CN111440773A - 一种t细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，具体步骤包括：1)CD4⁺T细胞及CD8⁺T细胞与CD3/CD28细胞扩增磁珠在高浓度钾离子培养基中培养；2)用装载CAR T基因的慢病毒进行感染；3)将细胞与CD3/CD28细胞扩增磁珠分离；4)在高浓度钾离子培养基中扩增细胞；5)检测体外杀伤效率；本发明在T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的过程中引入一定浓度的钾离子，可提高CAR T细胞的激活水平以及体外杀伤能力。本发明具有操作简单，重复性好，成本低廉的优点，具有很高的应用价值。

Description

一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学领域，尤其涉及一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法。

背景技术

肿瘤免疫治疗近年来在肿瘤治疗领域取得了诸多重要进展，包括过继性免疫治疗，非特异性免疫调节治疗，免疫检查点阻断治疗和单克隆抗体治疗等。其中，嵌合抗原受体T细胞治疗(Chimeric antigen receptor T cell therapy，CAR T cell therapy)是目前最重要的肿瘤免疫治疗方法之一，其主要治疗流程是通过慢病毒等方式改造病人外周血中分离的T细胞，得到特异性CAR T细胞实现对肿瘤的特异性治疗。

T细胞需要两个信号来激活，一般通过T细胞受体(T cell receptor，TCR)识别抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)递呈的抗原多肽以激活CD3信号通路获得第一信号，并同时通过T细胞表面的共刺激分子和APC或靶细胞上的配体结合以获得第二信号。两者共同作用激发下游级联反应使得T细胞激活和增殖并进行细胞杀伤等。鉴于第一信号会受到组织相容性复合体(MHC)限制的问题，为了摆脱这一限制，CAR T细胞主要通过表达嵌合抗原受体分子，直接与抗原受体结合并激活胞内信号以激活T细胞。在进行CAR T治疗时，需要从病人外周血中分离T细胞，并对T细胞进行体外培养以及改造。但如何改进其体外培养条件，以增加T细胞后续杀伤能力至关重要，将直接影响CAR T治疗效果而具有重要实际应用价值。

在最近的研究中发现，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞快速分裂并导致产生细胞凋亡与坏死的密集区域。在细胞坏死后，胞内离子释放造成肿瘤间质液(TIF)中局部离子失衡，钾离子高于血清中浓度并且抑制T细胞的效应子功能。进一步的研究显示，胞外高浓度的钾离子可通过触发T细胞饥饿反应，可限制T细胞效应子功能并且维持其干性。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，通过优化钾离子浓度培养基代替普通培养基进行CAR T细胞的体外培养和改造，以加强CAR T细胞的激活程度以及体外杀伤能力。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何加强CAR T细胞的激活程度以及体外杀伤能力。

为实现上述目的，本发明提供了一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分离纯化CD4⁺和CD8⁺T细胞；

2)制备高浓度钾离子培养基；

3)T细胞的培养与改造：将50万个步骤1)获得的CD4⁺T细胞与50万个步骤1)获得的CD8⁺T细胞混合，用0.5ml高浓度钾离子培养基重悬得到细胞悬液；将细胞悬液加入24孔细胞培养板中，滴加磁珠悬液，置于37摄氏度，5％CO₂培养箱，培养24小时；

4)慢病毒感染；

5)分离改造后的T细胞；

6)改造后的T细胞扩增；

7)培养9天后，当T细胞生长进入平台期时进行杀伤试验检测体外杀伤效率。

进一步地，步骤1)中，具体步骤为：先进行细胞计数，然后分离纯化CD4⁺和CD8⁺T细胞。

优选地，可使用细胞计数板或细胞计数仪进行细胞计数。

进一步地，CD4⁺T细胞从人外周血PBMC中分离纯化得到。

进一步地，CD8⁺T细胞从人外周血PBMC中分离纯化得到。

进一步地，高浓度钾离子培养基中氯化钾的质量浓度为：2500～4800mg/L。

进一步地，氯化钠的质量浓度为3000～6000mg/L。

进一步地，步骤3)的磁珠悬液通过以下步骤制备获得：a)在200万个CD3/CD28细胞扩增磁珠，加入5倍体积高浓度钾离子培养基；b)用磁铁吸附CD3/CD28细胞扩增磁珠，除去液体完成一次洗涤，重复步骤a)和步骤b)三次后用0.5ml高浓度钾离子培养基重悬得到磁珠悬液。

进一步地，步骤4)的具体为：加入装载CAR T基因的慢病毒并添加高浓度钾离子培养基至孔内液体满，培养3天后，吸去2ml培养上清，添加2ml新的高浓度钾离子培养基。

进一步地，步骤5)具体为：培养5天后，通过吹吸将改造后的T细胞与磁珠分离，使用磁铁除去磁珠。

进一步地，步骤6)具体步骤为：将T细胞置于6孔细胞培养板中，按50万T细胞每毫升添加新的高浓度钾离子培养基继续培养，培养7～8天后，按50万T细胞每毫升添加新的高浓度钾离子培养基。

进一步地，步骤7)中，杀伤试验为荧光素酶靶细胞杀伤试验。

技术效果：

1、本发明中，使用了优化钾离子浓度培养基代替普通培养基进行CAR T细胞的体外培养和改造，可以CAR T细胞的激活程度更高；

2、本发明所改造的CAR T细胞被激活后，体外杀伤能力更强。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是T细胞在不同培养条件下的生长曲线示意图；

图2是T细胞感染病毒后第6天，Meso-CAR的表达检测结果示意图；

图3是T细胞感染病毒后第6天，三次独立实验T细胞的感染效率示意图；

图4是CD4⁺T和CD8⁺T细胞混合在不同培养条件下的扩增情况对比示意图；

图5是在不同培养条件下，T细胞激活后表面PD-1的表达情况示意图；

图6是在不同培养条件下PD-1表达的平均荧光强度示意图；

图7是在不同条件培养下，Meso-CAR T细胞对不同靶细胞的杀伤效率对比示意图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

本实施例使用高浓度钾离子培养基，在体外改造靶向间皮素(Mesothelin)的Meso-CAR，并用常规培养作为阴性对照。培养期间记录细胞生长曲线，CAR感染效率，CD4⁺/CD8⁺T细胞扩增情况以及细胞表面PD-1的表达。细胞进入静息状态后，将细胞与表达间皮素的靶细胞BT549和Skov3共培养进行杀伤实验，检测体外杀伤效率。

本实施例具体操作如下：

1、从人外周血PBMC中分离纯化CD4⁺/CD8⁺T细胞

1)细胞计数；

2)使用美国Thermo Fisher公司CD4分离试剂盒(Dynabeads Untouched HumanCD4 T Cells Kit)以及CD8分离试剂盒(Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit)，按照说明书分别纯化出CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞。

2、制备高浓度钾离子培养基，培养基基础配方如下：

本实施例中，氯化钾的质量浓度为：3400mg/L，摩尔浓度为：45.33mM；氯化钠的质量浓度为：33680mg/L，摩尔浓度为：63.45mM。

3、T细胞的培养与改造

1)将0.5×10⁶CD4⁺T细胞与0.5×10⁶CD8⁺T细胞混合，用0.5ml高浓度钾离子培养基，对照组加入等量常规培养基重悬；

2)取2×10⁶CD3/CD28细胞扩增磁珠，加入5倍体积高浓度钾离子培养基，对照组加入等量常规培养基洗涤；

3)磁铁吸附磁珠，除去液体，用0.5ml高浓度钾离子培养基，对照组加入等量常规培养基重悬；

4)重复步骤2)和3)，洗涤三次；

5)将步骤1)中细胞悬液加入24孔细胞培养板中，再逐滴滴加步骤4)中磁珠悬液；

6)细胞置于37摄氏度，5％CO₂中培养；

7)培养24小时后，加入装载CAR T基因的慢病毒，并添加高浓度钾离子/常规培养基至孔内液体满；

8)培养3天后，吸去2ml培养上清，添加2ml新的高浓度钾离子/常规培养基；

9)培养5天后，吹吸分离细胞与磁珠，使用磁铁除去磁珠。进行CD4/CD8/PD-1染色；

10)对照组的细胞分别平均置于六孔细胞培养板的两个孔中，按50万个细胞每毫升添加新的高浓度钾离子培养基，对照组加入等量常规培养基继续培养。高浓度钾离子激活组也做同样处理；

11)培养7天后，按50万个细胞每毫升添加新的高浓度钾离子培养基。进行Meso-CAR染色；

12)培养9天后，进行细胞体外杀伤实验。

其中，不同培养条件下的生长曲线示意图如图1所示；T细胞感染病毒后第6天，三次独立实验T细胞的感染效率示意图如图3所示。

实施例2、CD4/CD8/PD-1的流式细胞染色

CD4/CD8/PD-1的流式细胞染色的操作步骤为：

1)取0.2×10⁶个细胞，使用FACS缓冲液洗涤并用50ml FACS缓冲液重悬；

2)加入5μl PE-anti CD4/FITC-anti CD8/APC-anti PD-1流式抗体；

3)室温避光孵育15min；

4)加入1ml FACS缓冲液洗涤；

5)1200rpm离心3min，弃上清；

6)重复步骤4)和5)三次；

7)用50μl FACS缓冲液重悬，使用Accuri C6读数，实验结果如图4、5、6所示。

实施例3、Meso-CAR的流式检测

Meso-CAR的流式检测的操作步骤为：

1)取0.2×10⁶个细胞，使用FACS缓冲液洗涤并用50μl FACS缓冲液重悬；

2)加入5μl Biotin-SP Goat Anti-Mouse IgG流式抗体；

3)冰上孵育30min；

4)加入1ml FACS缓冲液洗涤；

5)1200rpm离心3min。弃上清；

6)重复步骤4)和5)三次；

7)加入2μl PE偶联的二抗；；

8)重复步骤4)和5)三次；

9)冰上避光孵育15min；

10)用50μl FACS缓冲液重悬，使用Accuri C6读数，实验结果如图2所示。

实施例4、荧光素酶靶细胞杀伤实验

使用荧光素酶靶细胞杀伤实验检测改造后的T细胞的体外杀伤效率，具体步骤为：

1)使用DPBS洗涤细胞，使用无抗生素培养基重悬细胞；

2)根据CAR表达的阳性率，将实验组与未感染慢病毒的对照组混合，在96孔板中接种1×10⁴个相同阳性率的CAR T细胞，按照E：T＝1：1/5：1的比例加入表达Luciferase的肿瘤细胞系；

3)总体系补齐至100μl；

4)37摄氏度，5％CO₂中培养；

5)18h后室温加入100μl荧光素酶底物；

6)避光反应5min；

7)将混合体系转移到酶标仪白板中分析读值；

8)计算杀伤效率，杀伤效率＝(1-实验组荧光强度/无T细胞对照组荧光强度)×100，实验结果如图7所示。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分离纯化CD4⁺和CD8⁺T细胞；

2)制备高浓度钾离子培养基；

3)T细胞的培养与改造：将50万个步骤1)获得的所述CD4⁺T细胞与50万个步骤1)获得的所述CD8⁺T细胞混合，用0.5ml所述高浓度钾离子培养基重悬得到细胞悬液；将所述细胞悬液加入24孔细胞培养板中，滴加磁珠悬液，置于37摄氏度，5％CO₂培养箱，培养24小时；

4)慢病毒感染；

5)分离改造后的T细胞；

6)改造后的所述T细胞扩增；

7)培养9天后，当所述T细胞生长进入平台期时进行杀伤试验检测体外杀伤效率。

2.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述步骤1)中，具体步骤为：先进行细胞计数，然后分离纯化CD4⁺和CD8⁺T细胞，其中，可使用细胞计数板或细胞计数仪进行所述细胞计数。

3.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述CD4⁺T细胞从人外周血PBMC中分离纯化得到。

4.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述CD8⁺T细胞从人外周血PBMC中分离纯化得到。

5.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述高浓度钾离子培养基中氯化钾的质量浓度为：2500～4800mg/L。

6.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述步骤3)的所述磁珠悬液通过以下步骤制备获得：a)在200万个CD3/CD28细胞扩增磁珠，加入5倍体积所述高浓度钾离子培养基；b)用磁铁吸附所述CD3/CD28细胞扩增磁珠，除去液体完成一次洗涤，重复步骤a)和步骤b)三次后用0.5ml所述高浓度钾离子培养基重悬得到所述磁珠悬液。

7.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，步骤4)的具体为：加入装载CAR T基因的慢病毒并添加所述高浓度钾离子培养基至孔内液体满，培养3天后，吸去2ml培养上清，添加2ml新的所述高浓度钾离子培养基。

8.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述步骤5)具体为：培养5天后，通过吹吸将改造后的所述T细胞与所述磁珠分离，使用磁铁除去所述磁珠。

9.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述步骤6)具体步骤为：将所述T细胞置于6孔细胞培养板中，按50万所述T细胞每毫升添加新的所述高浓度钾离子培养基继续培养，培养7～8天后，按50万所述T细胞每毫升添加新的所述高浓度钾离子培养基。

10.如权利要求1所述的T细胞体外嵌合抗原受体改造及扩增的优化培养方法，其特征在于，所述步骤7)中，所述杀伤试验为荧光素酶靶细胞杀伤试验。

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