CN114224823A - 一种集化疗/光动力治疗/化学动力治疗“三位一体”的脑胶质瘤递药系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种集化疗/光动力治疗/化学动力治疗“三位一体”的脑胶质瘤递药系统及其制备方法。该递药系统是将包载有自发光光敏剂分子的RGD多肽修饰的脑胶质瘤靶向紫杉醇前药纳米粒和过氧化铜纳米点分散在温度敏感型水凝胶基质材料的三维骨架中。该体系集化疗/光动力治疗/化学动力治疗“三位一体”，协同提高胶质瘤术后治疗效果，有效降低脑胶质瘤术后复发的风险。

Description

一种集化疗/光动力治疗/化学动力治疗“三位一体”的脑胶质 瘤递药系统及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种温敏凝胶装载的三联靶向纳米递释系统，具体涉及新型术后胶质瘤治疗凝胶递药系统及其制备方法。
背景技术
脑胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)肿瘤，约占所有原发性CNS肿瘤的80％。脑胶质瘤恶性程度高，治疗效果不理想，预后极差且死亡率极高，其中位生存期小于18个月，5年生存率不足3％。世卫组织数据显示，脑胶质瘤成为35岁以下中青年第2号肿瘤杀手。目前脑胶质瘤在临床上主要以外科切除为主。然而，胶质瘤多生长在重要脑功能区，极大地限制了外科手术范围，且胶质瘤细胞呈浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，所以外科手术难度大，不可能完全切除肿瘤细胞，残留的少量浸润胶质瘤细胞和因手术激活的休眠期胶质瘤细胞迅速进入增殖期，造成术后短期内肿瘤复发而导致死亡。因此，胶质瘤术后综合治疗显得至关重要，其成败直接影响患者的生活质量和预后。
光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)是使用肿瘤定位光敏剂(Photosensitizer，PS)，用特定波长的光对肿瘤进行局部照射以激活PS。被激发的PS将其能量转移给分子氧，从而产生单线态氧等细胞毒性活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，它可以氧化关键细胞大分子导致肿瘤细胞凋亡。大量研究表明，PDT对实体肿瘤具有很好的治疗前景。然而大多数现有光敏剂的临床转化在很大程度上受到激活它们所需的外部光穿透深度的限制。尤其对于脑胶质瘤，外部激发光穿透过颅骨及脑组织达到病灶面临极大的挑战。为了克服这一障碍，可以采取自发光PDT用于深部肿瘤治疗。在这种方式下，光敏剂被肿瘤微环境触发的内部化学发光或生物发光激发，产生ROS杀死癌细胞。鲁米诺作为常见的一种化学发光试剂，在过氧化氢(H2O2)和金属离子(铁、铜等)催化下可自发产生蓝光。所以，以鲁米诺作为供体，通过生物发光共振能量转移作用(Bioluminescenceresonance energy transfer，BRET)将能量转移给第二代光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)，以产生细胞毒性活性氧杀伤术后残留的胶质瘤细胞。自发光PDT治疗肿瘤上具有原位自发光，供体受体一体化，无需考虑外部激发光穿透等其他PDT不具备的优点，具有相当大的应用潜力。
要将自发光PDT系统中的鲁米诺原位激发出光源，需要两个条件，H2O2和金属离子。与正常细胞相比，肿瘤细胞独特的细胞增殖活性、代谢活性和线粒体功能失常会促进H2O2的产生，然而随着PDT的进行，H2O2逐渐被消耗，不利于鲁米诺的激发。此外，金属离子催化剂仍需要解决。有研究表明，过氧化铜纳米点(CP-NDs)被肿瘤细胞内吞后，CP-NDs在酸性的胞内体/溶酶体中释放出铜离子，同时通过类芬顿反应产生高细胞毒性的羟基自由基(·OH)对肿细胞产生杀伤作用，即为化学动力学疗法(Chemodynamic Therapy，CDT)。因此，CP-NDs与鲁米诺-Ce6自发光PDT联用，既可以补充自发光PDT所需的金属催化剂和H2O2，又可以利用CP-NDs本身的CDT杀死术后残留的胶质瘤细胞。
紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是目前已发现最优秀的天然抗癌药物，体外显示出非常强的胶质瘤细胞毒性，但由于血脑屏障(Blood-Brain-Barrier,BBB)通透性差，体内起不到抗胶质瘤效果。所以目前对PTX抗胶质瘤研究主要集中在PTX脑靶向递药系统开发上。我们前期构建了一种胶质瘤细胞归巢肽修饰的PTX前药自组装纳米粒(PTX-NPs)。该纳米粒在胶质瘤细胞过表达的白介素13受体α2(IL13Rα2)介导下，增加胶质瘤细胞的摄取，并且具有超高载药量(PTX载药量高达56.6％)，生理环境下不泄露，在胞内还原性谷胱甘肽(Glutathione,GSH)刺激下响应性释放PTX，同时也能通过消耗GSH提高肿瘤微环境的氧化水平，强化PDT的效果。然而，即使修饰了靶向头基，静脉给药后，PTX-NPs分布到脑胶质瘤部位的纳米颗粒仍低于1％。目前临床上为了促进病人手术伤口愈合和避免感染，对胶质瘤术后患者进行全身系统放化疗都是在手术2周后进行。然而，残留的胶质瘤细胞在2周内即可完成1个分裂周期，细胞可能倍增，影响后续治疗效果。全身系统化疗不仅难以克服BBB，而且破坏机体免疫系统，从而加剧胶质瘤微环境的免疫抑制，促进胶质瘤细胞的免疫逃逸。此外，胶质瘤几乎不发生颅外转移，90％的胶质瘤患者手术切除后在手术腔2-3cm范围内复发而导致死亡。鉴于此，胶质瘤术后腔内局部综合治疗极具潜力。它具有如下优点：绕开了BBB的屏障，使药物直达病灶，避免了对机体正常组织的毒副作用；克服了脑室或瘤内给药压力大、空间小、操作不便和导致机体二次手术创伤等缺点；手术一结束，化疗即开始，降低了手术到化疗时间空窗期肿瘤细胞增殖而带来化疗失败的风险。1996年，美国FDA批准了Guilford公司的卡莫司汀(Bis-chloroethyltrosourea，BCNU)植入晶片(Gliadel wafer)，用于脑胶质瘤术后腔内局部化疗。该晶片是由7.7mg BCNU分散在192.3mg的Polifeprosan20聚合物中形成的植入剂。然而，其临床疗效和安全性饱受争议，主要存在以下缺点：药物释放过快；操作不便(外科医生需要植入多个晶片，容易导致易位而堵塞脑室)；引起严重的术后并发症(包括癫痫、颅内脓肿、脑膜炎、脑脊髓漏和伤口愈合异常等)。所以，研究更加安全、长效和给药方便的胶质瘤术后腔内制剂具有重大的社会意义和临床价值。
原位凝胶是一种具有三维网络结构的聚合物，在用药部位立即发生物理或化学交联，由液态转变成半固体凝胶的药物新剂型，广泛应用于缓控释给药系统，对胶质瘤术后腔内局部治疗具有很大的应用潜力。羟丙基甲壳素水凝胶是一种常用温度敏感原位凝胶，在室温或低于室温时为可流动的溶胶态，当温度接近体温则固化为凝胶，在局部缓慢释放药物。由于具有良好的生物相容性，亲水性，可注射性，注射后能够流入并填充于手术空腔，在体温刺激下交联成凝胶药物储库，维持药物的缓慢释放，胶凝过程不会发生明显的体积变化而与手术空腔完全吻合等优点，羟丙基甲壳素原位温敏凝胶在胶质瘤术后腔内局部治疗中具有很好的应用前景。
发明内容
本发明目的是，鉴于目前光敏剂用于胶质瘤存在的缺陷，提供一种自发光光敏剂的制备方法，配合上包覆有靶向肽RGD的紫杉醇前药纳米粒，可以为光动力治疗提供必要的光源，并且联合化学动力学和化疗的联合治疗方案。通过温敏水凝胶缓控释制剂，延长药物体内的释放时间，增加药物在脑胶质瘤部位的蓄积，提高抗胶质瘤疗效，降低毒副作用，达到靶向治疗增效目的。
本发明具体涉及一种集化疗/光动力治疗/化学动力治疗“三位一体”的脑胶质瘤递药系统及其制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
所述的集化疗/光动力治疗/化学动力治疗“三位一体”的脑胶质瘤递药系统是由RGD多肽修饰PTX前药纳米粒、自发光光敏剂分子、过氧化铜纳米点及温度敏感型水凝胶基质材料构成，优选温度敏感型水凝胶基质材料为羟丙基甲壳素。羟丙基甲壳素起到骨架支撑的作用。
该递药系统是将包载有自发光光敏剂分子(以下简称CL小分子)的RGD多肽修饰的脑胶质瘤靶向紫杉醇(PTX)前药纳米粒和过氧化铜纳米点分散在温度敏感型水凝胶基质材料的三维骨架中。其中，所述的自发光光敏剂分子是通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺反应得到。
所述的温度敏感型水凝胶基质材料为羟丙基甲壳素水凝胶基质材料。
上述集化疗/光动力治疗/化学动力治疗的脑胶质瘤术后递药系统的制备方法，其特征在于该方法将包载有自发光光敏剂分子的RGD多肽修饰的脑胶质瘤靶向紫杉醇前药纳米粒和过氧化铜纳米点按质量比1：1的比例混匀后，加入5％的羟丙基甲壳素水凝胶基质材料，4℃充分溶胀后，搅拌均匀。
所述的羟丙基甲壳素水凝胶基质材料是通过以下方法制备得到的：称取11g氢氧化钠和4g尿素，加入85ml蒸馏水，搅拌溶解，-在-20℃预冷4小时；称取4g甲壳素粉末分散于其中，-30℃机械搅拌2小时，-70℃冷冻6小时，转移到-20℃解冻4小时，继续溶解；溶解过程中每2～3小时取出进行搅拌，保证甲壳素分散均匀；冷冻48-72小时，将得到的样品在4℃中加入环氧丙烷10.6mL，密封好后机械搅拌反应1小时，再加环氧丙烷10mL反应1小时，最后10℃反应24h，用3mol/L稀盐酸10℃调节pH至中性以终止反应，加水稀释成溶液状，用截留分子量为为10K Da的透析袋透析除去未反应的小分子，透析液冷冻干燥，即得。
所述的过氧化铜纳米点是通过以下方法制备得到的：将0.5g聚乙烯吡咯烷酮溶解在5mL 0.01M的CuCl2·2H2O的水溶液中，然后将5mL 0.02M的NaOH和100μL H2O2依次添加到上述混合物中，搅拌30分钟后，通过超滤收集涂覆有聚乙烯吡咯烷酮的CP纳米点，并用水洗涤几次。
所述的包载有自发光光敏剂分子的RGD多肽修饰的脑胶质瘤靶向紫杉醇前药纳米粒是通过以下方法制备得到的：称取5mg的PTX-SS-C18和5mg的自发光光敏剂分子溶于0.5mL无水二甲亚砜中，在700rpm下室温搅拌，通过微量注射器缓慢将其滴加于去离子水中，搅拌反应25min后，使用截留分子量为10000的透析袋对所得溶液进行透析24小时，后经0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤即得CL@NPPTX；将RGD-PEG2000-DSPE溶于水中，并在室温下与CL@NPPTX搅拌混合(RGD-PEG2000-DSPE/CL@NPPTX＝20/100,w/w)，得到包载有自发光光敏剂分子的RGD多肽修饰的脑胶质瘤靶向紫杉醇前药纳米粒(即胶质瘤靶向纳米粒CL@RNPPTX)。
所述的PTX-SS-C18是通过以下方法制备得到的：将1.0g二硫代甘醇酸与15mL无水乙酸酐混合，在氮气保护下，35℃搅拌反应3h，待反应完全后，旋转蒸发去除乙酸和多余的乙酸酐，旋蒸后的产物溶于二氯甲烷，并加入1.49g的十八醇及65mg DMAP，室温下搅拌反应15h后用1％HAc终止，有机层用无水硫酸钠干燥，粗产物经硅胶柱层析纯化后得到中间体HOOC-CH2-SS-CH2-COOC18，将HOOC-CH2-SS-CH2-COOC18和HBTU在冰浴下溶于二氯甲烷，并逐滴加入N,N-二异丙基乙胺，反应30min后加入200mg PTX，在避光条件下，继续室温反应10h，待反应完全后，混合物先后用1％HAc和纯水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，粗产物经硅胶柱层析纯化，干燥后得到PTX-SS-C18。
RGD-PEG2000-DSPE是通过马来酰亚胺和巯基的缩合制备得到的。
RGD-PEG2000-DSPE具体制备方法为：精确称取10mg的巯基化的RGD多肽溶于1mL磷酸盐缓冲液中，然后称取4mg的Maleimide-PEG2000-DSPE溶于1mL的N,N-二甲基甲酰胺中，将二者先后缓慢滴加至8mL的磷酸盐缓冲液中，磁力搅拌4小时后，用截留分子量为3.5kDa，透析介质为纯水的透析法除去DMF和未反应的巯基化RGD多肽，后经冷冻干燥即得。
所述的自发光光敏剂分子是通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)–活化的缩合反应制备得到的。
所述的缩合反应具体为将50mg(0.08mmol)的Ce6溶于10ml无水DMSO中，依次加入EDC[236mg(1.23mmol)]和NHS[144mg(1.25mmol)]，将反应混合物在避光条件下50℃搅拌17小时；然后将鲁米诺[28mg(0.16mmol)]加入到上述溶液中，继续反应3天后，停止反应，将反应液制砂，使用柱层析法进行分离，流动相比例为氯仿：甲醇：甲酸＝20：1：0.1，旋转蒸发除去溶剂后得黑色固体产物，即为CL小分子。
本发明包载有自发光光敏剂分子的RGD多肽修饰的脑胶质瘤靶向紫杉醇前药纳米粒PTX前药纳米粒是利用二硫代甘醇酸将PTX与十八醇化学键合，得到PTX前药分子PTX-SS-C18，加入二氢卟吩e6(Ce6)和鲁米诺连接合成的自发光光敏剂分子(CL)与PTX-SS-C18共组装形成载药的PTX前药纳米粒，然后将巯基化的RGD多肽与马来酰亚胺-聚乙二-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Maleimide-PEG-DSPE)聚合物通过共价结合连接得到RGD修饰的磷脂(RGD-PEG-DSPE)，再将RGD-PEG-DSPE与制得的载药PTX前药纳米粒按照一定比例混合，即得载有自发光光敏剂CL的RGD靶向紫杉醇前药纳米粒(CL@RNPPTX)，聚乙二醇的分子量为500-5000，巯基化RGD多肽与Maleimide-PEG-DSPE的摩尔比为1～10：1。
本发明的有益效果：本发明构建的集化疗/光动力治疗/化学动力治疗“三位一体”的脑胶质瘤术后温敏水凝胶递药系统以液体形式注射于胶质瘤术后空腔，在体温刺激下交联成凝胶药物储库，缓慢释放CL@RNPPTX和CP-NDs。一方面，释放出的CP-NDs被术后残留胶质瘤细胞内吞后在内函体/溶酶体中产生过氧化氢和铜离子，通过类芬顿反应产生ROS杀伤胶质瘤细胞；另一方面，释放出的CL@RNPPTX在整合素αvβ3的介导下寻靶于浸润的胶质瘤细胞，并被其内吞，在胞内GSH响应下，释放出PTX，杀死胶质瘤细胞，并且消耗GSH强化ROS的细胞毒作用；同时CL@RNPPTX裂解释放出的CL小分子在铜离子和过氧化氢的存在下通过自发光发挥光动力治疗作用。该体系集化疗/光动力治疗/化学动力治疗“三位一体”，协同提高胶质瘤术后治疗效果，有效降低脑胶质瘤术后复发的风险。本项目为胶质瘤术后联合治疗研究提供了新思路，具有重要科学价值和临床前景。
附图说明
图1为CL小分子的核磁共振氢谱表征图。
图2为CL小分子光学性能，其中A为Ce6、鲁米诺和CL小分子的紫外吸收光谱图，B为Ce6和CL的荧光发射光谱，C为Ce6和鲁米诺的荧光发射光谱，D为铜离子加入后的CL极微弱发光图。
图3为RGD-PEG2000-DSPE核磁共振氢谱表征图。
图4为CL@RNPPTX透射电镜图。
图5为U87胶质瘤细胞的摄取荧光图，其中，图A和图B浓度为1μg/mL，图C和图D浓度为2μg/mL，图E和图F浓度为5μg/mL，图A、图C、图E是U87胶质瘤细胞对非靶向纳米粒的摄取情况，图B、图D、图F是U87胶质瘤细胞是对接枝有RGD靶向纳米粒的摄取情况。
图6为过氧化铜纳米点性能表征图，其中A为其扫描透射电镜图，B为紫外可见吸收光谱图，C为粒径分布图，D为加入高锰酸钾后的紫外吸收对比图。
图7为过氧化铜纳米点在脑脊液中的累计释放图。
图8为过氧化铜纳米点酸解产生·OH的能力，其中A为用H2O2、Cu2+或Cu2+加H2O2处理30分钟后的TMB水溶液的紫外可见光谱和照片(插图)，B为TMB法检测过氧化铜纳米点在不同pH值下产生的·OH。
图9为羟丙基甲壳素的核磁共振氢谱表征图。
图10为CP&CL@RNPPTX-Gel的物相及流变学性能，其中A为CP&CL@RNPPTX-Gel在室温和体温条件下的物相，B为CP&CL@RNPPTX-Gel的流变学性能。
图11为CP&CL@RNPPTX-Gel的扫描电镜图。
图12为凝胶系统的体内滞留性，用裸鼠行胶质瘤术后切除手术后，分别于手术腔内注射CP&CL@RNPPTX-Gel和CP&CL@RNPPTX-Sol(分散于水中的溶液)或尾静脉注射CP&CL@RNPPTX-Sol后3，7，14和21天后的脑内荧光成像图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述，具体实施例是在本发明的优选条件下进行。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
实施例1：自发光光敏剂分子(简称CL小分子)的合成
通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)–活化的缩合反应来制备CL小分子。简而言之，将50mg(0.08mmol)的Ce6溶于10ml无水DMSO中，依次加入EDC[236mg(1.23mmol)]和NHS[144mg(1.25mmol)]。将反应混合物在避光条件下50℃搅拌17小时。然后，将鲁米诺[28mg(0.16mmol)]加入到上述溶液中。继续反应，3天后，停止反应，将反应液制砂，使用柱层析法进行分离(流动相比例为氯仿：甲醇：甲酸＝20：1：0.1)，旋转蒸发除去溶剂后得黑色固体产物，即为CL小分子。通过核磁共振氢谱对其结构进行表征。结果如图1所示。
实施例2：CL的光谱学特性考察
通过紫外-可见光分光光度计和荧光分光光度计表征了鲁米诺，Ce6和CL的紫外吸收光谱和荧光激发和发射光谱。
为分析体外CL产生生物发光共振能量转移(BRET)效应的能力，将Cu2+缓慢滴加入含有H2O2的CL溶液中，然后将其置于超微弱光分析仪进行测定，得出随Cu2+加入而变化的发光曲线。结果见图2所示。
实施例3：RGD-PEG2000-DSPE的合成与表征
通过马来酰亚胺和巯基的缩合来制备RGD-PEG2000-DSPE，精确称取10mg的巯基化的RGD多肽溶于1mL磷酸盐缓冲液中，然后称取4mg的Maleimide-PEG2000-DSPE溶于1mL的N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，DMF)中，将二者先后缓慢滴加至8mL的磷酸盐缓冲液中，磁力搅拌4小时后，透析法(截留分子量为3.5kDa，透析介质为纯水)除去DMF和未反应的巯基化RGD多肽，后经冷冻干燥即得RGD-PEG2000-DSPE。通过核磁共振氢谱表征Maleimide-PEG2000-DSPE和所制的RGD-PEG2000-DSPE。结果如图3所示。
实施例4：RDG多肽修饰的胶质瘤靶向载CL小分子的PTX前药纳米粒的制备与表征
将1.0g二硫代甘醇酸与15mL无水乙酸酐混合，在氮气保护下，35℃搅拌反应3h。待反应完全后，旋转蒸发去除乙酸和多余的乙酸酐。旋蒸后的产物溶于二氯甲烷，并加入1.49g的十八醇及65mg DMAP，室温下搅拌反应15h后用1％HAc终止，有机层用无水硫酸钠干燥。粗产物经硅胶柱层析纯化后得到中间体(HOOC-CH2-SS-CH2-COOC18)。将HOOC-CH2-SS-CH2-COOC18和HBTU在冰浴下溶于二氯甲烷，并逐滴加入N,N-二异丙基乙胺，反应30min后加入200mg PTX，在避光条件下，继续室温反应10h。待反应完全后，混合物先后用1％HAc和纯水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。粗产物经硅胶柱层析纯化，干燥后得到PTX-SS-C18。
由于CL不溶于乙醇，故采用透析法制备CL@RNPPTX，精确称取5mg的PTX-SS-C18和5mg的CL溶于0.5mL无水二甲亚砜(DMSO)中，在室温搅拌(700rpm)下通过微量注射器缓慢将之滴加于去离子水中。搅拌反应25min后，使用截留分子量为3500的透析袋对所得溶液进行透析24小时，后经0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤即得CL@NPPTX。最后，将RGD-PEG2000-DSPE分别溶于水中，并与上述方法制得的CL@NPPTX混合(RGD-PEG2000-DSPE/CL@NPPTX＝20/100,w/w)，即得RDG多肽修饰的胶质瘤靶向载CL小分子的PTX前药纳米粒(CL@RNPPTX)。通过透射电镜观察其形态，结果如图4所示。
实施例5：U87MG细胞对香豆素6标记的RNPPTX的定性摄取观察
将对数培养期的U87MG细胞按4x104个细胞每孔的密度均匀接种于24孔板中，培养24小时后，显微镜下观察其形态；弃去培养基，PBS洗涤细胞一次后，用不含血清的培养基将载有香豆素-6的RNPPTX和NPPTX分别配置成香豆素-6浓度为1，2和5μg/mL的溶液，并于37℃下孵育1h或2h；孵育完成后，PBS洗涤细胞3次，每孔加入4％多聚甲醛对细胞进行室温固定15min，PBS洗涤2遍，加入DAPI染色液室温染色细胞核10min，孵育结束后，弃去染色液并用PBS洗涤3遍，立即置于荧光显微镜下观察并拍照。结果见图5所示。
实施例6：过氧化铜纳米点的制备
将聚乙烯吡咯烷酮(PVP,0.5g)溶解在含有CuCl2·2H2O(5mL，0.01M)的水溶液中。然后，将NaOH(5mL，0.02M)和H2O2(100μL)依次添加到上述混合物中。搅拌30分钟后，通过超滤收集涂覆有PVP的CP纳米点，并用水洗涤几次，即得过氧化铜纳米点。通过动态光散射法测定其粒度分布，透射电镜观察其形态，高锰酸钾的比色法表征其过氧化物基团的存在，结果如图6所示
实施例7：过氧化铜纳米点的pH响应释放考察
通过高速离心法考察CP NDs中Cu的体外释放行为，取适量制备好的纳米粒溶液，用释放介质稀释至50mL，置于50mL EP(Eppendorf)管中，释放介质为不同pH值(7.4或5.6)的缓冲溶液。将稀释后的纳米粒放入37℃恒温摇床(150rpm)，分别于0，0.5，2，4，24h取出平行的三组样品，立即转移离心管中，以16000g高速冷冻离心40min，取上清，并通过ICP-OES检测释放的Cu，计算释放百分率(％)。
结果见图7所示
实施例8：过氧化铜纳米点的类芬顿反应考察
将1mM的Cu2+和1mM的H2O2混合在含40μg/mL的TMB的醋酸盐缓冲溶液(pH5.5)中，混合30分钟后，用紫外-可见光分光光度计测定混合溶液在650nm处的紫外吸收。仅用Cu2+或H2O2处理的TMB溶液用作对照组。
将CP纳米点(0.2mg/mL)添加到具有不同pH值(7.4或5.5)的TMB溶液中。混合2小时后，测定混合溶液在650nm处的紫外吸收。结果见图8所示。
实施例10：羟丙基甲壳素的合成与表征
称取11g氢氧化钠和4g尿素于烧杯中，加入85ml蒸馏水，搅拌溶解，-在-20℃预冷4小时。称取4g甲壳素粉末分散于其中，-30℃机械搅拌2小时，-70℃冷冻6小时，转移到-20℃解冻4小时，继续溶解。溶解过程中每(2～3小时)取出进行搅拌，保证甲壳素分散均匀。冷冻48-72小时。将得到的样品在4℃中加入环氧丙烷10.6mL，密封好后机械搅拌反应1小时，再加环氧丙烷10mL反应1小时，最后10℃反应24h，用3mol/L稀盐酸10℃调节pH至中性以终止反应，加水稀释成溶液状，用透析袋(截留分子量为为10K Da)透析除去未反应的小分子，透析液冷冻干燥后，即得羟丙基甲壳素，利用核磁共振氢谱进行结构确认，结果见图9所示。
实施例9：集化疗/光动力治疗/化学动力治疗“三位一体”的温敏水凝胶递药系统(CP&CL@RNPPTX-Gel)制备
取制备好的CL@RNPPTX纳米粒溶液和过氧化铜纳米点溶液按质量比1：1的比例混匀后，加入占总重5％的羟丙基甲壳素水凝胶基质材料，4℃充分溶胀后，搅拌均匀后即得载药凝胶(CP&CL@RNPPTX-Gel)。
实施例10：CP&CL@RNPPTX-Gel的物相及流变学考察
应用小瓶倒置法，对CP&CL@RNPPTX-Gel在室温以及37℃时的状态进行测定，将CP&CL@RNPPTX-Gel凝胶溶液转移到小瓶中，将小瓶倾斜并拍照，然后将小瓶置于37℃恒温箱中，1min后取出，将小瓶倾斜并拍照。结果见图10A所示。CP&CL@RNPPTX-Gel在室温下，为流动的液体状态。在37℃条件下形成不流动的半固体状态，可知，CP&CL@RNPPTX-Gel具有良好的温敏性，在室温下具有可注射性，在体温刺激下能在短时间内形成凝胶态结构。
用1ml注射针吸取1ml凝胶溶液，打开旋转流变仪，将凝胶溶液通过注射器均匀置于流变仪的操作盘上，运用振荡模式，频率8Hz，应变振幅0.1％，测定0-40℃范围内载药水凝胶凝胶的储能模量(G’)和耗能模量(G”)随温度的变化关系。结果见图10B所示。该凝胶的相变温度为33.4℃，预示着该制剂在给药时具有良好的流动性，在体温刺激后，可以胶凝成凝胶态，有利于药物的缓释和长效。
实施例11：CP&CL@RNPPTX-Gel的结构考察
将CP&CL@RNPPTX-Gel凝胶置于-80℃冰箱预冷后，冷冻干燥得到CP&CL@RNPPTX-Gel冻干粉末，将冻干粉切片，厚度为1-2mm，在扫描电镜载物盘上粘上双面胶带，然后将冻干切片轻置于双面胶带上靠近载物盘圆心部位上，然后用吹气橡胶球朝载物盘径向朝外方向轻吹，使样品切片粘在胶带上。将载物盘置于离子溅射仪中，对样品表面进行喷金1-2min,随后将载物盘置于扫描电子显微镜下，选择合适倍数进行拍照。结果见图11所示，凝胶呈现为三维层状结构，并且放大后纳米颗粒清晰可见，两种纳米粒被包裹在层状结构中，表明可以作为药物储库，延长药物释放时间。
实施例12：CP&CL@RNPPTX-Gel的脑胶质瘤术后腔内滞留性考察
为了实现CP&CL@RNPPTX-Gel凝胶体内定位和可视化，将载有Dir荧光探针的RNPPTX纳米粒载入温敏凝胶中，并将其原位注射于胶质瘤术后空腔中，以监测该水凝胶系统在体内的缓释行为和分布情况。小动物可见光分析结果如图12所示，CP&CL@RNPPTX-Gel组在3d显现出了强烈的荧光，荧光信号随时间延长缓慢降低，一直到21d仍然可以观察较弱的荧光信号；而CP&CL@RNPPTX溶液(CP&CL@RNPPTX-Sol)组在3d也显示出较强的荧光，但其强度不及凝胶组，并且随着时间的延长，在21d就已经观察不到荧光信号了。这些结果表明，壳聚糖凝胶给药系统可以大大延长药物在术后空腔内的滞留时间，并且其具有可生物降解性，与尾静脉全身给药组相比，可以最大限度的将药物集中于脑内释放，同时避开其肝脏和脾脏等组织的毒副作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种集化疗/光动力治疗/化学动力治疗的脑胶质瘤术后递药系统，其特征在于该递药系统是将包载有自发光光敏剂分子的RGD多肽修饰的脑胶质瘤靶向紫杉醇前药纳米粒和过氧化铜纳米点分散在温度敏感型水凝胶基质材料的三维骨架中；其中，所述的自发光光敏剂分子是通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺反应得到。
2.根据权利要求1所述的集化疗/光动力治疗/化学动力治疗的脑胶质瘤术后递药系统，其特征在于所述的温度敏感型水凝胶基质材料为羟丙基甲壳素水凝胶基质材料。
3.一种权利要求1所述的集化疗/光动力治疗/化学动力治疗的脑胶质瘤术后递药系统的制备方法，其特征在于该方法将包载有自发光光敏剂分子的RGD多肽修饰的脑胶质瘤靶向紫杉醇前药纳米粒和过氧化铜纳米点按质量比1：1的比例混匀后，加入5％的羟丙基甲壳素水凝胶基质材料，4℃充分溶胀后，搅拌均匀。
4.根据权利要求3所述的集化疗/光动力治疗/化学动力治疗的脑胶质瘤术后递药系统的制备方法，其特征在于所述的羟丙基甲壳素水凝胶基质材料是通过以下方法制备得到的：称取11g氢氧化钠和4g尿素，加入85ml蒸馏水，搅拌溶解，-在-20℃预冷4小时；称取4g甲壳素粉末分散于其中，-30℃机械搅拌2小时，-70℃冷冻6小时，转移到-20℃解冻4小时，继续溶解；溶解过程中每2～3小时取出进行搅拌，保证甲壳素分散均匀；冷冻48-72小时，将得到的样品在4℃中加入环氧丙烷10.6mL，密封好后机械搅拌反应1小时，再加环氧丙烷10mL反应1小时，最后10℃反应24h，用3mol/L稀盐酸10℃调节pH至中性以终止反应，加水稀释成溶液状，用截留分子量为10K Da的透析袋透析除去未反应的小分子，透析液冷冻干燥，即得。
5.根据权利要求3所述的集化疗/光动力治疗/化学动力治疗的脑胶质瘤术后递药系统的制备方法，其特征在于所述的过氧化铜纳米点是通过以下方法制备得到的：将0.5g聚乙烯吡咯烷酮溶解在5mL 0.01M的CuCl2·2H2O的水溶液中，然后将5mL 0.02M的NaOH和100μLH2O2依次添加到上述混合物中，搅拌30分钟后，通过超滤收集涂覆有聚乙烯吡咯烷酮的CP纳米点，并用水洗涤几次。
6.根据权利要求3所述的集化疗/光动力治疗/化学动力治疗的脑胶质瘤术后递药系统的制备方法，其特征在于所述的包载有自发光光敏剂分子的RGD多肽修饰的脑胶质瘤靶向紫杉醇前药纳米粒是通过以下方法制备得到的：称取5mg的PTX-SS-C18和5mg的自发光光敏剂分子溶于0.5mL无水二甲亚砜中，在700rpm下室温搅拌，通过微量注射器缓慢将其滴加于去离子水中，搅拌反应25min后，使用截留分子量为3500的透析袋对所得溶液进行透析24小时，后经0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤即得CL@NPPTX；将RGD-PEG2000-DSPE溶于水中，并在室温下与CL@NPPTX搅拌混合，RGD-PEG2000-DSPE/CL@NPPTX＝20/100，w/w。
7.根据权利要求6所述的集化疗/光动力治疗/化学动力治疗的脑胶质瘤术后递药系统，其特征在于所述的PTX-SS-C18是通过以下方法制备得到的：将1.0g二硫代甘醇酸与15mL无水乙酸酐混合，在氮气保护下，35℃搅拌反应3h，待反应完全后，旋转蒸发去除乙酸和多余的乙酸酐，旋蒸后的产物溶于二氯甲烷，并加入1.49g的十八醇及65mg DMAP，室温下搅拌反应15h后用1％HAc终止，有机层用无水硫酸钠干燥，粗产物经硅胶柱层析纯化后得到中间体HOOC-CH2-SS-CH2-COOC18，将HOOC-CH2-SS-CH2-COOC18和HBTU在冰浴下溶于二氯甲烷，并逐滴加入N,N-二异丙基乙胺，反应30min后加入200mg PTX，在避光条件下，继续室温反应10h，待反应完全后，混合物先后用1％HAc和纯水洗涤，并用无水硫酸钠干燥，粗产物经硅胶柱层析纯化，干燥后得到PTX-SS-C18。
8.根据权利要求6所述的集化疗/光动力治疗/化学动力治疗的脑胶质瘤术后递药系统，其特征在于RGD-PEG2000-DSPE是通过马来酰亚胺和巯基的缩合制备得到的。
9.根据权利要求8所述的集化疗/光动力治疗/化学动力治疗的脑胶质瘤术后递药系统，其特征在于RGD-PEG2000-DSPE具体制备方法为：精确称取10mg的巯基化的RGD多肽溶于1mL磷酸盐缓冲液中，然后称取4mg的Maleimide-PEG2000-DSPE溶于1mL的N,N-二甲基甲酰胺中，将二者先后缓慢滴加至8mL的磷酸盐缓冲液中，磁力搅拌4小时后，用截留分子量为3.5kDa，透析介质为纯水的透析法除去DMF和未反应的巯基化RGD多肽，后经冷冻干燥即得。
10.根据权利要求1所述的集化疗/光动力治疗/化学动力治疗的脑胶质瘤术后递药系统，其特征在于自发光光敏剂分子是通过以下方法制备得到的：将0.08mmolCe6溶于无水DMSO中，依次加入EDC和NHS，反应后，避光条件下50℃搅拌17小时；然后将鲁米诺加入上述溶液中，继续反应3天，将反应液制砂，使用柱层析法分离；流动相比例为氯仿：甲醇：甲酸＝20：1：0.1，旋转蒸发除去溶剂后得黑色固体产物。
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