CN115836646B - 一种山桐子的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种山桐子的组织培养方法，属于山桐子组织培养技术领域，所述组织培养方法如下：(1)外植体选择：取山桐子幼嫩带芽枝条作为外植体，并对外植体进行预处理；(2)芽诱导培养：将外植体切成0.5cm大小后进行处理，然后接种到芽诱导培养基中进行芽诱导培养，待萌发出的小芽生长高度达到1㎝时转接进行增殖培养；(3)增殖培养：将诱导出的小芽接种到增殖培养基上培养，形成芽的丛生植株；(4)瓶外生根：在芽的丛生植株中选取2㎝的单芽，将单芽插入穴盘中，20天后生根，生根后再放置15天，然后移出温室在室外培养。解决了山桐子组织培养过程中由于组织新陈代谢紊乱造成成活率和生长状况低下的问题。
Description
技术领域
本发明涉及山桐子组织培养技术领域，尤其涉及一种山桐子的组织培养方法。
背景技术
山桐子，又名油葡萄，属大风子科山桐子属高大落叶乔木，树形优美，秋日果实深红色，花单性，雌雄异株或杂性，圆锥状下垂，是优良的园艺观赏树种。山桐子单株产果量高，全果含油，油脂品质高，兼具多种保健功能，是重要的木本油料物种，被誉为树上“油仓”。
山桐子目前的繁殖方法主要有扦插繁殖，种子繁殖以及组织培养，扦插繁殖法愈伤组织发育良好，但是周期长，繁殖系数低，每年只能增殖1～3倍；种子繁殖法繁殖量大，速度快，但是不能分辨雌雄、品种纯度不高，很容易出现变种；采用组织培养能在短期内提供大量优质穗条和种苗，以保护其种质资源，为山桐子的优良品种的培育及种源基地培育建设提供种苗保障，但是目前山桐子组织培养过程中，外植体伤口处会分泌酚类化合物，其性质很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，迅速生成褐色的醌类物质和水，醌类物质与外植体组织中的蛋白质发生聚合，引起其他酶系统失活，导致植物组织新陈代谢紊乱，进而造成植株生长状况低下，成活率降低。
因此，目前急需一种山桐子组织培养方法，解决山桐子组织培养过程中因植物组织新陈代谢紊乱造成植株生长状况低下、成活率降低的问题。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供一种山桐子组织培养方法，解决山桐子组织培养过程中因植物组织新陈代谢紊乱造成植株生长状况低下、成活率降低的问题。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：
一种山桐子的组织培养方法，所述组织培养包括以下步骤：
(1)外植体选择：于3-4月份采取生长健壮、无病虫害的山桐子优良单株的幼嫩带芽枝条作为外植体，保湿带回实验室，放在水里进行水培，水培期间用质量浓度为0.1％的高锰酸钾溶液喷洒外植体进行预处理，每天喷1次，连续喷3天，然后对外植体进行消毒处理；
(2)芽诱导培养：用镊子将消毒后的外植体切成0.5cm大小后进行低温和二氧化碳处理，然后接种到芽诱导培养基中进行芽诱导培养，并每隔12小时喷洒一次稳定剂，持续喷洒8天，20天后开始出现愈伤组织，带芽茎段侧芽萌发，待萌发出的小芽生长高度达到1㎝后，转接进行增殖培养；
(3)增殖培养：将诱导出的小芽接种到增殖培养基上培养25天，形成芽的丛生植株；
(4)瓶外生根：将生根基质放到灭菌高压锅内120℃高压灭菌30min，冷却后装入孔穴盘中；于芽的丛生植株中选取2㎝的单芽，将单芽用1000ppm生根粉处理30s，然后用镊子将单芽插入穴盘中，每个穴盘扦插一个单芽，然后置于温度为25℃，湿度为85％的温室中进行培养，穴盘上面用塑料盒保温，20天后生根，生根后再放置15天，然后移出温室在室外培养。
进一步，所述步骤(1)中外植体消毒具体操作如下：
将高锰酸钾溶液预处理后的外植体用70％的酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗2-3次，然后置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡3～5分钟，再用无菌水冲洗4-5次。
进一步，所述步骤(2)中芽诱导培养基为：MS+噻苯隆(TDZ)0.2mg/L+α-萘乙酸(NAA)1mg/L+细胞分裂素(6-BA)0.2mg/L+激动素(KT)0.5mg/L。
进一步，所述步骤(2)中低温和二氧化碳处理的具体操作为：将外植体放入玻璃瓶中，通入二氧化碳后密封处理10-20min，然后取出外植体置于4℃温度下处理10-15min。
进一步，所述步骤(2)中稳定剂包括以下重量份原料：
7-10份菌发酵液、0.3-0.5份醋酸铅、1-3份硫化铵、2-3份对氨基苯甲酸乙酯、2-3份硼氢化钾。
进一步，所述稳定剂的制备方法如下：
A、向对氨基苯甲酸乙酯中加入75％乙醇溶液，然后在50-60℃的温度下水浴加热8-10min，水浴加热完成后在室温条件下静置12h后得到对氨基苯甲酸乙酯混合液备用；
B、将醋酸铅、硫化铵、硼氢化钾混合后加入水搅拌均匀，然后加入对氨基苯甲酸乙酯混合液，500-800r/min的速率下高速搅拌5-7min，常温静置3-5h后加入菌发酵液混合均匀得到稳定剂。
进一步，所述菌发酵液为山桐子内生菌发酵培养得到的菌发酵液，具体制备方法如下：
采摘新鲜山桐子叶在无菌水下冲洗3min，冲洗完成后用75％乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗1次，再用10wt％次氯酸钠溶液浸泡15min，然后用无菌水冲洗5次；用无菌滤纸吸干叶片表面水分，然后将叶片剪成0.5cm×0.5cm大小后接种到PDA固体培养基中于25-28℃下培养，在叶片周围长出菌落后挑出菌株放入装有PD培养液的培养瓶中，置于摇床中25-28℃、150r/min培养15-20天，然后离心分离去除沉淀得到菌发酵液。
进一步，所述稳定剂的喷洒量为2-3g/株。
进一步，所述步骤(3)中增殖培养基为：MS+噻苯隆(TDZ)0.7mg/L+α-萘乙酸(NAA)0.3mg/L+细胞分裂素(6-BA)0.5mg/L。
进一步，所述步骤(4)中生根基质由蛭石和珍珠岩按照体积比3：1的比例组成。
在山桐子的组织培养过程中，外植体由于受到机械损伤，其伤口处会分泌酚类化合物，这些物质在多酚氧化酶的催化作用下被氧化成醌类物质，醌类物质会与外植体中的蛋白质聚合，造成酶系统失活，导致植物组织新陈代谢紊乱，进而造成植株生长状况低下，成活率低，因此在组织培养过程中需要对外植体进行处理，保证酶系统的活性，维持山桐子组织正常的新陈代谢，提高其成活率和生长状况；
将外植体放入玻璃瓶中，通入二氧化碳处理后再进行低温处理，可减少醌类物质的形成，这是由于二氧化碳可降低外植体的呼吸作用，进而抑制多酚氧化酶的活性，且多酚氧化酶在低温条件下时，其活性大大降低，进而其催化酚类物质形成醌类物质的作用降低，减少了醌类物质的形成，但是外植体不能长时间放置于二氧化碳和低温环境中，当其离开二氧化碳和低温环境时，多酚氧化酶的活性恢复，外植体中的酚类物质会再被氧化生成醌，造成代谢紊乱，因此需要对外植体进一步处理，减少醌类物质的形成，维持组织正常的新陈代谢；
向外植体持续喷洒稳定剂，稳定剂中的菌发酵液为山桐子内生菌发酵液，山桐子中的内生菌为出芽短梗霉，出芽短梗霉发酵产物中的普鲁兰多糖能够使多酚氧化酶处于较低的活性，降低其催化酚类物质氧化成醌的作用，减少醌类物质的形成，进而降低醌与外植体中的蛋白质结合，维持酶系统的活性，使得组织保持正常的新陈代谢；稳定剂中的醋酸铅作用于外植体分泌的酚类物质，与酚类物质中的羟基结合生成酯类物质，降低了酚类物质的含量，进而减少了醌类物质的生成；多酚氧化酶是一类含铜的氧化还原酶，稳定剂中的硫化铵与多酚氧化酶中的铜反应生成难溶性物质，进而抑制了多酚氧化酶的活性，减少了醌类物质的生成，降低醌类物质与外植体中蛋白质的聚合，进而维持了组织正常的新陈代谢；稳定剂中的对氨基苯甲酸乙酯与生成的醌类物质进行加成反应，阻碍了醌与蛋白质的聚合，保证了其他酶系统的活性，进而维持了组织正常的新陈代谢；稳定剂中的硼氢化钾与醌进行反应，将醌还原成酚类，降低醌的含量，从而减少醌与蛋白质的聚合，维持了酶系统的活性，使得植物组织新陈代谢保持正常，提高了植株的成活率，促进植株的生长。
有益效果：
本发明通过对山桐子外植体进行二氧化碳和低温处理，并持续喷洒稳定剂，可有效降低外植体中醌类物质的生成，减少醌与外植体中蛋白质的聚合，进而保证外植体酶系统的活性，维持组织正常的新陈代谢，并且提高植株的生长状况以及成活率，且该方法便于大规模的工厂化繁育，不受时间和季节的限制，此项技术可广泛用于大风子科山桐子属优良山桐子种苗的快速繁育，并为其它优良种质资源的繁育提供技术借鉴。
附图说明
图1：为本发明山桐子组织培养中芽诱导阶段图片；
图2：为本发明山桐子组织培养中增殖培养阶段芽的增殖图片。
具体实施方式
以下将结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明：
实施例1：稳定剂制备一
在制备稳定剂前先制备了菌发酵液，其制备方法如下：
采摘10g新鲜山桐子叶，在无菌水下冲洗3min，冲洗完成后用75％乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗1次，再用10wt％次氯酸钠溶液浸泡15min，然后用无菌水冲洗5次；用无菌滤纸吸干叶片表面水分，然后将叶片剪成0.5cm×0.5cm大小后接种到PDA固体培养基中于25℃下培养，叶片周围长出菌落后挑出菌株放入装有200mlPD培养液的培养瓶中，置于摇床中25℃、150r/min培养15天，然后离心分离去除沉淀得到菌发酵液。
称取35g菌发酵液、1.5g醋酸铅、5g硫化铵、10g对氨基苯甲酸乙酯、10g硼氢化钾。
制备方法：
A、向对氨基苯甲酸乙酯中加入100g 75％乙醇溶液，然后在50℃的温度下水浴加热8min，水浴加热完成后在室温条件下静置12h后得到对氨基苯甲酸乙酯混合液备用；
B、将醋酸铅、硫化铵、硼氢化钾混合后加入1.65kg水搅拌均匀，然后加入对氨基苯甲酸乙酯混合液，500r/min的速率下高速搅拌5min，常温静置3h后加入菌发酵液混合均匀得到稳定剂。
实施例2：稳定剂制备二
在制备稳定剂前先制备了菌发酵液，制备方法如下：
采摘10g新鲜山桐子叶，在无菌水下冲洗3min，冲洗完成后用75％乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗1次，再用10wt％次氯酸钠溶液浸泡15min，然后用无菌水冲洗5次；用无菌滤纸吸干叶片表面水分，然后将叶片剪成0.5cm×0.5cm大小后接种到PDA固体培养基中于26℃下培养，叶片周围长出菌落后挑出菌株放入装有200mlPD培养液的培养瓶中，置于摇床中26℃、150r/min培养18天，然后离心分离去除沉淀得到菌发酵液。
取40g菌发酵液、2g醋酸铅、10g硫化铵、12.5g对氨基苯甲酸乙酯、12.5g硼氢化钾。
制备方法：
A、向对氨基苯甲酸乙酯加入125g 75％乙醇溶液，然后在55℃的温度下水浴加热9min，水浴加热完成后在室温条件下静置12h后得到对氨基苯甲酸乙酯混合液备用；
B、将醋酸铅、硫化铵、硼氢化钾混合后加入2.45kg水搅拌均匀，然后加入对氨基苯甲酸乙酯混合液，700r/min的速率下高速搅拌6min，常温静置4h后加入菌发酵液混合均匀得到稳定剂。
实施例3：稳定剂制备三
在制备稳定剂前先制备了菌发酵液，制备方法如下：
采摘10g新鲜山桐子叶，在无菌水下冲洗3min，冲洗完成后用75％乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗1次，再用10wt％次氯酸钠溶液浸泡15min，然后用无菌水冲洗5次；用无菌滤纸吸干叶片表面水分，然后将叶片剪成0.5cm×0.5cm大小后接种到PDA固体培养基中于28℃下培养，叶片周围长出菌落后挑出菌株放入装有200mlPD培养液的培养瓶中，置于摇床中28℃、150r/min培养20天，然后离心分离去除沉淀得到菌发酵液。
取50g菌发酵液、2.5g醋酸铅、15g硫化铵、15g对氨基苯甲酸乙酯、15g硼氢化钾。
制备方法：
A、向对氨基苯甲酸乙酯中加入150g 75％乙醇溶液，然后在60℃的温度下水浴加热10min，水浴加热完成后在室温条件下静置12h后得到对氨基苯甲酸乙酯混合液备用；
B、将醋酸铅、硫化铵、硼氢化钾混合后加入3.25kg水搅拌均匀，然后加入对氨基苯甲酸乙酯混合液，800r/min的速率下高速搅拌7min，常温静置5h后加入菌发酵液混合均匀得到稳定剂。
对比例1：稳定剂制备
与实施例1形成对比，区别仅在于稳定剂制备时不添加菌发酵液。
称取1.5g醋酸铅、5g硫化铵、10g对氨基苯甲酸乙酯、10g硼氢化钾。
制备方法：
A：与实施例1相同；
B：将醋酸铅、硫化铵、硼氢化钾混合后加入1.65kg水搅拌均匀，然后加入对氨基苯甲酸乙酯混合液，500r/min的速率下高速搅拌5min，常温静置3h后得到稳定剂。
对比例2：稳定剂制备
与实施例1形成对比，区别仅在于稳定剂制备时不添加醋酸铅。
制备稳定剂前先制备了菌发酵液，菌发酵液制备方法与实施例1相同。
称取35g菌发酵液、5g硫化铵、10g对氨基苯甲酸乙酯、10g硼氢化钾。
制备方法：
A、与实施例1相同；
B、将硫化铵、硼氢化钾混合后加入1.5kg水搅拌均匀，然后加入对氨基苯甲酸乙酯混合液，500r/min的速率下高速搅拌5min，常温静置3h后加入菌发酵液混合均匀得到稳定剂。
对比例3：稳定剂制备
与实施例1形成对比，区别仅在于稳定剂制备时不添加硫化铵。
制备稳定剂前先制备了菌发酵液，菌发酵液制备方法与实施例1相同。
称取35g菌发酵液、1.5g醋酸铅、10g对氨基苯甲酸乙酯、10g硼氢化钾。
制备方法：
A、与实施例1相同；
B、将醋酸铅、硼氢化钾混合后加入1.15kg水搅拌均匀，然后加入对氨基苯甲酸乙酯混合液，500r/min的速率下高速搅拌5min，常温静置3h后加入菌发酵液混合均匀得到稳定剂。
对比例4：稳定剂制备
与实施例1形成对比，区别仅在于稳定剂制备时不添加对氨基苯甲酸乙酯混合液。
制备稳定剂前先制备了菌发酵液，菌发酵液制备方法与实施例1相同。
称取35g菌发酵液、1.5g醋酸铅、5g硫化铵、10g硼氢化钾。
制备方法：
B：将醋酸铅、硫化铵、硼氢化钾混合后加入1.65kg水搅拌均匀，500r/min的速率下高速搅拌5min，常温静置3h后加入菌发酵液混合均匀得到稳定剂。
对比例5：稳定剂制备
与实施例1形成对比，区别仅在于稳定剂制备时不添加硼氢化钾。
制备稳定剂前先制备了菌发酵液，菌发酵液制备方法与实施例1相同。
称取35g菌发酵液、1.5g醋酸铅、5g硫化铵、10g对氨基苯甲酸乙酯。
制备方法：
A、向对氨基苯甲酸乙酯中加入100g 75％乙醇溶液，然后在50℃的温度下水浴加热8min，水浴加热完成后在室温条件下静置12h后得到对氨基苯甲酸乙酯混合液备用；
B、将醋酸铅、硫化铵混合后加入650g水搅拌均匀，然后加入对氨基苯甲酸乙酯混合液，500r/min的速率下高速搅拌5min，常温静置3h后加入菌发酵液混合均匀得到稳定剂。
实施例4：山桐子组织培养方法
(1)外植体选择：于3月份采取生长健壮、无病虫害的山桐子优良单株的幼嫩带芽枝条作为外植体，保湿带回实验室，放在水里进行水培，水培期间用质量浓度为0.1％的高锰酸钾溶液喷洒外植体进行预处理，每天喷1次，连续喷3天，然后对外植体进行消毒处理，消毒处理具体操作如下：
将高锰酸钾溶液预处理后的外植体用70％的酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗2次，然后置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡3分钟，再用无菌水冲洗4次；
(2)芽诱导培养：用镊子将消毒后的外植体切成0.5cm大小，然后放入玻璃瓶中，通入二氧化碳后密封处理10min，然后取出外植体置于4℃温度下处理10min，处理完成后接种到芽诱导培养基(MS+噻苯隆(TDZ)0.2mg/L+α-萘乙酸(NAA)1mg/L+细胞分裂素(6-BA)0.2mg/L+激动素(KT)0.5mg/L)中进行芽诱导培养，并每隔12小时喷洒一次稳定剂，喷洒量为3g/株，持续喷洒8天，20天后开始出现愈伤组织，带芽茎段侧芽萌发，待萌发出的芽生长高度达到1㎝后，转接进行增殖培养；
(3)增殖培养：将诱导出的小芽接种到增殖培养基(MS+噻苯隆(TDZ)0.7mg/L+α-萘乙酸(NAA)0.3mg/L+细胞分裂素(6-BA)0.5mg/L)上培养25天，形成芽的丛生植株；
(4)瓶外生根：将蛭石和珍珠岩按照体积比3：1的比例混合后制备成生根基质，将生根基质放到灭菌高压锅内120℃高压灭菌30min，冷却后装入孔穴盘中；于芽的丛生植株中选取2㎝的单芽，将单芽用1000ppm生根粉处理30s，然后用镊子将单芽插入穴盘中，每个穴盘扦插一个单芽，然后置于温度为25℃，湿度为85％的温室中进行培养，穴盘上面用塑料盒保温，20天后生根，生根后再放置15天，然后移出温室在室外培养。
对比例6：山桐子组织培养方法
与实施例4形成对比，区别仅在于不将外植体进行二氧化碳处理。
(1)外植体选择：于3月份采取生长健壮、无病虫害的山桐子优良单株的幼嫩带芽枝条作为外植体，保湿带回实验室，放在水里进行水培，水培期间用质量浓度为0.1％的高锰酸钾溶液喷洒外植体进行预处理，每天喷1次，连续喷3天，然后对外植体进行消毒处理；消毒处理操作具体如下：
将高锰酸钾溶液预处理后的外植体用70％的酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗2次，然后置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡3分钟，再用无菌水冲洗4次；
(2)芽诱导培养：用镊子将消毒后的外植体切成0.5cm大小，然后置于4℃温度下处理10min，处理完成后接种到芽诱导培养基(MS+噻苯隆(TDZ)0.2mg/L+α-萘乙酸(NAA)1mg/L+细胞分裂素(6-BA)0.2mg/L+激动素(KT)0.5mg/L)中进行芽诱导培养，并每隔12小时喷洒一次稳定剂，喷洒量为3g/株，持续喷洒8天，20天后开始出现愈伤组织，带芽茎段侧芽萌发，待萌发出的芽生长高度达到1㎝后，转接进行增殖培养；
(3)增殖培养：将诱导出的小芽接种到增殖培养基(MS+噻苯隆(TDZ)0.7mg/L+α-萘乙酸(NAA)0.3mg/L+细胞分裂素(6-BA)0.5mg/L)上培养25天，形成芽的丛生植株；
(4)瓶外生根：将蛭石和珍珠岩按照体积比3：1的比例混合后制备成生根基质，将生根基质放到灭菌高压锅内120℃高压灭菌30min，冷却后装入孔穴盘中；于芽的丛生植株中选取2㎝的单芽，将单芽用1000ppm生根粉处理30s，然后用镊子将单芽插入穴盘中，每个穴盘扦插一个单芽，然后置于温度为25℃，湿度为85％的温室中进行培养，穴盘上面用塑料盒保温，20天后生根，生根后再放置15天，然后移出温室在室外培养。
对比例7：山桐子组织培养方法
与实施例4形成对比，区别仅在于不将外植体进行低温处理。
(1)外植体选择：于3月份采取生长健壮、无病虫害的山桐子优良单株的幼嫩带芽枝条作为外植体，保湿带回实验室，放在水里进行水培，水培期间用质量浓度为0.1％的高锰酸钾溶液喷洒外植体进行预处理，每天喷1次，连续喷3天，然后对外植体进行消毒处理；消毒处理具体操作如下：
将高锰酸钾溶液预处理后的外植体用70％的酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗2次，然后置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡3分钟，再用无菌水冲洗4次；
(2)芽诱导培养：用镊子将消毒后的外植体切成0.5cm大小，然后放入玻璃瓶中，通入二氧化碳后密封处理10min，处理完成后取出外植体接种到芽诱导培养基(MS+噻苯隆(TDZ)0.2mg/L+α-萘乙酸(NAA)1mg/L+细胞分裂素(6-BA)0.2mg/L+激动素(KT)0.5mg/L)中进行芽诱导培养，并每隔12小时喷洒一次稳定剂，喷洒量为3g/株，持续喷洒8天，20天后开始出现愈伤组织，带芽茎段侧芽萌发，待萌发出的小芽生长高度达到1㎝后，转接进行增殖培养；
(3)增殖培养：将诱导出的小芽接种到增殖培养基(MS+噻苯隆(TDZ)0.7mg/L+α-萘乙酸(NAA)0.3mg/L+细胞分裂素(6-BA)0.5mg/L)上培养25天，形成芽的丛生植株；
(4)瓶外生根：将蛭石和珍珠岩按照体积比3：1的比例混合后制备成生根基质，将生根基质放到灭菌高压锅内120℃高压灭菌30min，冷却后装入孔穴盘中；于芽的丛生植株中选取2㎝的单芽，将单芽用1000ppm生根粉处理30s，然后用镊子将单芽插入穴盘中，每个穴盘扦插一个单芽，然后置于温度为25℃，湿度为85％的温室中进行培养，穴盘上面用塑料盒保温，20天后生根，生根后再放置15天，然后移出温室在室外培养。
空白对照：山桐子组织培养方法
空白对照中外植体不进行二氧化碳和低温处理，采用无菌水对外植体进行喷洒。
(1)外植体选择：于3月份采取生长健壮、无病虫害的山桐子优良单株的幼嫩带芽枝条作为外植体，保湿带回实验室，放在水里进行水培，水培期间用质量浓度为0.1％的高锰酸钾溶液喷洒外植体进行预处理，每天喷1次，连续喷3天，然后对外植体进行消毒处理；消毒处理具体操作如下：
将高锰酸钾溶液预处理后的外植体用70％的酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗2次，然后置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡3分钟，再用无菌水冲洗4次；
(2)芽诱导培养：用镊子将消毒后的外植体切成0.5cm大小，然后接种到芽诱导培养基(MS+噻苯隆(TDZ)0.2mg/L+α-萘乙酸(NAA)1mg/L+细胞分裂素(6-BA)0.2mg/L+激动素(KT)0.5mg/L)中进行芽诱导培养，并每隔12小时喷洒一次无菌水，喷洒量为3g/株，持续喷洒8天，20天后开始出现愈伤组织，带芽茎段侧芽萌发，待萌发出的小芽生长高度达到1㎝后，转接进行增殖培养；
(3)增殖培养：将诱导出的小芽接种到增殖培养基(MS+噻苯隆(TDZ)0.7mg/L+α-萘乙酸(NAA)0.3mg/L+细胞分裂素(6-BA)0.5mg/L)上培养25天，形成芽的丛生植株；
(4)瓶外生根：将蛭石和珍珠岩按照体积比3：1的比例混合后制备成生根基质，将生根基质放到灭菌高压锅内120℃高压灭菌30min，冷却后装入孔穴盘中；于芽的丛生植株中选取2㎝的单芽，将单芽用1000ppm生根粉处理30s，然后用镊子将单芽插入穴盘中，每个穴盘扦插一个单芽，然后置于温度为25℃，湿度为85％的温室中进行培养，穴盘上面用塑料盒保温，20天后生根，生根后再放置15天，然后移出温室在室外培养。
实验：山桐子组织培养方法实验
1、为了进行对比，将实施例1、对比例1-5制备的稳定剂进行山桐子组织培养实验，实验共分为9组：实验组1、对比组1-7、空白对照组，每组20棵，3个重复。
2、稳定剂：
实验组1：采用实施例1制备的稳定剂；
对比组1-5：分别采用对比例1-5制备的稳定剂；
对比组6：采用实施例1制备的稳定剂；
对比组7：采用实施例1制备的稳定剂；
空白对照组：采用无菌水作为对照。
3、山桐子组织培养方法：
实验组1：采用实施例4的组织培养方法；
对比组1-5：采用实施例4的组织培养方法；
对比组6：采用对比例6的组织培养方法；
对比组7：采用对比例7的组织培养方法；
空白对照组：采用空白对照的组织培养方法，与上述实验组和对照组形成对比。
4、成活率检测：于瓶外生根培养20天后观察山桐子植株的成活率和植株生长状况，得到数据如表1所示：
表1
| 成活率(％) | 生长状况 | |
| 实验组1 | 90％ | 植株生长状况良好 |
| 对比组1 | 80％ | 植株较矮小、轻微失绿、叶片轻微皱缩 |
| 对比组2 | 70％ | 植株较矮小、轻微失绿、叶片皱缩 |
| 对比组3 | 70％ | 植株较矮小、轻微失绿、叶片轻微皱缩 |
| 对比组4 | 80％ | 植株较矮小、轻微失绿、叶片皱缩 |
| 对比组5 | 70％ | 植株较矮小、轻微失绿、叶片皱缩 |
| 对比组6 | 70％ | 植株较矮小、轻微失绿、叶片轻微皱缩 |
| 对比组7 | 80％ | 植株较矮小、叶片轻微皱缩 |
| 空白对照 | 50％ | 植株矮小、失绿、叶片皱缩 |
根据表1的数据分析可知：
(1)对比组1与实验组1相比，成活率降低10％，这是由于对比组1中的稳定剂制备时未添加菌发酵液，稳定剂中缺少菌发酵液中的普鲁兰多糖，未能降低多酚氧化酶活性，导致醌类物质生成较多，植株组织代谢紊乱，进而造成成活率减低；
(2)对比组2与实验组1相比，成活率降低20％，这是由于对比组2中的稳定剂制备时未添加醋酸铅，未能与外植体分泌的酚类物质结合，导致酚类物质被氧化成醌，醌进一步与蛋白质聚合，引起外植体的酶系统失活，植株组织新陈代谢紊乱，进而造成成活率低；
(3)对比组3与实验组1相比，成活率降低20％，是因为对比组3中稳定剂制备时未添加硫化铵，未能与多酚氧化酶结合，多酚氧化酶活性较高，导致酚类物质被氧化成醌，进而引起外植体的酶系统失活，植株组织新陈代谢紊乱，
进而造成成活率低；
(4)对比组4与实验组1相比，成活率降低10％，是因为对比组4中稳定剂制备时未添加对氨基苯甲酸乙酯，未能与生成的醌进行结合，导致醌与外植体中的蛋白质聚合，引起了组织新陈代谢紊乱，成活率降低；
(5)对比组5与实验组1相比，成活率降低20％，这是因为对比组5中稳定剂制备时未添加硼氢化钾，生成的醌类物质未还原成酚，进而与外植体中的蛋白质聚合，进而导致了组织新陈代谢紊乱，成活率降低；
(6)对比组6、对比组7与实验组1相比，成活率分别降低20％、10％，这是由于对比组6中山桐子组织培养时，外植体未放入二氧化碳中进行处理，对比组7中山桐子组织培养时，外植体未进行低温处理，多酚氧化酶活性未得到抑制，将酚类物质氧化成醌，进一步导致了组织新陈代谢紊乱，成活率降低；
(7)对比组1-7与实验组1相比，生长状况明显低于实验组1，说明将外植体进行二氧化碳和低温处理，并持续喷洒稳定剂能够提高植株的生长状况；
(8)对比组1-7与实验组1相比，成活率和生长状况明显低于实验组1，实验组1植株生长状况良好，而对照组1-7植株与实验组1相比，植株均比较矮小、有轻微失绿的情况、叶片轻微程度的皱缩，说明将外植体进行二氧化碳和低温处理，并持续喷洒稳定剂，能够维持组织正常的新陈代谢，提高成活率，改善外植体的生长状况。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
Claims (5)
1.一种山桐子的组织培养方法，其特征在于，所述组织培养包括以下步骤：
(1)外植体选择：于3-4月份采取山桐子优良单株的幼嫩带芽枝条作为外植体，保湿带回实验室，放在水里进行水培，水培期间用质量浓度为0.1％的高锰酸钾溶液喷洒外植体进行预处理，每天喷1次，连续喷3天，然后对外植体进行消毒处理；
(2)芽诱导培养：用镊子将消毒后的外植体切成0.5cm大小后进行低温和二氧化碳处理，然后接种到芽诱导培养基中进行芽诱导培养，并每隔12小时喷洒一次稳定剂，持续喷洒8天，20天后开始出现愈伤组织，带芽枝条侧芽萌发，待萌发出的芽生长高度达到1cm后，转接进行增殖培养；
(3)增殖培养：将诱导出的小芽接种到增殖培养基上培养25天，形成芽的丛生植株；
(4)瓶外生根：将生根基质放到灭菌高压锅内120℃高压灭菌30min，冷却后装入孔穴盘中；于芽的丛生植株中选取2cm的单芽，将单芽用1000ppm生根粉处理30s，然后用镊子将单芽插入穴盘中，每个穴盘扦插一个单芽，然后置于温度为25℃，湿度为85％的温室中进行培养，穴盘上面用塑料盒保温，20天后生根，生根后再放置15天，然后移出温室在室外培养；
步骤(2)中低温和二氧化碳处理的具体操作如下：
将外植体放入玻璃瓶中，通入二氧化碳后密封处理10-20min，然后取出外植体置于4℃温度下处理10-15min；
步骤(2)中稳定剂包括以下重量份原料：
7-10份菌发酵液、0.3-0.5份醋酸铅、1-3份硫化铵、2-3份对氨基苯甲酸乙酯、2-3份硼氢化钾；
所述稳定剂的制备方法如下：
A、向对氨基苯甲酸乙酯中加入75％乙醇溶液，然后在50-60℃的温度下水浴加热8-10min，水浴加热完成后在室温条件下静置12h后得到对氨基苯甲酸乙酯混合液备用；
B、将醋酸铅、硫化铵、硼氢化钾混合后加入水搅拌均匀，然后加入对氨基苯甲酸乙酯混合液，500-800r/min的速率下高速搅拌5-7min，常温静置3-5h后加入菌发酵液混合均匀得到稳定剂；
所述菌发酵液为山桐子内生菌发酵培养得到的菌发酵液，具体制备方法如下：
采摘新鲜山桐子叶在无菌水下冲洗3min，冲洗完成后用75％乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗1次，再用10wt％次氯酸钠溶液浸泡15min，然后用无菌水冲洗5次；用无菌滤纸吸干叶片表面水分，然后将叶片剪成0.5cm×0.5cm大小后接种到PDA固体培养基中于25-28℃下培养；在叶片周围长出菌落后挑出菌株放入装有PD培养液的培养瓶中，置于摇床中25-28℃、150r/min培养15-20天，然后离心分离去除沉淀得到菌发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种山桐子的组织培养方法，其特征在于，步骤(1)中外植体消毒具体操作如下：
将高锰酸钾溶液预处理后的外植体用70％的酒精浸泡30s，之后用无菌水冲洗2-3次，然后置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡3～5分钟，再用无菌水冲洗4-5次。
3.根据权利要求1所述的一种山桐子的组织培养方法，其特征在于，步骤(2)中芽诱导培养基为：MS+TDZ 0.2mg/L+NAA 1mg/L+6-BA 0.2mg/L+KT 0.5mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种山桐子的组织培养方法，其特征在于，步骤(3)中增殖培养基为：MS+TDZ 0.7mg/L+NAA 0.3mg/L+6-BA 0.5mg/L。
5.根据权利要求1所述的一种山桐子的组织培养方法，其特征在于，步骤(4)中生根基质由蛭石和珍珠岩按照体积比3：1的比例组成。
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