CN115025065B - 刺激响应性多功能靶向微型机器人及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种刺激响应性多功能靶向微型机器人及其制备方法和应用，该微型机器人的制备方法包括：(1)将Zn(NO3)2和HCl溶于乙醇溶液中，加入Fe3O4微球，然后加入2‑甲基咪唑，混合物室温下超声20分钟，磁体收集产物；(2)将步骤(1)所得产物用水分散，加入阿霉素搅拌24h，磁体分离产物；(3)将步骤(2)所得产物与盐酸多巴胺按质量比1:1混合，分散于Tris缓冲液中，室温搅拌反应9‑24小时，用磁体收集产物；(4)将步骤(3)所得产物与海藻酸钠溶液混合，通过静电纺丝逐滴添加到CaCl2溶液中，即得所述微型机器人。本发明提供的微型机器人可精准控制磁场，引导微型机器人精确靶向癌细胞，并使化学‑光热疗法相结合，实现卓越的抗肿瘤功效。

Description

刺激响应性多功能靶向微型机器人及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微型机器人制备技术领域，具体涉及一种刺激响应性多功能靶向微型机器人及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是目前世界上严重危害人类健康和生命的疾病之一。临床上虽有多种抗肿瘤药物可供使用，但由于肿瘤病因的复杂性、肿瘤的耐药性及抗肿瘤药物的毒副作用等因素，现有药物或治疗方式仍不能完全满足肿瘤治疗的需要，因此寻找新的疗法或开发药效高的智能型递药系统具有重要意义。
尽管载药纳米颗粒在临床上有一定成效，但是传统临床手术、放疗及化疗治疗手段仍存在诸多缺陷，如易复发、缺乏靶向性、多药耐药性及严重毒副作用限制其进一步发展。因为纳米颗粒仅靠体内的循环和渗透作用不能有效地靶向肿瘤，并不能直达肿瘤的深处。有研究表明，纳米粒的尺寸大小与细胞的胞吐呈负相关，即靶向性好的小粒径的粒子也更容易被代谢到体外，这降低了药物在肿瘤部位的滞留时间，一定程度上降低了药物的作用效果，纳米药物在肿瘤部位的滞留时间短的问题仍有待解决。
迄今为止，包括化学疗法和放射疗法在内的传统方法广泛用于手术切除后的临床癌症治疗。尽管这些治疗方法的抗肿瘤治疗效果取得了重要进展，但它们仍然存在许多不可避免的缺点：耐药性、健康组织的严重毒性、化疗药物在实体瘤中的血管分布不均匀、切除不完全，不可避免的肿瘤复发和手术中患者总生存率低，以及由于高剂量X射线照射和放疗恶性肿瘤的辐射抗性导致的全身副作用。最近，为了克服这些缺点并提高抗肿瘤治疗效果，不同药物和机制的治疗方法的组合被认为是抑制肿瘤生长和预防转移的有效且有前景的策略。
因此，构建多功能癌症治疗系统，将多种疗法结合起来，实现更有效的癌症治疗，仍然是一项值得进一步研究的重要任务。在各种联合疗法中，光热疗法(PTT)与化学疗法相结合，通过精确控制药物释放、降低多药耐药性、提高治疗效果，已成为一种很有前景的癌症治疗策略。化学-光热疗法的有效结合，与单独治疗相比，不仅可以显着提高协同抗肿瘤功效，而且可以促进药物释放，从而达到增强的化疗效果。此外，纳米粒子介导的热疗产生的热量可以按需方式定位在肿瘤内部，并且可以通过控制外源光源的时间和强度来精确调节温度升高。
PTT剂可以在近红外光照射下有效地将光能转化为热能，最终诱导肿瘤局部致命的高温，同时最大限度地减少对周围健康组织的伤害。更有价值的是，PTT可以通过改善细胞代谢和细胞膜通透性来协同提高治疗效果，从而促进细胞对抗癌药物的摄取。然而，目前可用的PTT剂如Au-基、Ag-基和Pd-基金属纳米颗粒(NPs)、碳基纳米材料由于易聚集、光稳定性差以及由化学物质引起的严重不良反应，尚难以实现临床应用。因此，开发更有用的PTT剂以避免上述缺点很重要。
在最近的研究中，聚多巴胺(PDA)在结构上与天然黑色素相似，是一种广泛分布于几乎所有生物体中的生物聚合物，由于其良好的生物相容性、卓越的生理稳定性和强近红外光(NIR)吸收能力。PDA作为PTT剂，具有40％左右的优异光热转换效率，远高于目前大多数PTT剂。在808nm-NIR激光照射下，PDA可以有效地将光能转化为热能，诱导肿瘤细胞的原位热疗和热消融。
在肿瘤的靶向治疗过程中，微型机器人由于结构尺寸微小、器件精密，能够在不同的液体环境中游动，由在其周围传播的化学燃料或外部能源(例如磁场、电场、超声波和光)提供动力，应用前景十分广阔。这些小型设备已用于许多应用，特别是在生物医学领域，由于能够将治疗剂或细胞输送到人体难以到达的部位，微型机器人有可能彻底改变医学的许多领域。这一研究领域的进展与材料科学和微纳米制造的进步有着根本的联系，虽然许多最近开发的材料适合作为微型机器人平台的组件，但将它们同化为高度集成的多功能设备一直是一个持续的挑战。如携带药物的纳米机器人在病人服用之后可以通过外部的磁场控制人体内的纳米机器人移动至病灶，再释放携带的药物进行治疗，但是在现有技术中，纳米机器人药物释放的速度通常较慢，治疗效果较差，目前已被报道的制备磁性载药纳米机器人的方法大多还都停留在实验阶段，存在着初始药物突释、尺寸均匀性低等问题。
因此，如何有效结合化学-光热疗法，并利用微型机器人的靶向操作性，提供一种刺激响应性靶向多功能微型机器人及其制备方法，用于显著提升靶向治疗肿瘤的效果，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明就是为了解决上述技术问题，从而提供一种刺激响应性多功能靶向微型机器人及其制备方法和应用。本发明的技术目的在于：提供一种可以显著提升靶向治疗效果、且能够很好结合化学-光热疗法进行肿瘤治疗的微型机器人，解决现有微型机器人的靶向治疗效果差和不具备多功能刺激响应性的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明首先提供了一种刺激响应性多功能靶向微型机器人的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将Zn(NO3)2和HCl添加到乙醇溶液中，将Fe3O4微球分散在上述乙醇溶液中得到悬浮液，然后将含2-甲基咪唑的乙醇溶液添加到上述悬浮液中，所述Zn(NO3)2、HCl和2-甲基咪唑的摩尔比为10:1:100，将得到的混合物在室温下超声20分钟，用磁体收集产物，并用乙醇和水洗涤产物；
(2)将步骤(1)所得产物用水分散，然后加入阿霉素搅拌24h，通过磁体分离产物；
(3)将步骤(2)所得产物与盐酸多巴胺按质量比1:1混合，分散在Tris缓冲液中，在室温下搅拌反应9-24小时，用磁体收集产物；
(4)微型机器人的制备
将步骤(3)所得产物与海藻酸钠溶液混合，通过静电纺丝逐滴添加到CaCl2溶液中，即得所述微型机器人。
本发明提供的上述微型机器人的制备方法，是针对于现有肿瘤治疗中存在的问题，将物理学和材料科学等多个学科知识结合起来，设计、制造出了一种刺激响应性多功能靶向微型机器人，该微型机器人可以很好作为肿瘤药物的递送系统，对内部(酸性pH)和外部(光)有刺激性响应，并且可以通过精准控制磁场，引导微型机器人靶向癌细胞，并使化学-光热疗法相结合，实现卓越的抗肿瘤功效。
为了很好构建出具有刺激响应性的多功能靶向微型机器人，本发明开发出了一种以多巴胺(PDA)包覆均匀分散的纳米粒子Fe3O4@ZIF-8/DOX，获得了一种Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA核-壳磁性纳米复合材料(NCs)，该复合材料以Fe3O4为核和ZIF-8为壳，并进一步将功能化的磁性纳米复合材料聚合成微球，形成本发明的微型机器人。
本发明提供的微型机器人在近红外(NIR)区域表现出强烈的吸收，并具有优异的光热效率，对亲水性抗癌药物阿霉素(DOX)具有很强的存储/输送能力。在低pH值下，由于表面PDA和ZIF-8的破坏，DOX的释放量得到不断增加。当负载DOX的微型机器人在近红外辐照下时，由于纳米颗粒产生的热量，局部温度迅速升高，导致DOX从ZIF-8壳中释放得更快。通过精确控制磁场，引导微机器人靶向癌细胞，结合化学-光热联合疗法，能够显著提升其抗肿瘤效果。总的来说，该刺激响应性多功能靶向微型机器人在未来的癌症治疗中显示出巨大的潜力。
进一步的是，步骤(1)中所述Fe3O4微球的制备方法包括以下步骤：
将FeCl3·6H2O、乙酸钠和柠檬酸钠按摩尔比1:6:0.3混合后溶解在乙二醇中，得到均匀黄色溶液，然后转移至高压釜中，加热至200℃持续反应10h，反应结束后，用磁体分离产物，并用乙醇和水洗涤产物。
进一步的是，步骤(1)中所述乙醇溶液的质量浓度为50％。
进一步的是，步骤(1)中所述Fe3O4微球与HCl的摩尔比为3:4。
进一步的是，步骤(2)中所述步骤(1)所得产物与阿霉素的质量比为4:1。
进一步的是，步骤(3)中所述Tris缓冲液的浓度为10mM，pH＝8.5。
进一步的是，步骤(3)中所述海藻酸钠溶液的浓度为16mg·mL-1，所述CaCl2溶液的浓度为13mg·mL-1。
本发明还提供了一种由上述制备方法制得的刺激响应性多功能靶向微型机器人。
本发明还提供了上述刺激响应性多功能靶向微型机器人的应用，其包括将该微型机器人制备成用于肿瘤治疗的相关靶向载体。或是，将该微型机器人制备成用于肿瘤治疗的相关药物。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明将物理学和材料科学等多个学科知识结合起来，设计、制造出了一种基于智能纳米载体的药物递送系统——刺激响应性多功能靶向微型机器人，该微型机器人对内部(酸性pH)和外部(光)均有刺激性响应；
(2)本发明提供的微型机器人，其中多巴胺作为覆盖层，除了可作为治疗成分，具有良好的光热传导效率之外，同时在生理环境下可有效降低运输过程中的药物泄露，多巴胺介导的热疗产生的热量可以按需方式定位在肿瘤内部，并且可以通过控制外源光源的时间和强度来精确调节温度升高；
(3)本发明提供的微型机器人，可以通过精准控制磁场，引导微型机器人精确靶向癌细胞，并使化学-光热疗法相结合，实现卓越的抗肿瘤功效。
附图说明
图1为NIR 808nm，2.0W·cm-2辐照下各纳米颗粒样品的光热性能；其中：(A)Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA在不同样品浓度下的光热性能；(B)ZIF-8、Fe3O4、Fe3O4@ZIF-8、Fe3O4@ZIF-8/DOX和Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA分散体(1000·μg mL-1)的温度升高趋势；(C)Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA样品经五次循环后的光热性能；(D)Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA样品在808nm激光照射下的红外成像。图2中：(A，B，C，D)不同条件下4T1细胞体外细胞毒性试验曲线；(E)CalceinAM/PI染色4T1细胞不同处理后的荧光图像：(a)空白对照；(b)只采用激光照射；(c)Fe3O4@ZIF-8/PDA；(d)Fe3O4@ZIF-8/PDA NCs激光辐照；(e)仅载DOX的Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA NCs；(f)Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDANCs激光辐照，NC浓度为129μg·mL-1，近红外辐照(2.0W·cm-2，5min)(比例尺：100μm)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明提供了一种刺激响应型靶向多功能微型机器人，其制备方法包括以下步骤：
(一)Fe3O4微球的制备
将FeCl3·6H2O(6.8g)、乙酸钠(12.0g)和柠檬酸钠(2.0g)溶解于乙二醇(200mL)中，得到均匀黄色溶液，将其转移至高压釜中，然后加热至200℃持续反应10h，反应结束后，用磁体分离产物，并用超纯水和乙醇反复洗涤几次，得到Fe3O4微球。
(二)Fe3O4@ZIF-8微球的制备
将Fe3O4微球(0.35g)分散在20mL的含2mmol Zn(NO3)2和0.2mmol HCl的50％乙醇溶液中，得到悬浮液，然后将40mL的含有20mmol 2-甲基咪唑(HMeIM，CAS号：693-98-1)的50％乙醇溶液添加到上述悬浮液中，将得到的混合物在室温下超声20分钟，用磁体收集产物，并用乙醇和水洗涤，得到Fe3O4@ZIF-8微球。
(三)Fe3O4@ZIF-8/DOX的制备
将Fe3O4@ZIF-8微球(0.03g)分散在15mL RO水(渗透水)中，加入7.5mg DOX(阿霉素，抗癌药物)搅拌24h，然后通过磁体分离产物，取上层清液，在最大吸收波长480nm处用紫外分光光度计测定其吸光度，根据载药前和载药后阿霉素质量浓度的变化，求得Fe3O4@ZIF-8/DOX材料的载药量和封装效率；
负载量的计算公式如下：
载药量％＝装载的DOX重量/(Fe3O4@ZIF-8/DOX总重)×100％
封装效率％＝装载的DOX重量/加入DOX总重×100％。
(四)Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA的制备
将12.5mg盐酸多巴胺(PDA)和12.5mg Fe3O4@ZIF-8/DOX分散在20mL Tris缓冲液(10mM，pH＝8.5)中，在室温下搅拌9小时并用磁体收集产物，得到Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA(记为NCs)。
(五)微型机器人的制备
将Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA添加到新鲜制备的海藻酸钠(16mg·mL-1)溶液中，混合均匀，再通过静电纺丝逐滴添加到CaCl2(13mg·mL-1)溶液中，制备成微型机器人(MOFBOT)。
实验例1
对实施例1各步骤中所得材料的性能进行研究。
(一)实验方法
1、不同纳米粒子的光热性能
将实施例1中各步骤所得不同的纳米颗粒样品各取1mg分别分散在1mL超纯水中，然后将这些样品分别用NIR激光(808nm)以2.0W·cm-2的功率密度照射5分钟，以研究不同纳米粒子在水溶液中的光热性能。
通过用NIR激光(808nm)以2.0W·cm-2的功率密度照射浓度分别为0.05mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.25mg·mL-1、0.5mg·mL-1和1mg·mL-1的Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA，使用红外热像仪记录温度，每30秒记录一次，以研究Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA在不同浓度下的光热性能。
2、体外细胞毒性
为了研究纳米载体的细胞毒性，将4T1细胞(小鼠乳腺癌细胞，来源于TCC菌种典藏中心(Manassas,VA,USA))与不同浓度的各种纳米载体共孵育。将4T1细胞(每孔1×104个细胞)接种到装有100μL培养基(10％FBS的DMEM/HIGH GLUCOSE培养基)的96孔板中，并在5％CO2的37℃条件下保持过夜，用溶于新鲜培养基的不同浓度的纳米颗粒代替培养基，并与4T1细胞孵育48小时，然后除去培养基，在每个孔中添加入20μLMTT(噻唑蓝，5mg·mL-1)并与细胞温育4小时以形成紫色甲臜产物，除去未反应的染料和培养基，并向每个孔中加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，摇动溶解甲臜，使用酶标仪在490nm波长下测量每个孔的吸光度。
取另一块96孔板用于研究近红外激光对细胞活力的影响。将4T1细胞与不同浓度的不同纳米载体孵育4小时，然后分别用功率密度为2W·cm-2的808nm激光辐照细胞5分钟。根据上述方法孵育后，使用酶标仪在490nm波长下测量每个孔的吸光度。
细胞存活率计算公式如下：
细胞存活率％＝(实验组OD值-凋零组OD值)/(对照组OD值-凋零组OD值)×100％
3、化学光热协同疗法
活/死双重染色法用于评估细胞水平上的化学光热疗法。采用钙黄绿素乙酰氧基甲酯(CalceinAM)将活细胞染成绿色，而碘化丙啶(PI)染料将死细胞染成红色，将浓度为129μg·mL-1的各样品(空白Fe3O4@ZIF-8/PDA和装载DOX的Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA)与细胞一起孵育，用808nm的激光以2W·cm-2的功率密度照射相应孔5分钟，同时将仅用激光辐照处理的细胞以及没有Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA和激光辐照的空白对照组分别进行比较。
(二)实验结果
1、光热效应
为了检验Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA的光热性能，采用NIR激光(808nm，2W·cm-2)照射样品300s，研究了不同浓度下Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA样品的温度变化(如图1中A分图)。使用红外热像仪(FLIRT620，美国)对Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA溶液(浓度分别为50、100、250、250和1000μg·mL-1)在18℃下进行测试，清楚地观察到了光热图像的颜色变化(如图1中D分图)。结果发现，随着辐照时间的增加以及Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA浓度的增加，溶液温度迅速升高，即使在250μg·mL-1的低浓度下，溶液温度也很容易加热到42℃以上，从而可以更有效地杀死癌细胞。
如图1中A分图所示，选择NIR激光(808nm，2W·cm-2)和纯水照射的不同时间间隔作为对照，在500μg·mL-1下仅照射5分钟后，溶液温度从18℃升高到62.5℃。光热图像的颜色从蓝色明显变为红色，而纯水图像的颜色随时间增加几乎没有变化，并且在相同的照射下水的温度几乎没有变化(仅升高1.7℃)。五次循环实验后，纳米颗粒仍然保持着良好的光热性能(如图1中C分图)。对照实验可得，1000μg·mL-1的Fe3O4微球在NIR激光(808nm，2W·cm-2)照射300s后，溶液温度从18℃升高到48.1℃(如图1中B分图)。
2、4T1细胞的细胞毒性和化学光热协同疗法测定
为了最终揭示该pH和NIR响应系统将通过化学-光热协同疗法的方法有效杀死细胞，从倒置荧光显微镜获得了不同条件下细胞的荧光图像。CalceinAM，中文名钙黄绿素乙酰氧基甲酯，是一种可渗透进入细胞、常用于测定真核细胞活力或线粒体通透性转换孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore,MPTP)的绿色荧光探针，钙黄绿素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶(PI)试剂盒(Solarbio Technology)用于标记活/死细胞。选择CalceinAM的非荧光染料，其可以渗透到细胞膜中并被细胞内酯酶水解为活细胞中钙黄绿素的绿色荧光染料，以表明细胞的活力。碘化丙啶(PI)的另一种细胞核染料仅能穿过受损的细胞膜并嵌入双链DNA中，从而在死细胞中显示红色荧光，用于评估Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA的协同治疗效果。
如图2中E分图的a部分和b部分所示，未进行任何处理的细胞显示出亮绿色的荧光，这表明该样品具有很高的细胞活力；即使在用NIR激光(808nm，2W·cm-2)照射这些细胞5分钟之后，细胞仍然保持优异的生存力。从图2中E分图进一步可知，该结果明显地表明，在功率密度为2.0W·cm-2的情况下，NIR激光对细胞的杀灭能力低，仅接受NCs和激光治疗的细胞死亡可忽略不计(红色)。但是，当将细胞与Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA孵育4小时后，能够观察到部分细胞死亡，在细胞内酸性条件下从降解的Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA中释放的DOX是导致细胞死亡的主要原因。
此外，当用NIR激光照射细胞5分钟时，几乎所有细胞都死亡了，相比之下，与单次使用DOX的NCs(化学疗法)或使用NIR的NCs(光热疗法)相比，使用NIR辐照的DOX加载的NCs表现出最高的细胞死亡率(如图2中E分图d和f部分)。这些结果表明，Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA系统确实在化学光热协同治疗中具有有效的治疗效果。
为了进一步定量评估Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA的协同治疗效果，随后研究了另一种MTT测定实验。从图2中A-D分图可知，在没有NIR激光照射下，Fe3O4、Fe3O4@ZIF-8和Fe3O4@ZIF-8/PDA的纳米颗粒显示出低细胞毒性。但是，当细胞与Fe3O4@ZIF-8/PDA孵育4小时，接着用NIR激光照射5分钟继续孵育44小时后发现，随着Fe3O4@ZIF-8/PDA浓度的逐渐增加，细胞活力出现了急剧下降。该结果证实了Fe3O4@ZIF-8/PDA具有优异的光热治疗能力，其可以将NIR光转换成热并随后杀死细胞。类似地，当将细胞与Fe3O4@ZIF-8/DOX一起孵育48小时，Fe3O4@ZIF-8/DOX也显示出一定程度的细胞毒性，并且该细胞毒性类似于游离DOX的细胞毒性。近红外照射前Fe3O4@ZIF-8/DOX的细胞毒性主要归因于内吞后该系统的DOX释放行为。
为了研究最终的协同治疗效果，将已用Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA预处理4小时的细胞用NIR激光照射5分钟。如图2所示，在这些条件下，样品浓度为129μg·mL-1时，细胞活力仅为8.37％，该值低于NIR照射的Fe3O4@ZIF-8/PDA和没有NIR照射的Fe3O4@ZIF-8/DOX。这些结果再次表明，Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA系统具有高效的协同治疗作用，这种协同治疗能力为Fe3O4@ZIF-8/DOX/PDA在癌症治疗领域促进多功能纳米载体的开发提供了机会。

Claims (10)

1.一种刺激响应性多功能靶向微型机器人的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将Zn(NO3)2和HCl添加到乙醇溶液中，将Fe3O4微球分散在上述乙醇溶液中得到悬浮液，然后将含2-甲基咪唑的乙醇溶液添加到上述悬浮液中，所述Zn(NO3)2、HCl和2-甲基咪唑的摩尔比为10:1:100，将得到的混合物在室温下超声20分钟，用磁体收集产物，并用乙醇和水洗涤产物；
(2)将步骤(1)所得产物用水分散，然后加入阿霉素搅拌24h，通过磁体分离产物；
(3)将步骤(2)所得产物与盐酸多巴胺按质量比1:1混合，分散在Tris缓冲液中，在室温下搅拌反应9-24小时，用磁体收集产物；
(4)将步骤(3)所得产物与海藻酸钠溶液混合，通过静电纺丝逐滴添加到CaCl2溶液中，即得所述微型机器人。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述Fe3O4微球的制备方法包括以下步骤：
将FeCl3·6H2O、乙酸钠和柠檬酸钠按摩尔比1:6:0.3混合后溶解在乙二醇中，得到均匀黄色溶液，然后转移至高压釜中，加热至200℃持续反应10h，反应结束后，用磁体分离产物，并用乙醇和水洗涤产物。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述乙醇溶液的质量浓度为50％。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述Fe3O4微球与HCl的摩尔比为3:4。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述步骤(1)所得产物与阿霉素的质量比为4:1。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述Tris缓冲液的浓度为10mM，pH＝8.5。
7.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述海藻酸钠溶液的浓度为16mg·mL-1，所述CaCl2溶液的浓度为13mg·mL-1。
8.一种如权利要求1-7任一项所述制备方法制得的刺激响应性多功能靶向微型机器人。
9.如权利要求8所述刺激响应性多功能靶向微型机器人的应用，其特征在于，所述应用包括将该微型机器人制备成用于肿瘤治疗的相关靶向载体。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括将该微型机器人制备成用于肿瘤治疗的相关药物。
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