因此，花可以包括穗状花序。
如本文中所使用，“皂苷”意指一种由与糖偶联的三萜组成的糖苷。报道的从夏枯草中分离的两种主要三萜组分是熊果酸和齐墩果酸，它们二者都是高度非极性的化合物。因此，相应的皂苷也是高度非极性的。
如本文中所使用，术语“水醇”可以理解为本领域通常理解的最广泛的意义。它可以为包含一种或多种醇与水的任何组合物。水醇溶剂可以是任何醇/水混合物。在一个实施方案中，溶剂为含有介于10与90％(v/v)之间，或含有介于25与85％(v/v)之间的醇，或含有介于50与82％(v/v)之间的醇，或含有介于60与80％(v/v)之间的醇，或含有介于65与75％(v/v)之间的醇，或含有大约70％(v/v)醇的醇/水混合物。
总多酚的定量可以通过任何方式进行。在优选的实施方案中，本发明的提取物的总多酚含量的定量可以根据已知的Folin-Ciocalteu方法进行。本发明的提取物中多酚的实例可以是例如咖啡酸和迷迭香酸。
在一个实施方案中，提取物的干含量可以占至少15g/L，甚至更优选至少20g/L。在给定初始重量的样品砂存在下，通过在105℃经过烘箱，直至获得恒定重量来测量固体含量。
根据本发明的提取物在标准条件(大约20℃的室温，大约1013hPa的常压)下可以为液体、糊状或固体。在本文上下文中，术语“液体(液态)”和“流体(流态)”可以互换理解。优选地，提取物首先以液体形式获得。然后，可以任选地除去一种或多种溶剂以获得固体形式的提取物。液体提取物也可以在减压下进行浓缩，使用但不限于真空浓缩器或旋转真空蒸发器。此外，在浓缩之后，可以干燥提取物。然后，优选地除去一种或多种溶剂的一部分。任选地，可以获得液体或糊状提取物。任选地，也可以将提取物用一种或多种溶剂重新稀释，以获得溶剂基提取物。任选地，提取物也可以通过任何手段(例如，结晶、色谱手段等)进行纯化。
可以任选地将提取物称为“酊剂”或“净油(absolute)”。用于制备溶剂基提取物的溶剂可以是含水溶剂(水或缓冲液)，或者其可以为含水溶剂与液态有机溶剂的组合。因此，根据本发明的夏枯草的地上部分的提取物是溶剂基提取物，其中稀释溶剂可以选自水、含水缓冲液、醇、二醇、乳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、甘油三酯、柠檬酸三乙酯、二辛醚、异硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、乙酸乙酯或其混合物。醇可以优选选自甲醇、乙醇和异丙醇。二醇可以优选选自戊二醇和甘油。
在优选的实施方案中，根据本发明的夏枯草的提取物为体积比为95/5至5/95，优选80/20至20/80的甘油:水的混合物。
夏枯草的根据本发明的提取物可以任选地在通过进行其他纯化方法产生的级分中获得，这些纯化方法包括通过具有恒定分子量临界值的超滤膜分离，或通过各种色谱方法分离，或液-液分离或结晶或沉淀。
如本文中所使用，术语“干提取物”可以在最广泛的意义上被理解为干物质形式，即不含溶剂的根据本发明的提取物。干提取物可以任选地在物理上以干物质的形式存在。然而将会直接理解的是，在涉及干物质百分比的计算中，它并非必然是以物理形式存在的干物质，而是干提取物也可以以溶解形式存在。然后，在计算中，从总质量中数学上减去溶剂的质量。
干物质(物理形式)可以通过合适的提取方法获得，随后是干燥获得的提取物的步骤。可以通过本领域已知的适合该目的的任何方法进行干燥。干燥意指除去用于提取的一种或多种溶剂。可以通过任意方式除去一种或多种溶剂。例如，可以通过使提取物经受热和干燥的气氛和/或将提取物放置在加热的板上以蒸发溶剂来实现。例如，干燥可以通过在真空中和/或在升高的温度蒸发(例如在旋转(真空)蒸发器中)或通过感兴趣的固体材料的结晶来实现。替代地或附加地，可以通过雾化或通过冻干来实现干燥。
在本发明的一个实施方案中，萃取溶剂可以选自包含水和水醇溶液的组。醇可以选自乙醇、甲醇、丙醇、丁醇、戊醇、苯酚、甘油、1,3-丁二醇、丙烷二醇或其两种或多种的混合物。因此，提取物可以是含水和/或水醇提取物的形式。在本发明的优选的实施方案中，溶剂是水和/或水醇(例如：水甲醇和/或水乙醇)。在特定实施方案中，溶剂是水，然后提取物是水提取物。
如本文中所使用，“提取物”可以是通过提取夏枯草的叶、茎和花制成的任何物质。根据本公开内容，PVE是通过所述植物的溶剂提取获得的溶剂基提取物。如本文中所使用，通过使用至少一种溶剂，优选极性溶剂来实现提取。因此，在优选的实施方案中，通过进行溶剂提取方法获得提取物。在优选的实施方案中，提取物由水和/或水醇提取方法获得，包括冷或热提取、超声波提取、回流冷却、针式提取和微波提取。然而，所使用的溶剂以及方法不限于此，只要可以获得根据本公开内容的精神提供固有有益效果的提取物。可以将溶剂添加至植物材料。这可以通过本领域已知的任何方法来实现，例如过滤、筛分、超滤、错流过滤、离心、随时间沉淀或其两种或多种的组合。
在优选的实施方案中，所述夏枯草的提取物为水提取物。
在一个实施方案中，夏枯草的水醇提取物为水甲醇或水乙醇提取物，优选水乙醇提取物。
本发明的一个方面涉及用于制备夏枯草的包括叶、茎和花(或由叶、茎和花组成)的(任选经干燥的)地上部分的提取物的方法，包括以下步骤：
i)用水或水醇溶剂进行所述地上部分的固/液提取，其中：
a.在水中的提取在80至150℃，优选在100至130℃，甚至更优选在85至130℃，特别是在90至120℃进行15分钟至10小时，优选进行30分钟至8小时，更优选进行1小时至6小时，最优选进行1.5至5小时；或
b.水醇提取在50至120℃，优选在60至115℃，更优选在70至110℃，特别是在80至105℃进行15分钟至10小时，优选进行30分钟至8小时，更优选进行1小时至6小时，最优选进行1.5至5小时；
(ii)将步骤(i)的固体残余物与提取物分离；
(iii)任选地通过除去至少一种溶剂或其部分而浓缩提取物。
在一种具体的实施方案中，在高温下，典型地在80至150℃，优选在100至130℃，甚至更优选在85至130℃，特别是在90至120℃，在纯化水中对地上部分的干燥粉末进行15分钟至10小时，优选30分钟至8小时，更优选1小时至6小时，最优选1.5至5小时进行热水提取，提取可以在回流下进行。植物材料与提取溶剂的比率按重量计可以在介于1:10与1:40之间，优选介于1:15与1:35之间，更优选介于1:20与1:30之间。可以将获得的液体过滤，在减压下介于20至60℃，优选介于25至55℃的温度浓缩，然后喷雾干燥。
在一个实施方案中，在环境压力(即980至1200hPa)、在高温(即80至120℃)，使用水和/或含有介于5与95％(v/v)醇的醇/水混合物进行提取。
在本发明的上下文中，提取物优选是干燥的、或冷冻的或冻干的、或新鲜的。植物材料可以以任何形式使用，例如粉末、粉碎物或任何其他形式。
根据本发明的提取物可以通过任何方式获得。它可以任选地由商业供应商获得，或者可以部分或全部由夏枯草的地上部分制备。在优选的实施方案中，溶剂是水、含水缓冲液或水醇。在特定的优选的实施方案中，溶剂是水，并且在合适的时间内通过热水提取来进行提取方法。
水醇溶剂为主要由一种或多种醇和水组成的溶剂混合物。优选地，水醇溶剂为(基本上)由一种或多种醇和水组成的50重量％以上、至少60重量％、至少70重量％、至少80重量％、至少90重量％、至少95重量％的溶剂混合物。任选地，水醇溶剂为(基本上)由一种或多种醇组成的50重量％以上、至少60重量％、至少70重量％、至少80重量％、至少90重量％、至少95重量％的溶剂混合物。如本文中所使用，水也可以包括热水或亚临界水。此外，可以使用一种或多种含水缓冲液。
因此，本发明的一个方面涉及通过实施上文描述的制备方法能够获得的夏枯草的地上部分的提取物。
本发明的另一方面涉及组合物的化妆品用途，该组合物包含作为活性成分的如上文描述的夏枯草地上部分的提取物或由作为活性成分的如上文描述的夏枯草地上部分的提取物组成，旨在预防和/或治疗心理情绪应激相关的障碍和/或皮肤和毛囊上的损伤。
在本发明的实施方案中，应激相关的障碍和/或损伤选自皮肤干燥、皮肤发红、皮肤异常色素沉着、皮脂失调、皮肤瘙痒、皮肤炎症、特应性皮炎、银屑病、白癜风、系统性红斑狼疮、脱发(即斑秃、休止期脱发)、毛发生长停滞、毛囊细胞凋亡、毛发浓厚、毛发斑白和毛发变薄，或其两种或多种。
在优选的实施方案中，应激相关的障碍可以为脱发、毛发生长停滞、毛囊细胞凋亡毛发浓厚、毛发斑白和毛发变薄。
在一个实施方案中，本发明的提取物用于调节应激诱导的神经免疫兴奋，用于调节应激诱导的感觉神经元兴奋，用于抵抗应激诱导的肥大细胞脱颗粒，用于促进至少一种健康激素的分泌，或用于其两种或多种。
有利地，组织包括皮肤和头皮。皮肤可以为干性皮肤、健康皮肤、正常皮肤和油性皮肤。
可以将根据本发明的提取物用作活性成分。此外，它可以原样以纯的形式使用，或可以与一种或多种其他组分混合。换言之，可以将它用作组合物中的抗应激活性成分，这意味着它能够限制和/或对抗皮肤和毛囊中的心里情绪应激缺陷效应。优选地，将它用于化妆品或药物组合物中。
值得注意的是，本公开内容中提供的实验研究表明，可以将包含本发明的夏枯草的地上部分的提取物(或甚至由本发明的夏枯草的地上部分的提取物组成)的组合物用作化妆品和/或药物目的的抗应激活性成分，特别是用于皮肤护理和毛发护理。事实上，包含夏枯草(或甚至由夏枯草组成)的组合物可以改善皮肤和毛发二者的状况，特别是当它们已面临心理情绪应激状况时。
因此，已令人惊讶地发现，响应于心理情绪应激，本发明的提取物可以积极调节至少一种或多种具体的生理反应，导致对皮肤和毛发二者的固有有益效果，证明了其在化妆品和药物目的中的用途。
值得注意的是，根据本发明的提取物能够触发健康激素的分泌，用于调节由至少一种应激介质诱导的神经免疫兴奋和/或用于调节健康激素例如β-内啡肽和催产素的释放。事实上，如上文所解释，通过神经免疫激活的心理情绪应激增加了毛囊和皮肤细胞产生NGF和糖皮质激素。这诱导肥大细胞脱颗粒和/或感觉神经元兴奋，随后分泌P物质和神经营养因子，如CGRP和NGF，它们增强肥大细胞激活，随后释放炎症分子。实验数据表明，根据本发明的提取物能够抵抗或缓解至少一种上述应激介质(即皮质醇、CGRP、组胺)的分泌。因此，可以改善皮肤和毛发的状况，并且可以通过产生例如催产素、β-内啡肽、多巴胺和血清素来获得健康感觉。
在本发明的一个实施方案中，健康激素可以包括β-内啡肽、催产素、血清素、多巴胺或其两种或多种的组合。
应激介质可以包括皮质醇等(即，可的松)、组胺、肾上腺素、去甲肾上腺素等或其两种或多种的组合。
此外，本发明的提取物能够保护毛囊免受应激相关的细胞凋亡和毛囊增殖的减少。事实上，糖皮质激素如皮质醇会对毛细胞的生存力和增殖以及毛囊的生长及其活力产生负面影响。
此外，根据本发明的提取物能够抵抗应激诱导的毛囊改变和/或减轻皮质醇诱导的毛发生长停滞。事实上，实验数据表明，根据本发明的提取物能够防止毛囊细胞凋亡和恢复这些细胞的增殖活性。
此外，根据本发明的提取物能够抵抗导致毛发斑白的应激诱导的毛囊色素沉着的改变。事实上，实验数据表明，所述提取物能够预防在应激条件下观察到的色素沉着的毛囊损失。
在本发明的优选的实施方案中，提取物可以具有至少一种以下对皮肤细胞和/或毛囊的活性：
(a)抵抗和/或减少肥大细胞的应激诱导的脱颗粒；
(b)预防皮肤应激诱导的炎症和/或刺激；
(c)减轻或抵抗皮质醇诱导的毛发生长；
(d)使应激的毛囊恢复产生VEGF；
(e)减轻或抵抗皮质醇诱导的脱发；
(f)抵抗皮质醇诱导的毛囊损伤；
(g)促进暴露于皮质醇的毛囊中减少的细胞增殖；
(h)抵抗皮质醇诱导的毛囊细胞凋亡；
(i)预防或限制皮质醇诱导的毛发斑白；
(j)促进由皮质醇减少的毛发致密化；
(k)预防或限制皮质醇诱导的毛发变薄；
(l)保护毛囊免受应激相关的细胞凋亡；
(m)其两种或多种的组合。
将要理解的是，在本发明的夏枯草的提取物或包含这样的本发明的提取物的组合物的上下文中做出的定义和优选的实施方案作必要修改后适用于其用途。
如本发明通篇中所使用，术语“心理情绪应激”或“应激”可以在本领域通常理解的最广泛的意义上互换地理解。换言之，它是指当人们处于精神和情绪压力下时产生的身体状态，导致下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴产生应激介质，包括P物质、神经营养素如降钙素基因相关肽(CGRP)和NGF，糖皮质激素如皮质醇、皮质酮和组胺。例如，这些应激介质可能在许多应激源(但不限于)如工作责任、经济压力、健康问题、家庭冲突可能触发心理情绪应激后分泌。该应激通常与身体症状有关，如头痛、睡眠障碍、消化问题和脱发。总之，这些症状负面地影响我们的健康。此外，光照(例如，暴露至紫外(UV)光、暴露至可见光和/或暴露至红外(IR)光、暴露至特定污染、暴露至一种或多种病原体(包括天然和化学产品)和/或过敏原、暴露至波动的温度和/或湿度、和/或暴露至机械约束(包括由于日常习惯如剃须、手套和/或戴口罩)也可以刺激这些应激介质。
如本发明通篇中所使用，术语“应激诱导的”或“应激相关的”可以在本领域通常理解的最广泛的意义上互换地理解。换言之，应激诱导是指由于皮肤上和/或毛发上的应激而产生的生理和物理影响。
如本文中所使用，术语“健康激素”或“快乐激素”可以在本领域通常理解的最广泛的意义上互换地理解为能够在受试者中提供健康或舒缓效果的分子(例如，由蛋白质或肽组成的激素，或者可以是化学分子)。
如本文中所使用，术语“神经免疫兴奋”是指感觉神经元和免疫系统二者的兴奋，导致肥大细胞脱颗粒和健康激素的释放。如本文中所使用，术语“感觉神经元兴奋”可以在本领域通常理解的最广泛的意义上进行理解。换言之，这意味着在接收到令人兴奋的信号(即：至少一种应激介质)之后，感觉神经元通过介导应激反应介质如皮质醇、神经生长因子(NGF)、组胺和P物质(SP)的产生，以及介导健康激素如催产素和β-内啡肽的产生，触发相应的反应。
如本文中所使用，术语“调节”是指神经元根据上下文提供的平衡反应。事实上，当感觉神经元兴奋时，它会导致至少一种健康激素的分泌和应激反应介质的产生。
令人惊讶的是，已发现可以将本发明的提取物用作抗应激活性成分。
因此，本发明的另一方面涉及化妆品或药物组合物，其包含：
(A)如上文所描述的夏枯草的地上部分的提取物作为活性成分；和
(B)不同于夏枯草的提取物的至少一种另外的化妆品和/或药学上可接受的成分，
其中组合物为局部用组合物，选自溶液、悬浮液、乳液、乳膏、糊剂、凝胶、洗液、粉末、皂、含表面活性剂的水、油、洗发剂和喷雾剂；和/或其中组合物为口服施用的营养保健组合物。
将要理解的是，在使用本发明的夏枯草的提取物的上下文中作出的定义和优选的实施方案作必要修改后适用于包含这样的提取物的组合物。
在此，根据本发明的提取物可以任选地被认为是(或者任选地甚至是唯一的)活性成分。如本文中所使用，术语“活性成分”可以在最广泛的意义上理解为可以单独或与一种或多种其他成分，如一种或多种本身无活性的载体或可以任选地协同作用的其他活性成分)一起表现出期望和预期活性的组分。优选地，本发明的活性成分是化妆品活性成分。更优选地，本发明的活性成分是抗应激相关活性成分。如本文中所使用，在本发明的上下文中的表达“抗应激”是指这样的活性物质能够对抗由应激引起的身体紊乱和/或损伤，并且其能够提供心理益处，如放松、减压。
可以将化妆品或药物组合物用于任何目的和以任何形式使用。在优选的实施方案中，组合物为局部用组合物，选自溶液、悬浮液、乳液、乳膏、糊剂、凝胶、洗液、粉末、皂、含表面活性剂的水、油、洗发剂和喷雾剂；和/或其中组合物为口服施用的营养保健组合物。
组合物还可以为或可以包含在选自乳液、凝胶、软膏、滋养品、液体皂、块皂、沐浴油、淋浴油、按摩油、化妆品、头皮护理剂、须后水、剃须产品、除臭剂、沐浴凝胶、洗发剂，及其两种或多种的组合的产品中。
任选地，化妆品或药物组合物也可以为可以口服施用至受试者的营养保健组合物。然后，化妆品或药物组合物可以任选地包括在食品，如食物补充剂中。然后，组合物可以典型地具有全身效果。根据本发明的营养保健组合物可以用可接受的载体配制成适合口服施用的任何形式，例如片剂、胶囊、颗粒、粉末、溶液、乳液或悬浮液。
化妆品或药物组合物可以包含任何含量的本发明的提取物。在优选的实施方案中，组合物包含按组合物总重量计少于30重量％的根据本发明的提取物。在优选的实施方案中，组合物包含按组合物总重量计0.0001至20重量％，更优选0.001至15重量％，甚至更优选0.005至10重量％，特别是0.01至5重量％的根据本发明的提取物。
不同于本发明的提取物的至少一种另外的化妆品和/或药学上可接受的成分可以为任何化妆品和/或药学上可接受的成分。在优选的实施方案中，化妆品和/或药学上可接受的成分为或包含至少一种化妆品和/或药学上可接受的载体。
如本文中所使用，术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“化妆品可接受的载体”、“化妆品可接受的赋形剂”、“载体”和“赋形剂”可以在最广泛的意义上互换地理解为可以支持根据本发明的含有夏枯草的提取物的组合物的化妆品和/或药理学上可接受性或可用性的任何物质。优选地，当施加至组织时，根据本发明的夏枯草的提取物或含有这样的至少一种提取物的组合物都不是有毒的。
准备使用的组合物优选可以是液体制剂，尤其是适合于局部和口服施用的组合物。该组合物的储存形式也可以是液体，但也可以是经干燥的形式(例如，粉末，如包含夏枯草的提取物或由夏枯草的提取物组成的粉末)，或者可以是糊剂或糖浆等。任选地，可以将经干燥的形式、糊剂或糖浆在被施用至感兴趣的皮肤之前溶解或乳化。
化妆品和/或药学上可接受的载体可以示例性地选自由以下组成的列表：含水缓冲液、盐水、水、醇、植物油、矿物油、聚合物或其两种或多种的组合。任选地，化妆品和/或药学上可接受的载体可以含有一种或多种化妆品和/或药学上可接受的添加剂。
在优选的实施方案中，这样的化妆品和/或药学上可接受的添加剂可以选自由以下组成的组：香料/香精、染料、颜料、乳化剂、润滑剂、螯合剂、酸度调节剂、抗微生物剂、防腐剂、抗氧化剂以及其两种或多种的组合。例如，化妆品和/或药学上可接受的载体可以任选地含有一种或多种洗涤剂、三乙醇胺、一种或多种香料、一种或多种发泡剂(例如月桂基硫酸钠(SLS)、十二烷基硫酸钠(SDS))、一种或多种着色剂(例如食用色素、颜料)、一种或多种维生素、一种或多种盐(例如钠、钾、钙、锌盐)、一种或多种保湿剂(例如山梨醇、甘油、丁二醇、丙二醇、甘露醇、丙二醇、聚葡萄糖)、一种或多种酶、一种或多种防腐剂(例如苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、一种或多种抗氧化剂、一种或多种草药和植物提取物、一种或多种稳定剂、一种或多种螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))、一种或多种聚合物(例如羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素、纤维素、羧乙基纤维素)、一种或多种稳定剂、一种或多种增溶剂、一种或多种润肤剂和/或一种或多种摄取介质(例如，聚乙烯亚胺(PEI)、细胞穿透肽(CPP)、蛋白质转导结构域(PTD)、抗微生物肽等)。
此外，除了夏枯草的提取物之外，本发明的组合物还可以含有一种或多种其他已知的活性成分，所述活性成分与所述夏枯草的提取物协同和/或互补地起作用，而不影响其活性或其如上文所述的预期用途。已知活性成分的实例可以为但不限于描述于文献EP-A3681467和EP-A3643295中的那些，所述文献在此通过引用引入。
根据本发明的组合物可以是化妆品产品或者可以包含在化妆品产品中。根据安全性研究和法律要求，可以减少或避免皮肤和毛发中的应激相关的有害影响。可以将该组合物用于任何用途。能达到所要求保护的期望的目的的任何施用途径都是合适的。施用可以是局部或全身施用。优选地，施用是局部施用。施用可以是局部施用、透皮施用、口服施用、借助于注射(例如，静脉内(i.v.)、动脉内(i.a.)、腹膜内(i.p.)、肌肉内(i.m.)和皮下(s.c.)注射)施用或鼻腔施用。例如，可以将根据本发明的组合物与可接受的载体配制成用于局部、口服、直肠、经粘膜、经鼻、肠道、肠内和肠胃外施用的任何合适形式。
在优选的实施方案中，组合物是局部用组合物。在优选的实施方案中，组合物是局部地施用至受试者的局部用组合物。在优选的实施方案中，组合物是局部地施用至皮肤的一部分，例如施用至脸、头皮，或身体的任何部分的局部用组合物。皮肤可以是所有皮肤类型，包括受损皮肤、干性皮肤、健康皮肤、中性皮肤和油性皮肤。
如上所述，可以将本发明的夏枯草的提取物或组合物用于任何目的。优选地，将其用于化妆品和/或药学目的。
本发明的提取物或包含这样的提取物的组合物可以具有局部和/或全身作用。在优选的实施方案中，当局部(locally和/或topically)施用时，其(主要或完全)具有局部作用。
如其中所使用，术语“受损皮肤”和“受损皮肤表型”可以在广泛意义上理解为暴露至一种或多种至少引发心理情绪应激的有害因素的任何类型的皮肤。
具有感兴趣的组织，尤其是皮肤、头皮和毛发的受试者可能遭受或可能具有发展上述障碍和/或损伤的风险。
如在本发明的上下文中所使用，术语“受试者”可以在最广泛的意义上被理解为任何生物。受试者优选是人或动物，更优选是人或哺乳动物，尤其是人类。
如本文中所使用，术语“障碍”可以在最广泛的意义上理解为任何病理状态。其优选可以为固有的疾病。如本文中所使用，术语“损伤”可以在最广泛的意义上理解为组织中的任何扰动或功能障碍，特别是在(其他)健康组织中。特别地，如本文中所使用，应激相关障碍和应激相关损伤可能由能够在组织内诱导心理情绪应激的因素固有地触发。组织优选意指皮肤，包括头皮和毛囊。
在本说明书和权利要求通篇中，除非上下文另有要求，否则开放措辞的术语，如“包含(comprise)”、“含有(contain)”、“包括(include)”等，以及变体，如“包含(comprises/comprising)”、“含有(contains/containing)”、“包括(includes/including)”等可以被理解为暗示涵盖规定的组成部分、成员、整数或步骤或者组成部分、成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他组成部分。
在描述本发明的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个”和“一种”和“该/所述”以及类似的引用应被理解为涵盖单数和复数二者，除非在此另有说明或与上下文明显矛盾。本文中值范围的叙述仅仅旨在作为单独引用落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另有说明，否则每个单独的值都被结合到说明书中，如同它在本文中被单独地以及彼此组合地叙述一样。除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则所有方法和程序步骤，包括本文中描述的方法限定产品步骤，都可以以任意合适顺序进行。本文中提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“如”、“例如”)的使用仅仅旨在更好地说明本发明，并且不对以其他方式保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对本发明的实践至关重要的任意未要求保护的元素。
本发明还涉及化妆品的非治疗方法，旨在通过根据需要在皮肤或头皮上施用有效量的包含如上文描述的夏枯草的地上部分的提取物(或由如上文描述的夏枯草的地上部分的提取物组成)的组合物，来预防和/或治疗受试者的皮肤中和毛囊中的应激诱导的障碍和/或损伤。
将要理解的是，在本发明的夏枯草的提取物的用途或包含本发明的这样的提取物的组合物的用途的上下文中作出的定义和优选实施方案作必要修改后适用于其化妆品方法。
本发明的另一方面涉及包含作为活性成分的上文描述的地上部分的提取物的或由作为活性成分的上文描述的地上部分的提取物组成的组合物的化妆品用途，旨在预防和/或治疗心理情绪应激相关的障碍和/或皮肤和毛囊上的损伤，和通过产生至少一种健康激素来促进健康感觉。
更一般而言，应该理解的是，这些方面和实施方式可以以任意方式和任意数量组合到另外的实施方案中。除非上下文另有指示，否则本申请中所有描述的元素的任意排列和组合应当被认为由本申请的描述所公开。
除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本文中描述的方法和材料是优选的，但是在本发明的实践或测试中也可以使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的其他方法和材料。
本文中引用或参考的所有文献在此被引入作为参考，并且可以在本发明的实践中采用。更具体而言，所有引用的文件都通过引用并入，其程度与每个单独的文件被具体和单独地指示通过引用并入的程度相同。
以下实施例和附图旨在说明本发明的另外的实施方案，而不限制其范围。
实施例
1.夏枯草的提取物的制备
收集夏枯草的叶、茎和花，彻底清洗以除去杂质，并在40至50℃干燥，粉碎至1mm以下的粒度。然后，将100g粉末浸入3L蒸馏水中。用沸水在回流下提取3次，持续2小时。将获得的液体在滤纸(Advantec，2号)上过滤，在减压下于50℃浓缩，然后喷雾干燥，以获得13g经干燥的夏枯草提取物。将10g该经干燥的粉末在1L甘油/水(80/20)(v/v)溶液中溶解，以获得10g/L的最终所谓夏枯草提取物(下文称为PVE)。根据Folin-Ciocalteu法测量的PVE的总多酚含量为0.73g/L或7.3％重量，基于干提取物的总重量计。对获得的PVE进行的液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析未显示皂苷的存在。
PVE中皂苷含量的用量
为了证实如HPLC-MS分析中已经表明的PVE中不存在皂苷，另外进行以下方案。通过将0.1g上述经干燥的PVE在10mL甲醇中溶解来制备样品溶液。然后，首先将0.005g人参皂苷Re在5mL甲醇中溶解。其次，用甲醇将0.5、1和2mL人参皂苷Re的该甲醇溶液各自稀释至10mL，以获得标准溶液。人参皂苷Re是例如在人参(Panax ginseng)中发现的三萜皂苷，其被描述为用于评价样品如植物提取物中皂苷的量的标准品(Hiai等，Planta Medica，第29(2)卷：116-22，1976)。
在每个试管中放入250μL样品溶液和标准溶液，添加250μL的8％香草醛-乙醇溶液和2.5mL的72％硫酸溶液，并在冰水浴中混合。将混合物溶液在水浴中于60℃温热20min，并测量545nm处的吸收。PVE中皂苷(等效人参皂苷Re)的浓度由校准曲线确定。下表1总结了结果：
表1：确认PVE中不存在皂苷
通过使用人参皂苷Re的上述测量的浓度获得校准曲线(图1)。皂苷的量根据下式确定：
总皂苷(％)＝[(Y-a)/b]*d*100
Y：样品的吸光度
a：线性回归线的截距(0.0596)
b：线性回归线的斜率(0.0011)
d：稀释系数(最终体积/等分试样体积)
将上述PVE用于后续测试。
2.体外研究：
2.1.PVE的β-内啡肽样作用的评价
为了评价PVE对皮质醇和组胺激发下感觉神经元兴奋的作用，进行了以下实验。
人类感觉神经元来源于hiPS细胞(人类诱导多能干细胞)。hiPS细胞通过转染人成纤维细胞获得。将细胞在96孔板中铺在分化培养基(M1)中，板上涂有一薄层(Corning；商品号：354277；批次：9238002)。细胞在37℃和5％CO2下孵育6天，每2天更换培养基。
在分化9天之后，将培养基M1用人类感觉神经元的成熟培养基(M2)代替。将细胞在37℃和5％CO2下孵育6天，每2天更换培养基。在培养的第18天(预孵育24小时)或培养的第19天(预孵育2小时)，取出培养基，并添加含有PVE或参比化合物β-内啡肽(Bachem；商品号：H-2700；批次：1069755)的新鲜培养基。进行以下条件：对照培养基，含有50、100或150ppmPVE的对照培养基，含有10μMβ-内啡肽的对照培养基。培养物在37℃和5％的CO2下孵育24小时。在孵育2或24小时之后，用各自10μM的皮质醇(Sigma Aldrich；商品号：H0888；批次：SLBN5690V)或组胺(Tocris；商品号：3545；批次：1A/18942)刺激培养板。在刺激30分钟之后，除去上清液并在-80℃储存。
在刺激30分钟之后上清液中释放的CGRP(antibodies-online；商品号：abx257902；批次：E2001551F)的量通过ELISA给药，并与未处理的对照进行比较。所有值均表示为平均值+/-均值标准误。使用ANOVA分析和Dunnett检验进行统计分析。*p<0.05；**p<0.005；***p<0.001相对于对照条件。###p<0.001相对于皮质醇或组胺状况。
结果，如图2A、2B、2C和2D所示，皮质醇和组胺激发均显著增加感觉神经元的兴奋，表现为CGRP释放的强烈增加。结果表明，PVE在短时间(2小时)或长时间(24小时)与应激分子预孵育后，可以抵抗或减轻应激诱导的感觉神经元的兴奋。事实上，首先皮质醇诱导感觉神经元兴奋，如CGRP释放的增加所证实，并且β-内啡肽在应激条件下能够将神经元兴奋降低至与对照条件相似的水平。其次，当在应激条件下用PVE处理感觉神经元时，表明了PVE缓解感觉神经元兴奋的能力，该兴奋导致SP、CGRP和NGF的分泌，这共同增强了肥大细胞激活，随后增强了炎症分子的释放。事实上，CGRP的水平以剂量依赖的方式降低。令人感兴趣的是，表明PVE触发与β-内啡肽相同的健康效果。在图2C和2D中表明了PVE抵抗由组胺诱导的感觉神经元兴奋的能力。令人感兴趣的是，表明PVE引发了比β-内啡肽同样的健康效果。
2.2.PVE的健康效果的评价
为了评价PVE在皮质醇和组胺激发下对催产素释放的作用，进行了以下实验。
基于先前解释的感觉神经元培养的方案，在刺激30分钟之后上清液中释放的催产素(antibodies-online；商品号：ABIN2862593；批次：20XT015a)的量通过ELISA给药，并与未处理的对照进行比较。
结果，如图3A和3B中所示，证实PVE在预孵育2小时之后强烈增加感觉神经元的催产素释放。在图3A中，表明了PVE促进催产素分泌(健康效果)和抵抗由皮质醇诱导的感觉神经元兴奋的能力。在图3B中，测量了PVE对组胺激发后感觉神经元释放催产素的作用。这些结果表明PVE促进催产素分泌和抵抗组胺诱导的感觉神经元兴奋的能力。此外，该实验显示，β-内啡肽对催产素的释放没有影响，表明PVE对皮质醇和组胺激发二者反应，即对应激条件的反应的最广泛的活性。总之，这些结果强调了PVE的健康潜在能力，因为它清楚地表明在皮质醇和组胺应激条件二者下催产素的剂量依赖性释放。
2.3.PVE抵抗糖皮质激素诱导的降低的毛囊细胞增殖和恢复VEGF分泌的能力的评价
在37℃于5％，CO2下将HFDP细胞维持在毛囊毛乳头细胞生长培养基(C-26501，PromoCell，Heidelberg，德国)中。将传代次数为4的细胞以2×104细胞/孔铺在24孔板中。将60％汇合的HFDPC用5、10或20ppm的PVE预处理2h，随后用200μM可的松处理。在孵育60h之后，回收细胞培养上清液，并使用ELISA试剂盒测量分泌的VEGF。对于细胞增殖分析，使用WST试验(EZ-Cytox，DogenBio，韩国)。使用微孔板分光光度法在450nm波长处测量吸光度。
如图4中所示，正如预期的那样，表明导致可的松产生的心理情绪应激抑制了HFDPC增殖。这些细胞是毛发生理学的主要参与者。结果还表明PVE恢复可的松诱导的毛发生长停滞的能力。事实上，尽管在可的松处理下，结果也表明PVE促进HFDPC生长的能力，因此表明PVE在毛发生理学中的有益效果，特别是促进毛发生长。
如图5中所示，结果表明PVE在可的松处理下以剂量依赖方式恢复VEGF分泌的能力。事实上，正如预期的那样，表明导致可的松产生的心理情绪应激减少了VEGF产生。VEGF参与调节毛囊周围的微循环，从而改善毛囊的营养，是毛发生理的关键。结果表明了PVE能够恢复HFDPC在应激状态下产生VEGF的能力，从而促进毛发生长。换言之，该结果证实了PVE可能是有效的抗应激诱导的毛发生长成分。
2.4.保护人类毛囊上的毛发生长免受心理情绪应激的能力的评价为了评价PVE对皮质醇应激下的毛发生长的影响，进行了以下实验。
从一名40岁女性的新鲜头皮/面部皮肤活检中取出人毛囊。在脱毛之后，通过显微镜观察选择分离的毛囊，以仅选择处于毛发生长初期阶段的毛囊。将它们随机置于补充的William’s E培养基(青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺(2mM)、氢化可的松(0.027μM)、亚硒酸钠(10ng/ml)、转铁蛋白(10μg/ml)和胰岛素(10μg/ml)中，并指示处理(对照，100μM的皮质醇，50或150ppm的PVE，存在或不存在皮质醇)。
将毛囊在37℃于5％CO2和相对湿度>95％下培养。在第1天和第3天更换培养基。使用立体显微镜设备(Carl Zeiss，Microscopy，法国)通过每日摄影监测分离的毛囊的生长5天。使用ImageJ软件测量每个毛囊的长度。
结果，如图6中所示，当用皮质醇处理人毛囊时，毛发生长从第1天到第5天强烈减少。据观察，PVE抵抗皮质醇诱导的毛发生长减慢。在5天之后，用PVE处理的应激毛囊的生长优于用PVE处理的非应激毛囊生长。事实上，与对照条件相比，PVE处理的应激毛囊平均生长80μm。同时观察到，基础(非应激)条件下的毛囊长度短于皮质醇处理下的毛囊长度。总之，这些结果表明PVE在应激条件下事后恢复和促进皮质醇诱导的毛发生长的能力。
2.5.PVE在保护毛囊结构方面的能力的评价
为了评价PVE对皮质醇应激和基础条件(非应激条件)下的毛囊结构的影响，进行了以下实验。
在多聚甲醛溶液(MM France，Brignais，法国)中过夜固定之后，使用自动脱水机(STP120 ThermoScientificTMWaltham，MA，美国)将样品脱水并浸渍在石蜡中。将5μM切片固定在Gold载玻片上，然后，在进行苏木精-曙红-藏红花(HES)染色。
苏木精-曙红-藏红花(HES)为使用细胞核、细胞质和基质着色剂的三色着色，通常用于组织的可视化。
结果，如图7中所示，当用皮质醇处理人毛囊时，它们的结构(真皮鞘和毛发基质)显著改变(用细线突出显示)。真皮鞘更薄。相反，PVE处理的皮质醇应激毛囊具有完整的结构和保守的组织，特别是真皮鞘层。真皮鞘位于毛囊的最外缘，并包括毛囊的结缔组织鞘。已知真皮鞘细胞有助于毛发循环和毛囊新生。毛发基质对毛囊的寿命，尤其是毛干产生至关重要。因此，保持坚固的真皮鞘和有活力的毛发基质对于维持毛囊稳态和防止脱发也是重要的。结果显示，在培养5天之后，毛囊仍然存活(对照条件)，相反，在皮质醇处理5天之后，毛囊明显受损和脆弱。这些结果表明了PVE在保护和增强毛囊免受皮质醇负面影响方面的能力，而且在基础条件下也是如此。事实上，在基础条件下(无应激源)在PVE存在下观察到较厚的真皮鞘。相反地，在皮质醇条件下，真皮鞘相当薄，毛发基质似乎发生了改变。
2.6.PVE在预防皮质醇诱导的毛囊细胞凋亡方面和在促进它们的增殖方面的能力的评价
为了评价PVE对皮质醇应激下的毛囊细胞增殖和细胞凋亡的影响，进行了以下实验。
为了进行免疫染色，使用连续的溶剂浴手动进行载玻片脱蜡。使用Dako EnvisionFlex解决方案(Agilent,Santa Clara，美国)进行热诱导表位回收。Ki-67(稀释度1/500)。通过在石蜡切片上实现的Ki-67免疫染色(小鼠单克隆抗Ki-67，DakoTMM7240，Santa Clara，美国)研究细胞增殖，按照供应商说明书，通过使用Plus Alexa 488TUNEL测定法(ThermoScientificTM，C10617，Waltham，MA，美国)研究细胞凋亡。
在TUNEL分析和Ki67抗体孵育后，切片在室温与Alexa 568偶联的第二抗体(A11004，Thermo Fischer ScientificTM，Waltham，MA，美国)孵育1小时。使用Hoechst(Invitrogen，商品号H3570)以1/5000在RT进行细胞核复染5分钟。将载玻片安装在水性培养基中。
结果，如图8中所示，由皮质醇应激引起的5天应激在细胞中诱导细胞凋亡，伴随着与对照条件相比减少的细胞增殖。该结果表明PVE通过显著减少凋亡细胞的数量和强烈增加毛囊细胞的增殖来有效抵抗皮质醇的有害作用。该结果证实了PVE在抵抗皮质醇诱导的毛囊损伤、避免或延迟皮质醇诱导的脱发、防止过早和延长的静息期以及保护来免受头发脆弱方面的有效功效。
正如预期的那样，已表明由皮质醇释放介导的心理情绪应激是凋亡细胞急剧增加和细胞活力下降的原因。这些数据可以解释在心理情绪应激下观察到的脱发。另人感兴趣的是，观察到PVE在抵抗皮质醇诱导的毛囊细胞损伤、凋亡和细胞增殖减少的能力。此外，PVE对细胞凋亡和细胞增殖有剂量依赖性改善作用。
2.7.PVE在保护毛囊色素沉着结构方面的能力的评价
为了评价PVE对基础或皮质醇应激下毛囊色素沉着的影响，进行了以下实验。
在多聚甲醛溶液(MM France，Brignais，法国)中过夜固定之后，使用自动脱水机(STP120 ThermoScientificTMWaltham，MA，USA)将样品脱水并浸渍在石蜡中。然后，将5μM切片固定在Gold载玻片上，然后进行Masson’s Fontana染色。该染色用于观察黑色素颗粒。黑色素是一种非脂质色素，棕色至黑色，生理上存在于毛发、眼睛和皮肤中。正如预期的那样，已表明由皮质醇释放介导的心理情绪应激是凋亡细胞急剧增加和细胞活力下降的原因。这些数据可以解释在心理情绪应激下观察到的脱发。令人感兴趣的是，观察到PVE在抵抗皮质醇诱导的毛囊细胞损伤、凋亡和降低细胞增殖的能力。此外，我们显示了PVE对细胞凋亡和细胞增殖的剂量依赖性改善作用。
结果，如图9中所示，当用皮质醇处理人毛囊时，毛囊色素沉着受到高度影响。事实上，在用皮质醇治疗5天之后，几乎所有的黑色素颗粒都消失了。
相反，PVE处理的皮质醇应激的毛囊的黑色素含量是保守的。该结果突出了PVE减轻心理情绪应激诱导的毛发斑白的潜力。正如预期的那样，已表明导致皮质醇释放的心理情绪应激也是导致毛发斑白的原因。事实上，在皮质醇条件下显示出较少的黑色素(黑色箭头)。然后，结果表明PVE通过促进色素沉着来预防皮质醇诱导的毛发斑白的能力。此外，在基础条件下(150ppm的浓度)也观察到PVE的促色素(pro-pigmenting)作用。
2.8.PVE抵抗糖皮质激素诱导的肥大细胞脱颗粒增加的能力的评价
为了评价PVE对肥大细胞脱颗粒的影响，进行了以下实验。
RBL-2H3细胞系是一种常用的β-己糖胺酶释放性细胞系，用于炎症、过敏和免疫学研究。将该BL-2H3细胞系用作肥大细胞模型，并给药β-己糖胺酶作为肥大细胞脱粒的标志物。
在37℃于5％CO2下将RBL-2H3，大鼠嗜碱性白血病(ATCC，CRL-2256TM)维持在含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中。将细胞以每孔2.5x105个细胞接种在48孔板中，并孵育24h。
在用HEPES缓冲的台式溶液(pH 7.4)替代之后，将PVE预处理1h，然后用500nMA23187(细胞脱粒的钙离子载体诱导剂)处理。将A23187用作验证实验的实验阳性对照。在A23187处理之后回收培养上清液1h。用含有1％triton X-100的台式溶液处理细胞，孵育15min，然后通过离心回收上清液。分别用50μl的对硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(4mM)(一种β-己糖胺酶底物)处理50μl培养上清液和裂解液，并在37℃反应30min。通过用50μl的50mM碳酸钠缓冲液处理停止反应，并在405nm处测量。
然后，使用β-己糖胺酶活性的计算来测量脱颗粒％：
脱颗粒(％)＝(OD上清液-OD空白)/(OD上清液+OD裂解液-OD空白)*100
如图10中所示，PVE以剂量依赖的方式抑制肥大细胞脱颗粒，因此表明其能够缓解导致脱发和皮肤损伤的神经源性炎症的能力。
3.体内研究：PVE在预防应激诱导的脱发方面和在促进应激人员毛发生长迟缓方面的能力的评价
为了评价PVE对皮质醇应激下人类志愿者毛囊的影响，进行了双盲和媒剂对照的临床研究。在该方面，《赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)》的建议和《协调良好临床实践国际会议指南(the guidelines of the International Conference onHarmonization Good Clinical Practice)》被认为适用于非药物研究。
为了确保志愿者应激，使用公知的感知压力量表(Perceived Stress Scale，PSS)问卷和Codesna公司商业化的特定应激测量装置(US-B2-10856797)评价他们的应激状态。PSS问卷是神经科学领域中最广泛使用的测量和评定人类心理情绪应激感知的工具。它由10个问题和评分答案组成，得出一个总体分数，总结如下：
PSS评分 应激感知水平
0至13 低
14至26 中
27至40 高
由于一致认为24的阈值对于焦虑检测可能是可靠的，因此选择得分高于24的志愿者进行本研究，以评价PVE对脱发和生长参数的影响。
为了确保被选择的志愿者真实应激，借助于Codesna的装置进行了第二次选择。该测量装置基于神经心脏病学领域中对脑-心脏相互作用进行的研究。心率变异性反映了自主神经系统(交感神经和副交感神经反应)内的失衡，并直接反映应激水平。该装置对自主神经系统失衡进行评分，允许评价有效的慢性应激，而不考虑任何主观(自我)评价。事实上，该装置测量生理参数：应激指数和反映受试者焦虑的心肺调整(cardiorespiratoryalignment)。
以下信息由Codesna装置的用户指南提供：
-应激指数
ο<15：非应激的
ο15至25：中度应激的
ο>25：高应激的
-超过1.5的心肺调整反映焦虑状态。
上述所选择的志愿者还通过了第三次选择，以确保他们患有应激诱导的脱发。在此方面，通常进行梳理测试，包括以标准化的方式梳理志愿者，并计算掉落的头发。事实上，只有超过10根掉落头发的志愿者被认为与研究的其余部分相关。
测量志愿者生理应激水平的重要性：
预选择27名PSS评分高于23分的女性。她们的生理应激按照用户指南使用Codesna的装置来测量。
在27名志愿者中，13名女性(占48％)表现出13以下的低生理应激水平(表1)，这意味着这些志愿者虽然认为自己应激，但并非生理学应激，因为她们的机体在没有身体影响的情况下处理了该应激。
其他14名小组成员的应激指数高于15的阈值，但一名成员为14岁但完成了另一测量参数：心肺调整高于1.5(1.64)。
可以得出的结论是，这14名志愿者确实应激，这证明了将他们纳入临床研究的合理性，使得他们的招募与PVE效果的临床评价更加相关。
表2：未纳入的和纳入的志愿者的PSS评分和应激指数
3.2.PVE在预防应激诱导的脱发方面和在增强应激志愿者中的毛发生长减慢的能力的评价
如上表2中所示，14名白种女性(年龄介于27与56岁之间，平均年龄42.6岁)被选择为处于应激并遭受应激相关的毛发损伤(脱发、头发生长速度减慢)。问题在于知晓这样的脱发是否至少部分地由于她们的应激。
然后，志愿者被要求在他们的头皮上施加包含PVE或安慰剂的凝胶乳膏制剂(表2)，每天一次，持续84天。在治疗之前，即首次施加之前48h和在84天治疗访视之前48h，剃掉1cm2头皮面积用于毛发扫描分析。在第0天-48h和第0天以及第84天-48h和第84天拍摄照片，以评价毛发生长(毛发长度的测量)、毛发生长初期阶段的比例、毛发生长终期阶段的比例和毛发生长初期/毛发生长终期比率。
表3：用于临床研究中的包含PVE的凝胶乳膏制剂
将表3中总结的两种凝胶乳膏施加在表1中选择的应激志愿者的头皮上。
毛发的长度、毛发生长初期阶段中毛囊的百分比、毛发生长终期阶段中毛囊的百分比以及毛发生长初期/毛发生长终期比率通过剃毛之后即刻或48小时之后使用毛发扫描对剃毛区域进行图片分析来测量。这是在使用凝胶乳膏之前和84天之后完成的。统计学：**：p<0.01，*：p<0.05，#：p<0.1，ns：不显著
如图11A中所示，PVE增强应激的志愿者的毛发生长。事实上，首先表明了安慰剂并不抵抗应激诱导的毛发生长减慢。事实上，在D84时，毛发生长速率下降了10.8％。该结果表明，所选择的志愿者确实应激，因为他们的毛发生长速率随时间推移下降。这也与体外结果一致(图3至9)。其次，表明在84天的治疗之后，与对照相比，毛发生长了21.3％。因此，可以得出结论，PVE固有地抵抗应激对毛发的有害影响，并且还增强了被应激减慢的毛发生长速率。
如图11B中所示，由于与对照相比，毛发生长初期阶段中的毛囊比例减少了5.2％，表明安慰剂在84天的治疗之后没能做到将毛囊维持在毛发生长初期阶段。相反，PVE增加了毛发生长初期阶段比例(+3.1％)，这意味着尽管存在应激，但毛发仍处于生长阶段。这些评估报告也与体外结果一致(例如：图4)。因此，PVE预防应激诱导的脱发。
如图11C中所示，与对照相比，在D84时毛发生长终期阶段的毛囊的比例增加了26.5％，这表明安慰剂没能做到抵抗毛囊进入毛发生长终期阶段。相反，与对照组相比，PVE在D84时将毛发生长终期阶段比例降低了15.6％，这意味着毛发保持在静止期，不会脱落。这些评估报告也与体外结果一致(图3至9)。因此，PVE预防应激诱导的脱发。
如图11D中所示，由于毛发生长初期/毛发生长终期比率在D84时下降23.5％，表明安慰剂没能做到抵抗应激诱导的毛囊进入毛发生长终期阶段。相反，PVE显著提高了应激诱导的毛发生长初期/毛发生长终期比率。这些评估报告与体外结果一致(图3至9)。因此，这反映了PVE通过刺激生长阶段(毛发生长初期)进入和通过抑制静止期(毛发生长终期)进入来促进毛发动态及其发育，这最终在毛发生长速度上是明显的，并预防应激诱导的脱发。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.夏枯草的由叶、茎和花组成的地上部分的提取物，所述提取物通过在选自水或者水与醇的混合物的溶剂中固/液提取来获得，其中：
i)其包含1至15重量％，优选2至12重量％，更优选3至10重量％的一种或多种多酚，基于提取物的干含量的总重量计；
ii)其包含小于0.1重量％，优选小于0.01重量％，更优选小于0.001重量％，特别是0重量％的皂苷，基于提取物的干含量的总重量计；
iii)提取物的干含量占至少10g/L(重量/溶剂体积)，优选至少15g/L，甚至更优选至少20g/L。
2.根据权利要求1的提取物，其中所述提取物为水提取物。
3.根据权利要求1的提取物，其中所述提取物为水甲醇提取物或水乙醇提取物，优选水乙醇提取物。
4.用于制备夏枯草的由叶、茎和花组成的(任选经干燥的)地上部分的提取物的方法，包括以下步骤：
i)在水或水醇溶剂中进行所述地上部分的固/液提取，其中：
a.在水中的提取在80至150℃，优选在100至130℃，甚至更优选在85至130℃，特别是在90至120℃进行15分钟至10小时，优选进行30分钟至8小时，更优选进行1小时至6小时，最优选进行1.5至5小时；或
b.在水醇中的提取在50至120℃，优选在60至115℃，更优选在70至110℃，特别是在80至105℃进行15分钟至10小时，优选进行30分钟至8小时，更优选进行1小时至6小时，最优选进行1.5至5小时；
(ii)将步骤(i)的固体残余物与提取物分离；
(iii)通过除去至少一种溶剂或其部分而浓缩提取物。
5.能够通过实施根据权利要求4的制备方法获得的夏枯草的地上部分的提取物。
6.化妆品或药学组合物，其包含：
(A)根据权利要求1至3和5中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物作为活性成分；和
(B)不同于夏枯草的所述提取物的至少一种另外的化妆品和/或药学上可接受的成分，
其中所述组合物为局部用组合物，选自溶液、悬浮液、乳液、乳膏、糊剂、凝胶、洗液、粉末、皂、含表面活性剂的水、油、洗发剂和喷雾剂；和/或其中该组合物为口服施用的营养保健组合物。
7.根据权利要求6所述的化妆品或药学组合物，其中参照所述组合物的总重量，所述组合物包含0.0001至20重量％，优选0.001至15重量％，更优选0.005至10重量％，尤其是0.01至5重量％的根据权利要求1至3和5中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物。
8.包含作为活性成分的根据权利要求1至3和5中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物的或由作为活性成分的根据权利要求1至3和5中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物组成的组合物的化妆品用途，旨在预防和/或治疗心理情绪应激相关的障碍和/或皮肤和毛囊上的损伤，选自皮肤瘙痒、皮肤炎症、脱发、毛发生长停滞、毛囊细胞凋亡、毛发浓厚、毛发斑白和毛发变薄，其中所述用途另外通过产生至少一种健康激素来促进健康感觉。
9.根据权利要求8所述的化妆品用途，其中所述提取物用于调节应激诱导的神经免疫兴奋，用于调节应激诱导的感觉神经元兴奋，用于抵抗应激诱导的肥大细胞脱颗粒或用于其两种或多种。
10.根据权利要求8和9中任一项所述的化妆品用途，其中所述健康激素选自β-内啡肽、催产素、血清素、多巴胺或其两种或多种的组合。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的化妆品用途，其中所述提取物具有至少一种以下对皮肤细胞和/或毛囊的活性：
(a)抵抗和/或减少肥大细胞的应激诱导的脱颗粒；
(b)预防皮肤应激诱导的炎症和/或刺激；
(c)减轻或抵抗皮质醇诱导的毛发生长；
(d)使应激的毛囊恢复产生VEGF；
(e)减轻或抵抗皮质醇诱导的脱发；
(f)抵抗皮质醇诱导的毛囊损伤；
(g)促进暴露于皮质醇的毛囊中减少的细胞增殖；
(h)抵抗皮质醇诱导的毛囊细胞凋亡；
(i)预防或限制皮质醇诱导的毛发斑白；
(j)促进由皮质醇减少的毛发致密化；
(k)预防或限制皮质醇诱导的毛发变薄；
(l)保护毛囊免受应激相关的细胞凋亡；
(m)其两种或多种的组合。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的用途，其中应激相关的障碍和/或损伤另外选自皮肤干燥、皮肤发红、皮肤异常色素沉着、皮脂失调、特应性皮炎、银屑病、白癜风、系统性红斑狼疮，或其两种或多种。
13.由作为活性成分的根据权利要求1至3、5中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物组成的组合物，所述组合物用于非治疗方法中，用于预防和/或治疗应激诱导的障碍和/或皮肤中和毛囊中的损伤，选自皮肤瘙痒、皮肤炎症、脱发、毛发生长停滞、毛囊细胞凋亡、毛发浓厚、毛发斑白和毛发变薄，其中另外用于通过产生至少一种健康激素来促进健康感觉。

Claims (14)

1.夏枯草的包括叶、茎和花的地上部分的提取物，所述提取物通过在选自水或者水与醇的混合物的溶剂中固/液提取来获得，其中：
i)其包含1至15重量％，优选2至12重量％，更优选3至10重量％的一种或多种多酚，基于提取物的干含量的总重量计；
ii)其包含小于0.1重量％，优选小于0.01重量％，更优选小于0.001重量％，特别是0重量％的皂苷，基于提取物的干含量的总重量计；
iii)提取物的干含量占至少10g/L(重量/溶剂体积)，优选至少15g/L，甚至更优选至少20g/L。
2.根据权利要求1的提取物，其中所述提取物为水提取物。
3.根据权利要求1的提取物，其中所述提取物为水甲醇提取物或水乙醇提取物，优选水乙醇提取物。
4.用于制备夏枯草的包括叶、茎和花的(任选经干燥的)地上部分的提取物的方法，包括以下步骤：
ii)在水或水醇溶剂中进行所述地上部分的固/液提取，其中：
a.在水中的提取在80至150℃，优选在100至130℃，甚至更优选在85至130℃，特别是在90至120℃进行15分钟至10小时，优选进行30分钟至8小时，更优选进行1小时至6小时，最优选进行1.5至5小时；或
b.在水醇中的提取在50至120℃，优选在60至115℃，更优选在70至110℃，特别是在80至105℃进行15分钟至10小时，优选进行30分钟至8小时，更优选进行1小时至6小时，最优选进行1.5至5小时；
(ii)将步骤(i)的固体残余物与提取物分离；
(iii)通过除去至少一种溶剂或其部分而浓缩提取物。
5.能够通过实施根据权利要求4的制备方法获得的夏枯草的地上部分的提取物。
6.化妆品或药学组合物，其包含：
(A)根据权利要求1至3和5中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物作为活性成分；和
(B)不同于夏枯草的所述提取物的至少一种另外的化妆品和/或药学上可接受的成分，
其中所述组合物为局部用组合物，选自溶液、悬浮液、乳液、乳膏、糊剂、凝胶、洗液、粉末、皂、含表面活性剂的水、油、洗发剂和喷雾剂；和/或其中该组合物为口服施用的营养保健组合物。
7.根据权利要求6所述的化妆品或药学组合物，其中参照所述组合物的总重量，所述组合物包含0.0001至20重量％，优选0.001至15重量％，更优选0.005至10重量％，尤其是0.01至5重量％的根据权利要求1至3和5中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物。
8.包含作为活性成分的根据权利要求1至3和5中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物的或由作为活性成分的根据权利要求1至3和5中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物组成的组合物的化妆品用途，旨在预防和/或治疗心理情绪应激相关的障碍和/或皮肤和毛囊上的损伤，和通过产生至少一种健康激素来促进健康感觉。
9.根据权利要求8所述的化妆品用途，其中所述提取物用于调节应激诱导的神经免疫兴奋，用于调节应激诱导的感觉神经元兴奋，用于抵抗应激诱导的肥大细胞脱颗粒或用于其两种或多种。
10.根据权利要求8和9中任一项所述的化妆品用途，其中所述健康激素选自β-内啡肽、催产素、血清素、多巴胺或其两种或多种的组合。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的化妆品用途，其中所述提取物具有至少一种以下对皮肤细胞和/或毛囊的活性：
(a)抵抗和/或减少肥大细胞的应激诱导的脱颗粒；
(b)预防皮肤应激诱导的炎症和/或刺激；
(c)减轻或抵抗皮质醇诱导的毛发生长；
(d)使应激的毛囊恢复产生VEGF；
(e)减轻或抵抗皮质醇诱导的脱发；
(f)抵抗皮质醇诱导的毛囊损伤；
(g)促进暴露于皮质醇的毛囊中减少的细胞增殖；
(h)抵抗皮质醇诱导的毛囊细胞凋亡；
(i)预防或限制皮质醇诱导的毛发斑白；
(j)促进由皮质醇减少的毛发致密化；
(k)预防或限制皮质醇诱导的毛发变薄；
(l)保护毛囊免受应激相关的细胞凋亡；
(m)其两种或多种的组合。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的用途，其中应激相关的障碍和/或损伤另外选自皮肤干燥、皮肤发红、皮肤异常色素沉着、皮脂失调、皮肤瘙痒、皮肤炎症、特应性皮炎、银屑病、白癜风、系统性红斑狼疮、脱发、毛发生长停滞、毛囊细胞凋亡、毛发浓厚、毛发斑白和毛发变薄，或其两种或多种。
13.化妆品非治疗方法，其旨在通过向有需要的皮肤和透皮上施用有效量的包含根据权利要求1至3、5至7中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物(或由根据权利要求1至3、5至7中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物组成)的组合物来预防和/或治疗受试者的皮肤中和毛囊中的应激诱导的障碍和/或损伤。
14.包含作为活性成分的根据权利要求1至3、5中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物的或由作为活性成分的根据权利要求1至3、5中任一项所述的夏枯草的地上部分的提取物组成的组合物，所述组合物用于非治疗方法中，用于预防和/或治疗应激诱导的障碍和/或皮肤中和毛囊中的损伤和通过产生至少一种健康激素来促进健康感觉。
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