CN117683735A - 一种提高猪瘟疫苗产能的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物领域，公开了一种提高猪瘟疫苗产能的生产工艺，将细胞、微载体混合后在转瓶中进行流动悬浮培养，培养成微载体单层细胞后接种猪瘟病毒毒种；所述转瓶包括瓶体；所述瓶体的内壁设有多条沿内壁凸起的凸条，相邻两条凸条构成一条沿瓶体轴向延伸的凹槽；在垂直于瓶体的轴线方向上，所述瓶体的内壁的截面展开后构成一条连续起伏的曲线。该工艺采用微载体培养扩繁病毒所用的细胞，而实施该工艺的容器为适配此工艺的单独开发的转瓶，该转瓶具有多条轴向延伸的凹槽，相比传统的皱壁细胞培养转瓶、直壁细胞转瓶，由此扩繁的病毒滴度更高。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种提高猪瘟疫苗产能的生产工艺。
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、发热和接触性传染病，在环境的突变或环境的恶化情况下，猪瘟极易爆发并传播，且在任何季节都可发生，且死亡率高，免疫猪瘟疫苗是预防猪瘟最有效的手段。
猪瘟病毒对细胞伤害较小，且为细胞分泌型病毒，具有无细胞病变的特点，相对传统转瓶培养，采用微载体培养具有一定的优势。
目前世界上微载体已广泛应用于疫苗、重组蛋白和单克隆抗体等研究领域，但采用微载体培养技术繁殖猪瘟病毒的报道较少。
因此，现阶段研发人员的目标在于：利用微载体培养技术积极探索猪瘟病毒的繁殖工艺，优化出一切可降本增效的生产技术。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种提高猪瘟疫苗产能的生产工艺，该工艺采用微载体培养扩繁病毒所用的细胞，而实施该工艺的容器为适配此工艺的单独开发的转瓶，该转瓶具有多条轴向延伸的凹槽，相比传统的皱壁细胞培养转瓶、直壁细胞培养转瓶，由此扩繁的病毒滴度高。
为实现上述目的，本发明提供了一种提高猪瘟疫苗产能的生产工艺，将细胞、微载体混合后在转瓶中进行流动悬浮培养，培养成微载体单层细胞后接种猪瘟病毒毒种；
所述转瓶包括瓶体；
所述瓶体的内壁设有多条沿内壁凸起的凸条，相邻两条凸条构成一条沿瓶体轴向延伸的凹槽；在垂直于瓶体的轴线方向上，所述瓶体的内壁的截面展开后构成一条连续起伏的曲线。
由于猪瘟病毒弱毒为细胞分泌型病毒，具有对细胞的伤害较小，无细胞病变的特点，致使本发明的微载体转瓶工艺更具优势，最后一代细胞培养在微载体上无需消化和传代，繁殖病毒后只需收取上清，无需冻融细胞或微载体，更加方便微载体的回收和利用，使用本工艺涉及的转瓶可反复利用，且价格低廉，使用的转瓶机价格较其他工艺的仪器设备更为便宜，且我国大部分企业均已购置大量的转瓶机，因此本发明无需配置新的设备即可实现细胞培养和病毒扩繁。
在上述的生产工艺中，所述凹槽为10～40条，所述凹槽的深度为瓶体半径的5%～15%。
在本发明的一些实施案例中，所述凹槽的数量为10条、11条、12条、13条、14条、15条、16条、17条、18条、19条、20条、21条、22条、23条、24条、25条、26条、27条、28条、29条、30条、31条、32条、33条、34条、35条、36条、37条、38条、39条或40条；
所述凹槽的深度为瓶体半径的5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%。
在上述的生产工艺中，所述凹槽为15～30条，所述凹槽的深度为瓶体半径的8%～12%。
在上述的生产工艺中，所述凸条由瓶体的壁向内凹陷形成，和/或，所述凸条的表面为弧面；和/或，所述凹槽的底面为平面或弧面。
在上述的生产工艺中，所述凸条的横截面为半圆形或半椭圆形。
在上述的生产工艺中，所述瓶体包括瓶身、与瓶身连接的瓶颈、连接在瓶颈上的瓶口；所述凹槽延伸至瓶颈位置，所述凹槽延伸至瓶颈靠近瓶口的位置。
在上述的生产工艺中，所述瓶体的材质为玻璃。
在上述的生产工艺中，包括以下步骤：
步骤1：细胞经传代放大至所需数量；
步骤2：将步骤1的细胞消化并与微载体一同转移至所述转瓶内，补加营养液；
步骤3：步骤2的细胞培养成微载体单层细胞后，换液培养并接种猪瘟病毒；
步骤4：收获猪瘟病毒，换液培养后继续收获病毒。
步骤5：重复步骤4。
在上述的生产工艺中，所述微载体在步骤2中补加营养液后的溶液中的浓度为1.25g/L～3.75g/L。
在本发明的一些实施案例中，所述微载体在步骤2中补加营养液后的溶液中的浓度为1.25g/L、1.5g/L、1.75g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.25g/L、3.5g/L、3.75g/L。
在上述的生产工艺中，所述细胞为猪睾丸ST传代细胞和/或猪肾PK-15传代细胞；
在上述的生产工艺中，所述转瓶使用的细胞培养转瓶机转速的转速为200～800r/h。
在本发明的一些实施案例中，所述转瓶使用的细胞培养转瓶机转速的转速为200r/h、300r/h、400r/h、500r/h、600r/h、700r/h或800r/h；
在上述的生产工艺中，所述转瓶中溶液的体积相当于转瓶体积的8～12%。
在本发明的一些实施案例中，所述转瓶中溶液的体积相当于转瓶体积的8%、9%、10%、11%或12%。
本发明的有益效果如下：
本发明的生产工艺在转瓶生产工艺上进行发明创新，培养出高效价的猪瘟病毒液，更换的瓶子价格低廉，也无需额外购买仪器设备，以此实现高度降本增效的生产工艺优化。
附图说明
图1A为本发明的第一部分的瓶体1的立体图；
图1B为本发明的第一部分的瓶体1的主视图；
图2为本发明的第一部分的瓶体1的垂直于轴线的剖视图；
图3为本发明的第一部分的瓶体1的内壁的截面示意图；
图4为本发明的第一部分的瓶体2的内壁的截面示意图；
图5为本发明的第一部分的瓶体3的内壁的截面示意图；
图6为本发明的第一部分的瓶体4的内壁的截面示意图；
图7为本发明的第一部分的瓶体5的内壁的截面示意图；
图8为本发明的第一部分的直壁转瓶的细胞培养示意图；
图9为本发明的第一部分的瓶体1的半流动半悬浮培养示意图；
图10为本发明的ST细胞在1.25g/L、2.5g/L或3.75g/L的微载体浓度下培养第一天的状态图；
图11为本发明的ST细胞在1.25g/L、2.5g/L或3.75g/L的微载体浓度下培养第二天的状态图；
图12为本发明的ST细胞在1.25g/L或2.5g/L的微载体浓度下培养第三天的状态图；
图13为本发明的ST细胞在3.75g/L的微载体浓度下培养第三天的状态图；
具体实施方式
下面对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
第一部分 瓶体在微载体培养方面的性能验证
参考图1-2，本实施例提供4种规格的瓶体以及一种规格的对比瓶体，不同规格的瓶体均由高硼硅玻璃材料经模具浇铸得到；
其具体结构包括：包括瓶体；所述瓶体的内壁设有多条沿内壁凸起的凸条1，相邻两条凸条1构成一条沿瓶体轴向延伸的凹槽2；在垂直于瓶体的轴线方向上，所述瓶体的内壁的截面展开后构成一条连续起伏的曲线。
瓶体具体包括瓶身、与瓶身连接的瓶颈3、连接在瓶颈上的瓶口4。
各规格的瓶体的瓶底直径约11.5cm，瓶身高约26cm，容积约为2L；其主要区别在于凹槽的数量、规格等，具体如下表1：
表1 瓶体规格表
| 编号 | 凸条条数 | 凹槽条数 | 凸条直径 mm | 附图 |
| 瓶体1 | 16 | 16 | 10 | 3 |
| 瓶体2 | 40 | 40 | 5.5 | 4 |
| 瓶体3 | 10 | 10 | 16.5 | 5 |
| 瓶体4 | 15 | 15 | 13.2 | 6 |
对比瓶体
大体同瓶体1，不同的地方在于，参考图7，其尺寸规格如下：
凸条条数为4条，凸条直径为10mm，命名为瓶体5。
采用上述的瓶体1、瓶体5以及细胞摇瓶和内置叶轮一次性反应瓶进行微载体细胞培养，其具体步骤如下：
1）Cytodex1（美国GE公司）微载体的预处理：
Cytodex1微载体的预处理：称取10gCytodex1微载体，浸泡于400ml pH7.2左右的PBS缓冲液中，室温浸泡3小时后自然沉降，弃去上清，重新加入200mlPBS，重悬后自然沉降，弃去上清，重新加入200mlPBS，121℃蒸汽高压灭菌30分钟，静置冷却后吸弃PBS，重新加入200ml含10%新生牛血清的DMEM培养液，放4℃冰箱保存备用。水化后的微载体沉淀体积约为20ml/g微载体。
2）Vero细胞传代至瓶体1
取四瓶80%～95%汇合层或薄单层的Vero细胞（T175细胞瓶），弃去细胞培养液，用PBS润洗一遍后，加入5ml胰酶消化，消化完毕后，弃去消化液，每瓶取5ml含10%新生牛血清的DMEM培养液吹散重悬后汇集一起，取100ul细胞悬液加入100ul 0.1%台盼蓝染色液，混匀后吸20ul至细胞计数板上，在Countstar细胞计数仪上进行细胞计数，计数后分别取2x107个细胞加入到硅化好的无菌瓶体1，离心管各倒取10ml步骤1处理好的微载体倒入瓶体1中，最后补至200ml培养液，摇晃混匀后转移至细胞培养转瓶机培养，一个在300r/h，37℃条件下转动培养，另一个在600r/h，37℃条件下转动培养。每天取样观察细胞在微载体上的生长情况并调节pH值在中性左右，避免过酸或过碱。
结果：利用Cytodex1官方推荐的培养细胞方法进行流动悬浮培养（微载体量为1.25g/L，细胞接种量为20cells/个微载体，本实施例的其它微载体细胞接种量均约为20cells/个微载体），差不多80%汇合层的T175细胞瓶细胞计数结果为2.6x106cells/ml，两组瓶子内Vero细胞在微载体上都在3天内可长满良好细胞单层，且生长速度和细胞贴球均匀程度并无明显差异，均约在3天内可长满良好的细胞单层，说明本发明的圆弧柱（凸条）对细胞和微载体的剪切力损伤并不大。
悬浮培养方式下，微载体使用细胞培养摇瓶等摇晃方式培养贴壁细胞的转速通常使用90r/min~110r/min；微载体使用摆臂摇瓶或磁力摇瓶等搅拌方式培养贴壁细胞的转速通常使用60r/min~80r/min；本发明的瓶体1使用300r/h的滚轴转速便可达到悬浮培养的目的，从培养的结果来看，由于培养液横面积较大，高比较低，因此细胞和微载体在混匀后随着波浪圆弧柱的转动进行培养时在低转速时的流动悬浮培养也可以得到很好的均匀培养效果，无需机械式的高转速搅动。
3）Vero细胞传代至细胞摇瓶、内置叶轮一次性反应瓶和瓶体5
取80%～95%汇合层或薄单层的Vero细胞（T175细胞瓶），弃去细胞培养液，用PBS润洗一遍后，加入5ml胰酶消化，消化完毕后，弃去消化液，每瓶取5ml含10%新生牛血清的DMEM培养液吹散重悬后汇集一起，取100ul细胞悬液加入100ul 0.1%台盼蓝染色液，混匀后吸20ul至细胞计数板上，在Countstar细胞计数仪上进行细胞计数，计数后分别取5.4x106个细胞加入到硅化过的细胞摇瓶和内置叶轮一次性反应瓶，离心管各倒取2.5ml步骤1处理好的微载体倒入细胞摇瓶和内置叶轮一次性反应瓶中，最后分别补至50ml培养液，摇晃混匀后细胞摇瓶置摇床培养，90r/min，37℃，5%二氧化碳；内置叶轮一次性反应瓶置细胞培养磁力搅拌器上培养，70r/min，37℃，5%二氧化碳；另取2x107个细胞加入到硅化好的灭菌瓶体5中，离心管倒取10ml微载体倒入瓶中，最后补至200ml培养液，置于细胞培养转瓶机培养，800r/h，37℃条件下转动培养；每天取样观察细胞在微载体上的生长情况并调节pH值在中性左右，避免过酸或过碱。
结果：微载体使用内置叶轮一次性反应瓶进行悬浮培养较好，其生长速度和贴球均匀性和瓶体1进行流动悬浮培养的效果无异，二者均在3天内长成良好的单层，每个微载体上细胞长得比较均匀，无明显空球，细胞均匀性较好。但使用细胞摇瓶的培养效果不佳，细胞摇瓶很难培养成良好的贴球单层，培养后期易停止生长且出现大量死细胞漂浮在培养液中，且重复几次也很难培养出搅拌悬浮或流动悬浮的效果，可能微载体利用摇晃悬浮的方式需要大量时间进行工艺摸索才能培养出良好的细胞。瓶体5的微载体在800r/h转速下，大部分时间处于部分微载体悬起，部分微载体在底下进行流动贴壁培养的状态，单个凸条的构造并不能支持整个培养体系进行流动悬浮培养，因此部分微载体上细胞长得比较均匀，部分微载体上细胞长得少，存在半球细胞或空球，整体需要4天才能观察到较多良好细胞单层的微载体。
此外，本部分还采用了硼硅酸盐直壁转瓶进行了微载体培养，其培养方法为：
取两瓶80%～95%汇合层或薄单层的Vero细胞（T175细胞瓶），弃去细胞培养液，用PBS润洗一遍后，加入5ml胰酶消化，消化完毕后，弃去消化液，每瓶取5ml含10%新生牛血清的DMEM培养液吹散重悬后汇集一起，取100ul细胞悬液加入100ul 0.1%台盼蓝染色液，混匀后吸20ul至细胞计数板上，在Countstar细胞计数仪上进行细胞计数，计数后分别取2x107个细胞加入到两个硅化过的2L的硼硅酸盐直壁转瓶，离心管各倒取10ml步骤1处理好的微载体倒入转瓶中，最后分别补至200ml培养液，摇晃混匀后置细胞培养转瓶机上培养，一个800r/h、37℃条件下培养，一个300r/h、37℃条件下培养。取每天取样观察细胞在微载体上的生长情况并调节pH值在中性左右，避免过酸或过碱。
结果：微载体使用传统的直壁转瓶进行悬浮培养效果不佳，可以观察到300r/h下，大部分微载体在底下进行流动贴壁培养，800r/h下，大部分微载体能悬起，但悬起的范围有限（两个转速下的培养方式见图8）。二者的流动方式类似瓶体1的半流动半悬浮培养（参考图9）。而800r/h的转速已接近市售细胞培养转瓶机的最高转速，理论上使用非常高的转速也能使直壁转瓶进行全悬浮培养，但成本将变高。
同时，本部分还进行了Vero细胞在瓶体1进行微载体流动悬浮培养时的消化传代，其操作具体为：
取Vero细胞在微载体上培养72小时后的瓶体1，静置1分钟后缓慢倾斜倒出培养液，随后加入30ml0.25%胰酶，用手转动几下后缓慢倾斜倒出胰酶，随后加入50ml0.25%胰酶，300r/h转动2分钟后，缓慢倾斜倒出部分胰酶，继续转动消化2分钟后，用力甩动几下瓶子，使大部分细胞脱落，加入DMEM营养液终止消化，此时按照实验所需分配微载体和细胞的悬液。
结果：使用瓶体1，由于曲面瓶颈的设置，微载体在缓慢倾斜时沉淀在瓶颈处，从而达到微载体和液体的绝佳的分离效果，因而消化时的操作非常方便，如要消化传代微载体，只需摸索好消化的时间或优化消化液的量和浓度。此外，弃液、收获微载体、收获培养液、回收时洗涤微载体等操作也变得非常方便。此等优点也是其它微载体培养容器在消化传代或收集分离微载体和上清等操作上的缺点。
此外，本部分还对其它瓶体的功能验证
采用上述的的验证方法验证Vero细胞的微载体培养，微载体培养方式均适用于瓶体2～瓶体4；
经过实验，建议的转速范围可参考表2：
表2 不同瓶体的适应的转速和培养效果
第二部分
实施例1
本部分以瓶体1为验证对象进行验证，具体如下：
1）Cytodex1（美国GE公司）微载体的预处理和瓶皿的硅化：
瓶体1装满2%的氢氧化钠溶液浸泡2小时后回收氢氧化钠溶液，冲洗干净后烘干，然后装满洗液浸泡2小时后回收洗液，冲洗干净后烘干。通风橱内加入50ml的二甲基二氯硅烷溶液后盖紧胶塞，手动润遍瓶内壁后放置在细胞转瓶机上慢速转动2小时，硅化完后可回收剩余的二甲基二氯硅烷溶液，随后置通风橱内吹干固化过夜，第二天使用50ml甲醇洗涤转动2小时，随后用水洗涤瓶子两次，最后将瓶子转移至160℃干热炉灭菌2小时。或配制成硅化液（含5%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液）进行硅化，通风橱内往瓶内倒入500ml硅化液，盖紧胶塞后放置在细胞转瓶机上慢速转动2小时，硅化完后回收硅化液，随后置通风橱内吹干过夜，第二天使用50ml乙醇洗涤转动2小时，随后用水洗涤瓶子两次，最后将瓶子转移至160℃干热灭菌2小时。
Cytodex1微载体的预处理：称取10gCytodex1微载体，浸泡于400ml pH7.2左右的PBS缓冲液中，室温浸泡3小时后自然沉降，弃去上清，重新加入200mlPBS，重悬后自然沉降，弃去上清，重新加入200mlPBS，121℃蒸汽高压灭菌30分钟，静置冷却后吸弃PBS，重新加入200ml的DMEM培养基，放4℃冰箱保存备用。水化后的微载体沉淀体积约为20ml/g微载体。
2）猪睾丸传代细胞（ST传代细胞）的制备和微载体培养
2.1、ST细胞的复苏：从细胞库中取出冻存细胞，37℃水浴快速搅动融化，1000r/min离心3分钟，吸弃上清液，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液吹散悬浮细胞，移入T75细胞培养瓶，补加至20ml含10%新生牛血清的DMEM培养液，置37℃培养至长成良好单层。
2.2、ST细胞的传代：将长成良好单层的T75细胞，用5ml的EDTA-胰酶溶液消化后，弃去消化液，使用5ml含10%新生牛血清的DMEM培养液吹散细胞，将细胞悬液全部传代至T175细胞瓶进行培养，补加至50ml含10%新生牛血清的DMEM培养液。T175细胞瓶的ST细胞长成良好单层后，用10ml的EDTA-胰酶溶液消化后，弃去消化液，使用10ml含10%新生牛血清的DMEM培养液吹散细胞，将细胞悬液按1:3的传代比例传代至3个T175细胞克氏瓶，置37℃培养至长成良好单层。
2.3、ST细胞扩大至瓶体1进行贴壁培养：将3瓶长成良好单层的T175细胞，每瓶用10ml的EDTA-胰酶溶液消化后，传代至2L体积的瓶体1进行培养，补加至200ml含10%新生牛血清的DMEM培养液。置细胞转瓶机上培养，37℃，20r/h条件下培养（20r/h指滚轴转速，本发明的所有转速数值均为滚轴转速）。
2.4、转瓶传代至瓶体1进行微载体培养：将长成80%~90%汇合层的2L瓶体1 ST传代细胞，弃去细胞培养液，用PBS润洗一遍后，用30ml的EDTA-胰酶溶液转动消化，消化完毕后，弃去消化液，加入20ml含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬吹散后，取100ul细胞悬液加入100ul 0.1%台盼蓝染色液，混匀后吸20ul至细胞计数板上，在countstar细胞计数仪上进行细胞计数，计数后取4.3x107个细胞，另取20ml上述灭菌好的微载体DMEM悬液（约含0.5gCytodex1微载体），自然沉降后弃去上清DMEM ，用含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬后全部转移至无菌硅化过的瓶体1中，最后补至200ml培养液，摇晃混匀后转移至细胞培养转瓶机培养，约420r/h，37℃转动培养；取6.45x107个细胞，另取30ml上述灭菌好的微载体DMEM悬液（约含0.75g Cytodex1微载体），自然沉降后弃去上清DMEM ，用含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬后全部转移至无菌硅化过的瓶体1中，最后补至200ml培养液，摇晃混匀后转移至细胞培养转瓶机培养，约420r/h，37℃转动培养；48小时后调节pH值避免过酸过碱。
3）猪瘟病毒兔化弱毒C株病毒液的繁殖和收获
3.1、病毒接种：步骤2中两个已形成良好ST细胞单层的瓶体1，缓慢倒出培养液，各添加20ml猪瘟病毒兔化弱毒C株生产用毒种病毒液，随后补加至200ml含2%新生牛血清的DMEM维持液。
3.2、病毒一收：上述3.1步骤病毒接种培养72小时后，缓慢倒出病毒液，补加至200ml含2%新生牛血清的DMEM维持液。
3.3、病毒二收：上述3.2步骤病毒一收后继续培养96小时后，缓慢倒出病毒液，补加至200ml含2%新生牛血清的DMEM维持液。
3.4、病毒三收：上述3.3步骤病毒二收后继续培养96小时后，缓慢倒出病毒液，补加至200ml含2%新生牛血清的DMEM维持液。
3.5、病毒四收：上述3.4步骤病毒三收后继续培养96小时后，缓慢倒出病毒液，补加至200ml含2%新生牛血清的DMEM维持液。
3.6、病毒五收：上述3.5步骤病毒四收后继续培养96小时后，缓慢倒出病毒液，补加至200ml含2%新生牛血清的DMEM维持液。
3.7、病毒六收：上述3.6步骤病毒五收后继续培养96小时后，缓慢倒出病毒液。
3.8、微载体的回收：病毒六收后，加入100ml0.25%胰蛋白酶消化液，37℃下转动瓶体1，时长2小时，随后加入终浓度0.2M的氢氧化钠溶液，浸泡2小时后缓慢倒出上清，重新加入终浓度0.2M的氢氧化钠溶液，浸泡过夜，静置沉淀，缓慢倒出上清，然后加入两倍微载体体积的PBS，轻轻搅拌，静置沉淀，弃去上清，重复三次。
结果：ST传代细胞传代至2L的瓶体1，长至80%~90%汇合层时，消化后进行细胞计数，细胞总数量约为1.13x108cells，按约20cells/个微载体的量，2.5g/L微载体和3.75g/L的添加量接种ST细胞和微载体，均在培养约3天左右可长成良好单层，接种猪瘟病毒之后每隔4天收获病毒并更换培养液。除一收外，收获的猪瘟病毒按现行中华人民共和国兽药典（2020年版三部）正文中猪瘟活疫苗（传代细胞源）的效力检验方法中的用兔检验方法进行效力测定。
由于瓶体1的曲面瓶颈设置，因而倒出培养液或收集病毒液时非常方便，缓慢倾斜时，微载体可快速沉淀倾斜至曲面瓶颈处，保证极大地倒干净培养液或病毒液，而使用其它培养容器进行微载体培养时在单独收获猪瘟病毒时则比较麻烦。
对比例1 猪瘟病毒兔化弱毒C株病毒液的直壁转瓶繁殖
包括以下步骤：
1）猪睾丸（ST）传代细胞的制备
1.1、ST细胞的复苏:从细胞库中取出冻存细胞，37℃水浴快速搅动融化，1000r/min离心3分钟，吸弃上清液，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液吹散悬浮细胞，移入T75细胞培养瓶，补加至20ml含8%新生牛血清的DMEM培养液，置37℃培养至长成良好单层。
1.2、ST细胞的传代：将长成良好单层的T75细胞，用3ml的EDTA-胰酶溶液消化后，按1:3的传代比例传代扩大至T175细胞瓶进行培养，补加至50ml含8%新生牛血清的DMEM培养液，置37℃培养箱培养。
1.3、ST细胞扩大至瓶体1进行贴壁培养：将3瓶长成良好单层T175细胞，每瓶用10ml的EDTA-胰酶溶液消化后，传代至2L体积的瓶体1进行培养，补加至200ml含10%新生牛血清的DMEM培养液。置细胞转瓶机上培养，37℃，20r/h条件下培养。
1.4、ST细胞由转瓶传代至直壁转瓶（内壁光滑，无凹槽、无凸条）和瓶体1：2L体积的瓶体1的ST细胞长成良好单层后，弃去细胞培养液，用PBS润洗一遍后，用30ml的EDTA-胰酶溶液转动消化，消化完毕后，弃去消化液，加入50ml含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬吹散后，取1/3的细胞悬液传代至原瓶，取1/6的细胞悬液传代至一个2L的直壁细胞转瓶。瓶体1置细胞转瓶机上培养，37℃，20r/h条件下培养。直壁细胞转瓶置细胞转瓶机上培养，37℃，28r/h条件下培养。
2）猪瘟病毒兔化弱毒C株病毒液的繁殖和收获
2.1、病毒接种：步骤1上述长成良好单层ST细胞的直壁细胞转瓶和瓶体1，弃去细胞培养液，随后2L的直壁细胞转瓶补加至200ml含2%新生牛血清和含10ml猪瘟病毒兔化弱毒C株生产用毒种病毒液的DMEM维持液；2L的瓶体1补加至200ml含2%新生牛血清和含10ml猪瘟病毒兔化弱毒C株生产用毒种病毒液的DMEM维持液；
2.2、病毒一收：上述2.1步骤病毒接种培养72小时后收获病毒液，分别补加至200ml含2%新生牛血清的DMEM维持液。
2.3、病毒二收：上述2.2步骤病毒一收后继续培养96小时后收获病毒液，分别补加至200ml含2%新生牛血清的DMEM维持液。
2.4、病毒三收：上述2.3步骤病毒二收后继续培养96小时后收获病毒液，分别补加至200ml含2%新生牛血清的DMEM维持液。
2.5、病毒四收：上述2.4步骤病毒三收后继续培养96小时后收获病毒液，分别补加至200ml含2%新生牛血清的DMEM维持液。
2.6、病毒五收：上述2.5步骤病毒四收后继续培养96小时后收获病毒液，分别补加至200ml含2%新生牛血清的DMEM维持液。
2.7、病毒六收：上述2.6步骤病毒五收后继续培养96小时后收获病毒液。
结果：ST细胞传代至2L的瓶体1后，长成良好单层后按约1:3的传代比例传代至一个2L的直壁细胞转瓶和一个2L的瓶体1，培养约2.5天可长成良好单层，第三天接种猪瘟病毒，之后每隔4天收获病毒并更换培养液。除一收外，收获的猪瘟病毒按现行中华人民共和国兽药典（2020年版三部）正文中猪瘟活疫苗（传代细胞源）的效力检验方法中的用兔检验方法进行效力测定。
实施例2 猪瘟病毒兔化弱毒C株病毒液的效价测定和比较
包括以下步骤：
1）病毒含量的测定
将实施例1和比对例1所繁殖的二收、三收、四收、五收和六收猪瘟病毒兔化弱毒病毒液按现行中华人民共和国兽药典（2020年版三部）正文中猪瘟活疫苗（传代细胞源）的效力检验方法中的用兔检验方法进行效力测定。
结果：在生产猪瘟疫苗的工艺过程中，接种病毒前的细胞传代，使用瓶体1添加不同浓度微载体进行培养；使用瓶体1进行贴壁培养；使用传统细胞直壁转瓶进行贴壁培养；四组在传代长成单层后接种猪瘟病毒，收获病毒后测定疫苗效价，结果显示使用瓶体1添加2.5g/L微载体培养各收次疫苗效价为传统细胞转瓶培养的2.5倍左右；使用瓶体1添加3.75g/L微载体培养各收次疫苗效价为传统细胞转瓶培养的3.5倍左右；而使用瓶体1培养各收次疫苗效价则为传统细胞转瓶培养的1.5倍左右。实验结果见表1。因此在疫苗的转瓶生产工艺中，接种病毒前的细胞传代添加2.5g/L~3.75g/L的微载体并更换为瓶体1进行流动悬浮培养，极大地利用了培养液和血清的价值，极大地提高疫苗的效价，以此实现降本增效的目的。具体效价结果可参考表3：
表3 病毒毒液效价表
实施例3 微载体细胞培养微载体浓度的优化
包括以下步骤：
1）Cytodex1（美国GE公司）微载体的预处理和瓶皿的硅化：
瓶体1装满2%的氢氧化钠溶液浸泡2小时后回收氢氧化钠溶液，冲洗干净后烘干，然后装满洗液浸泡2小时后回收洗液，冲洗干净后烘干。通风橱内加入50ml的二甲基二氯硅烷溶液后盖紧胶塞，手动润遍瓶内壁后放置在细胞转瓶机上慢速转动2小时，硅化完后可回收剩余的二甲基二氯硅烷溶液，随后置通风橱内吹干固化过夜，第二天使用50ml甲醇洗涤转动2小时，随后用水洗涤瓶子两次，最后将瓶子转移至160℃干热炉灭菌2小时。或配制成硅化液（含5%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液）进行硅化，通风橱内往瓶内倒入500ml硅化液，盖紧胶塞后放置在细胞转瓶机上慢速转动2小时，硅化完后回收硅化液，随后置通风橱内吹干过夜，第二天使用50ml乙醇洗涤转动2小时，随后用水洗涤瓶子两次，最后将瓶子转移至160℃干热灭菌2小时。
Cytodex1微载体的预处理：称取10gCytodex1微载体，浸泡于400ml PH7.2左右的PBS缓冲液中，室温浸泡3小时后自然沉降，弃去上清，重新加入200mlPBS，重悬后自然沉降，弃去上清，重新加入200mlPBS，121℃蒸汽高压灭菌30分钟，静置冷却后吸弃PBS，重新加入200ml含10%新生牛血清的DMEM培养液，放4℃冰箱保存备用。水化后的微载体沉淀体积约为20ml/g微载体。
2）猪睾丸（ST）传代细胞的制备
2.1、ST细胞的复苏:从细胞库中取出冻存细胞，37℃水浴快速搅动融化，1000r/min离心3分钟，吸弃上清液，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液吹散悬浮细胞，移入T75细胞培养瓶，补加至20ml含10%新生牛血清的DMEM培养液，置37℃培养至长成良好单层。
2.2、ST细胞的传代：将长成良好ST细胞单层的T75细胞，用3ml的EDTA-胰酶溶液消化后，按1:3的传代比例传代扩大至T175细胞瓶进行培养，补加至50ml含10%新生牛血清的DMEM培养液，置37℃培养至长成良好单层。
2.3、ST细胞扩大至转瓶：将3瓶长成良好ST细胞单层T175细胞，每瓶用5ml的EDTA-胰酶溶液消化后，传代至2L体积的瓶体1进行培养，补加至200ml含10%新生牛血清的DMEM培养液，置37℃、20r/h培养至长成良好单层。
2.4、转瓶传代至转瓶：将长成良好ST细胞单层的2L转瓶细胞，弃去细胞培养液，用PBS润洗一遍后，用20ml的EDTA-胰酶溶液消化，消化完毕后，双手紧握细胞转瓶两端甩动细胞转瓶，使ST细胞脱落，加入50ml含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬后平均传代至3个瓶体1，各自补至200ml含10%新生牛血清的DMEM培养液。置37℃、20r/h培养至长成良好单层。
2.5、转瓶传代至微载体培养：将3瓶长成80%~90%汇合层的2L瓶体1，弃去细胞培养液，用PBS润洗一遍后，用20ml的EDTA-胰酶溶液消化，消化完毕后，双手紧握细胞转瓶两端甩动细胞转瓶，使ST细胞脱落，加入20ml含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬后汇合至一起，取100ul细胞悬液加入100ul 0.1%台盼蓝染色液，混匀后吸20ul至细胞计数板上，在countstar细胞计数仪上进行细胞计数。计数后2.15x107个细胞，另取10ml上述灭菌好的微载体DMEM悬液（约含0.25g Cytodex1微载体），自然沉降后弃去上清DMEM ，用含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬后全部转移至无菌硅化过的瓶体1中，最后补至200ml培养液，摇晃混匀后转移至细胞培养转瓶机培养，约420r/h，37℃转动培养；取4.3x107个细胞，另取20ml上述灭菌好的微载体DMEM悬液（约含0.5g Cytodex1微载体），自然沉降后弃去上清DMEM ，用含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬后全部转移至无菌硅化过的瓶体1中，最后补至200ml培养液，摇晃混匀后转移至细胞培养转瓶机培养，约420r/h，37℃转动培养；取6.45x107个细胞，另取30ml上述灭菌好的微载体DMEM悬液（约含0.75g Cytodex1微载体），自然沉降后弃去上清DMEM ，用含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬后全部转移至上述ST细胞瓶体1中，最后补至200ml培养液，摇晃混匀后转移至细胞培养转瓶机培养，约420r/h，37℃转动培养；取8.6x107个细胞，另取40ml上述灭菌好的微载体DMEM悬液（约含1g Cytodex1微载体），自然沉降后弃去上清DMEM ，用含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬后全部转移至无菌硅化过的瓶体1中，最后补至200ml培养液，摇晃混匀后转移至细胞培养转瓶机培养，约420r/h，37℃转动培养；
每天取样观察并测定葡萄糖含量，调节pH值避免过酸过碱。
葡萄糖含量测定方法：
使用SBA-40E生物传感分析仪进行培养基葡萄糖含量的测定，培养瓶静置1分钟后吸取少量上清后取40ul上清用PBS稀释5倍，长期待机状态下的生物传感分析仪按动“开关”键，此时“样品”灯闪亮时使用微量注射器准确吸取25ul的葡萄糖标准液快速注入反应池，反应后待下次“样品”灯闪亮时继续使用微量注射器准确吸取25ul的葡萄糖标准液快速注入反应池，以此方法重复注入葡萄糖标准液直至“样品”灯常亮，“样品”灯常亮后准确吸取5倍稀释后的培养液25ul进行测定，每个样品重复测定三次，三次测定值取平均值后乘以50倍即为培养液的葡萄糖浓度，此时的葡萄糖浓度单位为mg/L。
结果：参考表4，使用4个不同的微载体浓度进行ST细胞的培养，每天取样观察细胞并测定葡萄糖含量。
表4 不同浓度微载体下ST细胞培养时葡萄糖消耗统计表
结果：在3.75g/L以下的微载体浓度下，三组浓度下培养的ST细胞均能在72小时内长成良好的单层（各组每天生长情况见图10~图13），24小时和48小时观察到的各组细胞生长情况较为一致，而3.75g/L微载体浓度的培养下，72小时可以观察到微载体上细胞的生长密度并不如2.5g/L组和1.25g/L组，可以测得72小时后葡萄糖的消耗率仅达73%，理论上3.75g/L组正常生长的葡萄糖消耗率应该在82%以上（各组每天的葡萄糖测定后计算值见表2），说明2.5g/L~3.75g/L之间单次DMEM培养液的营养利用率已基本接近极限。但2.5g/L组和3.75g/L组在72小时时更换维持液后72小时后细胞的生长密度相近，因此病毒一收前更换了维持液恰好弥补了3.75g/L浓度下葡萄糖利用率的不足的缺点。
而在3.75g/L~5g/L的微载体浓度下，则需考虑在培养过程中更换培养液、或补充溶氧、或补充葡萄糖等问题。但从培养液和血清的成本上考虑，3.75g/L的微载体浓度的流动悬浮培养方式已经极大地利用了传代后培养液的营养和换液后一收的营养，因此使用20cells/个微载体，3.75g/L的微载体浓度下接种ST细胞，并在培养3天后进行换液接种猪瘟病毒，是为利用瓶体1和微载体培养猪瘟疫苗的绝佳工艺参数。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种提高猪瘟疫苗产能的生产工艺，其特征在于，将细胞、微载体混合后在转瓶中进行流动悬浮培养，培养成微载体单层细胞后接种猪瘟病毒毒种；
所述转瓶包括瓶体；
所述瓶体的内壁设有多条沿内壁凸起的凸条，相邻两条凸条构成一条沿瓶体轴向延伸的凹槽；
在垂直于瓶体的轴线方向上，所述瓶体的内壁的截面展开后构成一条连续起伏的曲线。
2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述凹槽为10～40条，所述凹槽的深度为瓶体半径的5%～15%。
3.根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于，所述凹槽为15～30条，所述凹槽的深度为瓶体半径的8%～12%。
4.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述凸条由瓶体的壁向内凹陷形成，和/或，所述凸条的表面为弧面；和/或，所述凹槽的底面为平面或弧面。
5.根据权利要求4所述的生产工艺，其特征在于，所述凸条的横截面为半圆形或半椭圆形。
6.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述瓶体包括瓶身、与瓶身连接的瓶颈、连接在瓶颈上的瓶口；所述凹槽延伸至瓶颈位置，所述凹槽延伸至瓶颈靠近瓶口的位置。
7.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述瓶体的材质为玻璃。
8.根据权利要求1～7任一所述的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：细胞经传代放大至所需数量；
步骤2：将步骤1的细胞消化并与微载体一同转移至所述转瓶内，补加营养液；
步骤3：步骤2的细胞培养成微载体单层细胞后，换液培养并接种猪瘟病毒；
步骤4：收获猪瘟病毒，换液培养后继续收获病毒；
步骤5：重复步骤4。
9.根据权利要求8所述的生产工艺，其特征在于，所述微载体在步骤2中补加营养液后的溶液中的浓度为1.25g/L～3.75g/L。
10.根据权利要求1～7任一所述的生产工艺，其特征在于，所述细胞为猪睾丸ST传代细胞和/或猪肾PK-15传代细胞。
11.根据权利要求1～7任一所述的生产工艺，其特征在于，所述转瓶使用的细胞培养转瓶机转速为200～800r/h。
12.根据权利要求1～7任一所述的生产工艺，其特征在于，所述转瓶中溶液的体积相当于转瓶体积的8～12%。
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