CN117653603A - 一种单萜香豆素衍生物纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，公开了一种单萜香豆素衍生物纳米制剂及其制备方法和应用。所述单萜香豆素衍生物纳米制剂，包括：蛋白复合物和阳离子材料；所述蛋白复合物，包括：单萜香豆素衍生物和血清白蛋白；所述单萜香豆素衍生物的结构式为所述单萜香豆素衍生物纳米制剂可以通过阳离子材料对上皮紧密连接的调控作用进入体内，然后通过血清白蛋白在肿瘤微环境响应及SPARC介导的靶向摄取作用下实现对单萜香豆素衍生物的高效装载及肿瘤靶向精准递送。可应用于制备膀胱癌、结肠癌、肺癌等恶性肿瘤的灌注治疗和原位注射治疗的药物中。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种单萜香豆素衍生物纳米制剂及其制备方法和应用。
背景技术
香豆素衍生物是众多药用植物的活性成分，具有多种药理活性，其化学结构存在于很多抗肿瘤活性化合物中，被称为癌症化学预防剂。但其水溶性较差，几乎不溶解于水，生物利用率低下，无法作为常规药物使用。而在其结构上修饰亲水基团以增强水溶性则可能改变其药理活性。
因此，现有技术有待改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种单萜香豆素衍生物纳米制剂及其制备方法和应用，以解决香豆素衍生物生物利用率低下的问题，使其能够应用于恶性肿瘤的灌注治疗和原位注射治疗中。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种单萜香豆素衍生物纳米制剂，其中，包括：蛋白复合物和阳离子材料；
所述蛋白复合物，包括：单萜香豆素衍生物和血清白蛋白；
所述单萜香豆素衍生物的结构式为
具体的，单萜香豆素衍生物UM-15：((Z)-7-((3′,7′-dimethylocta-2′,6′-dien-1′-yl)oxy)-5-hydroxy-4-methyl-2H-chromen-2-one)不仅对膀胱癌细胞株表现出增殖抑制，同时可对具有干性特征的肿瘤细胞表现出选择性干性抑制作用，但其水溶性较差，几乎不溶解于水。因此，发明人将其制备成纳米制剂，实现高效装载及肿瘤靶向精准递送。
以下作为本发明的优选技术方案，但不作为对本发明提供的技术方案的限制，通过以下优选的技术方案，可以更好的达到和实现本发明的目的和有益效果。
作为优选的技术方案，所述血清白蛋白为人血清蛋白(HSA)、牛血清蛋白(BSA)和RSA(Ras蛋白是小型GTP结合蛋白大家族中的一员，是由190个氨基酸残基组成的小型GTP结合蛋白，具有GTP水解酶活性，分布于质膜胞质一侧)中的一种或多种；优选的，所述血清白蛋白为HSA。
具体的，不同于其它蛋白载体，以血清白蛋白为基础的制剂在体内的循环和分布可能受到包括细胞表面糖蛋白(Gp18、Gp30、Gp60)、酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白(SPARC)、新生儿Fc受体(FcRn)和Cubilin/Megalin复合物等多种白蛋白结合蛋白的共同调控。其中，SPARC也被称为骨黏连蛋白，其在膀胱癌、肺癌等恶性肿瘤细胞和肿瘤微环境中高表达，关于SPARC介导的白蛋白肿瘤靶向递送体系的研究已有报道。同时，血清白蛋白可通过巨胞饮识别被肿瘤细胞摄取。正常情况下，血清白蛋白在体内不被正常细胞作为能量物质吸收和代谢。然而，在RAS突变的肿瘤细胞中，血清白蛋白通过巨胞饮作用被摄取作为氨基酸来源，这是载药血清白蛋白在肿瘤中大量积累的重要可能机制，初步证实其潜在的肿瘤靶向优势。临床研究发现，膀胱癌、肺癌等多种肿瘤细胞SPARC的表达远远高于癌旁正常组织，肿瘤细胞SPARC可通过受体结合转运模式增加血清白蛋白体系的摄取，实现药物体系的肿瘤靶向递送。
作为优选的技术方案，所述阳离子材料为氟化壳聚糖、壳聚糖、聚乙烯亚胺、氟化聚乙烯亚胺中的一种或多种；优选的，所述辅佐透粘膜阳离子材料为氟化壳聚糖。
具体的，在前期的研究(CN 113730332 A)中，发明人以天然高分子多糖-壳聚糖为分子骨架，设计制备出具有良好生物安全性能的新型膀胱灌注载体-氟化壳聚糖(FCS)，证实其可通过对膀胱上皮细胞紧密连接的可逆调控改善灌注药物经细胞旁路途径的吸收效率及肿瘤组织中的渗透性，并通过“疏水疏油”特性促进药物的胞吞，同时降低阳离子聚合载体的毒副作用，提高灌注药物的治疗效果，证实FCS是一种具有很好临床应用转化前景的新型生物大分子药物灌注载体。
作为优选的技术方案，所述单萜香豆素衍生物和所述血清白蛋白通过所述血清白蛋白内的二硫键组装。
具体的，发明人基于传统“烫发”蛋白质二硫键重构原理，经简单的加热退火操作制备通过血清白蛋白内二硫键组装形成的蛋白复合物，该蛋白复合物可以实现在二硫键形成的过程中对溶液中小分子模型药物单萜香豆素衍生物的高效装载。
作为优选的技术方案，所述蛋白复合物表面带负电荷，与所述阳离子材料通过静电吸附作用自组装。
具体的，血清白蛋白载药前后其表面均带负电荷，可与阳离子材料通过静电作用自组装形成新的表面带正电荷的单萜香豆素衍生物纳米制剂。
作为优选的技术方案，所述血清白蛋白和所述阳离子材料的投料重量比为1:1～2；优选的，所述血清白蛋白和所述阳离子材料的投料重量比为1:1。
具体的，在所述血清白蛋白和所述阳离子材料的投料重量比为1:1时，所述单萜香豆素衍生物纳米制剂的粒径较小且分布最均匀。
一种如上所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂的制备方法，其中，包括：
将蛋白复合物与阳离子材料在水溶液中混合搅拌，得到所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂。
作为优选的技术方案，所述蛋白复合物的制备方法，包括：
将血清白蛋白溶于超纯水中，调节PH值至7.2～7.4，使血清白蛋白浓度为8～10mg/ml，如8mg/ml，9mg/ml，10mg/ml；在60～70℃水浴加热7～9min，得到血清白蛋白水溶液；
将单萜香豆素衍生物溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液中，超声分散后，逐滴加入所述血清白蛋白水溶液中，冰水浴搅拌自组装，超滤，离心，弃沉淀，得到所述蛋白复合物。
一种如上所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂在制备恶性肿瘤灌注治疗药物中的应用。
一种如上所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂在制备恶性肿瘤原位注射治疗药物中的应用。
作为优选的技术方案，本发明制备得到的单萜香豆素衍生物纳米制剂，可以应用于膀胱癌、结肠癌、肺癌等恶性肿瘤。
有益效果：本发明提供一种单萜香豆素衍生物纳米制剂及其制备方法和应用，所述单萜香豆素衍生物纳米制剂灌注到膀胱或腹腔中后，首先通过阳离子材料对上皮紧密连接的调控作用进入体内，然后通过血清白蛋白在肿瘤微环境响应及SPARC介导的靶向摄取作用下实现对单萜香豆素衍生物的高效装载及肿瘤靶向精准递送，显著提高了单萜香豆素衍生物的生物利用度，可应用于膀胱癌、结肠癌、肺癌等恶性肿瘤的灌注治疗和原位注射治疗中。
附图说明
图1为本发明单萜香豆素衍生物纳米制剂的制备方法流程图；
图2为单萜香豆素衍生物UM-15的核磁一维氢谱图；
图3为UM-15@HSAs-s/FCS和UM-15@HSA/FCS冻干前后PDI的检测结果图；
图4为UM-15@HSAs-s/FCS和UM-15@HSA/FCS冻干前后载药量的检测结果图；
图5为不同投料重量比得到的UM-15@HSAs-s/FCS和UM-15@HSA/FCS的电势和粒径检测结果图；
图6为UM-15@HSAs-s/FCS的肿瘤微环境响应性检测结果图；
图7为UM-15@HSAS-S/FCS的透膀胱黏膜性能检测结果图；
图8为UM-15@BSAs-s/FCS的小鼠体内灌注治疗效果图。
具体实施方式
本发明提供了一种单萜香豆素衍生物纳米制剂及其制备方法和应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的具体详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。
实施例1
本实施例为香豆素衍生物UM-15的制备。
UM-15的合成路线如下：
取1.26g间苯三酚，加入1.32g乙酰乙酸乙酯、1.53g POCl3，在40℃反应1h生成中间体4-甲基-5，7-二羟基香豆素(15-c)。在15-c中加入1.72g(Z)-1-溴-3,7-二甲基辛烷-2,6-二烯，50mL超干丙酮，室温反应2.5小时，得到香豆素衍生物UM-15。通过硅胶色谱柱对产物进行进一步的纯化处理即可获得UM-15，经1H NMR以及13CNMR鉴定其化学结构。UM-15的1H NMR如图2所示。
实施例2
本实施例为UM-15@HSAs-s和UM-15@HSA的制备。
(1)UM-15@HSAs-s的制备
HSA溶于超纯水中，调节PH值至7.4，使HSA浓度为9mg/mL，在65℃水中水浴加热8min。1mg UM-15溶于0.5mL DMSO溶液中，超声分散之后将其缓慢、逐滴加入至加热后的HSA水溶液中，立即在冰水中冷却降温，与此同时，在磁力搅拌机上搅拌2h进行自组装。搅拌结束后，将混悬液用30kDa的超滤管浓缩并去除DMSO，4000rpm离心10min，弃沉淀，得到UM-15@HSAs-s混悬液。
(2)UM-15@HSA的制备
HSA溶于超纯水中，调节PH值为7.4，使HSA浓度为9mg/mL，1mg UM-15溶于0.5mLDMSO溶液中，超声分散之后将其缓慢、逐滴加入至HSA水溶液中，搅拌10分钟后，4000rpm离心10min，弃沉淀，将混悬液用30kDa的超滤管浓缩并去除DMSO，得到UM-15@HSA混悬液。
实施例3
本实施例为UM-15@HSAs-s和UM-15@HSA包封率和载药量的检测实验。
制备过程中，取超滤后滤网外的液体，经0.22μM过滤器过滤，作为待测HPLC溶液，离心后的沉淀经1mL DMSO溶解后作为待测HPLC溶液。制备后得到的UM-15@HSAs-s和UM-15@HSA混悬液经冻干之后，称取10mg粉末，溶解于1mL的DMSO中，作为待测HPLC溶液。
经HPLC测定，UM-15@HSAs-s中UM-15的包封率EE＝86.3±5.7％，载药量DL＝18.9±2.0％；UM-15@HSA中UM-15的包封率EE＝19.8±1.7％，载药量DL＝4.2±0.8％。
实施例4
本实施例为UM-15@HSAs-s/FCS和UM-15@HSA/FCS的制备。
(1)UM-15@HSAs-s/FCS的制备
将等体积含有9mg/mLFCS的溶液加入实施例2中的UM-15@HSAs-s混悬液中，继续搅拌1h，随后14800rpm离心30min后，去除上层液体，反复清洗两次后将沉淀冻干形成冻干粉，得到UM-15@HSAs-s/FCS。
(2)UM-15@HSA/FCS的制备
将等体积含有9mg/mLFCS的溶液加入实施例2中的UM-15@HSA混悬液中，继续搅拌1h，随后14800rpm离心30min后，去除上层液体，反复清洗两次后将沉淀冻干形成冻干粉，得到UM-15@HSA/FCS。
实施例5
本实施例为UM-15@HSAs-s/FCS和UM-15@HSA/FCS冻干前后PDI和载药量的检测实验。
制备后得到的UM-15@HSAs-s/FCS和UM-15@HSA/FCS混悬液经冻干之后，称取10mg粉末，溶解于1mL的DMSO中，作为待测HPLC溶液，用作计算载药量；称取10mg粉末，溶解于1ml的纯水中，使用纳米粒度及Zeta电位分析仪分析粒径大小及PDI。
结果如图3和图4所示，与UM-15@HSA/FCS载药体系相比，UM-15@HSAs-s/FCS体系冻干前后PDI和UM-15载药量均无明显变化，说明HSAs-s/FCS载药体系良好的冻干稳定性。
实施例6
本实施例为UM-15@HSAs-s和FCS投料重量比对UM-15@HSAs-s/FCS自组装的影响实验。
为了确定纳米制剂自组装的最佳技术方案，我们考察了不同投料重量比的UM-15@HSAs-s和FCS对UM-15@HSAs-s/FCS自组装的影响，对不同投料重量比得到的UM-15@HSAs-s/FCS的电势和粒径进行检测。其中，UM-15@HSAs-s和FCS的投料重量比分别为4:1、2:1、1:1、1:2，除UM-15@HSAs-s和FCS的投料重量比不同外，其他制备操作均与实施例4相同。
结果如图5所示，UM-15@HSAs-s本身带负电，随着FCS投料重量比增加，UM-15@HSAs-s/FCS表面电荷增加，并在投料比1:1时粒径较小且分布最均匀。该实验证实了体系的形成，并确定了最优投料重量比。
实施例7
本实施例为UM-15@HSAs-s/FCS在肿瘤微环境中的响应性检测实验。
取20μL的UM-15@HSAs-s水溶液分别稀释于2mL pH为5.5、6.5、7.4、7.8的水溶液中，经纳米粒度及Zeta电位分析仪分析zeta电位。
取20μL的UM-15@HSAs-s/FCS分别稀释于pH为6.5含10mM GSH的水溶液、pH为6.5的水溶液、含10mM GSH的水溶液、pH为7.4的水溶液，经纳米粒度及Zeta电位分析仪分析纳米粒径。
取2mL的UM-15@HSAs-s/FCS置于透析袋(截留分子量3500)中，透析袋分别至于30mL的pH为5.5含10mM GSH的水溶液、pH为5.5的水溶液、含10mM GSH的水溶液、pH为7.4的水溶液中，时间点取50μL透析袋外溶液待测HPLC，检测药物浓度。
结果如图6所示，UM-15@HSAs-s在肿瘤酸性微环境中(Ph＜6.5)会发生电荷翻转，并在酸性、高GSH(5.0mM)发生体系的崩解，因而导致UM-15@HSAs-s/FCS的崩散及释药速率显著增加。图6中数据表明，UM-15@HSAs-s/FCS具有肿瘤微环境响应性释药的特性。
实施例8
本实施例为UM-15@HSAs-s/FCS的透膀胱黏膜性能检测实验。
通过C57BL/6雌性小鼠MB49原位肿瘤灌注实验，评价UM-15@HSAs-s/FCS的透膀胱黏膜性能。在健康的8周的C57BL/6雌性小鼠膀胱壁注射MB49细胞(6×105/个)，一周后将其随机分为3组，每组4只。麻醉后分别经尿道灌注Cy5.5荧光标记的HSA、UM-15@HSAs-s、UM-15@HSAs-s/FCS(HSA 0.1mg/mL，100μL)1小时，随后收集小鼠膀胱制备冰冻切片，并通过荧光共聚焦显微镜对其进行成像分析。
结果如图7所示，相比其他对照组，UM-15@HSAs-s/FCS组小鼠膀胱中Cy5.5的荧光强度更强，组织渗透深度更好，表明其更显著的膀胱上皮黏膜渗透性。
实施例9
本实施例为UM-15@HSAs-s/FCS的体内抗肿瘤效果评价实验。
将健康C57BL/6雌性小鼠(18-20g)分为两组，每组5只，通过膀胱壁注射fLuc-MB49细胞(5×105个)建立膀胱癌原位模型，接种两天后进行小鼠活体成像观察确认肿瘤模型的建立，随后小鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，分别膀胱灌注PBS,UM-15,UM-15@HSAs-s,UM-15@HSAs-s/FCS(UM-15 1.0mg/kg)1小时，分别在0,、7、14、21天各灌注一次，共治疗四次，每周治疗前通过生物发光成像系统对其原位肿瘤大小进行检测。
结果如图8所示，其中，b-c为各组膀胱原位肿瘤的生物发光成像及荧光强度，d-e分别为小鼠的生存曲线和体重变化情况。结果显示，UM-15@HSAs-s/FCS灌注具有最显著的抑瘤效果及灌注安全性，因此推断HSAs-s/FCS灌注载体可以改善灌注药物安全性的同时，提升其抗肿瘤效果。
综上所述，本发明提供一种单萜香豆素衍生物纳米制剂及其制备方法和应用。所述单萜香豆素衍生物纳米制剂，包括：蛋白复合物和阳离子材料；所述蛋白复合物，包括：单萜香豆素衍生物和血清白蛋白。通过对单萜香豆素衍生物进行改性，即与阳离子材料进行组装，形成纳米制剂，先通过阳离子材料对上皮紧密连接的调控作用进入体内，然后通过血清白蛋白在肿瘤微环境响应及SPARC介导的靶向摄取作用下实现对单萜香豆素衍生物的高效装载及肿瘤靶向精准递送，显著提高了单萜香豆素衍生物的生物利用度，可应用于膀胱癌、结肠癌、肺癌等恶性肿瘤的灌注治疗和原位注射治疗中。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种单萜香豆素衍生物纳米制剂，其特征在于，包括：蛋白复合物和阳离子材料；
所述蛋白复合物，包括：单萜香豆素衍生物和血清白蛋白；
所述单萜香豆素衍生物的结构式为
2.根据权利要求1所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂，其特征在于，所述血清白蛋白为HSA、BSA和RSA中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂，其特征在于，所述阳离子材料为氟化壳聚糖、壳聚糖、聚乙烯亚胺、氟化聚乙烯亚胺中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂，其特征在于，所述单萜香豆素衍生物和所述血清白蛋白通过所述血清白蛋白内的二硫键组装。
5.根据权利要求1所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂，其特征在于，所述蛋白复合物表面带负电荷，与所述阳离子材料通过静电吸附作用自组装。
6.根据权利要求1所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂，其特征在于，所述血清白蛋白和所述阳离子材料的投料重量比为1:1～2。
7.一种如权利要求1-6任一项所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括：
将蛋白复合物与阳离子材料在水溶液中混合搅拌，得到所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂。
8.根据权利要求7所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述蛋白复合物的制备方法，包括：
将血清白蛋白溶于超纯水中，调节PH值至7.2～7.4，使血清白蛋白浓度为8～10mg/mL，在60～70℃水浴加热7～9min，得到血清白蛋白水溶液；
将单萜香豆素衍生物溶于DMSO溶液中，超声分散后，逐滴加入到所述血清白蛋白水溶液中，冰水浴搅拌自组装，超滤，离心，弃沉淀，得到所述蛋白复合物。
9.一种如权利要求1-6任一项所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂在制备恶性肿瘤灌注治疗药物中的应用。
10.一种如权利要求1-6任一项所述的单萜香豆素衍生物纳米制剂在制备恶性肿瘤原位注射治疗药物中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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