CN117660345A - 肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性t细胞共培养模型及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于生物技术领域，本申请属于生物技术领域，具体涉及肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型的制备方法。通过提供一种肿瘤类器官与细胞毒性T细胞共培养的培养基，该培养基有利于肿瘤特异性细胞毒性T细胞发挥其特异性杀伤功能，有利于肿瘤类器官与细胞毒性T细胞共培养模型的建立。并且本申请利用同源的肿瘤类器官的裂解液激活树突状细胞，使其呈递肿瘤特异性抗原；再将具有肿瘤抗原呈递能力的树突状细胞与自体CD8+T细胞共培养，激活CD8+T细胞，最后将该肿瘤特异性细胞毒性T细胞与肿瘤类器官共培养。此共培养模型更真实地呈现了在生物体内肿瘤抗原特异性CD8+T细胞和肿瘤细胞之间的免疫反应，特异性高。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体涉及肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型及其制备方法。
背景技术
类器官是基于干细胞分化原理的三维（3D）细胞培养物。与传统的二维（2D）细胞培养物相比，类器官具有复杂的结构和功能，能更好地反映它们所来源的组织和器官的特征。与传统动物模型相比，类器官的建模和药筛更为容易且周期更短，同时避免了因物种差异而引入额外病理特征的风险。总的来说，类器官是良好的研究发育和疾病发病机制的模型，在器官替代、疾病模型开发和药物安全性评价等领域具有广阔的市场前景。
免疫检查点阻断（ICB）治疗是当前肿瘤免疫疗法中最前沿的策略之一，它通过提高T细胞活性来提高机体抗肿瘤能力，目前已经运用于各种癌症的治疗。但是在临床治疗中，由于低免疫原性、抗原呈递缺陷和存在免疫检查点分子替代分子等原因，ICB治疗仅对部分患者有效。但是，目前仍缺少ICB疗法的疗效评估平台，无法在治疗前预测患者对ICB疗法是否敏感，可能导致错过患者治疗的最佳窗口期，以及医疗的资源浪费。
在ICB治疗中，主要是靶向PD-1/PD-L1和细胞毒性T细胞相关蛋白4（CTLA-4）。PD-1作为一种T细胞抑制性共刺激分子，抑制了T细胞的激活，帮助肿瘤细胞进行免疫逃逸。PD-1/PD-L1抑制剂可以阻断PD-1和PD-L1的结合，恢复T细胞的活性，从而改善免疫反应。在目前的研究中，主要用以下几种系统评估人类肿瘤组织对PD-1阻断剂的免疫反应：气液界面类器官、具有器官型肿瘤球体的微流体装置和患者来源的肿瘤片段平台。在这些系统中，大多数使用了包含各种细胞类型的混合培养条件，会影响肿瘤的免疫特异性评估的准确性。
因此，传统技术中的肿瘤类器官与免疫细胞共培养模型用于评估肿瘤免疫特异性时，存在过程繁琐，评估准确性低的技术问题。
发明内容
基于此，本申请一实施例提供一种肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型及其制备方法，以解决传统技术中肿瘤免疫特异性评估过程繁琐与评估准确性低的技术问题。
本申请一方面提供一种肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型的制备方法，包括以下步骤：
将抗原呈递细胞与肿瘤细胞的裂解液共孵育，制备肿瘤特异性抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞和所述肿瘤细胞与待培养的肿瘤类器官同源，将所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与CD8+T细胞共培养，收集肿瘤特异性细胞毒性T细胞，所述CD8+T细胞与待培养的肿瘤类器官同源，将待培养的肿瘤类器官与所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养，制备肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型。
在其中一个实施例中，所述制备方法满足如下条件（1）~（3）中的一个或多个：
（1）所述抗原呈递细胞与所述肿瘤细胞的裂解液共孵育的时间为22h~26h。
（2）所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与所述CD8+T细胞共培养的时间为5天~7天。
（3）所述肿瘤类器官与所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养的时间为70h~74h。
在其中一个实施例中，所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与所述CD8+T细胞以1:（4~6）的比例共培养。
在其中一个实施例中，所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与所述CD8+T细胞于培养基I中共培养。
所述培养基I包括RPMI1640基础培养基，及添加在所述RPMI1640基础培养基中的体积浓度8%~12%人AB血清、1.5mM~2.5mM谷氨酰胺、80U/mL~120U/mL青霉素、80μg/mL~120μg/mL链霉素、0.8mM~1.2mM丙酮酸钠、0.04nM~0.06nM2-巯基乙醇、80U/m~120U/mLIL-2。
在其中一个实施例中，采用磁珠法收集所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞。
在其中一个实施例中，所述待培养的肿瘤类器官与所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞于培养基II中共培养。
所述培养基II包括：RPMI1640基础培养基，及添加在所述RPMI1640基础培养基中的体积浓度8%~12%人AB血清、1.5mM~2.5mM谷氨酰胺、80U/mL~120U/mL青霉素、80μg/mL~120μg/mL链霉素、0.8mM~1.2mM丙酮酸钠、0.04nM~0.06nM2-巯基乙醇、80U/m~120U/mLIL-2、180ng/mL~220ng/mLIFN-γ。
在其中一个实施例中，所述肿瘤特异性抗原呈递细胞包括树突状细胞或朗格汉斯细胞。
在其中一个实施例中，所述肿瘤类器官包括膀胱癌类器官、肺癌类器官、肝癌类器官、胃癌类器官、结肠癌类器官、前列腺癌类器官、乳腺癌类器官、卵巢癌类器官、鼻咽癌类器官和食道癌类器官中的一种或多种。
本申请另一方面还提供上述的方法制备得到的肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型。
本申请另一方面还提供上述的共培养模型在肿瘤免疫特异性评估中的应用。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：本申请一实施例通过从肿瘤同源的外周血单核细胞中诱导分化出成熟的抗原呈递细胞，利用同源的肿瘤类器官的裂解液激活抗原呈递细胞，使其呈递肿瘤特异性抗原，再将具有肿瘤抗原呈递能力的抗原呈递细胞与自体同源CD8+T细胞共培养，激活CD8+T细胞，使其成为具有识别肿瘤抗原能力的特异性细胞毒性T细胞，最后将该肿瘤特异性细胞毒性T细胞与肿瘤类器官共培养，使其发挥特异性杀伤功能。此共培养模型更真实地呈现了在生物体内肿瘤抗原特异性CD8+和肿瘤细胞之间的免疫反应，具有较高的特异性。
此外，此模型还可以作为研究肿瘤免疫细胞间相互作用和预测肿瘤患者对免疫检查点阻断疗法疗效的模板，在模型上还可以进行额外的基因操作或药物组合，从而促进对ICB治疗的进一步研究。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为食管鳞癌肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞的共培养情况；
图2为其中一个对比例（仅含肿瘤细胞）和实施例（加入肿瘤特异性细胞毒性T细胞）的流式结果；
其中single cells：单细胞；dead tumor cells：死亡肿瘤细胞；Alive tumorcells：存活肿瘤细胞。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
术语
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非与本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本申请中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1~10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本申请中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本申请中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。
本申请中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
术语“类器官”类器官即定义为：器官特异性细胞的集合，这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来，并能以与体内相似的方式经细胞分序(cell sorting out)和空间限制性的系别分化而实现自我组建。根据定义，类器官具备以下几个特征：（1）必须包含一种以上与来源器官相同的细胞类型；（2）应该表现出来源器官所特有的一些功能；（3）细胞的组织方式应当与来源器官相似。
术语“CD8+T磁珠”是一个间接磁性标记系统，用于从小鼠脾脏或淋巴结单细胞悬液中分选未用抗体标记的CD8+T细胞毒性T细胞。
术语“肿瘤免疫特异性评估”肿瘤特异性抗原及递呈，以及特异性免疫学识别和攻击，包括抗原抗体反应（若有），或免疫细胞的特异性攻击。
本申请一方面提供一种肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型的制备方法，包括以下步骤：
将抗原呈递细胞与肿瘤细胞的裂解液共孵育，制备肿瘤特异性抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞和所述肿瘤细胞与待培养的肿瘤类器官同源，将所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与CD8+T细胞共培养，收集肿瘤特异性细胞毒性T细胞，所述CD8+T细胞与待培养的肿瘤类器官同源，将待培养的肿瘤类器官与所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养，制备肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型。
其中，肿瘤同源为来自同一个个体，例如同一个体组织，同一外周血，即为个体同一来源。
具体步骤如下：
1、将肿瘤类器官通过冷冻（干冰）-解冻（常温）反复6~10次，提取细胞裂解液。
2、从肿瘤类器官同源的外周血单核细胞中分化出抗原呈递细胞与步骤1收集的肿瘤裂解物（200μg蛋白质/1×106个细胞）共孵育24小时以获得肿瘤抗原特异性树突状细胞。
3、用CD8+T细胞分离试剂盒（MojoSort™ Human CD8+T Cell Isolation Kit，Cat#480129）从肿瘤类器官同源的外周血单核细胞中中分离出CD8+T细胞。
4、将抗原特异性树突状细胞与CD8+T细胞以1:5的比例共培养在T细胞培养基，每三天弃一半培养基，加入新的T细胞培养液进行培养6天。诱导CD8+T细胞分化为肿瘤特异性细胞毒性T细胞。
T细胞培养基：RPMI 1640、10% male human AB serum（Sigma-Aldrich）、2mMUltraglutamine I、100 U/ml Penicillin、100μg/ml Streptomycin和25 U/ml IL-2。
5、利用CD8+T磁珠（MojoSort™ Human CD8 Nanobeads，Cat#480108）将上述共培养的肿瘤特异性细胞毒性T细胞分选出来。
6、将从基质胶中提取到的类器官部分用0.25%胰蛋白酶分离成单个细胞，并计算每个肿瘤类器官中肿瘤细胞的数量，以根据不同比率的计算用于共培养的肿瘤类器官和CD8+T细胞的数量。
7、将肿瘤类器官和肿瘤特异性细胞毒性T细胞按照不同比例接种到低吸附6/12/24/96孔板（PrimeSurface® #MS-90240Z）共培养，可以根据实验目的，在肿瘤类器官的培养过程中进行Cell Trace染料染色、转染、转基因、药物或细胞因子处理等步骤。
8、收集类器官或单细胞（肿瘤或免疫）进行实验分析。
在一个具体的示例中，所述制备方法满足如下条件（1）~（3）中的一个或多个：
（1）所述抗原呈递细胞与所述肿瘤细胞的裂解液共孵育的时间为22h~26h。
（2）所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与所述CD8+T细胞共培养的时间为5天~7天。
（3）所述肿瘤类器官与所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养的时间为70h~74h。
可选地，所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与所述CD8+T细胞以1:（4~6）的比例共培养。
进一步可选地，所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与所述CD8+T细胞于培养基I中共培养。
所述培养基I包括RPMI1640基础培养基，及添加在所述RPMI1640基础培养基中的体积浓度8%~12%人AB血清、1.5mM~2.5mM谷氨酰胺、80U/mL~120U/mL青霉素、80μg/mL~120μg/mL链霉素、0.8mM~1.2mM丙酮酸钠、0.04nM~0.06nM 2-巯基乙醇、80U/m~120U/mL IL-2。
在一个具体的示例中，采用磁珠法收集所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞。
其中，所述待培养的肿瘤类器官与所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞于培养基II中共培养。
所述培养基II包括：RPMI1640基础培养基，及添加在所述RPMI1640基础培养基中的体积浓度8%~12%人AB血清、1.5mM~2.5mM谷氨酰胺、80U/mL~120U/mL青霉素、80μg/mL~120μg/mL链霉素、0.8mM~1.2mM丙酮酸钠、0.04nM~0.06nM2-巯基乙醇、80U/m~120U/mLIL-2、180ng/mL~220ng/mLIFN-γ。
可选地，所述肿瘤特异性抗原呈递细胞包括树突状细胞或朗格汉斯细胞。
进一步可选地，所述肿瘤类器官包括膀胱癌类器官、肺癌类器官、肝癌类器官、胃癌类器官、结肠癌类器官、前列腺癌类器官、乳腺癌类器官、卵巢癌类器官、鼻咽癌类器官和食道癌类器官中的一种或多种。
本申请另一方面还提供上述的方法制备得到的肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型。
本申请另一方面还提供上述的共培养模型在肿瘤免疫特异性评估中的应用。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差，涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
本实施例提供了一种食管鳞癌肿瘤类器官和细胞毒性T细胞共培养的方法，所述方法包括以下步骤：
1、将食管鳞癌肿瘤类器官通过冷冻（干冰）-解冻（常温）反复6-10次，提取细胞裂解液。
2、将肿瘤类器官同源的外周血单核细胞中分化出成熟树突状细胞与步骤1收集的肿瘤类器官细胞裂解液（200μg蛋白质/1×106个细胞）共孵育24小时以获得肿瘤类器官抗原特异性树突状细胞。
3、用CD8+ T细胞分离试剂盒（MojoSort™ Mouse CD8 T Cell Isolation Kit，Cat#480007）从肿瘤类器官同源的外周血单核细胞中分离出CD8+T细胞。
4、将抗原特异性树突状细胞与CD8+T细胞以1:5的比例共培养在T细胞培养基中，每三天弃一半培养基，加入新的T细胞培养基进行培养，培养周期为6天，CD8+T细胞被诱导分化为肿瘤类器官抗原特异细胞毒性T细胞（CTL）。
T细胞培养液：RPMI 1640、10% male human AB serum（Sigma-Aldrich）、2mMGlutamax、100 U/ml Penicillin、100μg/ml Streptomycin、1mM sodium pyruvate、0.05nM2-mercapyoethanol和100U/ml IL-2。
4、利用CD8+T磁珠（MojoSort™ Mouse CD8 Nanobeads, Cat#480007）将上述共培养的肿瘤细胞特异细胞毒性T细胞分选出来。
5、将肿瘤类器官和肿瘤细胞特异细胞毒性T细胞按照1：50的比例（每孔接种细胞数目：2×103个类器官+1×105个肿瘤细胞特异细胞毒性T细胞）接种到低吸附的24孔板（PrimeSurface® #MS-90240Z）中进行共培养。
其中，共培养培养基：RPMI 1640、10% male human AB serum（Sigma-Aldrich）、2mM Glutamax、100 U/ml Penicillin、100μg/ml Streptomycin、1mM sodium pyruvate、0.05nM 2-mercapyoethanol、100U/ml IL-2和200 ng/mLIFN-γ。
6、共培养72h后，将共培养的肿瘤细胞特异细胞毒性T细胞和食管鳞癌肿瘤类器官消化成单细胞收集进行流式检测，共培养情况如图1所示，表1为不同患者实施例流式统计结果。
对比例1
对比例1为阴性对照，即共培养时，低吸附24孔板中的一个孔中仅加入食管鳞癌肿瘤类器官消化而成的单细胞，并未添加肿瘤细胞特异细胞毒性T细胞，添加共培养培养基，72h后与共培养细胞一起进行流式检测。
表1
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书和附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将抗原呈递细胞与肿瘤细胞的裂解液共孵育，制备肿瘤特异性抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞和所述肿瘤细胞与待培养的肿瘤类器官同源；
将所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与CD8+T细胞共培养，收集肿瘤特异性细胞毒性T细胞，所述CD8+T细胞与待培养的肿瘤类器官同源；
将待培养的肿瘤类器官与所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养，制备肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足如下条件（1）~（3）中的一个或多个：
（1）所述抗原呈递细胞与所述肿瘤细胞的裂解液共孵育的时间为22h~26h；
（2）所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与所述CD8+T细胞共培养的时间为5天~7天；
（3）所述肿瘤类器官与所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养的时间为70h~74h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与所述CD8+T细胞以1:（4~6）的比例共培养。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肿瘤特异性抗原呈递细胞与所述CD8+T细胞于培养基I中共培养；
所述培养基I包括RPMI 1640基础培养基，及添加在所述RPMI 1640基础培养基中的体积浓度8%~12%人AB血清、1.5mM~2.5mM谷氨酰胺、80U/mL~120U/mL青霉素、80μg/mL~120μg/mL链霉素、0.8mM~1.2mM丙酮酸钠、0.04 nM ~0.06 nM 2-巯基乙醇、80U/m~120U/mL IL-2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用磁珠法收集所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待培养的肿瘤类器官与所述肿瘤特异性细胞毒性T细胞于培养基II中共培养；
所述培养基II包括：RPMI 1640基础培养基，及添加在所述RPMI 1640基础培养基中的体积浓度8%~12%人AB血清、1.5mM~2.5mM谷氨酰胺、80U/mL~120U/mL青霉素、80μg/mL~120μg/mL链霉素、0.8mM~1.2mM丙酮酸钠、0.04nM ~0.06nM 2-巯基乙醇、80U/m~120U/mL IL-2、180ng/mL~220 ng/mL IFN-γ。
7.根据权利要求1~6任一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤特异性抗原呈递细胞包括树突状细胞或朗格汉斯细胞。
8.根据权利要求1~6任一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤类器官包括膀胱癌类器官、肺癌类器官、肝癌类器官、胃癌类器官、结肠癌类器官、前列腺癌类器官、乳腺癌类器官、卵巢癌类器官、鼻咽癌类器官和食道癌类器官中的一种或多种。
9.权利要求1~8任一项所述的方法制备得到的肿瘤类器官与肿瘤特异性细胞毒性T细胞共培养模型。
10.权利要求9所述的共培养模型在肿瘤免疫特异性评估中的应用。
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