CN110583484B - 一种毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的方法及其培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的方法及其培养基，属于组织培养技术领域，所述培养基含MS基础培养基、8mg/L核黄素、2mg/L6‑BA、0.1mg/LNAA、30mg/L蔗糖、6.5mg/L琼脂，所述毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的方法包括外植体处理、外植体消毒、防褐化培养三个步骤，能有效降低毛豹皮樟茎段在组织培养中的褐化率，提高增殖系数。

Description

一种毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的方法及其培养基

技术领域

本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的方法及其培养基。

背景技术

毛豹皮樟(Litsea coreana Levl.var.lanuginose(Migo)Yang et P.H.Huang)为樟科木姜子属小乔木，是西南地区古茶饮老鹰茶的主要原料植物。近年来，老鹰茶因富含山奈酚、槲皮素等黄酮类抗氧化物质，具有降血糖、降血脂的功效，且纯天然、无污染、风味独特等特性，深受市场青睐，表现较高的应用价值与经济价值。

毛豹皮樟是雌雄异株植物，果实生长期长且易被鸟雀取食，偶见母树上自然存的种子。种子内含有抑制生根的物质，自然成苗率极低，野生资源的种子繁殖难度高、遗传分化大。其组织中含有大量的多酚类化合物，致使扦插育苗时较难生根。所以采用组培快繁技术是解决毛豹皮樟人工繁育的主要方法之一，但因毛豹皮中的多酚氧化酶被激活，而使细胞内的酚类化合物聚合成暗黑色的大分子物质，组织培养中极易发生褐变，抑制外植体的生长与分化，从而降低组织培养的效率，甚至会导致外植体的死亡。引起褐变的原因包括，植物种类和基因型；外植体的类型和生理状态；外植体的大小和消毒时间；光照和温度；以及培养基成分。因此，选取合适的毛豹皮樟外植体以及进行合理的消毒和培育，调配适当的培养基成分是可以有效降低毛豹皮樟茎段在组织培养中的褐化率、并且提高增殖系数的，为规模化培育毛豹皮樟苗木提供技术指导和科学依据。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的方法及其培养基，能有效降低毛豹皮樟茎段在组织培养中的褐化率，提高增殖系数。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

一种毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的培养基，1L培养基含MS基础培养基、8mg/L核黄素、2mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30mg/L蔗糖、6.5mg/L琼脂，其余用水补齐。

本发明还公开了一种毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的方法，包括以下步骤：

外植体处理：将采摘的外植体放入pvp溶液中，低温浸泡；

外植体消毒：将上述低温浸泡后的外植体转入无菌操作台，用75wt％酒精消毒10s后漂洗干净、滤干水分，再转入液震荡消毒8min，漂洗干净后滤干水分，待用；

防褐化培养：将外植体已褐化部分切除，露出新的切口，切口处蘸取1‰pvp无菌溶液后涂抹防褐凝胶，随后转入防褐化的培养基，避光培养15d后，去掉遮光物，培养得到组培完成的外植体。

进一步，所述外植体选取毛豹皮樟的茎段。

进一步，所述外植体处理步骤中，所述pvp溶液浓度为1‰。

进一步，所述外植体处理步骤中，低温浸泡具体操作为：将外植体于4℃的温度条件下恒温浸泡24h。

进一步，所述外植体消毒步骤中，液震荡是由1‰浓度的pvp和1‰浓度的升汞溶液按照体积比为1:100混合制备而成。

进一步，所述防褐化培养步骤中，避光培养过程中，环境温度为20℃。

进一步，所述防褐化培养步骤中，去掉遮光物后，置于1600lx下培养10d，再调高室温至25℃培养20d。

进一步，所述防褐凝胶含有0.02-0.04wt％的锰离子和0.05-0.06wt％铁离子。

本发明的有益效果如下：

1、本发明将采摘的外植体放入pvp溶液中，低温浸泡，减少了外植体和空气接触的时间，促进水溶性酚类和醌类物质渗出，从源头上降低了外植体在培养过程中发生褐化，并且在防褐化培养步骤中，将防褐凝胶涂覆于切口处后，防褐凝胶中的锰离子、铁离子抑制酶促褐变反应，抑制残余的水溶性酚类和醌类物质褐化，降低褐化率，提高启动率。

2、处理中在培养基加入了核黄素能有效降低毛豹皮樟茎段在组织培养中的褐化率，其中以添加6mg/L核黄素效果最优，褐化率降低74.08％。而且茎段经过pvp溶液低温浸泡后也降低毛豹皮樟的褐化率。

3、采用本发明组织培养的方法可以提高外植体启动率，为规模化培育毛豹皮樟苗木提供技术指导和科学依据，本发明的组织培养方法简单方便，便于推广。

附图说明

图1是本发明实施例1的方法进行毛豹皮樟组织培养的生长情况图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明：

本发明中采用的防褐凝胶按照以下步骤进行制备:

(1)制备溶解液：取新鲜的芦荟汁50ml加入150ml 60wt％的乙醇溶液中，搅拌均匀，随后用频率为35kHz的超声波处理10min，过滤，滤液中加入0.01g硫酸锰和0.02g硫酸亚铁搅拌溶解后二次过滤，得到溶解液；添加含有大量抗氧化物质的芦荟汁液可以防止硫酸亚铁在搅拌过程中氧化，并且对毛豹皮樟的组织培养影响较小。

(2)改性I型卡拉胶：将80ml溶解液水浴加热至65℃，再将2gI型卡拉胶、0.5g刺槐豆胶加入，搅拌溶解后冷却至室温，加入5ml丙二醇、0.01g氧化钙，调节pH＝7，随后于65℃、0.2Mpa的条件下保温3h后取出冷却至室温，得到改性后的I型卡拉胶；

(3)防褐凝胶制备：将步骤(2)得到的改性I型卡拉胶和步骤(1)得到的40ml溶解液混合后加入0.1g卡波姆，调节pH＝8.2-8.5，搅拌均匀，随后置于频率为35kHz的超声波中超声波处理5min，得到防褐凝胶。

经测量，防褐凝胶中铁离子含量为0.05wt％，锰离子含量为0.03wt％。

将常见的、普通的购买于市场的上的5gI型卡拉胶制备成凝胶后,于1300lx的光照强度下，卡拉胶于27h丧失凝胶功能，将按照上述方法制备的5g改性I型卡拉胶按照相同的方法制备成凝胶后，于相同的条件下、1300lx的光照强度下72h未见丧失凝胶功能。

适当的添加铁离子和锰离子可以破坏酶蛋白结构，进而抑制酶促褐变反应，但是铁离子和锰离子浓度应该严格控制，防止切口附近细胞受损。防褐凝胶具有空间网状结构，将铁离子和锰离子牢牢包裹在内，长时间作用于切口处，放置切口褐化，但为了避免I型卡拉胶在长时间的光照下丧失凝胶作用，所以对I型卡拉胶进行改性，延长其凝胶效应，丙二醇在中性条件下醇解I型卡拉胶，降低I型卡拉胶分子量，增加抗氧化活性和稳定性。

实施例1：

制备毛豹皮樟组织培养防褐化培养基：

每升防褐化培养基含有MS基础培养基、2mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30mg/L蔗糖、6.5mg/L琼脂、核黄素，以水作为溶剂，余量为水。设置8个处理，每个处理中加入不同浓度梯度的核黄素如表1所示，每个处理6个平行，3个重复，对照组不添加核黄素，可以按照本领域常规制备培养基的步骤进行操作。MS基础培养基按照本领域技术人员常规采用的配方进行配置。具体处理如表1所示：

表1

	处理1	处理2	处理3	处理4	处理5	处理6	处理7	处理8
									核黄素mg/L	1	2	3	4	5	6	7	8

采用上述制备的培养基进行毛豹皮樟组织培养，步骤如下：

外植体处理：将采摘的茎段洗净后放入1‰pvp溶液中，随后置于4℃的恒温冰箱浸泡24h。

外植体消毒：将上述低温处理后的茎段转入无菌操作台，先用75wt％酒精消毒10s，立刻漂洗干净，并滤干水分，此步骤严格控制酒精消毒时间，不可超过10s，最后转入由体积比为1:100的1‰浓度的pvp和1‰浓度的升汞溶液制备的震荡液中，震荡消毒8min，漂洗干净后滤干水分，待用；

防褐化培养：在无菌滤纸上，切掉茎段已褐化部分，露出新的切口，蘸取1％浓度pvp无菌溶液后涂抹实施例1制备的1g防褐化凝胶，随后分别转入加入不同浓度梯度处理的防褐化的培养基中，每瓶转接3个外植体，置于20℃环境下，避光培养15d后去掉遮光物，置于1600lx下培养10d，再调高室温至25℃，培养20d左右，根据外植体的生长状态，统计褐化情况以及启动情况。统计数据如表2所示：

外植体生长状况判断标准：

长势旺盛：毛豹皮樟外植体芽点处呈深绿色，抽出新芽，新芽健壮，呈碧绿色，且长高；

长势很好：毛豹皮樟外植体生长点处呈浅绿色；有新芽抽出，健壮，且长高；

长势良好：毛豹皮樟外植体生长点处呈浅绿色，新芽萌动率较低，长势较慢；

长势一般：毛豹皮樟外植体生长点呈黄白色，偶见新芽抽出，长势较慢，一段时间后新芽出现脱落现象。

褐化率＝褐化的外植体个数/接种外植体总数×100％

表2毛豹皮樟外植体在实施例1不同处理下生长状况及防褐化情况

从表2实验数据中可以看出，涂抹了防褐化凝胶和添加核黄素以后，能有效降低毛豹皮樟外植体的褐化率，与不添加核黄素和不涂抹防褐化凝胶的处理分别降低了7.41％；7.41％；14.82％；50.00％；59.26％；74.08％；75.93％；77.78％，效果明显。在防褐凝胶用量相同的情况下，随着核黄素浓度的增加，外植体的生长状态反而受到影响。以处理6的效果最好，褐化率较低，芽点长势旺盛。

实施例2

防褐化培养基、防褐凝胶的制备如实施例1。

外植体处理：将采摘的毛豹皮樟茎段清洗干净以后直接转入无菌操作台，不在添加1‰PVP溶液中低温浸泡24h。

外植体消毒：如实施例1。

防褐化培养：如实施例1。

观察毛豹皮樟外植体生长状况，生长状况判断标准：如实施例1。

统计毛豹皮樟外植体褐化率，统计方式如实施例1。

统计褐化率以及生长状况如表3所示：

表3毛豹皮樟外植体在实施例2不同处理下生长状况及防褐化情况

从表3实验数据中可以看出，涂抹了防褐化凝胶和核黄素以后，毛豹皮樟褐化率明显降低，相比不添加核黄素和不涂抹防褐化凝胶的处理，分别降低了9.26％；11.11％；11.11％；27.78％；29.63％；44.44％；46.30％；51.85％。并且和实施例1一样，在防褐凝胶用量相同的情况下，随着核黄素浓度的增加，褐化率逐渐降低，但外植体的生长状态在核黄素达到6mg/L以后受到影响，因此，以培养基中添加6mg/L核黄素适用于毛豹皮樟外植体启动，褐化率较低，长势旺盛。

对比实施例1和实施例2还可以看出，茎段通过1‰pvp溶液中，4℃恒温低温浸泡24h后，有效降低了毛豹皮樟褐化率11.11％；9.26％；7.41％；14.82％；33.33％；40.74％；40.75％；40.74％；37.04％，说明通过1‰pvp低温浸泡，可以从源头上一定程度的降低毛豹皮樟的褐化率。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (4)

1.一种毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

外植体处理：将采摘的外植体放入pvp溶液中，低温浸泡，所述pvp溶液浓度为1‰；

外植体消毒：将上述低温浸泡后的外植体转入无菌操作台，用75wt%酒精消毒10s后漂洗干净、滤干水分，再转入液震荡消毒8min，漂洗干净后滤干水分，待用；所述液震荡是由1‰浓度的pvp 和1‰浓度的升汞溶液按照体积比为1:100混合制备而成；

防褐化培养：将外植体已褐化部分切除，露出新的切口，切口处蘸取1‰pvp无菌溶液后涂抹防褐凝胶，随后转入防褐化的培养基，避光培养15d后，去掉遮光物，培养得到组培完成的外植体；所述外植体选取毛豹皮樟的茎段，所述防褐凝胶含有0.02-0.04wt%的锰离子和0.05-0.06wt%铁离子；

1L所述培养基含MS基础培养基、8mg/L核黄素、2mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30mg/L蔗糖、6.5mg/L琼脂。

2.根据权利要求1所述的一种毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的方法，其特征在于，所述外植体处理步骤中，低温浸泡具体操作为：将外植体于4℃的温度条件下恒温浸泡24h。

3.根据权利要求2所述的一种毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的方法, 其特征在于，所述防褐化培养步骤中，避光培养过程中，环境温度为20℃。

4.根据权利要求3所述的一种毛豹皮樟组织培养中茎段防褐化的方法，其特征在于，所述防褐化培养步骤中，去掉遮光物后，置于1600lx下培养10d后，再调高室温至25℃培养20d。

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