CN117701747A - 基于sanger法检测幽门螺杆菌s/l-htra的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术技术领域，且公开了一种基于SANGER法检测幽门螺杆菌S/L‑HTRA的试剂盒及方法，本发明提供了基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L‑HtrA的试剂盒，所述试剂盒包括(1)PCR扩增反应试剂：2.5×PCR mix、PCR扩增引物；(2)测序试剂：HiDi、BIGDye；(3)去离子水、阳性对照品和阴性对照品。本发明提供了一种基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L‑HtrA的方法，对幽门螺杆菌毒力基因HtrA的第171位氨基酸的碱基突变进行高准确度和高灵敏度检测，判断幽门螺杆菌HtrA的分型。该检测方法快捷、准确、灵敏度高，对指导医生判断患者感染Hp的危害程度有重要意义。

Description

基于SANGER法检测幽门螺杆菌S/L-HTRA的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，具体为一种基于SANGER法检测幽门螺杆菌S/L-HTRA的试剂盒及方法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种寄生在胃部的革兰氏阴性微需氧细菌，Hp感染可导致胃炎、胃溃疡以及胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌。1994年世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究机构(International Agency for Research On Cancer，IARC)就将Hp定为胃癌的I类致癌原。2021年12月，美国卫生及公共服务部下属美国毒理研究项目(NTP)又将幽门螺杆菌慢性感染列为明确人类致癌物。全球约50％的人感染了幽门螺杆菌，但是感染者终身罹患胃癌的风险为1-5％，这可能是由于Hp致病能力存在一定差异。目前，大量研究表明幽门螺杆菌菌株致病性的差异主要与其毒力基因型致癌蛋白细胞毒素A(CagA)和空泡细胞毒素A(VacA)有关。CagA位于cagPAI，主要通过Ⅳ型分泌系统(T4SS)进入宿主细胞，但幽门螺杆菌不能从胃上皮细胞的顶端注射CagA，而需要穿过上皮细胞层，进入到靠近基底层的上皮细胞尾端，注射器T4SS才能发挥作用，将毒性因子CagA注入上皮细胞。在这个过程中，可以将黏连在一起的上皮细胞分开的丝氨酸蛋白酶HtrA发挥着重要的作用。

最新研究表明，幽门螺杆菌丝氨酸蛋白酶HtrA中一个碱基的替换，会导致第171位氨基酸从丝氨酸变成亮氨酸(171S→L)，这与胃癌的发生显著相关。171S型HtrA大多以单体形式存在，不能有效切割连接蛋白，而171L型HtrA则多为稳定三聚体，其蛋白水解活性提高了3-5倍，能有效切割宿主上皮细胞的黏连蛋白occludin和E-cadherin。因此，在171L型HtrA的存在下，黏连胃上皮细胞的E-cadherin裂解水平更高，会让幽门螺杆菌更容易钻进胃上皮的深部，将CagA注入胃上皮细胞，使毒性因子CagA的注射更强，导致更严重的胃上皮损伤。除此，与171S型HtrA幽门螺杆菌相比，171L型HtrA幽门螺杆菌会增加促炎的NF-kB激活和促炎细胞因子IL-8的释放，以及增强了DNA的双链断裂和微核形成。所以，携带171L型HtrA幽门螺杆菌的患者有更高风险罹患胃癌；在未来的幽门螺杆菌筛查中，可以通过引入HtrA的171S/L分型，判断感染者未来患胃癌的风险是否会大幅增加，从而更早期更精准判断需要干预的人群，准确指导治疗方案，精确用药。

目前已有针对个别幽门螺杆菌毒力基因(例如CagA和VacA)分型的检测方法及抗体试剂盒，但是暂无可以对幽门螺杆菌HtrA进行分型的检测试剂盒、方法。因此，本发明针对HtrA的分型检测提供了一种简便、快速、准确的检测方法及试剂盒。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于SANGER法检测幽门螺杆菌S/L-HTRA的试剂盒及方法，采用PCR扩增、结合Sanger测序技术，可快速准确地检测患者幽门螺杆菌HtrA的分型，为幽门螺杆菌的治疗提供指导。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：基于SANGER法检测幽门螺杆菌S/L-HTRA的试剂盒及方法，所述试剂盒包括：

(2)PCR扩增反应试剂：2.5×PCR mix、PCR扩增引物；

(2)测序试剂：HiDi、BIGDye；

(3)去离子水、阳性对照品和阴性对照品。

优选的，所述PCR扩增引物是：

上游引物(SEQ-F)：TACCATTCCAGGGAGCAATAAAG

下游引物(SEQ-R)：GATGGAAGCGTCTGTTTGAATGA

优选的，所述PCR扩增引物SEQ-F与SEQ-R在体系内的浓度均为0.2Mm。

优选的，包括以下步骤：

(1)待测粪便样本DNA提取；

(2)利用PCR扩增引物SEQ-F与SEQ-R，以待测粪便DNA为模板进行扩增，获得PCR产物；

(3)将普通PCR产物进行纯化；

(4)将步骤(3)获得的纯化产物进行测序，得到碱基序列和峰图；

(5)将步骤(4)的测序结果与参考序列进行比较，确定HtrA分型。若检测样本测序结果与参考序列一致，则判定HtrA为S型；若检测样本在第171位氨基酸发生突变，则判定HtrA为L型。

优选的，步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系包括：2.5×PCR mix 8μL、10μmol/L上游引物(SEQ-F)1μL、10μmol/L下游引物(SEQ-R)1μL、去离子水5μL、粪便样本DNA5μL。

优选的，步骤(2)中，所述PCR扩增反应程序参数为：95℃2min；依次95℃10s，60℃30S，72℃40s，进行40个循环；72℃5min延伸；4℃保温。

优选的，步骤(3)中，所述PCR产物纯化是使用磁珠法琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

优选的，步骤(4)中，所述测序是基于Sanger双脱氧链终止法进行一代测序。

优选的，所述试剂盒的保存方式为环氧冷冻液的环境中；所述环氧冷冻液的制备方法为：

S1.向N,N-二甲基甲酰胺溶剂中加入6-10重量份的间氯苯乙烯进行溶解，溶解后加入10-15重量份的1-(3-氨丙基)咪唑进行取代反应，在70-90℃下反应15-20h，反应后减压蒸馏除去溶剂，过滤并干燥，得到咪唑基苯乙烯；

S2.向二氯甲烷中加入5-10重量份的咪唑基苯乙烯和4-8重量份的(3-羧丙基)三甲基氯化铵进行溶解，然后再向其加入1-2重量份的N,N-二环己基碳二亚胺、0.2-0.5重量份的N-羟基丁二酰亚胺进行反应，在50-70℃下反应4-10h，反应后得到季铵-咪唑-苯乙烯；

S3.向N,N-二甲基甲酰胺溶剂中加入4-7重量份的季铵-咪唑-苯乙烯和3-6重量份的丙烯醇进行搅拌，然后在加入0.3-0.5重量份的偶氮二异丁腈进行聚合反应，在80-110℃下反应6-10h，反应后得到环氧苯乙烯；然后将环氧苯乙烯加入冰水中搅拌，得到环氧冷冻液。

(三)有益的技术效果

1.本发明提出了对幽门螺杆菌171S/L HtrA的检测，为医生判断患者感染Hp的危害程度提供信息，预测病情未来转归的情况，提示胃癌高发人群，从而准确指导治疗方案，精确用药；其中环氧冷冻液可以帮助试剂盒进行保存，和消灭空气中细菌中的效果。

2.本发明设计了扩增幽门螺杆菌的HtrA基因核苷酸序列的引物，只要粪便样本中存在幽门螺杆菌，不需要幽门螺杆菌体外培养，直接能通过粪便样本提取核酸；采用PCR技术与Sanger测序技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，构建了稳定的扩增体系。本发明提供的检测方法与二代测序技术、生物蛋白芯片技术相比，该方法成熟简便、检测敏感性高、特异性好，并降低了检测的成本和难度。

附图说明

图1是图1为5对引物在不同退火温度下特异性验证的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为引物对1使用2.5×PCR mix 1和2.5×PCR mix 2进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为引物对1的20例临床粪便样本的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为临床粪便样本的测序图。

具体实施方式

试剂盒的保存方式为环氧冷冻液的环境中；所述环氧冷冻液的制备方法为：

S1.向N,N-二甲基甲酰胺溶剂中加入6-10重量份的间氯苯乙烯进行溶解，溶解后加入10-15重量份的1-(3-氨丙基)咪唑进行取代反应，在70-90℃下反应15-20h，反应后减压蒸馏除去溶剂，过滤并干燥，得到咪唑基苯乙烯；

S2.向二氯甲烷中加入5-10重量份的咪唑基苯乙烯和4-8重量份的(3-羧丙基)三甲基氯化铵进行溶解，然后再向其加入1-2重量份的N,N-二环己基碳二亚胺、0.2-0.5重量份的N-羟基丁二酰亚胺进行反应，在50-70℃下反应4-10h，反应后得到季铵-咪唑-苯乙烯；

S3.向N,N-二甲基甲酰胺溶剂中加入4-7重量份的季铵-咪唑-苯乙烯和3-6重量份的丙烯醇进行搅拌，然后在加入0.3-0.5重量份的偶氮二异丁腈进行聚合反应，在80-110℃下反应6-10h，反应后得到环氧苯乙烯；然后将环氧苯乙烯加入冰水中搅拌，得到环氧冷冻液。

实施例1

基于Sanger法的幽门螺杆菌S/L-HtrA的检测方法，包括以下步骤：

(1)待测粪便样本DNA提取；

(2)利用PCR扩增引物SEQ-F与SEQ-R，以待测粪便DNA为模板进行扩增，获得PCR产物；

(3)将普通PCR产物进行纯化；

(4)将步骤(3)获得的纯化产物进行测序，得到碱基序列和峰图；

(5)将步骤(4)的测序结果与参考序列进行比较，确定HtrA分型。若检测样本测序结果与参考序列一致，则判定HtrA为S型；若检测样本在第171位氨基酸发生突变，则判定HtrA为L型。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照所用的试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

收集2例经临床诊断为幽门阳性的粪便样本，采用全自动核酸提取仪获取粪便样本DNA。使用所设计的五对PCR扩增引物，并分别调整退火温度为52℃、54℃、56℃、58℃、60℃，以2例粪便DNA、野生型对照、突变型对照和阴性对照为模板进行PCR扩增。五对引物碱基序列如表1所示，PCR扩增反应体系及扩增程序分别如表2和表3所示，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。

表1 PCR扩增引物序列

表2 PCR反应体系

表3扩增程序

通过不同退火温度(Tm)扩增的电泳图可看出，引物对2、3、4、5在退火温度为52℃、54℃、56℃、58℃、60时都存在非特异扩增；引物对1在退火温度为60℃时，相较于其余4对引物，目标条带更为单一、明亮，说明设计的5对引物中引物对1特异性好。

实施例2

收集4例经临床诊断为幽门阳性的粪便样本，采用全自动核酸提取仪获取粪便样本DNA。使用引物对1及2.5×PCR mix 1和2.5×PCR mix 2对4例粪便样本进行PCR扩增，PCR扩增反应体系分别为表4，PCR反应程序如表5；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，2.5×PCR mix 2与引物对1能有效扩增，条带单一明亮。

表4 PCR反应体系

表5扩增序列

实施例3

收集20例经临床诊断为幽门阳性的粪便样本，采用全自动核酸提取仪获取粪便样本DNA。使用Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的试剂盒，采用Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的方法，对20例粪便样本进行检测，具体包括以下步骤：

1.20例待测临床粪便样本DNA提取

(1)将20例临床粪便样本上下颠倒数次混匀，3500rpm离心3min；

(2)取300μL粪便样本上清液、20μL蛋白酶K和4μL核糖核酸酶A加入到核酸提取仪配套的样本板中；

(3)将样本板放入全自动核酸提取仪中，选择对应程序开始进行核酸提取，结束后获得待检测样本DNA。

2.PCR扩增

(1)配制PCR反应体系，每反应管的总反应体系为20μL，具体组分与用量如表6所示。

表6 PCR反应体系

(2)将步骤(1)配制好的试剂盖紧管盖，短暂离心数秒后，置于PCR反应仪中，按照表5设置程序参数进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3.PCR产物纯化

PCR产物纯化使用磁珠法琼脂糖凝胶DNA回收，具体操作步骤如下：

(1)在长波紫外灯照射下将目的条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量去除多余的琼脂糖凝胶)，称重后将其放入干净的1.5ml离心管中；

(2)向离心管中加入3倍胶体积的BufferMG后，将其放入50℃的水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡5秒钟；

(3)将离心管从水浴锅中取出，检测胶块是否完全融化以及溶液是否由黄色变成紫色(如胶块未完全溶解，将离心管放回水浴锅中继续孵育；如溶液颜色由黄色变成紫色，向离心管中加入10μL 3M的醋酸钠溶液)。短暂离心后，将离心管室温放置5分钟；

(4)向离心管中加入20μL充分混匀的Magbeads，涡旋震荡5秒钟后将其放入25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或连续颠倒混匀10分钟；

(5)将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)；

(6)将离心管从磁力架上取下，加入750μL Buffer GW1后涡旋点震1分钟或涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)；之后将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)；

(7)将离心管从磁力架上取下，加入750μLBuffer GW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)；之后将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)；

(8)重复步骤(7)；

(9)保持离心管固定于磁力架上，用移液器进一步去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5-10分钟，使乙醇挥发干净。

注意：如果离心管侧壁上有液珠，可向离心管中加入750μL无水乙醇。盖上盖后颠倒离心管(保持离心管固定于磁力架上)，之后彻底弃去无水乙醇。

(10)将离心管从磁力架上取下，加入30-100μL BufferEB。涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于50℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将离心管放于50℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟；

(11)将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中。纯化产物可以立即进行测序PCR或置于-20±5℃保存备用。

3.Sanger测序

(1)配制Sanger法PCR反应体系，每反应管总体积为5μL，反应体系具体的组分与用量如表7。

表7 Sanger法PCR反应体系

将表7中配好的试剂，置于PCR反应仪中，设置Sanger法PCR扩增程序参数进行扩增，得到Sanger法PCR扩增产物，具体扩增程序如表8。

表8 Sanger法PCR扩增程序

(2)Sanger法PCR扩增产物纯化

①向待测产物中加入2μL 0.125M EDTA和20μL无水乙醇，3600rpm离心20min，去上清。

②向待测产物中加入70％酒精(AR)50μL。3600rpm离心5min，去上清。

③室温避光放置15-30分钟，待酒精挥发干净后加入10μL HiDi Formanide，震荡离心后等待上机测序。

(3)基因分析仪测序：将步骤(2)得到的纯化的Sanger法PCR扩增产物ABI基因分析仪检测，以及ABI公司Data与Sequencing Analysis软件进行数据收集和分析。

5.Sanger测序结果分析

根据检测样本的测序结果分析HtrA的分型，测序的序列图如图4。5例临床样本分析结果显示4例样本的第171位氨基酸发生突变，则判定为L型HtrA(171L-HtrA)；1例临床粪便样本在第171位氨基酸未发生突变，则判定为S型HtrA(171S-HtrA)。

图1为5对引物在不同退火温度下特异性验证的琼脂糖凝胶电泳图。其中A是使用引物对1，退火温度分别为52℃、54℃、56℃、58℃和60℃时扩增产物的电泳图；B是使用引物对2，退火温度分别为52℃、54℃、56℃、58℃和60℃时扩增产物的电泳图；C是使用引物对3，退火温度分别为52℃、54℃、56℃、58℃和60℃时扩增产物的电泳图；D是使用引物对4，退火温度分别为52℃、54℃、56℃、58℃和60℃时扩增产物的电泳图；E是使用引物对5，退火温度分别为52℃、54℃、56℃、58℃和60℃时扩增产物的电泳图。M为Marker DL 10000，泳道1是野生型对照，泳道2是突变型对照，泳道3-4是临床粪便样本，泳道5是阴性对照。

图2为引物对1使用2.5×PCR mix 1和2.5×PCR mix 2进行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。其中A是使用2.5×PCR mix 1的扩增产物电泳图；B是使用2.5×PCR mix 2的扩增产物电泳图。M为Marker DL 10000，泳道1是野生型对照，泳道2是突变型对照，泳道3-6是临床粪便样本，泳道7是阴性对照。

图3为引物对1的20例临床粪便样本的琼脂糖凝胶电泳图。M为Marker DL 10000，泳道1-20分别是20例临床粪便样本，泳道21是阴性对照。

图4为5例临床粪便样本的测序图。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (9)

1.基于SANGER法检测幽门螺杆菌S/L-HTRA的试剂盒及方法，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)PCR扩增反应试剂：2.5×PCR mix、PCR扩增引物；

(2)测序试剂：HiDi、BIGDye；

(3)去离子水、阳性对照品和阴性对照品。

2.根据权利要求1所述的基于SANGER法检测幽门螺杆菌S/L-HTRA的试剂盒及方法，其特征在于，所述PCR扩增引物是：

上游引物(SEQ-F)：TACCATTCCAGGGAGCAATAAAG

下游引物(SEQ-R)：GATGGAAGCGTCTGTTTGAATGA 。

3.根据权利要求1基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增引物SEQ-F与SEQ-R在体系内的浓度均为0.2Mm。

4.一种基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)待测粪便样本DNA提取；

(2)利用PCR扩增引物SEQ-F与SEQ-R，以待测粪便DNA为模板进行扩增，获得PCR产物；

(3)将普通PCR产物进行纯化；

(4)将步骤(3)获得的纯化产物进行测序，得到碱基序列和峰图；

(5)将步骤(4)的测序结果与参考序列进行比较，确定HtrA分型。若检测样本测序结果与参考序列一致，则判定HtrA为S型；若检测样本在第171位氨基酸发生突变，则判定HtrA为L型。

5.根据权利要求4所述的一种基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的反应体系包括：2.5×PCR mix 8μL、10μmol/L上游引物(SEQ-F)1μL、10μmol/L下游引物(SEQ-R)1μL、去离子水5μL、粪便样本DNA5μL。

6.根据权利要求4所述的一种基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增反应程序参数为：95℃2min；依次95℃10s，60℃30S，72℃40s，进行40个循环；72℃5min延伸；4℃保温。

7.根据权利要求4所述的一种基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述PCR产物纯化是使用磁珠法琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。

8.根据权利要求4所述的一种基于Sanger法检测幽门螺杆菌S/L-HtrA的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述测序是基于Sanger双脱氧链终止法进行一代测序。

9.根据权利要求1所述的基于SANGER法检测幽门螺杆菌S/L-HTRA的试剂盒及方法，其特征在于，所述试剂盒的保存方式为环氧冷冻液的环境中；所述环氧冷冻液的制备方法为：

S1.向N,N-二甲基甲酰胺溶剂中加入6-10重量份的间氯苯乙烯进行溶解，溶解后加入10-15重量份的1-(3-氨丙基)咪唑进行取代反应，在70-90℃下反应15-20h，反应后减压蒸馏除去溶剂，过滤并干燥，得到咪唑基苯乙烯；

S2.向二氯甲烷中加入5-10重量份的咪唑基苯乙烯和4-8重量份的(3-羧丙基)三甲基氯化铵进行溶解，然后再向其加入1-2重量份的N,N-二环己基碳二亚胺、0.2-0.5重量份的N-羟基丁二酰亚胺进行反应，在50-70℃下反应4-10h，反应后得到季铵-咪唑-苯乙烯；

S3.向N,N-二甲基甲酰胺溶剂中加入4-7重量份的季铵-咪唑-苯乙烯和3-6重量份的丙烯醇进行搅拌，然后在加入0.3-0.5重量份的偶氮二异丁腈进行聚合反应，在80-110℃下反应6-10h，反应后得到环氧苯乙烯；然后将环氧苯乙烯加入冰水中搅拌，得到环氧冷冻液。