CN113755436B - 一种体外nk细胞的扩增方法及其nk细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞培养技术领域，具体公开了一种体外NK细胞的扩增方法及其NK细胞，所述体外NK细胞的扩增方法为从外周血或脐带血中分离提取单个核细胞，采用含有偶联蛋白磁性微球的培养基对提取的单个核细胞进行扩增培养，获得NK细胞；其中，所述偶联蛋白磁性微球上偶联有IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA中的至少一种。本发明将NK细胞生长所需的多个激活及扩增信号蛋白分子偶联到磁性微球表面，使用偶联蛋白磁性微球进行NK细胞的体外扩增培养，能够显著提高不同来源单个核细胞中NK细胞的扩增效率及纯度的稳定性，而且扩增得到的NK细胞具有较强的杀伤能力；并且能够通过简单的物理分离方法将外源性的磁珠微球从培养体系中全部移除，有利于细胞药物质量的控制。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种体外NK细胞的扩增方法及其NK细胞。
背景技术
NK细胞是先天性免疫系统的重要组成部分，是机体抗御感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞。与T细胞介导的免疫监视应答体系所不同的是，NK细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。
获得足够数量，足够纯度的NK细胞是开展NK细胞药物研发的基础。目前NK细胞大规模扩增工艺主要有两条技术路径：
1、在培养基里添加多种细胞因子如：IL2、IL15、IL18等，刺激NK细胞活化信号通路，对NK细胞进行扩增与激活。但这种方式存在的问题是由于不同来源的血液样本中NK细胞含量不一，扩增潜能各异，导致扩增效率和扩增纯度呈现比较大的差异，无法满足细胞药物开发中批件次均一性的要求。
2、还有一种方法是用采用滋养层(feed layer)细胞作为核心原材料来进行NK细胞扩增，其大致工艺为用K562细胞(一种B细胞来源的白血病细胞系)，用基因工程改造的方式把能特异性扩增激活NK细胞的细胞因子如IL21等跨膜表达在K562细胞膜表面，将基因工程改造的K562细胞系通过放射源辐射照射灭活后，按照一定比例加入到NK细胞培养体系中，NK细胞能够以工程化K562细胞为核心聚团生长，K562细胞表达的跨膜细胞因子能够持续作用于NK细胞表面相应的受体，传递激活信号。采用这种方法进行扩增的NK细胞具有扩增效率及扩增纯度高的优势，但是由于其采用的支持物是肿瘤细胞系，虽然经过了辐照灭活，但不可避免的会在终产物中产生残留，给后续的临床研究及药物注册申报带来巨大的障碍。
发明内容
针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一种体外NK细胞的扩增方法及其NK细胞。
基于上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种体外NK细胞的扩增方法，从血液中分离提取单个核细胞，采用含偶联蛋白磁性微球的培养基对提取的单个核细胞进行扩增培养，获得NK细胞；其中，所述偶联蛋白磁性微球上偶联有IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白中的至少一种。
根据上述的扩增方法，优选地，采用含偶联蛋白磁性微球的培养基对分离的单个核细胞进行扩增培养的具体操作为：
(1)将提取的单个核细胞接种至含偶联蛋白磁性微球的培养基的培养瓶中，培养4-5天，培养过程通过向培养瓶中补加含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基，控制细胞密度为6×105/mL～1×106/mL；其中，含偶联蛋白磁性微球的培养基是将自体血浆、偶联蛋白磁性微球悬浮液、IL-2加入到GT-T551无血清培养基中，混合均匀得到的；
(2)在培养的第6-7天，向培养瓶中补加含偶联蛋白磁性微球的培养基继续进行培养，培养过程控制细胞密度为8×105/mL～1×106/mL；
(3)在培养的第8-11天，补加含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基继续进行培养，培养过程控制细胞浓度在1×106/mL～2×106/mL；(4)培养至第14-18天，收集培养的NK细胞。
根据上述的扩增方法，优选地，偶联蛋白磁性微球悬浮液的制备方法包括以下步骤：
(S1)采用结合缓冲液对His-tag蛋白纯化磁珠进行洗涤，洗涤后收集磁珠，得到预处理His-tag蛋白纯化磁珠；
(S2)将带有His标签的蛋白重悬于结合缓冲液中，得到蛋白溶液，然后将蛋白溶液与步骤(S1)得到的预处理His-tag蛋白纯化磁珠进行混合反应，反应后进行磁性分离，去上清，得到偶联蛋白磁性微球；其中，所述蛋白为IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白中的至少一种；
(S3)采用洗涤缓冲液对步骤(S2)得到的偶联蛋白磁性微球进行洗涤，然后将洗涤后的偶联蛋白磁性微球重悬于洗涤缓冲液中，即得偶联蛋白磁性微球悬浮液，其中，每毫升偶联蛋白磁性微球悬浮液中含有20～80mg的偶联蛋白磁性微球；更加优选地，每毫升偶联蛋白磁性微球悬浮液中含有80mg的偶联蛋白磁性微球。
根据上述的扩增方法，优选地，每毫升偶联蛋白磁性微球悬浮液中，每种带有His标签蛋白的含量为0.5-1mg；更加优选地，每毫升偶联蛋白磁性微球悬浮液中，每种带有His标签蛋白的含量为1mg。
根据上述的扩增方法，优选地，偶联蛋白磁性微球上偶联有IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA中的至少两种，任意两种蛋白的质量比为1:1。
根据上述的扩增方法，优选地，步骤(1)中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中偶联蛋白磁性微球的数量与接种的单个核细胞数量相同；步骤(2)中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中偶联蛋白磁性微球的数量与补加培养基前培养瓶中的细胞数量相同。
根据上述的扩增方法，优选地，步骤(1)中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为2.5％-10％，IL-2的浓度为200U/mL；含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为2.5％-10％，IL-2的浓度为200U/mL；步骤(2)中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为1％-5％，IL-2的浓度为200U/mL；步骤(3)中，含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为1％～5％，IL-2的浓度为200U/mL。
根据上述的扩增方法，优选地，所述结合缓冲液的体系为：20mM磷酸钠、500mM氯化钠、5～50mM咪唑，pH为7.4；所述洗涤缓冲液的体系为：20mM磷酸钠、500mM氯化钠、50～100mM咪唑，pH为7.4。
根据上述的扩增方法，优选地，步骤(S1)中His-tag蛋白纯化磁珠的材质为聚苯乙烯微球、聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球、聚苯乙烯-镍微球中的任意一种；更加优选地，His-tag蛋白纯化磁珠的材质为聚苯乙烯-镍微球。
根据上述的扩增方法，优选地，His-tag蛋白纯化磁珠的尺寸为100nm～50μm；更加优选地，基质微球的尺寸为30μm。
根据上述的扩增方法，优选地，细胞密度为1×106/mL。
第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的扩增方法制备得到的NK细胞产品。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
(1)本发明将NK细胞生长所需的多个激活及扩增信号蛋白分子偶联到磁性微球表面，使用偶联蛋白的磁性微球进行NK细胞的体外扩增培养，能够显著提高不同来源单个核细胞中NK细胞的扩增效率及纯度的稳定性，而且扩增得到的NK细胞具有较强的杀伤能力。
(2)本发明提供的一种体外NK细胞的扩增方法相较于目前以肿瘤细胞K562细胞系作为细胞因子载体的所构建的滋养层细胞来进行NK细胞培养的方法而言，能够通过简单的物理分离方法将外源性的磁珠微球从培养体系中全部移除，有利于细胞药物质量的控制。
(3)本发明能够通过简单的拼接方法来调整所偶联的信号蛋白分子，能够对不同的免疫细胞进行定向大规模扩增，有利于提供标准化的细胞药物扩增框架体系。
附图说明
图1为本发明实施例2～实施例6的NK细胞扩增曲线；
图2为本发明实施2的NK细胞流式表型；
图3为本发明施例3的NK细胞流式表型；
图4为本发明施例4的NK细胞流式表型；
图5为本发明施例5的NK细胞流式表型；
图6为本发明施例6的NK细胞流式表型；
图7为效靶比为1:1与5:1时，实施例2～实施例6培养15天得到的NK细胞对K562细胞的杀伤活性图；
图8为实施例6的外周血来源的单个核细胞中NK细胞的扩增纯度结果；
图9为实施例8的脐带血来源的单个核细胞中NK细胞的扩增纯度结果；
图10为实施例6外周血和实施例8脐带血来源的单个核细胞中NK细胞的扩增效率结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步详细说明，但并不限制本发明的范围。
实施例1：外周血单个核细胞的分离提取外周血单个核细胞的分离提取，主要包括以下步骤：
(1)取外周血在2900r/min下离心10min，取上层血浆在56℃下，灭活30min，然后在1500r/min下离心10min，取上清液作为自体血浆备用。
(2)使用氯化钠注射液稀释步骤(1)中剩余的血细胞层，并吹打混匀，取稀释血液30mL缓慢的添加到15mL淋巴分离液表面，在1500rpm/min下离心20min；将离心后的单个核细胞层吸出至新的50mL离心管中，每管15～20mL，使用氯化钠注射液定容至45mL，在1700rpm/min下离心10min，去除上清液，得到粗提取单个核细胞；
(3)二次洗涤：将步骤(2)得到的单个核细胞用氯化钠注射液重悬，合并于1个离心管中，定容至40ml，吸取上述离心管内的细胞悬液0.5ml加入EP管中，混匀后放入细胞计数仪进行计数。在1000rpm/min下离心10min，去除上清液，得到单个核细胞。
(一)为了研究磁性微球偶联不同蛋白对NK细胞扩增的影响，本发明进行了实施例2～实施例6的实验，实施例2～实施例6的具体内容如下所示。
实施例2：
一种体外NK细胞的扩增方法，包括以下步骤：
(1)制备偶联IL15蛋白磁性微球悬浮液：
(S1)将直径为30μm、材质为聚苯乙烯-镍微球的His-tag蛋白纯化磁珠充分混合均匀后置于离心管中，进行磁性分离，弃去上清，然后加入10mL结合缓冲液(20mM磷酸钠、500mM氯化钠和5～50mM咪唑的混合液)，使磁珠重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到预处理His-tag蛋白纯化磁珠；
(S2)将带有His标签的IL15蛋白重悬于10mL结合缓冲液中，然后加入到含有步骤(S1)得到的预处理His-tag蛋白纯化磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡震荡器震荡20s后，再将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合30min，之后在磁性分离器上进行磁性分离，移去上清液；然后加入10mL结合缓冲液，使沉淀物重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到偶联IL15蛋白磁性微球；
(S3)在步骤(S2)得到的偶联IL15蛋白磁性微球中加入洗涤缓冲液，使偶联IL15蛋白磁性微球重悬，然后进行磁性分离，移去上清液；最后使用5mL洗涤缓冲液将偶联IL15蛋白磁性微球重悬，即得偶联IL15蛋白磁性微球悬浮液；其中，每毫升偶联IL15蛋白磁性微球悬浮液含有80mg偶联IL15蛋白磁性微球；每毫升偶联IL15蛋白磁性微球悬浮液中，带有His标签的IL15蛋白含量为1mg；
(2)将根据实施例1的步骤提取的外周血单个核细胞接种至含偶联IL15蛋白磁性微球的培养基的T75培养瓶中，进行培养，其中，细胞接种密度为1×106/mL，含偶联IL15蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15蛋白磁性微球的数量与接种的单个核细胞数量比为1:1；含偶联IL15蛋白磁性微球的培养基是将自体血浆、偶联IL15蛋白磁性微球悬浮液、IL-2加入到GT-T551无血清培养基中，混合均匀得到的；偶联IL15蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为5％，IL-2的浓度为200U/mL；
(3)培养第1-2天，观察细胞密度，补加10mL含自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，继续培养；第3天，将300g培养液离心8min，弃去上清液，使用200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基重悬沉淀，并添加自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)，调整细胞密度为1×106/mL，；第4天，加入含自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为1％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，使细胞密度为1×106/mL；
(4)NK细胞培养至6-7天，向培养瓶中补加偶联IL15蛋白磁性微球的培养基继续进行培养，培养过程中控制总细胞密度在1×106/mL(若培养液体积大于100mL或细胞数量大于100M，则可以转移至T175培养，随着培养体积加大，再逐步转移到细胞培养袋培养)；其中，含偶联IL15蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15蛋白磁性微球的数量与补加培养基前培养瓶中的细胞数量比为1:1；偶联IL15蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为1％，IL-2的浓度为200U/mL；
(5)培养第8-11天，继续观察培养，并调整细胞密度在1×106/mL左右；
(6)培养第18天，利用磁性支架将磁性微球吸附在离心管壁上，使细胞与磁性微球分离，收集培养的NK细胞。
实施例3：
一种体外NK细胞的扩增方法，包括以下步骤：
(1)制备偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球悬浮液：
(S1)将直径为30μm、材质为聚苯乙烯-镍微球的His-tag蛋白纯化磁珠充分混合均匀后置于离心管中，进行磁性分离，弃去上清，然后加入10mL结合缓冲液(20mM磷酸钠、500mM氯化钠和5～50mM咪唑的混合液)，使磁珠重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到预处理His-tag蛋白纯化磁珠；
(S2)将分别带有His标签的IL15和CD137L蛋白重悬于10mL结合缓冲液中，然后加入到含有步骤(S1)得到的预处理His-tag蛋白纯化磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡震荡器震荡20s后，再将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合30min，之后在磁性分离器上进行磁性分离，移去上清液；然后加入10mL结合缓冲液，使沉淀物重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球；
(S3)在步骤(S2)得到的偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球中加入洗涤缓冲液，使偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球重悬，然后进行磁性分离，移去上清液；最后使用5mL洗涤缓冲液将偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球重悬，即得偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球悬浮液；其中，每毫升偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球悬浮液含有80mg偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球；每毫升偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球悬浮液中，带有His标签的IL15蛋白含量为1mg，带有His标签的CD137L蛋白含量为1mg；
(2)将根据实施例1的步骤提取的外周血单个核细胞接种至含偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球的培养基的T75培养瓶中，进行培养，其中，细胞接种密度为1×106/mL，含偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球的数量与接种的单个核细胞数量比为1:1；含偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球的培养基是将自体血浆、偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球悬浮液、IL-2加入到GT-T551无血清培养基中，混合均匀得到的；含偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为5％，IL-2的浓度为200U/mL；
(3)培养第1-2天，观察细胞密度，补加10mL含自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，继续培养；第3天，将300g培养液离心8min，弃去上清液，使用200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基重悬沉淀，并添加自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)，调整细胞密度为1×106/mL，第4天，加入含自体血浆(自体血浆在GT-T551无血清培养基中的体积分数为1％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，使细胞密度为1×106/mL；
(4)NK细胞培养至6-7天，向培养瓶中补加含偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球的培养基继续进行培养，培养过程中控制总细胞密度在1×106/mL(若培养液体积大于100mL或细胞数量大于100M，则可以转移至T175培养，随着培养体积加大，再逐步转移到细胞培养袋培养)；其中，含偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15与CD137L蛋白磁性微球的数量与补加培养基前培养瓶中的细胞数量比为1:1；含偶联IL15蛋白与CD137L磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为1％，IL-2的浓度为200U/mL；
(5)培养第8-11天，继续观察培养，并调整细胞密度在1×106/mL左右；
(6)培养第18天，利用磁性支架将磁性微球吸附在离心管壁上，使细胞与磁性微球分离，收集培养的NK细胞。
实施例4：
一种体外NK细胞的扩增方法，包括以下步骤：
(1)制备偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球悬浮液：
(S1)将直径为30μm、材质为聚苯乙烯-镍微球的His-tag蛋白纯化磁珠混合均匀后置于离心管中，进行磁性分离，弃去上清，然后加入10mL结合缓冲液，使磁珠重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到预处理His-tag蛋白纯化磁珠；
(S2)将分别带有His标签的IL15、IL18和CD137L蛋白重悬于10mL结合缓冲液中，然后加入到含有步骤(S1)得到的预处理His-tag蛋白纯化磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡震荡器震荡20s后，再将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合30min，之后在磁性分离器上进行磁性分离，移去上清液；然后加入10mL结合缓冲液，使沉淀物重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球；
(S3)在步骤(S2)得到的偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球加入洗涤缓冲液，使偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球重悬，然后进行磁性分离，移去上清液；最后使用5mL缓冲液将偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球重悬，即得偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球悬浮液；其中，每毫升偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球悬浮液含有80mg偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球；每毫升偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球悬浮液中，带有His标签的IL15蛋白含量为1mg，带有His标签的CD137L蛋白含量为1mg，带有His标签的IL18蛋白含量为1mg；
(2)将根据实施例1的步骤提取的外周血单个核细胞接种至含偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球的培养基的T75培养瓶中，进行培养，其中，细胞接种密度为1×106/mL，含偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球的数量与接种的单个核细胞数量比为1:1；含偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球的培养基是将自体血浆、偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球悬浮液、IL-2加入到GT-T551无血清培养基中，混合均匀得到的；含偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为5％，IL-2的浓度为200U/mL；
(3)培养第1-2天，观察细胞密度，补加10mL含自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，继续培养；第3天，将300g培养液离心8min，弃去上清液，使用含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基重悬沉淀，并添加自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)，调整细胞密度为1×106/mL；第4天，加入含自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为1％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，使细胞密度为1×106/mL；
(4)NK细胞培养至6-7天，向培养瓶补加含偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球的培养基继续进行培养，培养过程中控制总细胞密度在1×106/mL(若培养液体积大于100mL或细胞数量大于100M，则可以转移至T175培养，随着培养体积加大，再逐步转移到细胞培养袋培养)；其中，含偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球的数量与补加培养基前培养瓶中的细胞数量比为1:1；含偶联IL15、IL18与CD137L蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为1％，IL-2的浓度为200U/mL；
(5)培养第8-11天，继续观察培养，并调整细胞密度在1×106/mL左右；
(6)培养第18天，利用磁性支架将磁性微球吸附在离心管壁上，使细胞与磁性微球分离，收集培养的NK细胞。
实施例5：
一种体外NK细胞的扩增方法，包括以下步骤：
(1)制备偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球悬浮液：
(S1)将直径为30μm、材质为聚苯乙烯-镍微球的His-tag蛋白纯化磁珠混合均匀后置于离心管中，进行磁性分离，弃去上清，然后加入10mL结合缓冲液，使磁珠重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到预处理His-tag蛋白纯化磁珠；
(S2)将分别带有His标签的IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白重悬于10mL结合缓冲液中，然后加入到含有步骤(S1)得到的预处理His-tag蛋白纯化磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡震荡器震荡20s后，再将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合30min，之后在磁性分离器上进行磁性分离，移去上清液；然后加入10mL结合缓冲液，使沉淀物重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球；
(S3)在步骤(S2)得到的偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球中加入洗涤缓冲液，使偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球重悬，然后进行磁性分离，移去上清液；最后使用5mL缓冲液将偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球重悬，即得偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球悬浮液；其中，每毫升偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球悬浮液含有80mg偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球；每毫升偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球悬浮液中，带有His标签的IL15蛋白含量为1mg，带有His标签的CD137L蛋白含量为1mg，带有His标签的IL18蛋白含量为1mg，带有His标签的CD86蛋白含量为1mg；
(2)将根据实施例1的步骤提取的外周血单个核细胞接种至含偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球的培养基的T75培养瓶中，进行培养，其中，细胞接种密度为1×106/mL，含偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球的数量与接种的单个核细胞数量比为1:1；含偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球的培养基是将自体血浆、偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球悬浮液、IL-2加入到GT-T551无血清培养基中，混合均匀得到的；含偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为5％，IL-2的浓度为200U/mL；
(3)培养第1-2天，观察细胞密度，补加10mL含自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，继续培养；第3天，将300g培养液离心8min，弃去上清液，使用含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基重悬沉淀，并添加自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)，调整细胞密度为1×106/mL；第4天，加入含自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为1％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，使细胞密度为1×106/mL；
(4)NK细胞培养至6-7天，向培养瓶中补加含偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球的培养基继续进行培养，培养过程中控制总细胞密度在1×106/mL(若培养液体积大于100mL或细胞数量大于100M，则可以转移至T175培养，随着培养体积加大，再逐步转移到细胞培养袋培养)；其中，含偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球的数量与补加培养基前培养瓶中的细胞数量比为1:1；含偶联IL15、IL18、CD86与CD137L蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为1％，IL-2的浓度为200U/mL；
(5)培养第8-11天，继续观察培养，并调整细胞密度在1×106/mL左右；
(6)培养第18天，利用磁性支架将磁性微球吸附在离心管壁上，使细胞与磁性微球分离，收集培养的NK细胞。
实施例6：
一种体外NK细胞的扩增方法，包括以下步骤：
(1)制备偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球悬浮液：
(S1)将直径为30μm、材质为聚苯乙烯-镍微球的His-tag蛋白纯化磁珠混合均匀后置于离心管中，进行磁性分离，弃去上清，然后加入10mL结合缓冲液，使磁珠重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到预处理His-tag蛋白纯化磁珠；
(S2)将分别带有His标签的IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白重悬于10mL结合缓冲液中，然后加入到含有步骤(S1)得到的预处理His-tag蛋白纯化磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡震荡器震荡20s后，再将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合30min，之后在磁性分离器上进行磁性分离，移去上清液；然后加入10mL结合缓冲液，使沉淀物重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球；
(S3)在步骤(S2)得到的偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球中加入洗涤缓冲液，使偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球重悬，然后进行磁性分离，移去上清液；最后使用5mL缓冲液将偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球重悬，即得偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球悬浮液；其中，每毫升偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球悬浮液含有80mg偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球；每毫升偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球悬浮液中，带有His标签的IL15蛋白含量为1mg，带有His标签的CD137L蛋白含量为1mg，带有His标签的IL18蛋白含量为1mg，带有His标签的CD86蛋白含量为1mg，带有His标签的MICA蛋白含量为1mg；
(2)将根据实施例1的步骤提取的外周血单个核细胞接种至含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基的T75培养瓶中，进行培养，其中，细胞接种密度为1×106/mL，含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的数量与接种的单个核细胞数量比为1:1；含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基是将自体血浆、偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球悬浮液、IL-2加入到GT-T551无血清培养基中，混合均匀得到的；含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为5％，IL-2的浓度为200U/mL；
(3)培养第1-2天，观察细胞密度，补加10mL含自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，继续培养；第3天，将300g培养液离心8min，弃去上清液，使用含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基重悬沉淀，并添加自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)，调整细胞密度为1×106/mL；第4天，加入含自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为1％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，使细胞密度为1×106/mL；
(4)NK细胞培养至6-7天，向培养瓶中补加含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基继续进行培养，培养过程中控制细胞密度在1×106/mL(若培养液体积大于100mL或细胞数量大于100M，则可以转移至T175培养，随着培养体积加大，再逐步转移到细胞培养袋培养)；其中，含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的数量与补加培养基前培养瓶中的细胞数量比为1:1；含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为1％，IL-2的浓度为200U/mL；
(5)培养第8-11天，继续观察培养，并调整细胞密度在1×106/mL左右；
(6)培养第18天，利用磁性支架将磁性微球吸附在离心管壁上，使细胞与磁性微球分离，收集培养的NK细胞。
在NK细胞培养过程中，计数制作NK细胞扩增曲线图，实施例2～实施例6的细胞扩增曲线图如图1所示。
由图1可知，单个核细胞在五种不同的磁性微球组合的刺激诱导下，NK细胞的扩增速度和数目是有差异的，实施例5中NK细胞扩增数目为731×107个，实施例6中NK细胞扩增数目达到1140×107个，远远高于实施例2～实施例4中NK细胞的扩增数目。即实施例5、6中应用的磁性微球组合优于其他组合。
为了研究磁性微球偶联不同蛋白对NK细胞扩增的影响，通过流式细胞仪检测实施例2～实施例6的NK细胞表型(CD3-CD16+CD56+)，其结果如表1和图2～图6所示。
表1：流式检测NK细胞(CD3-CD16+CD56+)表达率
| 实施例编号 | 磁性微球偶联蛋白种类 | CD3-CD16+CD56+ |
| 实施例2 | IL15 | 30.08％ |
| 实施例3 | IL15、CD137L | 58.07％ |
| 实施例4 | IL15、IL18、CD137L | 73.81％ |
| 实施例5 | IL15、IL18、CD86、CD137L | 84.32％ |
| 实施例6 | IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA | 97.06％ |
由表1和图2～图6可知，实施例2培养的NK细胞纯度在30.08％，实施例3培养的NK细胞纯度在58.07％，实施例4培养的NK细胞纯度在73.81％，实施例5培养的NK细胞纯度在84.32％，实施例6培养的NK细胞纯度在97.06％，这些数据表明，实施例5、6培养的NK细胞纯度较高。
为了检测NK细胞对肿瘤细胞的杀伤功能，本发明将实施例2～实施例6培养15天的NK细胞与K562肿瘤细胞，按效靶比1:1、5:1接种于95孔板，培养8小时后用LDH酶释放发检测NK细胞对K562细胞的杀伤活性，结果如图7所示。
由图7可知，效靶比5:1时，实施例2～实施例6培养的NK细胞对K562的杀伤率均在50％以上；效靶比1:1时，实施例5、实施例6培养的NK细胞对K562细胞杀伤在90％以上，故实施例5、6中使用的偶联蛋白磁性微球培养的NK细胞对K562细胞的杀伤力优于实施例2～实施例4。
(二)为了研究不同来源的单个核细胞的NK细胞的扩增，本发明使用脐带血提取单个核细胞进行了实施例8的实验，实施例8的具体内容如下所示。
实施例7：脐带血单个核细胞的分离提取
脐带血单个核细胞的分离提取步骤与实施例1相同，不同在处在于：步骤(1)中取脐带血在2900r/min下离心10min。
实施例8：
一种体外NK细胞的扩增方法，包括以下步骤：
(1)制备偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球悬浮液：
(S1)将直径为30μm、材质为聚苯乙烯-镍微球的His-tag蛋白纯化磁珠混合均匀后置于离心管中，进行磁性分离，弃去上清，然后加入10mL结合缓冲液，使磁珠重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到预处理His-tag蛋白纯化磁珠；
(S2)将分别带有His标签的IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白重悬于10mL结合缓冲液中，然后加入到含有步骤(S1)得到的预处理His-tag蛋白纯化磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡震荡器震荡20s后，再将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合30min，之后在磁性分离器上进行磁性分离，移去上清液；然后加入10mL结合缓冲液，使沉淀物重悬，之后进行磁性分离，移去上清液，得到偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球；
(S3)在步骤(S2)得到的偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球中加入洗涤缓冲液，使偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球重悬，然后进行磁性分离，移去上清液；最后使用5mL缓冲液将偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球重悬，即得偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球悬浮液；其中，每毫升偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球悬浮液含有80mg偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球；每毫升偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球悬浮液中，带有His标签的IL15蛋白含量为1mg，带有His标签的CD137L蛋白含量为1mg，带有His标签的IL18蛋白含量为1mg，带有His标签的CD86蛋白含量为1mg，带有His标签的MICA蛋白含量为1mg；
(2)将根据实施例7中步骤提取的脐带血单个核细胞接种至含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基的T75培养瓶中，进行培养，其中，细胞接种密度为1×106/mL，含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的数量与接种的单个核细胞数量比为1:1；含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基是将自体血浆、偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球悬浮液、IL-2加入到GT-T551无血清培养基中，混合均匀得到的；含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为5％，IL-2的浓度为200U/mL；
(3)培养第1-2天，观察细胞密度，补加10mL含自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，继续培养；第3天，将300g培养液离心8min，弃去上清液，使用含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基重悬沉淀，并添加自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为5％)，调整细胞密度为1×106/mL；第4天，加入含自体血浆(在GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为1％)、含200U/mL IL-2的GT-T551无血清培养基，使细胞密度为1×106/mL；
(4)NK细胞培养至6-7天，向培养瓶中补加含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基继续进行培养，培养过程中控制细胞密度在1×106/mL(若培养液体积大于100mL或细胞数量大于100M，则可以转移至T175培养，随着培养体积加大，再逐步转移到细胞培养袋培养)；其中，含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基中偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的数量与补加培养基前培养瓶中的细胞数量比为1:1；含偶联IL15、IL18、CD86、CD137L、MICA蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为1％，IL-2的浓度为200U/mL；
(5)培养第8-11天，继续观察培养，并调整细胞密度在1×106/mL左右；
(6)培养第15天，利用磁性支架将磁性微球吸附在离心管壁上，使细胞与磁性微球分离，收集培养的NK细胞。
对实施例6和实施例8不同来源单个核细胞中NK细胞的扩增进行纯度测定，其结果如图8和图9所示。
由图8和图9可知，使用相同的偶联蛋白磁性微球，对人外周血和脐带血来源的单个核细胞进行扩增培养，得到的NK细胞纯度无差异，均能满足临床应用需求。
同时，对实施例6和实施例8中NK细胞的扩增效率进行分析，其结果如图10所示。
由图10可知，使用相同的偶联蛋白磁性微球，对人外周血和脐带血来源的单个核细胞进行扩增培养，得到的NK细胞数目均能达到临床应用需求。
Claims (7)
1.一种体外NK细胞的扩增方法，其特征在于，从血液中分离提取单个核细胞，采用含偶联蛋白磁性微球的培养基对提取的单个核细胞进行扩增培养，获得NK细胞；其中，所述偶联蛋白磁性微球上偶联有IL15、IL18、CD86、CD137L和MICA蛋白，五种蛋白的质量比为1:1:1:1:1；
采用含偶联蛋白磁性微球的培养基对分离的单个核细胞进行扩增培养的具体操作为：
（1）将提取的单个核细胞接种至含偶联蛋白磁性微球的培养基的培养瓶中，培养4-5天，培养过程通过向培养瓶中补加含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基，控制细胞密度为6×105/mL～1×106/mL；其中，含偶联蛋白磁性微球的培养基是将自体血浆、偶联蛋白磁性微球悬浮液、IL-2加入到GT-T551无血清培养基中，混合均匀得到的；
（2）在培养的第6-7天，向培养瓶中补加含偶联蛋白磁性微球的培养基继续进行培养，培养过程控制细胞密度为8×105/mL～1×106/mL；
（3）在培养的第8-11天，补加含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基继续进行培养，培养过程控制细胞浓度在1×106/mL～2×106/mL；
（4）培养至第14-18天，收集培养的NK细胞。
2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，偶联蛋白磁性微球悬浮液的制备方法包括以下步骤：
（S1）采用结合缓冲液对His-tag蛋白纯化磁珠进行洗涤，洗涤后收集磁珠，得到预处理His-tag蛋白纯化磁珠；
（S2）将带有His标签的蛋白重悬于结合缓冲液中，得到蛋白溶液，然后将蛋白溶液与步骤（S1）得到的预处理His-tag蛋白纯化磁珠进行混合反应，反应后进行磁性分离，去上清，得到偶联蛋白磁性微球；其中，所述蛋白为IL15、IL18、CD86、CD137L和MICA蛋白；
（S3）采用洗涤缓冲液对步骤（S2）得到的偶联蛋白磁性微球进行洗涤，然后将洗涤后的偶联蛋白磁性微球重悬于洗涤缓冲液中，即得偶联蛋白磁性微球悬浮液，其中，每毫升偶联蛋白磁性微球悬浮液中含有20～80mg的偶联蛋白磁性微球。
3.根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，每毫升偶联蛋白磁性微球悬浮液中，每种带His标签蛋白的含量为0.5-1mg。
4.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤（1）中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中偶联蛋白磁性微球的数量与接种的单个核细胞数量相同；步骤（2）中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中偶联蛋白磁性微球的数量与补加培养基前培养瓶中的细胞数量相同。
5.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，步骤（1）中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为2.5%-10%，IL-2的浓度为200U/mL；含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为2.5%-10%，IL-2的浓度为200U/mL；步骤（2）中，含偶联蛋白磁性微球的培养基中自体血浆的体积分数为1%-5%，IL-2的浓度为200U/mL；步骤（3）中，含自体血浆、IL-2的GT-T551无血清培养基中自体血浆的体积分数为1%～5%，IL-2的浓度为200U/mL。
6.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，步骤（S1）中His-tag蛋白纯化磁珠的材质为聚苯乙烯微球、聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物微球、聚苯乙烯-镍微球中的任意一种。
7.根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，His-tag蛋白纯化磁珠的尺寸为100nm～50μm。
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