CN113813383A - 一种过氧化铜透皮微针系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种过氧化铜透皮微针系统及其制备方法和应用。所述过氧化铜透皮微针系统包括：微针基底、以及分布在微针基底的至少一个微针针体；所述微针针体包含基质和过氧化铜纳米颗粒。

Description

一种过氧化铜透皮微针系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种过氧化铜透皮微针系统及其制备方法和应用，具体涉及是一种微针针体部分由生物相容性的聚合物材料和过氧化铜纳米颗粒混合构成的透皮微针系统，具有良好透皮性和水溶性，可透皮递送过氧化铜纳米颗粒至浅表层肿瘤区域，结合自增强化学动力学治疗和光热治疗实现增强的肿瘤治疗效果，在抗浅表层肿瘤方面具有潜在应用价值，属于生物材料学领域。
背景技术
癌症是威胁人类健康的主要疾病之一，且发病率和死亡率每年呈上升趋势。其中，浅表层肿瘤，例如黑色素瘤，是恶性度非常高的肿瘤。针对浅表层肿瘤的常用治疗方式为手术切除、放射治疗和药物化疗。但这些手段存在很多缺陷，例如，侵入性的外科手术会造成大面积皮肤创伤；放射治疗和全身性化疗由于缺乏特异靶向性和肿瘤多抗性，会造成严重的副作用，且治疗效果差；这些治疗方式治疗后复发几率大。因此，寻求高效且低副作用的治疗方式成为抗浅表层肿瘤的迫切需要。
化学动力学治疗(CDT)是近些年来兴起的基于活性氧(ROS)的新型癌症治疗方式，被认为是高安全性的治疗手段。典型地，在肿瘤组织中引入某些金属离子(如铁、锰、钴、铜等)或芬顿试剂以原位催化芬顿或类芬顿反应，将肿瘤内的低活性过氧化氢(H2O2)转化为高毒性的羟基自由基(·OH)诱导癌细胞死亡，从而实现化学动力学治疗。相对于光动力学治疗(PDT)过程中产生的单线态氧(1O2)，羟基自由基是一种具有更高反应活性的活性氧，因此能诱导更强的细胞氧化破坏，从而提供更好的抗肿瘤效果。相对于正常细胞或组织，H2O2在肿瘤组织中过表达，而且偏酸性的肿瘤微环境更有利于催化芬顿或类芬顿反应，因此化学动力学治疗具有较高的肿瘤选择性，能有效地杀死癌细胞且避免对正常细胞或组织造成严重损伤。然而，这种芬顿型化学动力学治疗过程中羟基自由基的产生会受到肿瘤组织中有限的过氧化氢浓度、肿瘤内抗氧化防御机制(例如，高表达的还原型谷胱甘肽(GSH)能清除过量的ROS，保护癌细胞不受氧化破坏)、较低的催化效率等因素的限制，从而降低最终的抗肿瘤效果。另外，光热治疗(PTT)是另一种新兴的癌症治疗方式，其利用光热试剂在肿瘤组织聚集后，在外界光源(一般是近红外光)的激发下将光能转化为局部高热来杀死癌细胞，从而实现癌症治疗。相对而言，肿瘤细胞比正常细胞对高温更加敏感。然后，光热治疗的抗肿瘤效果会受到肿瘤细胞内的防御机制(例如热休克蛋白)、外界光源的组织穿透性、光热试剂的光热转化效率等因素的影响。研究表明，将光热治疗与其他治疗模式相结合可以优化癌症治疗效果，并降低治疗的安全风险。因此，设计多功能的治疗体系，同时具有较好的化学动力学性能和光热转化性能，并能克服治疗的限制，将大大提高癌症治疗效果。
近年来，金属过氧化物类纳米颗粒由于能在特定环境下同时提供氧气或过氧化氢以及活性金属离子以增强癌症治疗效果，受到研究者们的青睐。开发、应用新型金属过氧化物类纳米颗粒在癌症治疗方面呈现巨大的潜力。
目前传统的给药方式，例如口服和静脉注射等，仍存在一些缺陷。其中，由于体内复杂的新陈代谢和生理屏障，这些给药方式的效率受到限制，导致治疗试剂的生物可利用性很低，最终影响治疗效果。微针(MNs)具有卓越的刺穿能力和高效的药物输送能力，其能渗透皮肤角质层输送大量药物至真皮层实现高效治疗，因此被认为是一种有潜力的透皮给药工具。一般地，利用生物相容性较好的聚合物材料作为基体制备感应的微针，以控制治疗药物的释放，降低副作用。这种基于微针的透皮给药方式呈现无痛、最小化侵入性、可自我管理、治疗药物负载量可调等优点，在生物医学领域呈现广阔的发展前景。目前，微针已被开发用于疫苗递送、糖尿病治疗、肥胖抑制、脱发治疗、眼科疾病、伤疤修复等多种生物医学应用方面。针对浅表层肿瘤治疗，利用微针有望实现治疗试剂在浅表层肿瘤病灶的透皮递送，优化癌症治疗。因此，设计、开发新型的透皮微针系统用于抑制浅表层肿瘤呈现极大的吸引力。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种过氧化铜透皮微针系统及其制备方法和应用。所述的过氧化铜透皮微针系统及其制备方法要解决现有技术中的对浅表层肿瘤治疗效果不佳、安全性低的技术问题。
一方面，本发明提供了一种过氧化铜透皮微针系统，包括：微针基底、以及分布在微针基底的至少一个微针针体；所述微针针体包含基质和过氧化铜纳米颗粒。
本公开中，以生物相容性较好的聚合物材料作为微针基底制备微针，并在微针针体部分负载过氧化铜纳米颗粒，形成过氧化铜透皮微针系统。其中，聚合物材料和过氧化铜纳米颗粒的比例可以调节。过氧化铜纳米颗粒具有良好的分散性，呈现酸性环境感应性，能够在偏酸性的肿瘤微环境下分解成为铜离子和过氧化氢。一方面铜离子可以催化芬顿反应转化肿瘤组织内的过氧化氢为羟基自由基实现化学动力学治疗；另一方面，分解所产生的过氧化氢可以供应类芬顿反应原料消耗，促进羟基自由基产生，增强化学动力学治疗效果。而且，过氧化铜纳米颗粒可以通过氧化还原反应消耗肿瘤组织/细胞内的还原型谷胱甘肽，从而增强活性氧介导的肿瘤治疗。制备的过氧化铜透皮微针系统具有良好的透皮性和水溶性，可有效刺入皮肤组织，透皮递送治疗的过氧化铜纳米颗粒至真皮层肿瘤病灶区域，实现过氧化氢自供应以及还原型谷胱甘肽消耗所增强的化学动力学治疗。另外，由于过氧化铜纳米颗粒的负载，制备的透皮微针系统具备优异的光热转化性能，能在刺入肿瘤部位皮肤后结合红外光照射，诱导明显的局部高热，从而实现精确的光热治疗。其中，过氧化铜纳米颗粒的负载量影响化学动力学性能以及光热性能。最终，利用透皮微针系统，通过联合自增强的化学动力学治疗和光热治疗，可以实现增强的抗肿瘤效果，并减少副作用，在抗浅表层肿瘤方面呈现巨大的潜力。本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。
较佳的，所述过氧化铜纳米颗粒的颗粒尺寸为10nm～200nm。
较佳的，所述微针针体中过氧化铜纳米颗粒的掺杂含量为1wt％～50wt％，优选为2.5～20wt％，更优选为2.5～15wt％，更优选为2.5wt％～10wt％。
较佳的，所述微针针体的形状为棱锥；所述棱锥的高度为200～1000μm；所述棱锥的底边长为50～400μm。
较佳的，所述微针基底的材料组成选自聚乙烯吡络烷酮、聚乙二醇、透明质酸、聚己内酯、聚乳酸、壳聚糖中的至少一种；所述微针针体中基质材料选自聚乙烯吡络烷酮、聚乙二醇、透明质酸、聚己内酯、聚乳酸、壳聚糖中的至少一种。
另一方面，本发明提供了一种过氧化铜透皮微针系统的制备方法，通过模版法和真空处理过程来制备所述过氧化铜透皮微针系统，包括：
(1)将过氧化铜纳米颗粒、基质材料和溶剂混合，得到第一混合浆料；将微针基底材料和溶剂混合，得到第二混合浆料；
(2)将第一混合浆料加入到聚二甲基硅氧烷微针模具中，利用真空处理使得第一混合浆料填充到微针针体的模具尖端中，然后去除多余的第一混合浆液并干燥；
(3)将第二混合浆料加入到聚二甲基硅氧烷微针模具中，利用真空处理和二次干燥以形成微针基底，最终得到过氧化铜透皮微针系统。
较佳的，所述干燥的温度为25～60℃，时间为1～24小时。
较佳的，所述二次干燥的温度为25～60℃，时间为1～24小时。
较佳的，所述溶剂为去离子水、纯水、超纯水中的至少一种。
较佳的，所述真空处理的真空度≤0MPa。
较佳的，在碱性溶液条件下、以聚乙烯吡络烷酮为稳定剂，制备得到过氧化铜纳米颗粒；优选地，具体步骤包括：将聚乙烯吡络烷酮和铜源加入溶剂中搅拌至完全溶解，再加入配制好的氢氧化钠水溶液搅拌，最后加入过氧化氢进行反应，再经离心、水洗和干燥，得到所述过氧化铜纳米颗粒；更优选地，所述铜源为含铜的盐类，最优选为CuCl2·2H2O；所述的溶剂为去离子水、纯水、超纯水中的至少一种。
再一方面，本发明提供了一种过氧化铜透皮微针系统在制备抗浅表层肿瘤材料中的应用。
进一步地，对制备的过氧化铜透皮微针系统进行性能表征发现，该透皮微针系统具有良好的透皮性和水溶性，可有效刺入皮肤组织，透皮递送治疗的过氧化铜纳米颗粒至真皮层肿瘤病灶区域。同时对其细胞毒性进行探究发现，透皮微针系统溶解后释放的过氧化铜纳米颗粒能被肿瘤细胞有效摄取，而且在细胞中诱导大量活性氧产生并且一定程度上降低细胞中还原型谷胱甘肽的浓度，最终诱导大量肿瘤细胞死亡，但对正常细胞没有造成明显的细胞毒性。另外，由于过氧化铜纳米颗粒的负载，该透皮微针系统具有优异的光热转化能力，可以吸收红外光并快速转化为局部高热，这有助于实现精确的光热治疗。
在表皮肿瘤裸鼠模型上进行动物实验发现，该透皮微针系统能通过自增强的化学动力学治疗有效抑制肿瘤生长；该透皮微针系统在特定的红外光照射下，能诱导肿瘤部位产生高热；结合红外光照射，该透皮微针系统可以联合自增强的化学动力学治疗和光热治疗提供更好的抗肿瘤效果，而且无明显副作用。
有益效果：
本发明开发设计了新型的透皮微针系统，对多功能治疗试剂进行在浅表层肿瘤病灶的精准透皮递送，提高最终的肿瘤抑制效果，呈现极大的吸引力。而且，本发明设计制备的生物相容性的微针系统，对过氧化铜纳米颗粒进行精确的透皮递送，使其在浅表层肿瘤部位有效聚集，进行自增强的化学动力学治疗，并进一步结合光热治疗，有望实现更加高效、安全的癌症治疗。
附图说明
图1a-图1f为本发明中制备的过氧化铜纳米颗粒表征，其中(1a)透射电镜照片，(1b)动态光散射水动力尺寸分布，(1c)X射线衍射分析，(1d-1f)X射线光电子能谱分析。
图2a-图2f为本发明中制备的过氧化铜纳米颗粒性能测试，其中(2a)铜离子催化芬顿反应，(2b-2c)过氧化铜纳米颗粒在不同pH条件下的羟基自由基产生，(2d)铜离子氧化还原型谷胱甘肽，(2e-2f)过氧化铜纳米颗粒消耗还原型谷胱甘肽。
图3a-图3g为本发明中制备的过氧化铜透皮微针系统表征，其中(3a)过氧化铜透皮微针系统实物照，(3b)扫描电镜照片，(3c)铜元素在微针上的分布图，(3d)生物倒置显微镜照片，(3e)过氧化铜透皮微针系统在水中的溶解性测试，(3f)抗压强度测试，(3g)刺猪皮测试。
图4为本发明中制备的过氧化铜透皮微针系统在刺猪皮前的实物照。
图5为本发明中制备的过氧化铜透皮微针系统在刺猪皮后的实物照。
图6a-图6f为本发明中制备的过氧化铜透皮微针系统溶解液的体外细胞实验，其中(6a)过氧化铜纳米颗粒细胞吞噬测试，(6b)黑色素瘤细胞内活性氧测试，(6c)黑色素瘤细胞内还原型谷胱甘肽含量分析，(6d)黑色素瘤细胞毒性分析，(6e)人永生化角质形成细胞毒性分析，(6f)黑色素瘤细胞活死染色分析。
图7a-图7c为本发明中制备的过氧化铜透皮微针系统的光热性能测试，其中(7a)不同过氧化铜纳米颗粒含量的透皮微针系统的光热曲线，(7b)不同激光密度下过氧化铜透皮微针系统的光热曲线，(7c)过氧化铜透皮微针系统的光热稳定性分析。
图8a-图8f为本发明中制备的过氧化铜透皮微针系统的体内抗黑色素瘤实验，其中(8a)过氧化铜透皮微针系统体内光热性能测试，(8b)不同处理条件后动物模型上黑色素瘤的生长曲线，(8c)不同处理条件后动物模型的体重变化曲线，(8d)治疗结束后取出的黑色素瘤的重量，(8e)治疗结束后取出的黑色素瘤的实物照，(8f)动物模型治疗前后的实物照。
具体实施方式
以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
在本发明中，过氧化铜透皮微针系统由微针基底和分布其上的微针针体组成。所述微针基底由生物相容性的聚合物材料构成，且所述的微针针体由与基底相同(也可不同)的聚合物材料和过氧化铜纳米颗粒混合构成。一方面，透皮微针针体中所包含的过氧化铜为10nm～200nm的纳米尺度的颗粒，在水溶液中具有较好的分散性，可被肿瘤细胞有效吞噬实现治疗；另一方面，透皮微针针体中的过氧化铜纳米颗粒呈现酸性环境感应性，能够在偏酸性的肿瘤微环境下分解成为铜离子和过氧化氢，通过铜离子催化芬顿反应转化肿瘤组织内的过氧化氢以及自供应的过氧化氢为羟基自由基实现化学动力学治疗，而且过氧化铜纳米颗粒可以通过氧化还原反应消耗肿瘤组织/细胞内的还原型谷胱甘肽，进一步增强羟基自由基介导的化学动力学治疗；此外，过氧化铜纳米颗粒的负载，使得透皮微针系统具备优异的光热转化性能，能在刺入肿瘤部位皮肤后结合红外光照射，诱导明显的局部高热，从而实现精确的光热治疗。因此，本发明专利中的过氧化铜纳米颗粒的负载是为了联合自增强的化学动力学治疗和光热治疗，从而实现增强的抗肿瘤效果，并减少副作用，在抗浅表层肿瘤方面呈现巨大的潜力，而并非简单地释放H2O2杀死肿瘤细胞。
在可选的实施方式中，微针基底由聚乙烯吡络烷酮、聚乙二醇、透明质酸、聚己内酯、聚乳酸、壳聚糖等生物相容性的聚合物材料中的一种或多种构成，且分布其上的微针针体由与基底相同的聚合物材料和过氧化铜纳米颗粒混合构成。
其中，氧化铜纳米颗粒的尺寸可为10纳米～200纳米，在水溶液中有良好的分散性。
本发明中，过氧化铜透皮微针系统具有良好的透皮性和水溶性，可透皮递送过氧化铜纳米颗粒至浅表层肿瘤区域，实现自增强的化学动力学治疗，而且具有光热转化能力，可进一步结合光热治疗实现增强的肿瘤治疗效果。该过氧化铜透皮微针系统在抗浅表层肿瘤方面具有应用前景。以下示例性地说明过氧化铜透皮微针系统的制备方法。
利用以聚乙烯吡络烷酮为稳定剂，在碱性溶液条件下制备过氧化铜纳米颗粒。将聚乙烯吡络烷酮和铜源加入溶剂中搅拌至完全溶解，再加入配制好的氢氧化钠水溶液搅拌，最后加入过氧化氢反应一段时间(15～120分钟)，经离心、水洗、干燥后得过氧化铜纳米颗粒粉末。所述的铜源可为含铜的盐类，优选为CuCl2·2H2O；所述的溶剂为去离子水、纯水、超纯水中的至少一种。对制备的过氧化铜纳米颗粒进行性能表征发现，过氧化铜纳米颗粒具有酸性环境感应产生羟基自由基和消耗还原型谷胱甘肽的能力，这有助于实现自增强的肿瘤化学动力学治疗。
利用模版法并结合真空处理过程，制备微针针体为生物相容性较好的聚合物材料和过氧化铜纳米颗粒且基底为相同的聚合物材料的透皮微针系统。
将过氧化铜纳米颗粒粉末和生物相容性的聚合物材料按一定质量比混合，并溶解在适量的溶剂中搅拌得到一种混合均匀、粘度适宜的第一混合浆液。将生物相容性的聚合物材料溶解在适量的溶剂中，得到第二混合浆料。其中，溶剂可为去离子水、纯水、超纯水中的至少一种。
将第一混合浆料加入到聚二甲基硅氧烷微针模具中，并利用真空处理以促进混合浆料填充到微针尖端中；接着，去除多余的第一混合浆液并干燥。将仅含有生物相容性的聚合物材料的第二混合浆料继续加到聚二甲基硅氧烷微针模具中，然后再次真空处理以形成贴片背衬；最后，在25～60℃(例如37℃)下干燥过夜后，从聚二甲基硅氧烷微针模具中小心剥离得到所述透皮微针系统。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1过氧化铜纳米颗粒的制备：
称取2g聚乙烯吡络烷酮(Mw1000)和34.1mgCuCl2·2H2O，加入到20mL的去离子水中搅拌至完全溶解；配置好20mL摩尔浓度为0.02M的氢氧化钠水溶液，并缓慢地加入上述溶液中；随后，加入400μL过氧化氢溶液(浓度30wt％)持续搅拌反应30分钟；最后，离心收集产物，并用去离子水清洗3次，置于60℃真空烘箱干燥后，得到过氧化铜纳米颗粒粉末。
图1为按照上述方法制备出的过氧化铜纳米颗粒的透射电镜照片、动态光散射水动力尺寸分布、X射线衍射分析、X射线光电子能谱分析结果，证明制备出了分散性良好的过氧化铜纳米颗粒。
实施例2
图2为本发明实施例1所制备的过氧化铜纳米颗粒的相关性能测试。
根据3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)能和羟基自由基反应从无色变成蓝色以及反应产物在654nm处呈现特征吸收，将其作为指示剂探测材料催化芬顿型反应产生羟基自由基的能力。首先，将Cu2+(1mM)、H2O2(1mM)以及Cu2+(1mM)加H2O2(1mM)分别加入含有TMB指示剂的醋酸钠缓冲溶液(pH5.2)中，反应5分钟后测量紫外吸收光谱(400～800nm)(图2a)。结果显示，只有Cu2+(1mM)加H2O2(1mM)组在650nm处出现明显的特征吸收，这表明铜离子能催化类芬顿反应转化过氧化氢为羟基自由基。其次，将实施例1所制备的过氧化铜纳米颗粒(200μg/mL)加入含有TMB指示剂的不同pH的醋酸钠缓冲溶液(pH5.2或7.4)中，在特定时间点记录测试溶液在654nm处的特征吸收值并在第15分钟测量紫外吸收光谱(500～800nm)(图2b-2c)。结果显示，所制备的过氧化铜纳米颗粒呈现酸性环境感应性，在酸性且无外加过氧化氢条件下能自催化产生羟基自由基，但在中性条件下几乎无羟基自由基产生。这是由于在酸性环境下，过氧化铜纳米颗粒分解为铜离子和过氧化氢，其中铜离子通过催化类芬顿反应将产生的过氧化氢转化为羟基自由基。这表明所制备的过氧化铜纳米颗粒可以感应偏酸性的肿瘤微环境，能够实现过氧化氢自供应的化学动力学治疗。
根据5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)能和还原型谷胱甘肽反应生成在412nm处呈现特征吸收的黄色产物且当还原型谷胱甘肽被消耗时黄色产物转换回DTNB，将其作为指示剂探测材料清除还原型谷胱甘肽的能力。首先，配置Tris-盐酸缓冲溶液(10mM，pH8.5)。将2mL不同浓度的Cu2+(0、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2mM)缓冲溶液与2mL含有DTNB指示剂且含有0.4mM还原型谷胱甘肽的缓冲溶液混合，在室温下反应10分钟后测试紫外吸收光谱(350～550nm)(图2d)。结果显示，铜离子能有效清除还原型谷胱甘肽，这是由于铜离子与还原型谷胱甘肽发生氧化还原反应。其次，将2mL不同浓度的实施例1所制备的过氧化铜纳米颗粒(0、40、80、160、320μg/mL)缓冲溶液与2mL含有DTNB指示剂且含有0.4mM还原型谷胱甘肽的缓冲溶液混合，在室温下反应10分钟后测试溶液在412nm处的特征吸收值(图2e)，或者将2mL实施例1所制备的过氧化铜纳米颗粒(40μg/mL)缓冲溶液与2mL含有DTNB指示剂且含有0.4mM还原型谷胱甘肽的缓冲溶液混合，室温下反应后在特定时间点(0、5、15、30、45、60分钟)测试溶液在412nm处的特征吸收值变化(图2f)。结果表明，所制备的过氧化铜纳米颗粒具有卓越的清除还原型谷胱甘肽的能力，且清除效果呈现浓度、时间依赖性。这表明所制备的过氧化铜纳米颗粒可以有效清除肿瘤组织/细胞内的还原型谷胱甘肽，从而自增强化学动力学治疗效果。
实施例3过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)的制备：
称取适量实施例1所制备的过氧化铜纳米颗粒粉末和聚乙烯吡络烷酮聚合物(Mw40000)均匀混合，形成过氧化铜纳米颗粒粉末占混合材料的总质量比为10％的混合材料，并加入适量的去离子水，不断搅拌形成一种混合均匀、粘度适宜的混合浆液；随后，将混合浆料加入到聚二甲基硅氧烷微针模具(购买自新加坡MicropointTechnologiesPte有限公司)中，使混合浆料铺满整个微针模具空腔底部；将装有混合浆料的微针模具置于37℃真空烘箱中抽真空至-0.1MPa并保持1分钟，可以观察到浆料中出现明显的气泡，这表明混合浆料被填充到微针针尖中去了；接着，将微针模具空腔底部多余的混合浆液去除，此时填充到微针针尖中的混合浆液已无法去除，将仅聚乙烯吡络烷酮聚合物(Mw40000)和适量去离子水混合搅拌后形成的浆料加满整个微针模具空腔，并再次置于37℃真空烘箱中抽真空至-0.1MPa并保持1分钟，如此形成透皮微针系统的基底；最后，置于37℃烘箱干燥后，从聚二甲基硅氧烷微针模具中小心剥离得到过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)。
图3a-3e为按照上述方法制备出的过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)的实物照、扫描电镜照片、铜元素在微针上的分布图、生物倒置显微镜照片、在水中的溶解性测试。结果证明所制备的过氧化铜透皮微针系统由7毫米×7毫米的正方形基底和分布其上的10×10阵列且高度为600微米的微针针体组成，微针针体为正四面体结构，每个针体底部宽度约为200微米，针体间距约500微米；过氧化铜纳米颗粒均匀地分散在微针针体中；透皮微针系统具有良好的水溶性，能在含水环境中快速降解并释放过氧化铜纳米颗粒。
实施例4过氧化铜透皮微针系统(MN-5％)的制备：
称取适量实施例1所制备的过氧化铜纳米颗粒粉末和聚乙烯吡络烷酮聚合物(Mw40000)均匀混合，形成过氧化铜纳米颗粒粉末占混合材料的总质量比为5％的混合材料，并加入适量的去离子水，不断搅拌形成一种混合均匀、粘度适宜的混合浆液；随后，将混合浆料加入到聚二甲基硅氧烷微针模具(购买自新加坡MicropointTechnologiesPte有限公司)中，使混合浆料铺满整个微针模具空腔底部；将装有混合浆料的微针模具置于37℃真空烘箱中抽真空至-0.1MPa并保持1分钟，可以观察到浆料中出现明显的气泡，这表明混合浆料被填充到微针针尖中去了；接着，将微针模具空腔底部多余的混合浆液去除，此时填充到微针针尖中的混合浆液已无法去除，将仅聚乙烯吡络烷酮聚合物(Mw40000)和适量去离子水混合搅拌后形成的浆料加满整个微针模具空腔，并再次置于37℃真空烘箱中抽真空至-0.1MPa并保持1分钟，如此形成透皮微针系统的基底；最后，置于37℃烘箱干燥后，从聚二甲基硅氧烷微针模具中小心剥离得到过氧化铜透皮微针系统(MN-5％)。
实施例5过氧化铜透皮微针系统(MN-2.5％)的制备：
称取适量实施例1所制备的过氧化铜纳米颗粒粉末和聚乙烯吡络烷酮聚合物(Mw40000)均匀混合，形成过氧化铜纳米颗粒粉末占混合材料的总质量比为2.5％的混合材料，并加入适量的去离子水，不断搅拌形成一种混合均匀、粘度适宜的混合浆液；随后，将混合浆料加入到聚二甲基硅氧烷微针模具(购买自新加坡MicropointTechnologiesPte有限公司)中，使混合浆料铺满整个微针模具空腔底部；将装有混合浆料的微针模具置于37℃真空烘箱中抽真空至-0.1MPa并保持1分钟，可以观察到浆料中出现明显的气泡，这表明混合浆料被填充到微针针尖中去了；接着，将微针模具空腔底部多余的混合浆液去除，此时填充到微针针尖中的混合浆液已无法去除，将仅聚乙烯吡络烷酮聚合物(Mw40000)和适量去离子水混合搅拌后形成的浆料加满整个微针模具空腔，并再次置于37℃真空烘箱中抽真空至-0.1MPa并保持1分钟，如此形成透皮微针系统的基底；最后，置于37℃烘箱干燥后，从聚二甲基硅氧烷微针模具中小心剥离得到过氧化铜透皮微针系统(MN-2.5％)。
实施例6过氧化铜透皮微针系统(MN-0％)的制备：
称取适量聚乙烯吡络烷酮聚合物(Mw40000)和一定的去离子水混合搅拌形成均匀、粘度适宜的浆液，将其作为过氧化铜纳米颗粒粉末占混合材料的总质量比为0％的材料；随后，将浆料加入到聚二甲基硅氧烷微针模具(购买自新加坡MicropointTechnologiesPte有限公司)中，使浆料铺满整个微针模具空腔底部；将装有浆料的微针模具置于37℃真空烘箱中抽真空至-0.1MPa并保持1分钟，可以观察到浆料中出现明显的气泡，这表明浆料被填充到微针针尖中去了；接着，将微针模具空腔底部多余的浆液去除，此时填充到微针针尖中的浆液已无法去除，将相同的浆料加满整个微针模具空腔，并再次置于37℃真空烘箱中抽真空至-0.1MPa并保持1分钟，如此形成透皮微针系统的基底；最后，置于37℃烘箱干燥后，从聚二甲基硅氧烷微针模具中小心剥离得到过氧化铜透皮微针系统(MN-0％)。
实施例7
图3f为本发明实施例3-6所制备的过氧化铜透皮微针系统的抗压强度测试。图3g为本发明实施例3所制备的过氧化铜透皮微针系统的刺猪皮测试。图4和图5分别为本发明实施例3所制备的过氧化铜透皮微针系统在刺猪皮测试前后的实物照。
采用Zwick万能材料试验机对制备的过氧化铜透皮微针系统的抗压强度进行分析。其中，机械探头以0.5mm/分钟的恒定速度从上方下降，传感器与透皮微针系统接触后实时记录运动距离和压力。结果表明，实施例3-6所制备的过氧化铜透皮微针系统在变形为0.2mm时都具有超过0.1N/针的抗压强度，这满足一般的刺皮要求(图3f)。例如，实施例3所制备的过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)呈现高的抗压强度(0.4N/针)，足以穿过角质层和表皮屏障进行透皮药物输送。
进一步地，选取一块新鲜的猪皮对制备的过氧化铜透皮微针系统进行刺猪皮测试。将过氧化铜透皮微针系统压入猪皮中1分钟，然后将其从皮肤中拉出。结果表明，所制备的过氧化铜透皮微针系统能有效刺入猪皮形成微孔，且保留微针针体部分于猪皮内。这表明所制备的过氧化铜透皮微针系统能实现过氧化铜纳米颗粒的透皮递送。
实施例8
图6为本发明实施例3-6所制备的过氧化铜透皮微针系统溶解液的体外细胞实验。
分别取1个实施例3-6所制备的过氧化铜透皮微针系统置于1mL细胞培养基中1分钟，得到包含不同浓度过氧化铜纳米颗粒的透皮微针系统溶解液，利用该溶解液进行细胞测试：
1)将黑色素瘤细胞铺在24孔板中，与过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)溶解液(其中过氧化铜纳米颗粒用异硫氰酸荧光素(FITC)标记)共培养4个小时后，用多聚甲醛溶液(质量百分比为4％)固定15分钟，再用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色5分钟，最后利用荧光显微镜观察(图6a)。结果表明，绿色荧光FITC标记的过氧化铜纳米颗粒充分围绕在蓝色荧光DAPI标记的细胞核周围，暗示过氧化铜纳米颗粒能被肿瘤细胞有效吞噬；
2)因为2',7'-二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)能进入细胞水解成DCFH，其能被活性氧氧化成有绿色荧光的DCF，所以将DCFH-DA作为检测细胞内活性氧产生的探针。将黑色素瘤细胞铺在24孔板中，与过氧化铜透皮微针系统(MN-10％、MN-5％、MN-2.5％、MN-0％)溶解液共培养4个小时后，加入DCFH-DA检测液培养20分钟，最后利用荧光显微镜观察(图6b)。结果表明，过氧化铜纳米颗粒能在肿瘤细胞中诱导产生活性氧，且呈现浓度依赖性；
3)将黑色素瘤细胞铺在12孔板中，与过氧化铜透皮微针系统(MN-10％、MN-5％、MN-2.5％、MN-0％)溶解液共培养4个小时后，去除培养基并用PBS冲洗；随后，每孔加入500μLTriton-X-100缓冲液(0.4％)在4℃条件下裂解细胞10分钟后，将裂解物离心(8000rpm)5分钟；取400μL上清液利用DTNB/DMSO测试液(10mM)检测细胞中的还原型谷胱甘肽，并用微孔板分光光度计测量孔板在412nm处的特征吸光度，根据还原型谷胱甘肽的标准曲线计算含量(图6c)。结果表明，过氧化铜纳米颗粒可以在一定程度上消耗肿瘤细胞内的还原型谷胱甘肽，这有助于促进活性氧诱导的细胞死亡，从而增强化学动力学治疗效果；
4)将黑色素瘤细胞和人永生化角质形成细胞铺在96孔板中，与过氧化铜透皮微针系统(MN-10％、MN-5％、MN-2.5％、MN-0％)溶解液共培养24个小时后，利用标准的CCK-8方法，对细胞存活率进行测试计算。结果表明，透皮微针系统溶解液对肿瘤细胞造成显著的致死效果，且细胞杀死作用随着透皮微针中所含过氧化铜纳米颗粒的量增加而增强(图6d)，但对正常细胞没有明显的毒性(图6e)，这有利于实现安全的肿瘤选择性的化学动力学治疗；
5)将黑色素瘤细胞铺在24孔板中，与过氧化铜透皮微针系统(MN-10％、MN-5％、MN-2.5％、MN-0％)溶解液共培养24个小时后，加入钙黄绿素-AM/典化丙啶双染试剂(Calcein-AM/PI)对活/死细胞进行染色10分钟，最后利用荧光显微镜观察(图6f)。结果与CCK-8分析结果一致，表明过氧化铜透皮微针系统溶解液能有效杀死肿瘤细胞，且呈现过氧化铜纳米颗粒浓度依赖性。
实施例9
图7为本发明实施例3-6所制备的过氧化铜透皮微针系统的光热性能测试。
将实施例3-6所制备的过氧化铜透皮微针系统(MN-10％、MN-5％、MN-2.5％、MN-0％)用808nm激光器(1.0W/cm2)照射5分钟，期间用红外光热成像仪实时记录温度变化(图7a)；将实施例3所制备的过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)用808nm激光器(0.5、0.75、1.0、1.25W/cm2)照射5分钟，期间用红外光热成像仪实时记录温度变化(图7b)。结果表明，过氧化铜透皮微针系统具有较好的光热转化能力，温度升高程度随着过氧化铜纳米颗粒负载量的提高以及激光功率密度的提高而增加，这暗示能通过控制过氧化铜透皮微针系统的制备过程以及激光器的功率对光热性能进行有效调控，实现所需的光热治疗。
将实施例3所制备的过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)用808nm激光器(1.0W/cm2)进行循环照射，在五个加热-冷却循环周期内利用红外光热成像仪实时记录温度变化(图7c)。结果表明，过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)在五个加热-冷却循环周期内都保持相同的光致升温效果，这证明其具有良好的光热稳定性。
实施例10
图8为本发明实施例3和6所制备的过氧化铜透皮微针系统(MN-10％、MN-0％)的体内抗黑色素瘤实验。
将黑色素瘤细胞(100万个)注射到裸鼠(4周龄，雌性)的后腿右背部皮下建立黑色素瘤动物模型，当肿瘤体积达到约60mm3时进行体内实验：
1)选取3只黑色素瘤负荷裸鼠，一只选取非黑色素瘤部位用808nm激光器(0.75W/cm2)进行照射，一只选取黑色素瘤部位用808nm激光器(0.75W/cm2)进行照射，一只黑色素瘤部位插入实施例3所制备的过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)后用808nm激光器(0.75W/cm2)进行照射，都利用红外光热成像仪实时记录温度变化(图8a)。结果表明，动物模型中黑色素瘤区域在808nm激光照射下有一定的温度升高，过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)的插入进一步提高光热转化效果，诱导局部高热，这有助于实现精确的光热治疗；
2)将20只黑色素瘤负荷裸鼠随机平均分配到五组，并进行不同的处理：A：不做任何处理，作为对照组；B：将实施例6所制备的过氧化铜透皮微针系统(MN-0％)插入黑色素瘤区域，作为MN-0％组；C：对黑色素瘤部位用808nm激光器(0.75W/cm2)进行照射10分钟，作为激光组；D：将实施例3所制备的过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)插入黑色素瘤区域，作为MN-10％组；E：将实施例3所制备的过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)插入黑色素瘤区域，并用808nm激光器(0.75W/cm2)进行照射10分钟，作为MN-10％加激光组。每2天记录一次治疗动物的体重和肿瘤体积，持续12天(肿瘤体积V＝(L×W2)/2，L为长度，W为宽度)(图8b-8c)。实验过程中，根据肿瘤体积和动物伦理，第10天处死A和B组黑色素瘤负荷裸鼠，第12天处死C、D和E组黑色素瘤负荷裸鼠，并取出实体肿瘤进行称重(图8d-8f)。结果表明，相对于施例6所制备的过氧化铜透皮微针系统(MN-0％)，实施例3所制备的过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)呈现显著的黑色素瘤抑制效果，这是由于利用透皮微针系统对过氧化铜纳米颗粒进行了透皮给药至表皮黑色素瘤区域，在偏酸性的肿瘤微环境下实现了过氧化氢自供应以及还原型谷胱甘肽自清除所增强的化学动力学治疗。另外，结合近红外光的照射，过氧化铜透皮微针系统(MN-10％)实现了增强的肿瘤抑制效果，这来自于光热治疗和化学动力学治疗的联合作用。可以观察到(图8e)，在基于透皮微针系统(MN-10％)的联合光热治疗和化学动力学治疗后，有个别动物模型上的肿瘤已完全清除。而且，治疗过程中，动物模型的体重没有发生明显的变化(图8c)，表明所制备的过氧化铜透皮微针系统具有较好的生物相容性而且治疗过程具有高安全性。因此，所制备的过氧化铜透皮微针系统在抑制浅表层肿瘤具有突出作用，为高效、安全的癌症治疗提供新的借鉴。
本发明所涉及的过氧化铜透皮微针系统及其制备方法、应用并不仅仅限定于上述实施例1至10中的内容。以上内容仅为本发明构思下的基本说明，而在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种过氧化铜透皮微针系统，其特征在于，包括：微针基底、以及分布在微针基底的至少一个微针针体；所述微针针体包含基质和过氧化铜纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的过氧化铜透皮微针系统，其特征在于，所述过氧化铜纳米颗粒的颗粒尺寸为10 nm～200 nm。
3.根据权利要求1或2所述的过氧化铜透皮微针系统，其特征在于，所述微针针体中过氧化铜纳米颗粒的掺杂含量为1wt%～50wt%，优选为2.5 wt %～10 wt %。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的过氧化铜透皮微针系统，其特征在于，所述微针针体的形状为棱锥；所述棱锥的高度为200～1000μm；所述棱锥的底边长为50～400μm。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的过氧化铜透皮微针系统，其特征在于，所述微针基底的材料组成选自聚乙烯吡络烷酮、聚乙二醇、透明质酸、聚己内酯、聚乳酸、壳聚糖中的至少一种；所述微针针体的基质材料选自聚乙烯吡络烷酮、聚乙二醇、透明质酸、聚己内酯、聚乳酸、壳聚糖中的至少一种。
6.一种权利要求1-5中任一项所述的过氧化铜透皮微针系统的制备方法，其特征在于，通过模版法和真空处理过程制备所述过氧化铜透皮微针系统，包括：
（1）将过氧化铜纳米颗粒、基质材料和溶剂混合，得到第一混合浆料；将微针基底材料和溶剂混合，得到第二混合浆料；
（2）将第一混合浆料加入到聚二甲基硅氧烷微针模具中，利用真空处理使得第一混合浆料填充到微针针体的模具尖端中，然后去除多余的第一混合浆液并干燥；
（3）将第二混合浆料加入到聚二甲基硅氧烷微针模具中，利用真空处理和二次干燥以形成微针基底，最终得到过氧化铜透皮微针系统。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述干燥的温度为25～60℃，时间为1～24小时；所述二次干燥的温度为25～60℃，时间为1～24小时。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为去离子水、纯水、超纯水中的至少一种；所述真空处理的真空度≤0 MPa。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在碱性溶液条件下、以聚乙烯吡络烷酮为稳定剂，制备得到过氧化铜纳米颗粒；优选地，具体步骤包括：将聚乙烯吡络烷酮和铜源加入溶剂中搅拌至完全溶解，再加入配制好的氢氧化钠水溶液搅拌，最后加入过氧化氢进行反应，再经离心、水洗和干燥，得到所述过氧化铜纳米颗粒；更优选地，所述铜源为含铜的盐类，最优选为CuCl2·2H2O；所述的溶剂为去离子水、纯水、超纯水中的至少一种。
10.一种权利要求1-5中任一项过氧化铜透皮微针系统在制备抗浅表层肿瘤材料中的应用。
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