CN117652418A - 一种莲的愈伤组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，更具体地，涉及一种莲的愈伤组织培养方法，更具体地，涉及一种并蒂莲的愈伤组织培养方法。本发明提供了一种莲的愈伤组织培养方法，包括：S1、将莲子进行表面消毒并转入无菌环境，然后剥离莲心作为诱导外植体；S2、对莲心进行预诱导；S3、再对莲心进行诱导；以及S4、对所述诱导后的愈伤组织进行培养。发现使用特定方式剥离的莲心并通过分步诱导的方式对莲进行培养，其污染率低且重复性高，同时能够获得较高的诱导率，并且褐化时间慢，材料存活率高。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，更具体地，涉及一种莲的愈伤组织培养方法，更具体地，涉及一种并蒂莲的愈伤组织培养方法。
背景技术
植物组织培养技术不仅可以使植株快速繁殖，还可保持植物基因和性状的稳定性，在植物离体快繁和基因遗传研究中应用广泛。
并蒂莲是莲属多年生草本植物，是荷花中的极品，象征着百年好合、永结同心。它出现概率是十万分之一,十分罕见，无法人工复制极为珍贵。并蒂莲的出现属于自然偶然生长现象，无法通过莲藕及种子进行繁殖和繁育。通过植物组培的方法，可以将并蒂莲花器官进行种质资源保存，用于并蒂莲再生苗的研究以及并蒂莲特殊特殊花器官研究材料的保存。
目前，关于莲的组织培养研究较少，且外植体选择多集中在莲藕的顶芽和叶芽部位。李佳等以莲藕顶芽和侧芽为外植体诱导得到莲藕愈伤组织，诱导率在20％以上。熊雅倩等采用了授粉后形成莲子9天的种子胚芽为外植体，平均诱导率为23.7％，但是继代培养80天后莲愈伤组织基本都褐化死亡。多数研究虽然可得到愈伤组织，但外植体取材有特定要求，且后续继代培养都不可避免出现褐化死亡现象，导致诱导出愈伤组织不能长时间继代留存。虽然有报道利用莲茎尖和优胚为外植体，诱导出愈伤组织且再生出植株的报道，但是实验条件的可重复性差，诱导出的愈伤组织继代和褐化严重，不能得到解决。
本领域需求一种莲的愈伤组织培养方法，其可重复性好，诱导率高，同时褐化率低。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种莲的愈伤组织培养方法，包括：
S1、将莲子进行表面消毒并转入无菌环境，然后剥离莲心作为诱导外植体；
S2、对莲心进行预诱导；
S3、再对莲心进行诱导；以及
S4、对所述诱导后的愈伤组织进行培养。
申请人创造性的发现使用特定方式剥离的莲心并通过分步诱导的方式对莲进行培养，其污染率低且重复性高，同时能够获得较高的诱导率，并且褐化时间慢，材料存活率高。
进一步地，所述S1步骤中表面消毒使用消毒剂进行消毒。
在一个具体的实施方案中，所使用的消毒剂为八四消毒剂或者乙醇。
进一步地，所述消毒剂中有效氯离子的质量分数为5.1％～6.9％，举例地，可以为5.2％、5.4％、5.6％、5.8％、6％、6.2％、6.4％、6.6％、6.8％；所述乙醇为体积比为75％的乙醇。
进一步地，所述S2步骤预诱导使用的预诱导培养基包括：MS、蔗糖、琼脂、6-BA、NAA中的一种或多种。
更进一步地，所述蔗糖在预诱导培养基中的质量浓度为1-5％，举例地，可以为1％、2％、3％、4％、5％，优选为3％。
更进一步地，所述琼脂在预诱导培养基中的浓度为10-15g/L，举例地，可以为10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L。优选为12g/L。
更进一步地，所述6-BA在预诱导培养基中的浓度为0.8-1.5mg/L，举例地，可以为0.8mg/L、0.9mg/L、1.0mg/L、1.1mg/L、1.2mg/L、1.3mg/L、1.4mg/L、1.5mg/L，优选为1mg/L。
更进一步地，所述NAA在预诱导培养基中的浓度为0.1-0.5mg/L，举例地，可以为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L，优选为0.5mg/L。
更进一步地，所述预诱导为25℃光照培养10天。
进一步地，所述S3步骤诱导使用的诱导培养基包括：2,4-D、6-BA、NAA中的一种或多种。
更进一步地，所述2,4-D在诱导培养基中的浓度为3.0～6.0mg/L，举例地，可以为3.0mg/L、3.5mg/L、4.0mg/L、4.5mg/L、5.0mg/L、5.5mg/L、6.0mg/L，优选为4.0mg/L。
更进一步地，所述6-BA在诱导培养基中的浓度为0.2-0.5mg/L，举例地，可以为0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L，优选为0.3mg/L。
更进一步地，所述NAA在诱导培养基中的浓度为0.1-0.5mg/L，举例地，可以为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L，优选为0.5mg/L。
进一步地，所述S4步骤中培养愈伤组织的培养基中具有抗褐化剂。进一步地，所述抗褐化剂为活性炭、抗坏血酸、抗坏血酸钙、抗坏血酸钠、维生素B6和L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水化合物中的一种或多种。优选地，所述抗褐化剂为活性炭、抗坏血酸钙，或抗坏血酸钠。更优选地，所述抗褐化剂为抗坏血酸钙。
更进一步地，所述活性炭在培养愈伤组织的培养基中的质量浓度为0.01％-0.05％，举例地，可以为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％，优选为0.01％。
更进一步地，所述抗坏血酸钙在培养愈伤组织的培养基中的浓度为0.1～0.5g/L，举例地，可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L，优选为0.1g/L。
更进一步地，所述抗坏血酸钠在培养愈伤组织的培养基中的浓度为0.1～0.5g/L，举例地，可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L，优选为0.1g/L。
进一步地，所述S4步骤中培养愈伤组织的培养基中具有凝固剂。进一步地，所述凝固剂为琼脂、卡拉胶和结冷胶中的一种或多种。优选地，所述凝固剂为结冷胶。
进一步地，所述S4步骤中培养愈伤组织的培养基中包括：2,4-D、NAA、TDZ中的一种或多种。
更进一步地，所述2,4-D在培养基中的浓度为1.0-2.0mg/L，举例地，可以为1.0mg/L、1.2mg/L、1.4mg/L、1.6mg/L、1.8mg/L、2.0mg/L，优选为1.0mg/L。
更进一步地，所述NAA在培养基中的浓度为0.1-0.3mg/L，举例地，可以为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L，优选为0.1mg/L。
更进一步地，所述TDZ在培养基中的浓度为0.1-0.3mg/L，举例地，可以为0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L，优选为0.1mg/L。
在一个具体的实施方案中，所述S4步骤中培养愈伤组织的培养基中包括：2,4-D、NAA、TDZ，所述的抗褐化剂为抗坏血酸钙。
申请人创造性的发现使用抗坏血酸钙，并搭配2,4-D、NAA、TDZ，能够获得更好的诱导率和更低的褐化率，并且存活率更高。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、不同部位外植体的预诱导的污染程度
对并蒂莲各部位外植体进行表面消毒，采用84消毒液(有效氯含量为：5.1％～6.9％)处理20分钟，在预诱导培养基(MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+1mg/L6-BA+0.5mg/L NAA)上培养5天，并验证其出现杂菌的时间和污染程度(培养基表面出现黏液状菌斑，或者培养基上出现绒毛状菌丝，则为出现杂菌。+，++，+++是污染程度的分布情况，+代表污染率＜30％，++代表污染率31-60％
，+++代表污染率＞60％)，结果如表1所示，从表中可以看出莲心污染率最低且污染率重复可控，适合用于后续的愈伤组织预诱导。
表1
实施例2、莲心不同获取方式对诱导的影响
本实施例对莲心的获取方式进行了研究，通过控制氯离子的质量分数浓度和剥离时间，对褐化和诱导率进行了研究，结果如表2所示，从表2中可以看出，先对莲子进行84表面消毒后再无菌条件下分离出莲心诱导愈伤组织，污染率低且诱导率较高(诱导条件为：在MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+1mg/L6-BA+0.5mg/L NAA的条件下，25℃光照培养10天进行预诱导后，再经诱导条件MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+4.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA的条件下25℃黑暗条件下处理)。
其中，愈伤组织诱导率＝诱导成功数量/总诱导处理的外植体数量*100％
表2
注：“+”表示程度较轻；“++”表示程度较重；“+++”表示程度严重；“-”表示无该情况发生。
实施例3、不同诱导方式对莲诱导率的影响
本实施例对不同诱导方式的莲诱导率和褐化时间进行了研究。
预诱导+诱导的条件：经将莲心消毒灭菌后，在MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA的条件下，25℃光照培养10天进行预诱导后，再经诱导条件MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+4.0mg/L 2,4-D+0.1mg/LNAA的条件下25℃黑暗条件下处理。
直接诱导条件：经将莲心消毒灭菌后，在MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+0.5mg/L6-BA+4.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA的条件下25℃黑暗条件直接诱导。
结果如表3所示，从表3中可以看出，发现25℃光照培养10天进行预诱导后处理的莲心愈伤组织的诱导率在20％以上，而直接诱导的莲心愈伤组织诱导率在10％以下，且出现褐化时间早，一般10天左右诱导出的愈伤组织就开始褐化，一般30天左右90％以上愈伤组织褐化死亡。而经预诱导再进行诱导的莲心愈伤组织褐化时间慢，一般20天后才出现，50天以后约有30％的材料褐化死亡。
表3
| 处理方式 | 诱导率 | 褐化时间 | 褐化率和死亡率 |
| 预诱导+诱导 | ＞20％ | ＞20天 | 30％ |
| 直接诱导 | ＜10％ | ～10天 | 90％ |
实施例4、不同凝固剂对莲褐化率的影响
本实施例研究了不同的凝固剂对莲褐化率的影响。
诱导条件为：经将莲心消毒灭菌后，在MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+1mg/L6-BA+0.5mg/L NAA的条件下，25℃光照培养10天进行预诱导后，再经诱导条件MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+4.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA(pH＝5.8，121℃灭菌15min)的条件下25℃黑暗条件下处理。莲的愈伤组织的继代培养的培养条件为MS+3％蔗糖+凝结剂+抗褐化剂(pH＝5.8，121℃灭菌15min)。
选用了三种凝结剂，具体的凝结剂有琼脂、卡拉胶和结冷胶剂，MS+3％蔗糖(pH＝5.8，121℃灭菌15min)，凝结剂配比如下：7g/L琼脂、12g/L卡拉胶、5g/L结冷胶。具体结果如表4所示，组1-6为平行对照组验证以减少误差。从表4中可以看出，使用结冷胶作为凝固剂能降低莲愈伤组织褐化率。
表4
实施例5、不同抗褐化剂对莲褐化率的影响
本实施例研究了不同的抗褐化剂对莲褐化率的影响。诱导条件为：经将莲心消毒灭菌后，在MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA的条件下，25℃光照培养10天进行预诱导后，再经诱导条件MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+4.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA(pH＝5.8，121℃灭菌15min)的条件下25℃黑暗条件下处理。莲的愈伤组织的继代培养的培养条件为MS+3％蔗糖+5g/L结冷胶+抗褐化剂(pH＝5.8，121℃灭菌15min)。
选用了七种抗褐化剂，具体的抗褐化剂有(1)1g/L活性炭、(2)0.5g/L水解络蛋白+1g/L PVP、(3)0.1g/L抗坏血酸、(4)+0.1g/L抗坏血酸钙、(5)0.1g/L抗坏血酸钠、(6)0.1g/L维生素B6、(7)0.1g/L L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水化合物。具体结果如表5所示，组1-6为平行对照组验证以减少误差，从表5中可以看出，使用抗坏血酸钙、活性炭、抗坏血酸钠能降低莲愈伤组织褐化率。
表5
注：“+”表示程度较轻；“++”表示程度较重；“+++”表示程度严重；“-”表示无该情况发生。
实施例6、本发明培养基对莲培养的影响
本实施例研究了不同的培养基组分对莲愈伤组织褐化率的影响。对经过预诱导+诱导(诱导条件为：经将莲心消毒灭菌后，在MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+1mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA的条件下，25℃光照培养10天进行预诱导后，再经诱导条件MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+4.0mg/L 2,4-D+0.1mg/LNAA(pH＝5.8，121℃灭菌15min)的条件下25℃黑暗条件下处理)，莲的愈伤组织的继代培养的培养条件为MS+3％蔗糖+5g/L结冷胶+0.1g/L抗坏血酸钙(pH＝5.8，121℃灭菌15min)，具体所使用的激素培养基组分的成分如下所示：
A.1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA
B.1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA+0.1mg/L TDZ
C.1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ
D.0,5mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA
E.0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA+0.1mg/L TDZ
F.0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L TDZ
对莲培养结果如表6所示，从表6中可以看出，当使用激素组合B的时候，能够获得最低13.3％的褐化率和最高31.67％的增殖率。
其中，愈伤组织褐化率＝产生褐化的愈伤组织/总的愈伤组织*100％
表6
| 不同激素配比 | A | B | C | D | E | F |
| 愈伤组织褐化率 | 46.7％ | 13.3％ | 16.7％ | 56.5％ | 36.7％ | 20.0％ |
| 愈伤组织增殖率 | 13.3％ | 31.67％ | 16.7％ | 17.4％ | 20.0％ | 16.7％ |
实施例7、本发明愈伤组织培养方法对并蒂莲的培养
步骤S1：对并蒂莲的莲心进行表面消毒，采用84消毒液(有效氯含量为：5.1％～6.9％)处理20分钟，再无菌条件下然后剥离莲心作为诱导外植体。
步骤S2：将诱导外植体在MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+1mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA的条件下，25℃光照培养10天进行预诱导。
步骤S3：预诱导之后，在MS+3％蔗糖+12g/L琼脂+
A.0.5mg/L 6-BA+4.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA
B.0.3mg/L 6-BA+3.0mg/L 2,4-D+0.3mg/L NAA
或C.0.3mg/L 6-BA+6.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L NAA
的条件下25℃黑暗条件进行诱导，获得莲的愈伤组织。
步骤S4：对莲的愈伤组织进行继代培养，使用的培养基为：MS+3％蔗糖+5g/L结冷胶+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L NAA+0.1mg/L TDZ+0.1g/L抗坏血酸钙(pH＝5.8，121℃灭菌15min)。
使用本发明的方法能够获得如下表7的增殖率。
表7
| 组别 | A | B | C |
| 增殖率 | 31.67％ | 26.67％ | 28.89％ |
Claims (10)
1.一种莲的愈伤组织培养方法，包括：
S1、将莲子进行表面消毒并转入无菌环境，然后剥离莲心作为诱导外植体；
S2、对莲心进行预诱导；
S3、再对莲心进行诱导；以及
S4、对所述诱导后的愈伤组织进行培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2步骤预诱导使用的预诱导培养基包括：MS、蔗糖、琼脂、6-BA、NAA中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蔗糖在预诱导培养基中的浓度为1-5％，优选为3％；和/或，所述琼脂在预诱导培养基中的浓度为10-15g/L，优选为12g/L；和/或，所述6-BA在预诱导培养基中的浓度为0.8-1.5mg/L，优选为1mg/L；和/或，所述NAA在预诱导培养基中的浓度为0.1-0.5mg/L，优选为0.5mg/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预诱导为25℃光照培养10天。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3步骤诱导使用的诱导培养基包括：2,4-D、6-BA、NAA中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述2,4-D在诱导培养基中的浓度为3.0～6.0mg/L，优选为4.0mg/L；和/或，所述6-BA在诱导培养基中的浓度为0.2-0.5mg/L，优选为0.3mg/L；和/或，所述NAA在诱导培养基中的浓度为0.1-0.5mg/L，优选为0.5mg/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4步骤中培养愈伤组织的培养基中具有抗褐化剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗褐化剂为活性炭、抗坏血酸、抗坏血酸钙、抗坏血酸钠、维生素B6和L-抗坏血酸2-磷酸盐倍半镁盐水化合物中的一种或多种；优选地，所述抗褐化剂为活性炭、抗坏血酸钙、抗坏血酸钠；更优选地，所述抗褐化剂为抗坏血酸钙。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4步骤中培养愈伤组织的培养基中包括：2,4-D、NAA、TDZ中的一种或多种。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述2,4-D在培养基中的浓度为1.0-2.0mg/L，优选为1.0mg/L；和/或，所述NAA在培养基中的浓度为0.1-0.3mg/L，优选为0.1mg/L；和/或，所述TDZ在培养基中的浓度为0.1-0.3mg/L，优选为0.1mg/L。
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