CN117660279A - 一种通过疮痂病链霉菌SCAB_75421基因提高thaxtomin A产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通过疮痂病链霉菌SCAB_75421基因提高thaxtomin A产量的方法，通过基因工程途径在疮痂病链霉菌中对SCAB_75421基因缺失，获得thaxtomin A高产菌株，利用所得菌株生产thaxtomin A；其中，SCAB_75421基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明筛选到了thaxtomin A生物合成负调控基因SCAB_75421，并通过基因工程途径对疮痂病链霉菌中的SCAB_75421基因缺失，获得thaxtomin A高产菌株，为提高工业生产thaxtomin A发酵产量提供了技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种通过疮痂病链霉菌SCAB_75421基因提高thaxtomin A产量的方法。
背景技术
链霉菌是一种G+C含量高的革兰氏阳性丝状细菌，能够生物合成众多结构复杂、功能多样的次生代谢产物，其代谢产物广泛应用于医药健康、畜牧业、工业以及农业除草剂中。在链霉菌种，次级代谢产物的合成基因多以成簇的形式位于基因组内，而合成代谢产物的基因簇又受多种调控基因的调控，主要包括：途径特异性调控、多效调控和全局调控。通过一系列的调控基因改造可以影响链霉菌次级代谢产物的合成，研究次级代谢调控的分子机制将对利用基因工程手段得到理想的工程改造菌株应用于实际生产具有极大的促进作用。本发明目的就是通过基因工程途径定向改变调控基因来获得thaxtomin A高产菌株，用于thaxtomin A的生产。
Thaxtomin A在农业除草剂方面的应用有着很大的潜力。与草甘膦等商用除草剂相比，thaxtomin A对阔叶杂草的除草活性明显优秀，且对大麦、水稻和玉米等禾本科作物几乎无伤害。因此，提高thaxtomin A的产量逐渐引起广泛关注。Thaxtomin A在纳摩尔水平上即可引起植物细胞肥大，使植物细胞无法正常伸长，导致幼苗发育迟缓，其主要机制是抑制纤维素的生成。Thaxtomin A的生物合成基因簇是由txtC、txtH、txtB、txtA、txtR、txtE和txtD七个基因组成，其中六个基因(txtA、txtB、txtC、txtD、txtE、txtH)编码生物合成酶，txtR编码AraC/XylS家族转录调控蛋白，txtR激活基因txtA、txtB、txtC和txtD的表达，从而激活thaxtomin A的生物合成。
Lrp(leucine-responsive regulatory protein)家族蛋白是一类广泛存在于原核生物中的转录调控因子家族。Lrp具有至关重要的作用，能够参与调控氨基酸代谢、中心代谢、能量代谢以及物质转运等生理过程。先前的研究已经对抗生素产生菌中Lrp蛋白的调控功能进行了较为系统的研究，然而目前在疮痂病链霉菌等致病性链霉菌中Lrp蛋白的调控功能和分子机制仍需深入研究。关于疮痂病链霉菌中通过调控基因工程手段提高thaxtomin A产量的研究非常少，仅仅只有通过缺失调控因子CebR基因提高txtR的表达，从而提高thaxtomin A产量的报道。基于疮痂病链霉菌基因组序列的生物学信息预测，疮痂病链霉菌SCAB_75421基因编码一种Lrp家族蛋白，并经本发明实验室研究发现，疮痂病链霉菌SCAB_75421基因缺失导致thaxtomin A产量显著提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种通过疮痂病链霉菌SCAB_75421基因提高thaxtomin A产量的方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种通过疮痂病链霉菌SCAB_75421基因提高thaxtomin A产量的方法，通过基因工程途径在疮痂病链霉菌中对SCAB_75421基因进行缺失，获得疮痂病链霉菌thaxtomin A高产菌株，利用所得菌株生产thaxtomin A；其中，所述SCAB_75421基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为本发明的优选方式之一，所述SCAB_75421基因属于Lrp(leucine-responsiveregulatory protein，亮氨酸应答调控蛋白)家族转录调控蛋白。
作为本发明的优选方式之一，所述在疮痂病链霉菌中对SCAB_75421基因进行缺失的步骤中，采用的疮痂病链霉菌具体为疮痂病链霉菌87.22菌株，通过自杀型质粒pUCTSR和同源重组技术来实现基因的缺失。其中，疮痂病链霉菌87.22菌株为目前已公开、且为公众所得的菌株，由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供，保藏编号为CGMCC 4.1765。
作为本发明的优选方式之一，所述SCAB_75421基因的表达产物用于负调控thaxtomin A的生物合成。
本发明相比现有技术的优点在于：
本发明研究筛选到了thaxtomin A生物合成负调控基因SCAB_75421，并通过基因工程途径对疮痂病链霉菌中的SCAB_75421基因进行缺失，获得thaxtomin A高产菌株(即，疮痂病链霉菌SCAB_75421基因缺失突变株)，为提高工业生产thaxtomin A发酵产量提供了技术支持。其中，当在疮痂病链霉菌中缺失SCAB_75421基因时，thaxtomin A产量显著提高62.8％；而在ΔSCAB_75421突变株中回补SCAB_75421基因后，thaxtomin A的产量则得到了恢复；由此表明，SCAB_75421是一个参与thaxtomin A生物合成的负调控因子，SCAB_75421基因的缺失可以用于定向提高疮痂病链霉菌中thaxtomin A的生物合成产量。
附图说明
图1是SCAB_75421基因及其邻近基因在疮痂病链霉菌染色体上的位置信息图；
图2是利用自杀型质粒pUCTSR和同源重组技术构建缺失突变株的示意图；
图3是ΔSCAB_75421缺失突变株PCR验证示意图(图中，用硫链丝菌素抗性基因tsr替换疮痂病链霉菌染色体上SCAB_75421基因，1代表阳性对照1580bp，2代表阴性对照453bp，3代表阳性克隆的PCR克隆扩增条带与1大小相同，M代表5000bp DNA Marker)；
图4是疮痂病链霉菌原始菌株87.22和疮痂病链霉菌系列菌株发酵产物中thaxtomin A产量分析图(具体包括原始菌株疮痂病链霉菌87.22、缺失突变株ΔSCAB_75421、回补菌株ΔSCAB_75421/pIB-75421及其空载对照菌株ΔSCAB_75421/pIB139发酵液中thaxtomin A产量的HPLC分析)；
图5是ΔSCAB_75421缺失突变株的生物量分析图(具体包括原始菌株疮痂病链霉菌87.22和缺失突变株ΔSCAB_75421发酵过程中菌体干重的分析)；
图6是疮痂病链霉菌原始菌株87.22和疮痂病链霉菌系列菌株的孢子生长情况分析图(具体包括原始菌株疮痂病链霉菌87.22、缺失突变株ΔSCAB_75421、回补菌株ΔSCAB_75421/pIB-75421及其空载对照菌株ΔSCAB_75421/pIB139在SFM平板上的产孢情况)；
图7是原始菌株疮痂病链霉菌87.22与ΔSCAB_75421缺失突变株中thaxtomin A生物合成相关基因的转录分析(具体包括thaxtomin A生物合成基因簇基因txtR、txtA、txtE的24h与48h转录分析)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所使用的菌株和质粒见表1，所使用的引物序列见表2。
下述实施例中所使用的大肠杆菌在液体LB培养基或在添加2.0％琼脂的LB固体平板上于37℃进行培养。疮痂病链霉菌87.22菌株在TSB培养基或在含有2％琼脂的SFM固体平板上于28℃进行培养，疮痂病链霉菌发酵生产thaxtomin A时所用培养基为OBB液体发酵培养基，于28℃进行培养。大肠杆菌和疮痂病链霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由通用生物系统(安徽)有限公司完成。
表1本发明实施例中所使用的菌株和质粒
表2本发明实施例中所用引物
实施例1
SCAB_75421基因相关信息：
SCAB_75421基因以及其邻近基因在疮痂病链霉菌染色体上的位置信息，参见图1。
SCAB_75421基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
实施例2
ΔSCAB_75421缺失突变株的构建(参见图2)：
以疮痂病链霉菌基因组为模板，利用75421-UF/R和75421-DF/R作为引物，PCR扩增出SCAB_75421基因部分的上下游1500bp同源片段，并将目的片段回收；分别用HindIII/XbaI和KpnI/EcoRI双酶切上下游片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段后，克隆至pUCTSR质粒，得到重组质粒pUCTSR-ΔSCAB_75421；对pUCTSR-ΔSCAB_75421进行双酶切验证。具体引物序列见表2，表2中标记下划线的“AAGCTT”、“TCTAGA”、“GGATCC”和“GAATTC”序列分别为限制性内切酶HindIII、XbaI、KpnI和EcoRI的酶切位点。
将构建好的重组质粒转入大肠杆菌ET12567(pUZ8002)中，通过跨属接合转移技术将质粒pUCTSR-ΔSCAB_75421转化至疮痂病链霉菌87.22中；利用硫链丝菌素筛选具有抗性的阳性突变株，并通过引物75421-C-F/R对挑取的菌株进行PCR分析；将验证成功的阳性菌株命名为ΔSCAB_75421(图3)。
实施例3
回补菌株以及回补空载菌株的构建：
以疮痂病链霉菌基因组为模板，利用引物75421-CF/R，PCR扩增出完整的SCAB_75421基因片段，同时两侧分别引入EcoRI和HindIII酶切位点。经琼脂糖凝胶回收PCR产物，连接到载体质粒pIB139，得到重组质粒pIB-75421；双酶切验证重组质粒构建成功，将重组质粒pIB-75421和空载质粒pIB139转化至ET12567(pUZ8002)感受态中；通过接合转移后，将pIB-75421和pIB139导入缺失突变株ΔSCAB_75421中，用安普霉素筛选具有抗性的接合子；经PCR验证后，得到正确的回补菌株ΔSCAB_75421/pIB-75421和回补空载菌株ΔSCAB_75421/pIB139。
实施例4
疮痂病链霉菌系列菌株中thaxtomin A产量的检测：
将平板上长势相同的疮痂病链霉菌87.22和ΔSCAB_75421系列菌株(缺失突变株ΔSCAB_75421、回补菌株ΔSCAB_75421/pIB-75421以及回补空载菌株ΔSCAB_75421/pIB139)的孢子接种至TSB种子瓶内，摇床温度28℃，转速220rpm振荡培养2天，再转接至OBB液体培养基内，28℃，220rpm振荡培养7天。待发酵结束后对发酵液中的thaxtomin A进行萃取和HPLC分析，利用thaxtomin A标准曲线计算得到产量。
实施例5
疮痂病链霉菌系列菌株孢子生长情况的观察：
为了明确SCAB_75421基因是否影响菌体孢子的形成，将原始菌株87.22和疮痂病链霉菌系列菌株(缺失突变株ΔSCAB_75421、回补菌株ΔSCAB_75421/pIB-75421以及回补空载菌株ΔSCAB_75421/pIB139)同时涂布于SFM平板上，培养箱28℃倒置培养，观察孢子生长情况。
实施例6
疮痂病链霉菌87.22与ΔSCAB_75421中thaxtomin A生物合成相关基因的转录分析：
利用TaKaRa RNA提取试剂盒，将发酵过程中的疮痂病链霉菌87.22和突变菌株ΔSCAB_75421进行RNA提取，反转录成cDNA后，使用实时荧光定量PCR分析thaxtomin A生物合成相关基因的转录水平。
实施例7
上述各实施例的具体实验结果分析：
1、SCAB_75421基因缺失后thaxtomin A产量显著提高
SCAB_75421基因缺失突变株ΔSCAB_75421在OBB液体培养基中发酵7天，萃取后经HPLC分析，thaxtomin A产量比原始菌株87.22的产量提高62.8％(图4)，表明SCAB_75421基因与thaxtomin A生物合成呈负调控关系。
发酵过程中，每天对发酵的菌体进行取样并测定生物量，结果表明ΔSCAB_75421缺失突变株与原始菌株87.22的菌体量几乎没有差异(图5)，表明SCAB_75421的缺失对菌体生长几乎没有影响，即SCAB_75421的缺失对thaxtomin A产量的影响，不是通过影响菌体生长而产生的。
2、SCAB_75421基因回补
为了确定缺失突变株ΔSCAB_75421的表型完全是由SCAB_75421基因突变引起的，本发明构建了SCAB_75421基因的回补实验；pIB-75421利用红霉素抗性基因强启动子PermE*起始SCAB_75421基因的转录表达，用于突变株ΔSCAB_75421的回补。经发酵和HPLC分析，回补菌株ΔSCAB_75421/pIB-75421中thaxtomin A产量恢复到与原始菌株87.22的相一致水平(图4)。
3、SCAB_75421基因缺失后不影响菌株的形态分化
为了明确SCAB_75421基因是否影响菌体孢子的形成，将原始菌株87.22、缺失突变株ΔSCAB_75421、回补菌株ΔSCAB_75421/pIB-75421以及回补空载菌株ΔSCAB_75421/pIB139同时涂布于SFM平板上，培养箱28℃倒置培养，观察孢子生长情况。
结果显示，相对于原始菌株87.22，缺失突变株ΔSCAB_75421、回补菌株ΔSCAB_75421/pIB-75421以及回补空载菌株ΔSCAB_75421/pIB139的孢子形态无明显差异(图6)，说明SCAB_75421的缺失不影响疮痂病链霉菌孢子的形成。
4、SCAB_75421基因负调控thaxtomin A生物合成基因的转录
qRT-PCR的结果证明，相比出发菌株87.22，缺失突变株ΔSCAB_75421中，24h和48h时thaxtomin A生物合成基因簇上的基因txtR、txtA、txtE的表达量都具有显著提高(图7)，表明SCAB_75421基因的缺失可以造成thaxtomin A生物合成相关基因的转录水平显著上升，从而提高thaxtomin A的产量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种通过疮痂病链霉菌SCAB_75421基因提高thaxtomin A产量的方法，其特征在于，通过基因工程途径在疮痂病链霉菌中对SCAB_75421基因进行缺失，获得疮痂病链霉菌thaxtomin A高产菌株，利用所得菌株生产thaxtomin A；其中，所述SCAB_75421基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的通过疮痂病链霉菌SCAB_75421基因提高thaxtomin A产量的方法，其特征在于，所述SCAB_75421基因属于Lrp家族转录调控蛋白。
3.根据权利要求1所述的通过疮痂病链霉菌SCAB_75421基因提高thaxtomin A产量的方法，其特征在于，所述在疮痂病链霉菌中对SCAB_75421基因进行缺失的步骤中，采用的疮痂病链霉菌具体为疮痂病链霉菌87.22菌株，通过自杀型质粒pUCTSR和同源重组技术来实现基因的缺失。
4.根据权利要求1～3任一所述的通过疮痂病链霉菌SCAB_75421基因提高thaxtomin A产量的方法，其特征在于，所述SCAB_75421基因的表达产物用于负调控thaxtomin A的生物合成。
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