CN110234401A - 用于适应性免疫调节的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

一些实施方案涉及用于调节免疫应答的方法和组合物。在某些方面，免疫应答是I型超敏性应答。在一些特定方面，对象患有变应性哮喘或变应性鼻炎。使用常规的实验性哮喘小鼠模型(BALB/c)，本发明人证明了TLR激动剂，特别是TLR2/6和TLR9激动剂(例如，TLR9寡核苷酸激动剂/PAM2CSK4)的组合与抗原(例如，卵白蛋白(OVA))的气雾剂施用抑制免疫应答(例如抗原特异性IgE的产生)，并且响应于用与明矾混合的抗原进行的腹膜内(IP)免疫接种而减少支气管肺泡灌洗液(BAL)中的气道嗜酸性粒细胞的数目。

Description

用于适应性免疫调节的方法和组合物
本申请要求于2016年11月9日提交的美国临时专利申请序列号62/419,739的优先权，其通过引用整体并入本文。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明在由国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的R43HL115903的政府支持下完成。政府在本发明中具有一定的权利。
引用序列表
37 CFR 1.821-1.825所要求的序列表正与本申请一起以电子方式提交。序列表通过引用并入本文。
联合研究协议的各方
本文中所述的某些实施方案是在本发明制定时生效的联合研究协议的范围内进行的活动的结果。所述联合研究协议的各方是德克萨斯大学系统董事会(Board ofRegents of the University of Texas System)和德克萨斯A&M大学系统(Texas A&MUniversity System)。
背景技术
哮喘(Asthma)是复杂的肺部炎性疾病，其特征在于嗜酸性粒细胞炎症、血清IgE水平升高、黏液产生和可逆性气流阻塞。目前用于治疗变应性哮喘的可用治疗剂提供了即时的症状缓解，并且有些甚至降低气道炎症；然而，它们仍然不足。因此，需要用于治疗变应性疾病的其他策略。
IgE在I型超敏反应中起着重要作用，I型超敏反应表现为多种变应性疾病，例如变应性哮喘、变应性鼻炎、食物过敏(food allergy)以及一些类型的慢性荨麻疹和特应性皮炎。IgE在变应性病症(例如对某些药物、蜂刺以及特异性脱敏免疫治疗中使用的抗原制剂的过敏反应)中也起着关键作用。
发明概述
一些实施方案涉及用于调节免疫应答的方法和组合物，以及用于在患有潜在炎性疾病(例如，COPD)的患者中减轻下呼吸道感染的组合物和方法。
在某些方面，免疫应答是变应性免疫应答。在某些方面，免疫应答是I型超敏性应答。在另一些方面，免疫应答是IgE介导的免疫应答。在一些特定方面，对象患有变应性哮喘或变应性鼻炎。使用常规的实验性哮喘小鼠模型(BALB/c)，本发明人证明了TLR激动剂，特别是TLR2/6和TLR9激动剂的组合(例如，TLR9寡核苷酸激动剂(O)/PAM2CSK4(S-[2，3-二(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基]-[R]-半胱氨酰-[S]-丝氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酸x 3 CF3COOH)(P)以及抗原(例如，卵白蛋白(OVA))的气雾剂施用抑制免疫应答(例如抗原特异性IgE的产生)，并且响应于用与明矾混合的抗原进行的腹膜内(IP)免疫接种，减少支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage，BAL)液中的气道嗜酸性粒细胞的数目。相反，在O/P-OVA攻击模型中，小鼠IgG2a(Th1免疫的标志物)的血清水平提高。这些结果表明，施用雾化的O/P与抗原的组合具有使免疫应答偏离于由暴露于抗原产生的2型变应性炎症的能力。
在一些实施方案中，本文中所述的方法和组合物可用于治疗超敏反应。本文中使用的“超敏反应”是指不期望的免疫系统应答。超敏反应分为四类。I型超敏反应包括变态反应(例如，特应性、过敏性或哮喘)。II型超敏反应是细胞毒性/抗体介导的(例如，自身免疫性溶血性贫血、血小板减少、胎儿成红细胞增多或古德帕斯丘综合征(Goodpasture′ssyndrome))。III型是免疫复合物疾病(例如，血清病、阿蒂斯反应(Arthus reaction)或SLE)。IV型是迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity，DTH)、细胞介导的免疫记忆应答和非抗体依赖性(例如，接触性皮炎、结核菌素皮肤测试或慢性移植排斥)。在某些实施方案中，对象已被诊断患有疾病或病症，或者先前已针对疾病或病症进行治疗。在某些实施方案中，特别考虑到对象是人对象。在另一些实施方案中，对象是可发展或具有指定的疾病或病症或者经历本文中所述的生理作用的哺乳动物。
本文中使用的“变态反应”意指以IgE对肥大细胞和嗜碱性粒细胞的过度活化为特征的疾病。在某些情况下，IgE对肥大细胞和嗜碱性粒细胞的过度活化(部分地或完全地)导致炎性应答。在某些情况下，炎性应答是局部的。在某些情况下，炎性应答导致气道变窄(即支气管收缩)。在特定情况下，炎性应答导致鼻的炎症(即鼻炎)。在某些情况下，炎性应答是全身性的(即过敏反应)。
另外的一些方面涉及用于在对象中使2型变应性应答或抗原特异性IgE水平减弱的方法，其包括向易感于I型超敏反应(例如变态反应和/或变应原诱导的哮喘)的对象施用有效量的至少两种TLR激动剂。在某些方面，对象已暴露于变应原。考虑到在一些实施方案中，应答或抗原特异性IgE水平降低。在另一些方面，预防性地施用组合物。在另一个方面，向哮喘或I型超敏反应对象预防性地施用组合物。在另一个方面，TLR激动剂选自TLR2/1、TLR2/6、TLR3、TLR4、TLR5、TLR9和TLR7激动剂。在某些方面，TLR激动剂组合物包含TLR9激动剂和TLR2/6激动剂。TLR2/6激动剂可以是二酰化脂多肽，例如PAM2CSK4。TLR9激动剂可以是TLR9寡核苷酸激动剂，包括但不限于A型CpG寡脱氧核苷酸、B型CpG寡脱氧核苷酸、C型CpG寡脱氧核苷酸或其他寡脱氧核苷酸。在某些方面，TLR9寡核苷酸激动剂是C型寡脱氧核苷酸(ODN)，例如ODN2395(5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’(22mer)(SEQ ID NO：1))或ODNM362(5’-tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat-3’(25mer)(SEQ ID NO：2))或ODN10101(5’-tcgtcgttttcgcgcgcgccg-3’(SEQ ID NO：3))或9mer(5’-cgcgaagcg-3’(SEQ ID NO：4))或H-Tel 22(5’-agggttagggttagggttaggg-3’(SEQ ID NO：5))或其类似物。在一些特定方面，TLR9寡核苷酸具有硫代磷酸酯或磷酸二酯骨架。某些制剂或方法可包括单独或组合施用1、2、3、4或更多种TLR9寡核苷酸激动剂。TLR激动剂组合物可包含抗炎剂和/或其他可药用赋形剂。在某些方面，抗炎剂选自倍他米松、去炎松、地塞米松、强的松、莫米松、氟尼缩松和布地奈德，特别是布地奈德。在某些方面，药用赋形剂是甘油。
在某些方面，TLR激动剂组合物包含PAM2CSK4和TLR9寡核苷酸激动剂。在一些特定方面，TLR9在某些方面TLR2/6激动剂(例如，PAM2CSK)与TLR9激动剂(例如，ODN)的摩尔比为或为约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7或1∶8。在某些方面，TLR激动剂组合物与变应原组合施用。在某些方面，在施用TLR激动剂组合物之前；期间；之后；之前和期间；之前和之后；期间和之后；或者之前、期间和之后施用变应原或使对象暴露于变应原。组合物可以施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次(或其中可推导出的任何范围)。在某些方面，每4、6、8、10、12或24小时或者每1、2、3、4、5、6、7天、周或月以及其中可推导出的任何范围施用组合物。在某些方面，基于每天或每周连续施用组合物。
某些实施方案涉及通过施用TLR激动剂的组合而抑制2型(或Th2介导的)变应性炎症或I型超敏反应。在某些方面，靶抗原或变应原与TLR激动剂组合物组合施用。在另一些实施方案中，对象已被诊断患有或确定为患有慢性哮喘。在另一些实施方案中，在给予TLR激动剂之前，对象已被诊断患有和/或评价了2型变态反应。在某些实施方案中，患者已经在接受对于变态反应或哮喘的治疗。在一些方法中，患者还施用哮喘药物，例如皮质类固醇、肾上腺素或短期β2激动剂。在另一些实施方案中，作为补充或替代，患者正在接受抗组胺剂或其他变态反应治疗。在一些实施方案中，患者正在服用免疫抑制剂。
I型超敏反应(或速发超敏反应(immediate hypersensitivity))是通过再暴露于称为变应原的特定类型的抗原引发的变应性反应。I型不能与II型、III型或IV型超敏反应相混淆。暴露可通过摄入、吸入、注射或直接接触进行。
在1型超敏反应中，抗原被呈递至对该抗原具有特异性的CD4+Th2细胞，该抗原刺激B细胞产生也对该抗原具有特异性的IgE抗体。正常感染性免疫应答与1型超敏性应答之间的差异在于在1型超敏反应中抗体是IgE而不是IgA、IgG或IgM。在致敏作用期间，IgE抗体与组织肥大细胞和血嗜碱性粒细胞表面上的Fcε受体结合。由IgE抗体包被的肥大细胞和嗜碱性粒细胞是“致敏的”。随后暴露于相同的变应原使致敏细胞上所结合的IgE交联，导致脱颗粒和作用于周围组织的药理学活性介质(例如，组胺、白三烯(LTC4和LTD4)以及前列腺素)的分泌。这些产物的主要作用是血管舒张和平滑肌收缩。
本文中使用的术语“抗原”是能够被抗体或T细胞受体结合的分子。另外，抗原能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B淋巴细胞和/或T淋巴细胞的产生。引起生物反应的抗原的结构方面，例如三维构象或修饰(例如，磷酸化)，在本文中称为“抗原决定簇”或“表位”。B淋巴细胞通过抗体产生对外来抗原决定簇作出应答，而T淋巴细胞是细胞免疫的介质。因此，抗原决定簇或表位是被抗体(或在MHC的情况下，被T细胞受体)识别的抗原的那些部分。抗原决定簇不需要是连续序列或蛋白质的区段，并且可包含彼此不紧密相邻的多个序列。在某些实施方案中，除抗体之外的结合部分并工程化为与抗原特异性结合，例如，适配体、avimer等。
本文中使用的术语“变应原”是包含抗原的物质，其可在对象中引起不期望的(例如，1型超敏反应)免疫应答(即，变应性应答或反应)。变应原包括但不限于植物变应原(例如，豚草花粉变应原)、昆虫变应原、昆虫刺变应原(例如，蜂刺变应原)、动物变应原(例如，宠物变应原，例如动物皮屑(animal dander)或猫Fel d 1抗原)、乳胶变应原、霉菌变应原、真菌变应原、化妆品变应原、药物变应原、食品变应原、灰尘、昆虫毒液、病毒、细菌等。食品变应原包括但不限于牛乳变应原、鸡蛋变应原、坚果变应原(例如，花生或树坚果(treenut)变应原等)、鱼变应原、贝类变应原、大豆变应原、豆类变应原、籽变应原和小麦变应原。昆虫刺变应原包括是或与蜂刺、黄蜂刺、大黄蜂刺、小黄蜂(yellow jacket)刺等相关的变应原。昆虫变应原还包括房尘螨变应原(例如，Der P1抗原)和蟑螂变应原。药物变应原包括是或与抗生素、NSAID、麻醉剂等相关的变应原。花粉变应原包括草变应原、树变应原、杂草变应原、花变应原等。可用本文中提供的任何组合物和方法治疗对于本文中提供的任何变应原发生不期望的免疫应答或处于发生不期望的免疫应答风险之中的对象。可用所提供的任何组合物和方法治疗的对象也包括对所提供的任何变应原具有变态反应或处于具有变态反应风险之中的那些。“与变态反应相关的变应原”是产生不期望的免疫应答的变应原，其单独或与其他变应原组合在对象中导致或临床医生预期会导致变应性应答或反应或者变应性应答或反应的症状。“变应原的类型”意指在不期望的免疫应答的情况下，共有相同或基本上相同抗原特征的分子。在一些实施方案中，变应原可以是蛋白质、多肽、肽或脂蛋白。
某些实施方案涉及用于治疗(包括预防性治疗)或改善呼吸道感染，特别是下呼吸道感染的组合物和方法。在某些方面，正在接受治疗的对象具有潜在的炎性疾病。某些方面涉及向患有微生物感染或者处于发生或获得微生物感染风险之中的个体施用有效量的TLR9激动剂和TLR2/6激动剂的制剂或方法。在某些方面，TLR2/6激动剂是二酰化脂肽，例如PAM2CSK4。在另一个方面，TLR9激动剂是TLR9寡核苷酸激动剂。TLR9激动剂可以是TLR9寡核苷酸激动剂，包括但不限于A型CpG寡脱氧核苷酸、B型CpG寡脱氧核苷酸、C型CpG寡脱氧核苷酸或其他寡脱氧核苷酸。在某些方面，TLR9寡核苷酸激动剂是ODN2395(5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’(22mer)(SEQ ID NO：1))或ODNM362(5’-tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat-3’(25mer)(SEQ ID NO：2))或ODN10101(5’-tcgtcgttttcgcgcgcgccg-3’(SEQ ID NO：3))或9met(5’-cgcgaagcg-3’(SEQ ID NO：4))或H-Tel 22(5’-agggttagggttagggttaggg-3’(SEQ ID NO：5))或其类似物。在一些特定方面，TLR9寡核苷酸具有硫代磷酸酯或磷酸二酯骨架。某些制剂或方法可包括单独或组合施用1、2、3、4或更多种TLR9寡核苷酸激动剂。
在另一些方面，TLR9激动剂和TLR2/6激动剂以雾化制剂施用。TLR9激动剂和/或TLR2/6激动剂可以以个体体重的约0.1、1、5、10、50μg或mg/kg至约5、10、50、100μg或mg/kg(包括于其间的所有值和范围)的量施用。
某些实施方案涉及可药用组合物，其包含TLR9激动剂和TLR2/6激动剂、抗炎剂以及一种或更多种药用赋形剂，其中所述组合物是无菌的且基本上不含致病性微生物。在某些方面，TLR2/6激动剂是二酰化脂肽，例如PAM2CSK4。在另一个方面，TLR9激动剂是TLR9寡核苷酸激动剂。抗炎剂可选自倍他米松、去炎松、地塞米松、强的松、莫米松、氟尼缩松和布地奈德，特别是布地奈德。在某些方面，药用赋形剂是甘油。
术语“分离的”可以指基本上不含其起源来源的细胞材料、细菌材料、病毒材料或培养基(当通过重组DNA技术产生时)，或者化学前体或其他化学品(当化学合成时)的核酸或多肽。此外，分离的化合物是指可以作为分离的化合物施用于对象的一种化合物；换句话说，如果化合物黏附于柱或包埋在琼脂糖凝胶中，则其可不被简单地认为是“分离的”。此外，“分离的核酸片段”或“分离的肽”是不作为天然存在的片段和/或通常不处于功能状态的核酸或蛋白质片段。
本发明的部分(例如多肽、肽、抗原、变应原或免疫原)可与其他部分(例如辅料、蛋白质、肽、支持物、荧光部分或标签)共价或非共价地缀合或连接。术语“缀合”或“免疫缀合”广泛地用于定义一个部分与其他药剂的有效缔合，并且不旨在仅指任何类型的有效缔合，并且尤其不限于化学“缀合”。
术语“提供”根据其通常含义“供给或提供以供使用”来使用。在一些实施方案中，通过施用蛋白质直接提供蛋白质，而在另一些实施方案中，通过施用编码蛋白质的核酸有效地提供蛋白质。在某些方面，本发明考虑了包含核酸、抗原、肽和/或表位的多种组合的组合物。变应原或抗原可同时与一种或更多种TLR激动剂施用于对象。在一些实施方案中，其与1、2、3或更多种TLR激动剂在同一组合物中。此外，其可与一种或更多种TLR激动剂连接。
在本申请通篇讨论了本发明的另一些实施方案。关于本发明的一个方面所讨论的任何实施方案也适用于本发明的其他方面，反之亦然。本文中所述的每个实施方案应理解为可应用于本发明所有方面的本发明的实施方案。预期对于本发明的任何方法或组合物都可以实施本文中所讨论的任何实施方案，并且反之亦然。此外，本发明的组合物和药盒可用于实现本发明的方法。
在权利要求书和/或说明书中，当与术语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词可意指“一个/种”，但其也与“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。
在本申请通篇，术语“约/大约”用于表示一个值包括用于测定所述值的装置或方法之误差的标准差。
虽然本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义，但是在权利要求书中使用的术语“或/或者”用于意指“和/或”，除非明确地表明仅指替代方案或替代方案是相互排斥的。
本说明书和权利要求书中使用的词语“包含(comprising)”(以及“包含”的任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(以及“具有”的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(以及“包括”的任何形式，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及“含有”的任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
从以下详细描述中，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应当理解的是，虽然详细描述和具体指出了本发明的一些具体实施方案，但是其仅以举例说明的方式给出，由于通过该详细描述，对于本领域技术人员来说，本发明的精神和范围内的多种变化和修改方案将变得明显。
附图说明
以下附图构成本说明书的部分，并包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过与本文中给出的具体实施方案的详细描述组合参考这些附图中的一个或更多个，可以更好地理解本发明。
图1雾化的OVA-O/P减弱变应性免疫应答。(A)变应性致敏小鼠模型。通过IP注射用OVA/明矾相隔两周对Balb/c小鼠(n＝10)进行免疫接种两次。在第一次免疫接种当天，组3中的小鼠用OVA-O/P三次/周给予气雾剂攻击(+OVA-O/P，9X)。在第二次免疫接种当天，用单独的OVA/明矾(组6)、单独的O/P(组5)、OVA-O/P(6X，组4)、或与单独的O/P组分组合给予的OVA(6X，组7和8)，以三次/周持续两周施用气雾剂攻击。在第21天收获小鼠用于血清学和BAL分析。(B)通过夹层ELISA分析来自1A中小鼠的血清以测量总IgE。检测到用单独的OVA处理的小鼠(组6，17.23±1.82)与用OVA-O/P(9X)处理的小鼠(组3，3.69±0.53)之间总IgE显著降低(P＝0.0001)。(C)将来自相同小鼠的血清用于测量OVA特异性IgE。用单独的OVA处理的小鼠(C，组6，4.36±0.82)与用OVA加O/P处理的小鼠(组4，1.24±0.26，p＝0.005)的比较揭示了OVA特异性IgE降低70％，表明迟钝的变应性应答。最后，组6与组3的比较揭示了甚至更多的显著性差异(组6：4.36±0.82相对于组3：0.35±0.7，P＝0.0008)。
图2与OVA组合的、雾化的O/P提高了IgG2a，Thl标志物和抗炎IgG1生物标志物。如图1A(左侧)中所述，对BALB/c小鼠(n＝10)进行免疫接种。如材料和方法中所述，使用夹层ELISA测量来自小鼠血清样品的总IgG、总IgG1和总IgG2a水平。用单独的OVA处理的小鼠(顶侧，组6)与用OVA-O/P处理的小鼠(顶侧)的比较未揭示两组之间总IgG的显著性差异。然而，IgG1的ELISA确实揭示，与单独的OVA(组6，6.01±0.66，P＝0.035)相比，OVA-O/P处理的小鼠(组4，n＝10，9.16±1.18)中IgG1水平略微提高。另外，IgG2a的ELISA揭示，与单独的OVA(组6，25±3，P＝0.02)相比，OVA-O/P处理的小鼠(组3，8.4±21)中IgG2a水平略微提高。
图3通过BAL中炎性细胞测量的OVA的变应性致敏最优化。(A)通过IP注射用OVA/明矾相隔一周对Balb/c小鼠(n＝10)进行免疫接种一次(组2，4至6)或两次(组3，7至9)。在第7天时，一次/周(组6和9)、两次/周(组5和8)或三次/周(组4和7)连续2周施用用单独的OVA/明矾的气雾剂攻击。在第31天时收获小鼠用于血清学和BAL分析。(B)通过瑞氏吉姆萨(Wright-Giemsa)染色分析来自3A中小鼠的BAL的总的和差异细胞计数。注意与所有其他组相比，组8中的嗜酸性粒细胞(EOS)是如何升高的。
图4通过血清免疫球蛋白测量的变应性致敏的最优化。如图3A中所述，对Balb/c小鼠(n＝10)进行免疫接种。夹层ELISA用于测量来自小鼠血清样品的总IgE、OVA IgE、OVAIgG1和IgG2a水平。注意在本实验中，组8中的总IgE水平(上侧，11.05±2.39)高于组5中的(5.36±1.70，P＝0.09)，尽管没有统计学显著性。
图5用于用雾化的OVA-O/P确定最有效窗口的炎性细胞和黏蛋白分析。A)如A中所示，用单独的OVA(组2)或用OVA-O/P以多种间隔对BALB/c小鼠(n＝10)进行免疫接种和气雾剂攻击。B)如材料和方法中所述，从六个组的小鼠(n＝5)收集BAL并确定总的和差异细胞计数。与其他四组相比，组3中的小鼠显示出在BAL中具有最少量的EOS(橙色条)。(C)BAL收获之后，将肺用10％福尔马林固定，包埋到石蜡中并切成3μm切片，然后用高碘酸希夫(periodic acid Schiff，PAS)染色，以用于来自六个组(n＝5)的黏蛋白密度分析。与其他组相比，组3中的小鼠显示出具有最低的黏蛋白密度，这与图5B一致。
图6通过免疫球蛋白分析用雾化的OVA-O/P的最有效窗口的确定。如图5A中所述和在左侧中举例说明的，对Balb/c小鼠(n＝10)进行免疫接种和气雾剂攻击。夹层ELISA用于测量来自小鼠血清样品(n＝10)的总IgE、OVA IgE、OVA IgG1和IgG2a水平。OVA处理的小鼠(顶侧，组2，24.66±8.23)与OVA-O/P(组311.15±2.61)中的总IgE的比较揭示了IgE水平略微降低。另外，OVA处理的小鼠(第二侧，组2，3.77±1.00)与OVA-O/P(组3，2.14±0.34)中的OVA-IgE的比较揭示OVA-IgE水平降低。
发明详述
变应性哮喘是与嗜酸性粒细胞浸润、黏液产生提高、气道高反应性(airwayhyperresponsiveness，AHR)和气道重塑相关的慢性呼吸疾病(Barnes，Nature ReviewsImmunology(2008)，8，183-92)。尽管最近在了解哮喘的病理生理学方面取得了进展，但一些治疗仍然依赖于通过皮质类固醇的全身免疫(general immune)抑制，其可能具有不期望的副作用，而短效药物可提供即时的症状缓解，但仍然有些不足(Fanta，N Engl J Med(2009)，360：1002-14)。需要用于治疗变应性疾病的另外的治疗。
固有免疫系统提供针对侵入性病原体的即时防御(West等，Annu.Rev.CellDev.Biol.(2006)，22：409-37；Ferrandon等，Nat Rev Immunol(2007)，7：862-74)。在过去的数年里，一些研究可诱导的固有抗性的报道已揭示，当用多种Toll样受体(TLR)激动剂刺激时肺具有显著提高其固有免疫防御的稳健能力(Evans等，Annu Rev Physiol(2010)，72：413-35；Clement等，Am J Respir Crit Care Med(2008)，177：1322-30；Evans等，Am JRespir Cell Mol Biol(2010)，42：40-50；Tuvim等，PLoS ONE(2009)，4：e4176)。直到最近，大多数关于哺乳动物中免疫的工作集中在白细胞上，因为它们具有令人印象深刻的一系列抗微生物功能。虽然已知哺乳动物上皮细胞(如昆虫的那些)能够产生抗微生物蛋白，但对哺乳动物中活性上皮防御(active epithelial defense)的相对重要性了解很少(Ferrandon等，Nat Rev Immunol(2007)，7：862-74)。
为了获得对在影响免疫应答中肺上皮细胞作用的更好的了解，研究人员将小鼠暴露于非可分型的(未包封的)流感嗜血杆菌(non-typeable(unencapsulated)Haemophilusinfluenzae，NTHi)细菌的雾化的裂解物中，推断这将以反映天然暴露的比例刺激具有病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的混合物的上皮细胞(Clement等，Am J Respir Crit Care Med(2008)，177：1322-30)。这种暴露触发了对多种微生物病原体的高水平抗性，并提供了宿主保护，如通过肺内提高的微生物杀伤所证明的(Clement等，Am J Respir Crit Care Med(2008)，177：1322-30)。在随后的研究中，裂解物诱导针对所有测试的病原体(包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌、孢子形成生物恐怖剂炭疽杆菌(B.anthracis)、真菌烟曲霉菌(A.fumigatus)以及流感病毒)的抗性(Evans等，Am JRespir Cell Mol Biol(2010)，42：40-50；Tuvim等，PLoS ONE(2009)4：e4176)。最后，许多研究已证明上皮细胞本身在为宿主提供这种观察到的可诱导抗性中起主导作用(Ferrandon等，Nat Rev Immunol(2007)，7：862-74；Evans等，Annu Rev Physiol(2010)，72：413-35；Clement等，Am J Respir Crit Care Med(2008)，177：1322-30；Evans等，Am JRespir Cell Mol Biol(2010)，42：40-50；Tuvim等，PLoS ONE(2009)，4：e4176；Mizgerd，NEngl J Med(2008)，358：716-27)。总之，这些研究支持用TLR配体操纵气道上皮固有免疫防御可提供保护而不受其他感染的观念。
为了确定必要的和充分的刺激并开发化学限定的治疗，检查了缺乏固有免疫信号传导组分的小鼠，例如MyD88-/-和Trif-/-(Duggan等，J Immunol(2011)，186(10)：5916-26；Evans等，Br J Pharmacol(2011)，163：195-206)。与Trif-/-小鼠相反，在MyD88-/-小鼠中细菌裂解物不能诱导抗性，表明TLR的亚类参与介导该应答。为了明确地确定涉及哪些TLR配体，对单独和成对组合的、涵盖TLR 1至9的15种TLR配体(包括对TLR 2/1和2/6异二聚体具有差异活性的配体)进行筛选。没有单配体的治疗使小鼠存活率提高超过20％。某些组合(例如，TLR9+TLR2/6激动剂)使存活率提高超过40％。在某些方面，用CpG寡脱氧核苷酸(“ODN”，TLR9配体)和Pam2CSK4(“Pam2”，TLR2/6配体)治疗实现强烈的协同作用(Duggan等，J Immunol(2011)，186(10)：5916-26)。用ODN/Pam2预处理的小鼠在用铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)或肺炎克雷佰菌(K.pneumoniae)的攻击下存活，在每种情况下都与肺病原体负荷的降低相关(Evans等，Br J Pharmacol(2011)，163：195-206)。这些可诱导抗性的机制的研究已通过毒性、生物标志物和剂量最优化的研究得到补充(Evans等，Br J Pharmacol(2011)，163：195-206)。
I.适应性免疫
免疫系统通常分为：(a)固有免疫，其包含提供即时“第一线”防御以持续避开病原体的组分和(b)适应性(获得性)免疫，其包含抗体的制备和特异性设计成靶向特定病原体的T细胞的产生或刺激。使用适应性免疫，身体可随时间的推移形成对特定病原体的特异性免疫。这种应答需要数天才能形成，并因此不能有效预防初始入侵，但通常其将预防任何后续的感染，并且还有助于清除持久的感染。
通过抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)可诱导两种类型的效应CD4+T辅助细胞应答，指定为Th1和Th2，每一种设计成消除不同类型的病原体。指示感染是否将触发Th1或Th2型应答(1型或2型应答)的因素尚不完全了解，但产生的应答在不同病原体的清除方面起了重要作用。Th1应答的特征在于干扰素-γ的产生，其激活巨噬细胞的杀菌活性，并诱导B细胞以产生调理(包被)和补体固定抗体，并导致“细胞介导的免疫”。Th2应答的特征在于白介素4的释放，其使得激活B细胞以产生中和非溶细胞性抗体，导致“体液免疫”。通常来说，Thl应答对细胞内病原体(宿主细胞内的病毒和细菌)更有效，而Th2应答对细胞外细菌、寄生生物(包括蠕虫)和毒素更有效。像细胞毒性T细胞一样，大多数CD4+辅助细胞在感染消除之后将死亡，少数仍为CD4+记忆细胞。
II.免疫调节组分
目前，变应性疾病和哮喘通常用以下药物中的一种或更多种治疗：(1)抗组胺药和抗白三烯药，其拮抗炎性介质组胺和白三烯，(2)局部的或全身性的(经口或可注射的)皮质类固醇，其抑制广谱的炎性机制，和(3)短效或长效支气管扩张药，其使哮喘中收缩气道的平滑肌放松。已知长期使用全身性皮质类固醇引起许多严重的副作用并且建议避免，如果有可用的替代治疗。
IgE、IgE合成途径和IgE介导的变应性/炎性途径都是在干预变态反应和哮喘的病理过程方面的重要靶标。最终产生分泌IgE的浆细胞的B淋巴细胞分化和成熟途径，经历表达IgE的B淋巴母细胞的中间步骤，并涉及与表达IgE的记忆B细胞的相互作用。
A.变应原
在某些实施方案中，免疫调节组合物包括变应原组分或与变应原组分结合施用。变应原组分可包括以下变应原或其衍生物中的一种或更多种，其包括但不限于：微生物(例如，细菌、病毒、真菌)、花粉(例如，农场植物、树、杂草、草)、动物皮屑、膜翅目毒液(hVmenoptera venorn)、昆虫(例如，房尘螨)、植物性食品和动物性食品。
变应原可选自一种或更多种类型的螨，例如，房尘螨(粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae))；房尘螨(屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus))；食品/贮螨(粗脚粉螨(Acarus siro))；房尘螨(热带无爪螨(Blomia tropicalis))；贮螨(拱殖嗜渣螨(Chortoglyphus arcuates))；房尘螨(埋内欧尘螨(Euroglyphus maynei))；食品/贮螨(害嗜鳞螨(Lepidoglyphus destructor))；食品/贮螨(腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae))；和房尘螨(家食甜螨(Glycyphagus domesticus))。
变应原可选自一种或更多种类型的毒液，例如，大黄蜂毒液(熊蜂属(Bombusspp.))；欧洲大黄蜂毒液(黄边胡蜂(Vespa crabro))；蜜蜂(意蜂属(Apis mellifera.))；混合大黄蜂毒液(黄蜂属(Dolichovespula spp))；混合纸巢蜂毒液(造纸胡蜂属(Polistesspp.))；混合小黄蜂毒液(黄胡蜂属(Vespula spp.))；白(秃)面大黄蜂毒液(黄蜂属具斑的(Dolichovespula maculate))；和大黄蜂毒液(黄蜂翻石鹬属(Dolichovespulaarenaria))。
变应原可选自一种或更多种类型的昆虫，例如锯蚁(较小的木蚁(Camponotuspennsylvanicus))；火蚁(红火蚁(Solenopsis invicta))；火蚁(黑火蚁(Solenopsisrichteri))；美洲蠊(美洲大蠊(Periplaneta Americana))；德国小蠊(Blattellagermanica)；东方蜚蠊(Blatta orientalis)；马蝇(虻属(Tabanus spp.))；马蝇(抗家蝇(Musca domestica))；蜉蝣(蜉蝣属(Ephemeroptera spp.))；蚊(蚊科(Culicidae sp.))；和蛾(异角类属(Heterocera spp.))。
变应原可选自一种或更多种类型的上皮、皮屑以及毛发和羽毛，例如，金丝雀羽毛(金丝雀(Serinus canaria))；猫上皮(家猫(Felis domesticus))；牛上皮(家牛(BosTaurus))；鸡羽毛(原鸡(家养)(Gallus gallas(domesticus)))；狗上皮，混合品种(家犬(Canis familiaris))；鸭羽毛(肛绿头鸭(Canis familiaris))；沙鼠上皮(长爪沙鼠(Meriones unguiculatus))；山羊上皮(野山羊(Capra hircus))；鹅羽毛(家雁属(Anserdomesticus))；豚鼠(豚鼠属(Cavia porcellus))；上皮(荷兰猪(cobaya))；仓鼠上皮(金仓鼠(Mesocricetus auratus))；猪上皮(野猪(Sus scrofa))；马上皮(家马(Equuscaballus))；小鼠上皮(小家鼠(Mus musculus))；长尾小鹦鹉羽毛(鹦鹉科(Psittacidaespp.))；鸽子羽毛(斑尾鸽(Columbafasciata))；兔上皮(穴兔属(Oryctolaguscuniculus))；尖刺鼠属(褐家鼠属(Rettus norvegicus))；和羊毛，羊(绵羊(Ovisaries))。
变应原可选自一种或更多种类型的皮屑，例如，猫皮屑/抗原(家猫(家养)(Feliscatus(domesticus))；狗皮屑，混合品种(家犬(Canis familiaris))；和贵宾犬皮屑(家犬(Canis familiaris))。
变应原可选自一种或更多种类型的真菌，例如，直立顶孢霉(Acremoniumstrictum)、链格孢菌(Altemaria alternate)、阿姆斯特丹曲霉(Aspergillusamstelodami)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、曲霉属真菌(Aspergillus furmigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillusterreus)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)、根腐离蠕孢(Bipolaris sorokiniana)、贵腐菌(Botrytis cinerea)、白色念珠菌(Candida albicans)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、腊叶芽枝霉(Cladosporiumherbarum)、球孢枝孢(Cladosporium sphaerospermum)、Drechslere spicifera、黑附球菌(Epicoccum nigrum)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、茄腐皮镰孢霉(Fusarium solani)、白地霉(Geotrichum candidum)、黏帚霉(Gliocladium viride)、茄长蠕孢(Helminthosporium solani)、小孢子菌(Microsporumcanis)、顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)、交链孢菌(Altemaria fermis)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、出芽茁霉(Pullularia pullulans)、麦根腐德氏霉(Drechslera sorokiniana)、麦根腐长蠕孢(Helminthosporium sativum)、着色芽生菌属大麦坚黑粉菌(Hormodendrum hordei)、穗状弯孢霉(Curvularia spicifera)、黑附球菌(Epicoccum purpurascens)、卵孢霉乳酸(Oospora lactic)、胶霉属(Gliocladiumdeliquescens)、暗绿椎枝孢(Spondylocladium atrovirens)、小孢子菌(Microsporumlanosum)、卷枝毛霉f.circinelloides(Mucor circinelloides f.circinelloides)、卷枝毛霉f.lusitanicus(Mucor circinelloides f.lusitanicus)、密丛毛霉(Muncorplumbeus)、有害疣孢霉(Mycogone pemiciosa)、脉孢菌(Neurospora intermedia)、黑孢霉(Nigrospora oryzae)、拟青霉(Paecilomyces variotii)、短密青霉(Penicillium brevi-compactum)、卡门柏青霉(Penicillium camembertii)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、指状青霉菌(Penicillium digitatum)、青霉菌(Penicillium expensum)、特异青霉(Penicillium notatum)、青霉属roquefortii(Penicillium roquefortii)、番薯干腐病菌(Phoma betae)、多主枝孢(Phomma herbarum)、Rhigopus霉(Rhigopus oryzae)、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、短帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)、干朽菌(Serpulalacrymans)、毛球腔菌属(Setosphaeria rostrata)、匐柄霉hotryosum(Stemphyliumhotryosum)、茄匍柄霉(Stemphylium solani)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、粉红聚端孢菌(Trichothecium roseum)、高大毛霉(Mucor mucedo)、总枝状毛霉(Mucorracemosus)、脉孢菌sitophil(Neurospora sitophil)、念珠菌属好食脉孢菌(Moniliasitophila)、茎点霉(Phoma pigmentivora)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、微黑根霉(Rhizopus nigricans)、深红类酵母(Rhodotorula rubra var.mucilaginosa)、干朽菌(Merulius lacrymans)、明脐霉(Exserohilum rostratum)、长蠕孢霉(Helminthosporiumhalodes)、绿色木霉(Trichoderma viride)、指间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)和粉红复端孢霉(Cephalothecium roseum)。
变应原可选自一种或更多种类型的黑粉菌，例如，大麦黑粉菌(黑粉菌属裸露(Ustilago nuda))、狗牙草(黑粉菌属(ustilago))、黑粉菌(cynodontis)、玉米黑粉菌(玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis))、约翰逊草(孢堆黑粉菌属(sporisorium))、黑粉菌(cruentum)、燕麦黑粉菌(燕麦黑粉菌属(Ustilago avenae))、和小麦黑粉菌(小麦散黑粉菌(Ustilago tritici))。
变应原可选自一种或更多种类型的草花粉，例如，巴伊亚草(雀稗(Paspalumnotalum))；百慕大草(狗牙根(Cynodon dactylon))；加拿大蓝草(早熟禾(Poacompressa))；光滑布雷姆草(无芒雀麦(Bromus inermis))；加那利草(虉草(Phalarisarundinacea))；玉米(玉蜀黍(Zea mays))；库奇/夸克草(偃麦草(Elytrigia repens(Agropyron repens)))；约翰逊草(石茅高粱(Sorghum halepense))；肯塔基蓝草(草地早熟禾(Poa pratensis))；草原羊茅(草地羊茅(Festuca pratensis(elatior)))；栽培燕麦(燕麦(Avena sativa))；果园草(鸭茅(Dactylis glomerata))；红顶草(巨大剪股颖属(Agrostis gigantean(alba)))；栽培黑麦(黑麦(Secale cereale))；巨大野生黑麦(巨型野生黑麦(Leymus (Elymus)condensatus))；意大利黑麦(多年生黑麦草属(Loliumperenne ssp.Multiflorum))；多年生黑麦(黑麦草(Lolium perenne))；黄花草(Anthoxanehum odoratum)；梯牧草(猫尾草(Phleum pretense))；棉绒(绒毛草(Holcuslanatus))；栽培小麦(小麦(Triticum aestivum))；圣奥古斯丁草(钝叶草(Stenotaphrumsecundatum))和西部冰草(披碱草属冰草属(Elymus(Agropyron)))。
变应原可选自一种或更多种类型的杂草花粉，例如，Allscale(多果滨蔾(Atriplex polycarpa))、酒神菊属(酒神菊(Baccharis halimifolia))、酒神菊(Baccharis sarothroides)、菊科灌木(猪毛菜(Hymenoclea salsola))、粗心杂草(绿穗苋(Amaranthus hybridus))、苍耳属植物(苍耳(群体)(Xanthium strumarium(commune))、黄色酸模(皱叶酸模(Rumex crispus))、狗茴香(泽兰属(Eupatorium capillifolium))、秋麒麟草(一枝黄花属(Solidago spp.))、西部水大麻(糙果苋(Amaranthus tuberculatus(Acnida tamariscina)))、香柏(Allenrolfea occidentalis)、耶路撒冷橡树(总状花藜(Chenopodium botrys))、地肤/希茉莉(地肤(Kochia scoparia))、Lambs Quarter(藜(Chenopodium album))、草类湿地接骨木(假苍耳(Iva xanthifolia))、窄叶湿地接骨木(山芝麻(Iva angustifolia))、粗糙湿地接骨木(黄花蒿(纤毛纲)(Iva annua(ciliata)))、土荆芥(Chenopodium ambrosioides)、普通野艾(蒌蒿(Artemisiavulgaris))、Darkleaved野艾(艾属(Artemisia ludoviciana))、荨麻(大荨麻(Urticadioica))、帕尔默苋菜(Amaranthus palmeri)、红根/粗糙的藜(反枝苋(Amaranthusretroflexus))、具刺的藜(具刺的苋属(Amaranthus spinosus))、英国车前草(长叶车前(Plantago lanceolata))、贫草(Iva axillaris)、Quailbrush(滨蔾属(Atriplexlentiformis))、兔灌木(豚草属三叶草薯蓣(Ambrosia deltoidea))、沙漠豚草(Ambrosiadumosa)、假豚草(Ambrosia acanthicarpa)、巨大豚草(三裂叶豚草(Ambrosia trifida))、短豚草(普通豚草(Ambrosia artemisiifolia))、细长豚草(Ambrosia confertiflora)、南部豚草(Ambrosia bidentata)、西部豚草(Ambrosia psilostachya)、俄罗斯蓟(猪毛菜属(Salsola kali(pestifer)))、沿海鼠尾草(及加州蒿(Artemisia californica))、牧场鼠尾草(冷蒿(Artemisia frigida))、普通蒿属植物(三齿蒿(Artemisia tridentate))、一年生蒿属植物(Atriplex wrightii)、蒿属植物(密叶滨藜(Atriplex confertifolia))、红色/羊酢浆草(小酸模(Rumex acetosella))和Wingscale(滨藜属(Atriplex canescens))、一年生苦艾草(黄花蒿(Artemisia annua))。
变应原可选自一种或更多种类型的树木花粉，例如，金合欢属(金合欢属(Acaciaspp.))、欧洲桤木(Alnus glutinosa)、红桤木(红枝桤木(Alnus rubra))、标签桤木(灰桤木属皱珊瑚目(Alnus incana ssp.Rugosa))、白桤木(菱叶桤木(Alnus rhombifolia))、亚利桑那州木樨科(绒毛白蜡(Fraxinus velutina))、绿/红木樨科(美国红梣(Fraxinuspennsylvanica))、俄勒冈州木樨科(俄勒冈白蜡树(Fraxinus latifolia))、白木樨科(美国梣(Fraxinus Americana))、山杨(山杨次生林(Populus tremuloides))、杨梅(蜡杨梅(Myrica cerifera))、美国山毛榉(美国水青冈(美洲)(Fagus grandifolia(americana)))硬红木/木麻黄属(木麻黄(Casuarina equisetifolia))、黑/甜桦木(美洲甜桦(Betulalenta))、欧洲白桦木(垂枝桦(Betula pendula))、红/河桦木(岸黑桦(Betula nigra))、春桦木(桦木属朴树(水藓属)(Betula occidentalis(fontinalis)))、白桦木(Betulapopulifolia)、梣叶枫(复叶槭(Acer negundo))、日本雪松(日本柳杉(Cryptomeriajaponica))、山雪松(刺柏属(Juniperus ashei(sabinoides)))、红雪松(北美圆柏(Juniperus virginiana))、盐雪松(红花多枝怪柳(Tamarix gallica))、黑三角叶杨(香脂杨属毛果杨(Populus balsamifera ssp.Trichocarpa))、东部三角叶杨(美洲黑杨(Populus deltoids))、佛利蒙三角叶杨(弗里芒杨(Populus fremontii))、里奥格兰德三角叶杨(Populus wislizeni)、西部三角叶杨(Populus monilifera(sargentii))、美国亚利桑那州柏树(绿干柏(Cupressus arizonica))、无叶柏树(落羽杉(Taxodiumdistichum))、意大利柏树(地中海柏木(Cupressus sempervirens))、美国榆树(美国榆(Ulmus Americana))、雪松榆树(南方岩榆(Ulmus crassifolia))、西伯利亚榆树(白榆(Ulmus pumila))、桉树(蓝桉树(Eucalyptus globulus))、朴树(Celtis occidentalis)、榛树(美洲榛(Corylus Americana))、欧洲榛(欧洲榛(Corylus avellana))、光滑山核桃树(光滑山核桃(Carya glabra))、粗皮山核桃树(粗皮山核桃(Carya ovata))、小糙皮山核桃(大糙皮山核桃(Carya laciniosa))、白山核桃树(毛山核桃(Carya alba))、Oneseed刺柏(樱核圆柏(Juniperus monosperma))、平肖刺柏(Juniperus pinchotii)、洛基山刺柏(洛基山圆柏(Juniperus scopulorum))、犹他州刺柏(Juniperus osteosperma)、西部刺柏(北美西部圆柏(Juniperus occidentalis))、蝗虫花(刺槐属(Robinia))、黑色(伪刺槐(pseudoacacia))、芒果花(芒果(Mangifera indica))、沿海槭树(大叶槭(Acermacrophyllum))、红槭树(红花槭(Acer rubrum))、银槭树(银白槭(Acer saccharinum))、糖槭树(糖槭(Acer saccharum))、白千层(五脉白千层(银叶树属)(Melaleucaquinquenervia(leucadendron)))、牧豆树(腺牧豆树(Prosopis glandulosa(julifiora)))、纸桑树(构树(Broussonetia papyrifera))、红桑树(红桑(Morusrubra))、白桑树(白桑(Morus alba))、亚利桑那州栎树/Gambel(Quercus gambe)、黑栎树(美洲黑栎(Quercus velutina))、布尔栎树(Quercus macrocarpa)、加州黑栎树(加州黑栎(Quercus kelloggii))、加州栎树(禾叶栎(Quercus agrifolia))、加州白/山谷栎树(Quercus lobata)、英国栎树(夏栎Quercus robur))、冬青栎树(Quercus ilex)、波斯特栎树(星毛栎(Quercus stellata))、红栎树(Quercus rubra)、灌丛栎树(加州丛栎(Quercusdumosa))、弗吉尼亚栎(弗吉尼亚栎(Quercus virginiana))、水栎树(黑栎(Quercusnigra))、西部白/Gany栎树(奥里根白栎(Quercus garryana))、白栎树(Quercus alba)、橄榄(油橄榄(Olea europaea))、俄罗斯橄榄(Elaeagnus angustifolia)、橙色花粉(甜橙(Citrus sinensis))、皇后棕榈(皇后葵(金山葵属)(Arecastrum romanzoffianum)(Cocosplumosa))、山胡桃(Carya illinoensis)、漆椒树(Schinus molle)、漆椒树/佛罗里达冬青(Schinus terebinthifolius)、火炬松(Pinus taeda)、东方白松树(北美乔松(Pinusstrobus))、长叶松(长叶松(Pinus palustris))、北美黄松(西黄松(Pinus ponderosa))、沼泽低地松树(湿地松(Pinus elliottii))、弗吉尼亚松(弗吉尼亚松(Pinusvirginiana))、西部白松树(加州山松(Pinus monticola))、黄松树(萌芽松(Pinusechinata))、伦巴第杨树(黑杨(Populus nigra))、白杨树(银白杨(Populus alba))女贞(普通女贞(Ligustrum vulgare))、甜胶皮枫香树(胶皮枫香树(Liquidambarstyraciflua))、东部悬铃木(一球悬铃木(Platanus occidentalis))、东部悬铃木(三球悬铃木(Platanus orientalis))、西部悬铃木(加州悬铃木(Platanus racemosa))、悬铃木/伦敦梧桐(悬铃木(Platanus acerifolia))、黑核桃(黑胡桃(Juglans nigra))、加州黑核桃(加利福尼亚胡桃(Juglans californica))、英国核桃(胡桃(Juglans regia))、阿罗约柳树(毛柄柳(Salix lasiolepis))、黑柳(黑柳(Salix nigra))和褪色柳(褪色柳(Salixdiscolor))。
变应原可选自一种或更多种类型的野生和栽培花，例如，牛眼雏菊(菊属滨菊(Chrysanthemum leucanthemum))、蒲公英(药用蒲公英(Taraxacum offficinale))和向日葵(Helianthus annuus)。
变应原可选自一种或更多种类型的栽培农场植物花粉，例如，紫花苜蓿(Medicagosativa)、蓖麻(Ricinus communis)、红车轴草(Trifolium pratense)、芥菜(油菜属(Brassica spp.))和甜菜(Beta vulgaris)。
变应原可选自一种或更多种类型的植物性食品，例如，扁桃(Prunus dulcis)、苹果(Malus pumila)、杏(Prunus armeniaca)、香蕉(Musa paradisiaca(sapientum))、大麦(Hordeum vulgare)、利马豆(Phaseolus lunates)、海军豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、花斑豆(菜豆属(Phaseolus sp.))红肾豆(菜豆属(Phaseolus sp.))、青刀豆/绿豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、黑莓(Rubus allegheniensis)、蓝莓(越橘属(Vaccinium sp.))、花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)、荞麦(Fagopyrum esculentum)、甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)、可可豆(Theobroma cacao)、甜瓜(Cucumis melo)、胡萝卜(Daucus carota)、菜花(Brassica oleracea var.botrytis)、芹菜(Apiumgraveolens var.dulce)、樱桃(李属(Prunus sp.))、肉桂(Cinnamomum verum)、咖啡(阿拉比卡咖啡(Coffee Arabica))、玉米(Zea mays)、越橘(Vaccinium macrocarpon)、黄瓜(Cucumis sativus)、大蒜(Allium sativum)、生姜(Zingiber officinale)、葡萄(葡萄属(Vitis sp.))、葡萄柚(Citrus paradise)、啤酒花(Humulus lupulus)、柠檬(Citruslimon)、生菜麦芽(Lactuca sativa)、蘑菇(Agaricus campestris)、芥菜(芸薹属(Brassica sp.))、肉豆蔻(Myristic fragrans)、燕麦(Avena sativa)、绿橄榄(Oleaeuropaea)、洋葱(Allium cepa var.cepa)、橙(Citrus sinensis)、黑眼豌豆(豇豆(Vignaunguiculata))、绿豌豆(嫩豌豆(Pisum sativum(English)))、桃(Prunus persica)、梨(Pyrus communis)、黑胡椒(Piper nigrum)、青椒(Capsicum annuum var.annuum)、菠萝(Ananas comosus)、甘薯(Ipomoea batatas)、白薯(Solanum tuberosum)、覆盆子(Rubusidaeus var.idaeus)、大米(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、芝麻(Sesamumorientale(indicum))、大豆(Glycine max)、菠菜(Spinacia oleracea)、黄南瓜(Cucurbita pepo var.melopepo)、草莓(Fragaria chiloensis)、番茄(Lycopersiconesculentum(lycopersicum))、萝卜(Brassica rapa var.rapa)、香草豆(Vanillaplanifolia)、西瓜(Citrullus lanatus var.lanatus)和全麦(Triticum aestivum)。
变应原可选自一种或更多种类型的鱼和贝类，例如，黑鲈鱼(黑鲈属(Micropterussp.))、鲶鱼(斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus))、蛤(硬壳蛤(Mercenariamercenaria))、鳕鱼(大西洋鳕(Gadus morhua))、螃蟹(蓝蟹(Callinectes sapidus))、比目鱼(川鲽属(Platichthys sp.))、大比目鱼(庸鲽属(Hippoglossus sp.))、龙虾(美洲螯龙虾(Homarus americanus))、鲭(大西洋鲭鱼(Scomber scombrus))、牡蛎(美洲巨蛎(Crassostrea virginica))、海鲈(Sebastes marinus)、鲑鱼(安大略鲑(Salmo salar))、沙丁鱼(鲱形目(Clupeiformes))、扇贝(Pectan magellanicus)、虾(对虾属(Penaeussp.))、湖鳟(红点鲑属(Salvelinus sp.))和金枪鱼(Thunnus sp.)。
变应原可选自一种或更多种类型的动物性食品，例如，牛肉(Bus Taurus)、羔羊肉(绵羊(Ovis aries))和猪肉(野猪(Sus scrofa))。
变应原可选自一种或更多种类型的禽制品，例如鸡肉(原鸡(Gallus gallus))、白鸡(原鸡(Gallus gallus))蛋、鸡(原鸡(Gallus gallus))蛋蛋黄和火鸡肉(火鸡(Meleagris gallopavo))。
变应原可选自一种或更多种类型的乳制品，例如，牛(Bos Taurus)酪蛋白和牛(Bos Taurus)乳。
变应原可选自一种或更多种类型的坚果，例如，巴西坚果(Bertholletiaexcelsa)、腰果(西部腰果属(Anacardium occidental))、椰子(Cocos nucifera)、榛果/榛子(美洲榛(Corylus Americana))、花生(Arachis hypogaea)、山核桃(美国山核桃(Caryaillinoensis))、黑胡桃(美国黑核桃(Juglans nigra))和英国胡桃(胡桃(Juglansregia))。
变应原可选自一种或更多种类型的杂类材料，例如乳胶、银等。
B.炎性疾病
存在大量表现出慢性炎症组分的疾病。这些包括但不限于：炎性关节疾病(例如，类风湿性关节炎、骨关节炎、多关节炎和痛风)，慢性炎性结缔组织病(例如，红斑狼疮、硬皮病、Sjorgen综合征、多皮肌炎和皮肌炎、血管炎、混合结缔组织病(mixed connectivetissue disease，MCTD)、肌腱炎、滑膜炎、细菌性心内膜炎、骨髓炎以及银屑病)，慢性炎性肺病(例如，慢性呼吸疾病、肺炎、纤维化肺泡炎、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病(chronicobstructive pulmonary disease，COPD)、支气管扩张、肺气肿、硅肺和其他尘肺以及结核病)，慢性炎性肠道和胃肠道炎性疾病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩病(Crohn′sdisease))，慢性神经炎性疾病(例如，慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(chronicinflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathV)、多发性硬化、Guillan-Barre综合征和重症肌无力(myasthemia gravis))，其他炎性疾病(例如，乳腺炎、蹄叶炎、喉炎、慢性胆囊炎、桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、炎性乳房疾病)；由伤口中植入的异体引起的慢性炎症；以及由于离心运动之后肌肉损伤的急性炎性组织损伤(例如，迟发性肌肉痛(delayed onset muscle soreness)-DOMS)。在某些方面，炎性病症或疾病选自但不限于慢性炎性肺病(例如，慢性呼吸疾病、肺炎、纤维化肺泡炎、慢性支气管炎，慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管扩张、肺气肿、硅肺和其他尘肺以及结核病)。在一些特定方面，炎性疾病是COPD。
用于慢性炎性病症的通常治疗方式是通过施用非类固醇抗炎药物(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)，例如双氯芬酸、布洛芬、阿司匹林、保泰松、吲哚美辛、萘普生和吡罗昔康。尽管NSAID可能有效，但已知它们与许多副作用和不良反应有关。这些可包括胃肠问题，例如消化不良、溃疡和出血、嗜睡、恶心或呕吐、便秘、变应性反应以及有时发生的肝毒性。通常，有效剂量与毒性剂量之间的裕量(margin)相当小(即2至3倍)。尽管有这些副作用，但使用NSAID作为抗炎剂是人类医学和兽医学的标准惯例。然而，在兽医学中，越来越关注它们在食品动物中的使用，因为它们在食品链中药物(例如保泰松)可积聚。
C.Toll样受体(Toil-like receptor，TLR)激动剂
Toll样受体(TLR)是高度保守的跨膜蛋白，其由用于模式识别的具有多个富含亮氨酸重复序列的胞外域，跨膜α-螺旋和用于细胞内信号传导的Toll/白介素-1受体(Toll/interleukin-1 receptor，TIR)结构域组成。已经确定了至少13种哺乳动物TLR，每种TLR特异性地定位于质膜或内体膜，并且每种TLR检测PAMP的独特补体(Akira等，2006；Shi等，2006)。在PAMP识别后，通过细胞溶质TIR衔接蛋白组合的TLR特异性募集发生信号传导。与四种其他衔接子中的一种或更多种一致，TIR衔接蛋白MyD88是来自大多数TLR的信号传导所必需的。在有或没有TRAM参与的情况下，从TLR3和TLR4观察到的MyD88独立信号传导事件都需要TIR衔接子TRIF(也称为TICAM-1)(Yamamoto等，2003)。TLR特异性TIR衔接子信号级联放大激活受体特异性转录因子(例如NF-κB、激活蛋白-1和干扰素调节因子(interferonregulatory factor，IRF))，导致炎性基因和抗微生物基因的表达(Akira等，2006；O′Neill，L.A.和Bowie，2007；Takeda，K.，和Akira，2004)。
TLR激动剂是用于直接激活TLR(例如，诱导由TLR信号传导途径介导的信号传导事件)的任何化合物或物质。合适的TLR激动剂包括TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂。特别考虑的是具体涉及TLR2/6激动剂与TLR9激动剂组合的组合物和方法。
本文中使用的术语“激动剂”是指可以与受体(例如，TLR)组合以产生细胞活性的化合物。激动剂可以是与受体直接结合的配体。作为替代地，激动剂可通过以下间接与受体组合：例如，(a)与另一种直接结合至受体的分子形成复合物，或(b)在其他情况下导致另一种化合物的修饰使得其他一种化合物与受体直接结合。激动剂可被称为特定TLR的激动剂(例如，TLR7激动剂)或特定的TLR组合的激动剂(例如，TLR7/8激动剂(TLR7和TLR8二者的激动剂))。
术语
本文中可互换使用的“TLR9寡核苷酸激动剂”、“CpG-ODN”、“CpG核酸”、“CpG多核苷酸”和“CpG寡核苷酸”是指刺激或激活TLR9受体的多核苷酸。特别地，“CpG-ODN”、“CpG核酸”、“CpG多核苷酸”和“CpG寡核苷酸”包含至少一个5′-CG-3′部分，并且在许多实施方案中包含未甲基化的5′-CG-3′部分。通常，TLR9寡核苷酸激动剂是具有至少6个核苷酸碱基的单链或双链DNA或RNA多核苷酸，其可包含经修饰核苷酸或经修饰核苷的序列，或由其组成。在一些实施方案中，CpG核酸的5′-CG-3′部分是回文的核苷酸序列的部分。在一些实施方案中，CpG核酸的5′-CG-3′部分是非回文的核苷酸序列的部分。TLR9寡核苷酸可以是寡核苷酸类似物。
合适的TLR激动剂包括分离的天然存在的TLR激动剂和合成的TLR激动剂。从TLR激动剂的天然存在来源分离的TLR激动剂通常是经纯化的，例如，经纯化的TLR激动剂为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。合成的TLR激动剂通过标准方法制备，并且通常为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。
合适的TLR激动剂包括不与任何其他化合物连接的TLR激动剂。合适的TLR激动剂包括与第二化合物共价或非共价连接的TLR激动剂。在一些实施方案中，TLR激动剂与另一种化合物直接连接。在另一些实施方案中，TLR激动剂通过接头与另一种化合物连接。与TLR激动剂连接的化合物包括载体、支架、不溶性支持物、微粒、微球体等。载体包括治疗性多肽；提供提高的溶解度的多肽；在生理介质(例如，血清或其他体液)中提高TLR激动剂半衰期的多肽；等等。在一些实施方案中，TLR激动剂将直接地或通过接头与第二TLR激动剂缀合。
在一些实施方案中，TLR激动剂是TLR激动剂的前药形式。前药由与活性治疗剂共价连接的前药部分构成。前药能够通过其结构的某些化学或酶促修饰在体内转换为药物(活性治疗剂)。前药部分的实例是本领域中公知的，并且可以见于以下参考文献中：Biological Approaches to the Controlled Delivery of Drugs，R.L.Juliano，NewYork Academy of Sciences，(1988)；Hydrolysis in Drug and Prodrug Metabolism：Chemistry，Biochemistry，and Enzymology，Bernard Testa，Vch VerlagsgesellschaftMbh，(2003)；和Prodrugs：Topical and Ocular Drug Delivery，Kenneth Sloan，MarcelDekker；(1992)。前药部分的实例是肽，例如，将TLR配体引导至作用位点的肽，以及在其氨基末端具有两个或更多个游离和未偶联羧酸的肽。其他示例性的可切割前药部分包括酯基、醚基、酰基、烷基、磷酸基、磺酸基、N-氧化物和叔丁氧基羰基。
在一些实施方案中，TLR激动剂是单体TLR激动剂。在另一些实施方案中，TLR激动剂是多聚化的(multimerized)，例如TLR激动剂是聚合的。在一些实施方案中，多聚化的TLR激动剂是同功能的(homofunctional)，例如，由一种类型的TLR激动剂构成。在另一些实施方案中，多聚化的TLR激动剂是异功能的(heterofunctional)TLR激动剂。
在一些实施方案中，TLR配体是嵌合TLR配体(在本文中也称为“异功能的”TLR配体)。在一些实施方案中，嵌合TLR激动剂包含TLR9激动剂部分和TLR2激动剂部分。以下是异功能的TLR激动剂的非限制性实例。
在一些实施方案中，嵌合TLR配体具有下式：(X)n-(Y)m，其中X是TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂，并且其中Y是TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂和TLR9激动剂，并且n和m独立地为来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大的整数(包括于其间的所有值和范围)。在某些实施方案中，X或Y是TLR9，并且X或Y是TLR2/6。
TLR2激动剂。TLR2激动剂包括分离的天然存在的TLR2激动剂和合成的TLR2激动剂。从TLR2激动剂的天然存在来源分离的TLR2激动剂通常是经纯化的，例如，经纯化的TLR2激动剂为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。合成的TLR2激动剂通过标准方法制备，并且通常为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。
TLR2激动剂包括不与任何其他化合物连接的TLR2激动剂。TLR2激动剂包括与第二化合物共价或非共价连接的TLR2激动剂。在一些实施方案中，TLR2激动剂与另一种化合物直接连接。在另一些实施方案中，TLR2激动剂通过接头与另一种化合物连接。
TLR2激动剂包括合成的三酰化和二酰化脂肽。TLR2配体的非限制性实例是FSL-1(来源于唾液支原体1(Mycoplasma salivarium 1)的合成脂蛋白)、Pam3Cys(三棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸)或S-[2，3-二(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基]-N-棕榈酰-(R)-半胱氨酸，其中“Pam3”是“三棕榈酰-S-甘油基”)(Aliprantis等，1999)。Pam3Cys的衍生物也是合适的TLR2激动剂，其中衍生物包括但不限于S-[2，3-二(棕榈酰氧基)-(2-R，S)-丙基]-N-棕榈酰-(R)-Cys-(S)-Ser-(Lys)4-羟基三氢氯化物；Pam3Cys-Ser-Ser-Asn-Ala；PaM3Cys-Ser-(Lys)4；Pam3Cys-Ala-Gly；Pam3Cys-Ser-Gly；Pam3Cys-Ser；PaM3Cys-OMe；Pam3Cys-OH；PamCAG，棕榈酰-Cys((RS)-2，3-二(棕榈酰氧基)-丙基)-Ala-Gly-OH；等等。合适的TLR2激动剂的另一个非限制性实例是Pam2CSK4 PaM2CSK4(二棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸-丝氨酸-(赖氨酸)4；或Pam2Cys-Ser-(Lys)4)是合成的二酰化脂肽。合成的TLR激动剂已在文献中描述。参见，例如，Kellner等(1992)；Seifer等(1990)；Lee等(2003)。
TLR3激动剂。TLR3激动剂包括分离的天然存在的TLR3激动剂和合成的TLR3激动剂。从TLR3激动剂的天然存在来源分离的TLR3激动剂通常是经纯化的，例如，经纯化的TLR3激动剂为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。合成的TLR3激动剂通过标准方法制备，并且通常为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。
TLR3激动剂包括不与任何其他化合物连接的TLR3激动剂。TLR3激动剂包括与第二化合物共价或非共价连接的TLR3激动剂。在一些实施方案中，TLR3激动剂与另一种化合物直接连接。在另一些实施方案中，TLR3激动剂通过接头与另一种化合物连接。
TLR3激动剂包括天然存在的双链RNA(dsRNA)、合成的ds RNA和合成的dsRNA类似物等等(Alexopoulou等，2001)。合成的ds RNA类似物的示例性非限制性实例是聚(I：C)。
TLR4激动剂。合适的TLR4激动剂包括分离的天然存在的TLR4激动剂和合成的TLR4激动剂。从TLR4激动剂的天然存在来源分离的TLR4激动剂通常是经纯化的，例如，经纯化的TLR4激动剂为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。合成的TLR4激动剂通过标准方法制备，并且通常为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。
TLR4激动剂包括不与任何其他化合物连接的TLR4激动剂。合适的TLR4激动剂包括与第二化合物共价或非共价连接的TLR4激动剂。在一些实施方案中，TLR4激动剂与另一种化合物直接连接。在另一些实施方案中，TLR4激动剂通过接头与另一种化合物连接。与TLR4激动剂连接的合适化合物包括载体、支架等。
TLR4激动剂包括天然存在的脂多糖(LPS)，例如来自多种革兰氏阴性菌的LPS；天然存在的LPS的衍生物；合成的LPS；细菌热休克蛋白-60(Hsp60)；甘露糖醛酸聚合物；flavolipin；糖醛酸磷壁酸(teichuronic acid)；肺炎链球菌(S.pneumoniae)肺炎球菌溶血素；细菌菌毛、呼吸道合胞体病毒包被蛋白等等。TLR4激动剂还包括单磷酰脂质A-合成(MPLA，Invivogen)和磷酸化的六酰基二糖(PHAD，Avanti Polar Lipid)，以及其他合成的TLR4激动剂。
TLR5激动剂。合适的TLR5激动剂包括分离的天然存在的TLR5激动剂和合成的TLR5激动剂。从TLR5激动剂的天然存在来源分离的TLR5激动剂通常是经纯化的，例如，经纯化的TLR4激动剂为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。合成的TLR5激动剂通过标准方法制备，并且通常为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。
TLR5激动剂包括不与任何其他化合物连接的TLR5激动剂。合适的TLR5激动剂包括与第二化合物共价或非共价连接的TLR5激动剂。在一些实施方案中，TLR5激动剂与另一种化合物直接连接。在另一些实施方案中，TLR5激动剂通过接头与另一种化合物连接。与TLR5激动剂连接的合适的化合物包括载体、支架等。
TLR5激动剂包括鞭毛蛋白(flagellin)的高度保守的22个氨基酸区段以及全长鞭毛蛋白及其其他区段。
TLR7激动剂。合适的TLR7激动剂包括分离的天然存在的TLR7激动剂和合成的TLR7激动剂。从TLR7激动剂的天然存在来源分离的TLR7激动剂通常是经纯化的，例如，经纯化的TLR7激动剂为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。合成的TLR7激动剂通过标准方法制备，并且通常为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。
TLR7激动剂包括不与任何其他化合物连接的TLR7激动剂。合适的TLR7激动剂包括与第二化合物共价或非共价连接的TLR7激动剂。在一些实施方案中，TLR7激动剂与另一种化合物直接连接。在另一些实施方案中，TLR7激动剂通过接头与另一种化合物连接。
TLR7配体包括咪唑并喹啉化合物、鸟苷类似物、嘧啶酮化合物(例如溴匹立明和溴匹立明类似物)等等。起TLR7配体作用的咪唑并喹啉化合物包括但不限于咪喹莫特(也称为Aldara、R-837、S-26308)和R-848(也称为瑞喹莫德、S-28463；具有化学结构：4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α.-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇)。合适的咪唑并喹啉试剂包括咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、6，7-稠合的环烷基咪唑并吡啶胺和1，2桥联咪唑并喹啉胺。这些化合物已在美国专利4,689,338、4,929,624、5,238,944、5,266,575、5,268,376、5,346,905、5,352,784、5,389,640、5,395,937、5,494,916、5,482,936、5,525,612、6,039,969和6,110,929中进行了描述。适合于在主题方法中使用的特定种类的咪唑并喹啉试剂包括R-848(S-28463)、4-氨基-2-乙氧基甲基-α，α-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-s-i-乙醇和1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(R-837或咪喹莫特)。同样适合使用的是化合物4-氨基-2-(乙氧基甲基)-α，α-二甲基-6，7，8，9-四氢-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇水合物(参见，例如Gorden等(2005)中的BM-003)。
合适的化合物包括具有与五元含氮杂环稠合的2-氨基吡啶的那些。这样的化合物包括，例如，咪唑并喹啉胺，包括但不限于例如经取代咪唑并喹啉胺，例如，经酰胺取代的咪唑并喹啉胺、经磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺、经脲取代的咪唑并喹啉胺、经芳基醚取代的咪唑并喹啉胺、经杂环醚取代的咪唑并喹啉胺、经酰氨基醚取代的咪唑并喹啉胺、经亚磺酰氨基醚取代的咪唑并喹啉胺、经脲取代的咪唑并喹啉醚、经硫醚取代的咪唑并喹啉胺，和经6-，7-，8-或9-芳基或者杂芳基取代的咪唑并喹啉胺；四氢咪唑并喹啉胺，包括但不限于经酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺、经磺酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺、经脲取代的四氢咪唑并喹啉胺、经芳基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、经杂环醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、经酰氨基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、经亚磺酰氨基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、经脲取代的四氢咪唑并喹啉醚和经硫醚取代的四氢咪唑并喹啉胺；咪唑并吡啶胺，包括但不限于经酰胺取代的咪唑并吡啶胺、经亚磺酰氨基取代的咪唑并吡啶胺、经脲取代的咪唑并吡啶胺、经芳基醚取代的咪唑并吡啶胺、经杂环醚取代的咪唑并吡啶胺、经酰氨基醚取代的咪唑并吡啶胺、经亚磺酰氨基醚取代的咪唑并吡啶胺、经脲取代的咪唑并吡啶醚和经硫醚取代的咪唑并吡啶胺；1，2-桥联咪唑并喹啉胺；6，7-稠合的环烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并萘啶胺；四氢咪唑并萘啶胺；唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺；唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺；唑并萘啶胺；噻唑并萘啶胺；以及与吡啶胺、喹啉胺、四氢喹啉胺、萘啶胺和四氢萘啶胺稠合的1H-咪唑二聚物。
化合物包括经取代的咪唑并喹啉胺、四氢咪唑并喹啉胺、咪唑并吡啶胺、1，2-桥联咪唑并喹啉胺、6，7-稠合的环烷基咪唑并吡啶胺、咪唑并萘啶胺、四氢咪唑并萘啶胺、唑并喹啉胺、噻唑并喹啉胺、唑并吡啶胺、噻唑并吡啶胺、唑并萘啶胺和噻唑并萘啶胺。
本文中使用的经取代咪唑并喹啉胺是指经酰胺取代的咪唑并喹啉胺、经磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺、经脲取代的咪唑并喹啉胺、经芳基醚取代的咪唑并喹啉胺、经杂环醚取代的咪唑并喹啉胺、经酰氨基醚取代的咪唑并喹啉胺、经亚磺酰氨基醚取代的咪唑并喹啉胺、经脲取代的咪唑并喹啉醚、经硫醚取代的咪唑并喹啉胺，或者经6-，7-，8-或9-芳基或杂芳基取代的咪唑并喹啉胺。
起TLR7配体作用的鸟苷类似物包括某些经C8-取代的和经N7，C8-双取代的鸟嘌呤核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，包括但不限于洛索立宾(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)、7-硫代-8-氧代鸟苷(TOG)、7-脱氮鸟苷和7-脱氮脱氧鸟苷(deazadeoxyguanosine)(Lee等，2003)。溴匹立明(PNU-54461)、5-卤代-6-苯基-嘧啶酮和溴匹立明类似物描述于文献中并且同样适合使用。参见，例如，Vroegop等(1999)。合适的经C8-取代鸟苷的另外的实例包括但不限于8-巯基鸟苷、8-溴代鸟苷、8-甲基鸟苷、8-氧代-7，8-二氢鸟苷、C8-芳基氨基-2′-脱氧鸟苷、C8-丙炔基-鸟苷、经C8-和N7-取代的鸟嘌呤核糖核苷(例如，7-烯丙基-8-氧代鸟苷(洛索立宾)和7-甲基-8-氧代鸟苷)、8-氨基鸟苷、8-羟基-2′-脱氧鸟苷以及8-羟基鸟苷。
在一些实施方案中，经取代鸟嘌呤TLR7配体是单体的。在另一些实施方案中，经取代鸟嘌呤TLR7配体是多聚体的。因此，在一些实施方案中，TLR7配体具有下式：(B)q，其中B是经取代鸟嘌呤TLR7配体，并且q是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。多聚体TLR7配体中的单独的TLR7配体单体彼此直接或通过接头共价或非共价地连接。合适的TLR7激动剂包括如美国专利公开2004/0162309中所述的TLR7配体。
在一些实施方案中，TLR7激动剂是选择性TLR7激动剂，例如，激动剂通过TLR7调节细胞活性，但不通过TLR8调节细胞活性。TLR7选择性激动剂包括美国专利公开2004/0171086中所示的那些。这样的TLR7选择性激动剂化合物包括但不限于N1-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-6，7，8，9-四氢-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}-4-氟-1-苯磺酰胺、N1-[4-(4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]-4-氟-1-苯磺酰胺、N-[4-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]甲磺酰胺、N-{3-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2，2-二甲基丙基}苯甲酰胺、N-(2-{2-[4]-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)-N-甲基甲磺酰胺、N-(2-{2-[4-氨基-2]-(2-甲氧基乙基)-6，7，8，9-四氢-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)苯甲酰胺、N-[4-(4-氨基-2-甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]环戊烷甲酰胺、1-[4-(1，1-二氧桥异噻唑烷-2-基)丁基]-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、2-甲基-1-[5-甲基磺酰基)戊基-6，7，8，9-四氢-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、N-{2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-6，7-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基]-1，1-二甲基乙基}-N-环己基脲、N-[2-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-1，1-二甲基乙基]苯甲酰胺、N-[3-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2，2-二甲基丙基]甲磺酰胺、1-[6-(甲磺酰基)己基]-6，7-二甲基-2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-4-胺、6-(6-氨基-2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-N-甲氧基-N-甲基己酰胺、1-[2，2-二甲基-3-((甲基磺酰基)丙基]-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、N-[4-(4-氨基-2-甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]-N-甲基-N-苯基脲、1-{3-[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-8-基]苯基}乙酮、7-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-2-甲基庚-2-醇、N-甲基-4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁烷-1-磺酰胺、N-(4-甲氧基苄基)-4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁烷-1-磺酰胺、N-{2-[4-氨基-3-(乙氧基甲基)-6，7-二甲基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基]-1，1-二甲基乙基}甲磺酰胺、2-乙氧基甲基-1-(3-甲氧基丙基)-7-(5-羟甲基吡啶-3-基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、1-[(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)甲基]-2-(乙氧基甲基)-7-(吡啶-3-基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、4-[3-(4-氨基-6，7-二甲基-2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]吡啶-1-基)丙烷-1-磺酰基]-苯甲酸乙酯、2-丁基-1-{2-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]乙基}-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、N-(2-{4-氨基-2-乙氧基甲基-7-[6-(甲烷磺酰基氨基)己氧基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-1，1-二甲基乙基)甲磺酰胺、N-(6-{[4-氨基-2-乙氧基甲基-1-(2-甲烷磺酰基氨基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-7-基]氧基}己基)乙酰胺、1-[4-(1，1-二氧桥异噻唑烷-2-基)丁基]-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-3-基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、1-[4-(1，1-二氧桥异噻唑烷-2-基)丁基]-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-4-基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、1-[4-(1，1-二氧桥异噻唑烷-2-基)丁基]-2-乙氧基甲基-7-苯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、2-(乙氧基甲基)-1-{[1-(甲基磺酰基)哌啶-4-基]甲基}-7-(吡啶-3-基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、2-(乙氧基甲基)-1-[(1-异丁酰基哌啶-4-基)甲基]-7-(吡啶-3-基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、2-(乙氧基甲基)-1-{[1-(吗啉基-4-基羰基)哌啶-4-基]甲基}-7-(吡啶-3-基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、环丙烷羧酸[3-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丙氧基]酰胺、异丙基氨基甲酸4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-7-基酯、乙基4-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁酸酯、1-[4-氨基-2-乙基-7-(吡啶-3-基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇、1-(4-氨基-2-乙基-7-[5-{羟甲基)吡啶-3-基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇、1-(3-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-8-(吡啶-3-基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丙基]吡咯烷-2-酮、N-(2-{4-氨基-2-乙氧基甲基-7-[6-(甲烷磺酰基氨基)己氧基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-1，1-二甲基乙基)乙酰胺、1-{3-[4-氨基-7-(3-羟甲基苯基)-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丙基}吡咯烷-2-酮、N-{4-[4-氨基-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-3-基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}-N′-丙基脲、N-{4-[4-氨基-2-乙氧基甲基-7-(吡啶-3-基))-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}丁酰胺、5-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)-4，4-二甲基戊-2-酮、1-环己基甲基-2-乙氧基甲基-7-(5-羟甲基吡啶-3-基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺、N，N-二甲基-5-(4-氨基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)戊烷-1-磺酰胺、N-{3-[(4-氨基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)氨基]丙基}甲磺酰胺和/或N，N-二甲基-4-(4-氨基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁烷-1-磺酰胺。
另外的合适的TLR7选择性激动剂包括但不限于2-(乙氧基甲基)-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(美国专利5,389,640)、2-甲基-1-[2-(3-吡啶-3-基丙氧基)乙基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(WO 02/46193)、N-(2-{2-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙氧基}乙基)-N-甲基环己烷甲酰胺(美国专利公开2004/0171086)、1-[2-(苄氧基)乙基]-2-甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(WO 02/46189)、N-{8-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]辛基}-N-苯基脲(美国专利公开2004/0171086(IRM5))、2-丁基-1-[5-(甲基磺酰基)戊基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(WO 02/46192)、N-{3-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丙基}-4-甲基苯磺酰胺(美国专利6,331,539)和N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]环己烷甲酰胺(美国专利公开2004/0171086(IRM8))。同样适合使用的是TLR7选择性激动剂N-[4-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]甲磺酰胺(Gorden等，2005)。
TLR8激动剂。合适的TLR8激动剂包括分离的天然存在的TLR8激动剂和合成的TLR8激动剂。从TLR8激动剂的天然存在来源分离的TLR8激动剂通常是经纯化的，例如，经纯化的TLR8激动剂为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。合成的TLR8激动剂通过标准方法制备，并且通常为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。
TLR8激动剂包括不与任何其他化合物连接的TLR8激动剂。TLR8激动剂包括与第二化合物共价或非共价连接的TLR8激动剂。在一些实施方案中，TLR8激动剂与另一种化合物直接连接。在另一些实施方案中，TLR8激动剂通过接头与另一种化合物连接。
TLR8激动剂包括但不限于例如R-848及其衍生物和类似物的化合物。合适的TLR8激动剂包括具有与五元含氮杂环稠合的2-氨基吡啶的化合物。这样的化合物包括，例如，咪唑并喹啉胺，其包括但不限于例如经取代的咪唑并喹啉胺，例如，经酰胺取代的咪唑并喹啉胺、经磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺、经脲取代的咪唑并喹啉胺、经芳基醚取代的咪唑并喹啉胺、经杂环醚取代的咪唑并喹啉胺、经酰氨基醚取代的咪唑并喹啉胺、经亚磺酰氨基醚取代的咪唑并喹啉胺、经脲取代的咪唑并喹啉醚、经硫醚取代的咪唑并喹啉胺，和经6-，7-，8-或9-芳基或者杂芳基取代的咪唑并喹啉胺；四氢咪唑并喹啉胺，包括但不限于经酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺、经磺酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺、经脲取代的四氢咪唑并喹啉胺、经芳基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、经杂环醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、经酰氨基醚取代四氢咪唑并喹啉胺、经亚磺酰氨基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺、经脲取代的四氢咪唑并喹啉醚和经硫醚取代的四氢咪唑并喹啉胺；咪唑并吡啶胺，包括但不限于经酰胺取代的咪唑并吡啶胺、经磺酰氨取代的咪唑并吡啶胺、经脲取代的咪唑并吡啶胺、经芳基醚取代的咪唑并吡啶胺、经杂环醚取代的咪唑并吡啶胺、经酰氨基醚取代的咪唑并吡啶胺、经亚磺酰氨基醚取代的咪唑并吡啶胺、经脲取代的咪唑并吡啶醚和经硫醚取代的咪唑并吡啶胺；1，2-桥联咪唑并喹啉胺；6，7-稠合的环烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并萘啶胺；四氢咪唑并萘啶胺；唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺；唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺；唑并萘啶胺；噻唑并萘啶胺；以及与吡啶胺、喹啉胺、四氢喹啉胺、萘啶胺或四氢萘啶胺稠合的1H-咪唑二聚物。
在一个特定实施方案中，TLR8激动剂是经酰胺取代的咪唑并喹啉胺。在一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经脲取代的咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经芳基醚取代的咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经杂环醚取代的咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经酰氨基醚取代的咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经亚磺酰氨基醚取代的咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经脲取代的咪唑并喹啉醚。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经硫醚取代的咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经6-，7-，8-或9-芳基或者杂芳基取代的咪唑并喹啉胺。
在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经磺酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经脲取代的四氢咪唑并喹啉胺。
在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经芳基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经杂环醚取代的四氢咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经酰氨基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经亚磺酰氨基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经脲取代的四氢咪唑并喹啉醚。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经硫醚取代的四氢咪唑并喹啉胺。
在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经酰胺取代的咪唑并吡啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经磺酰胺取代的咪唑并吡啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经脲取代的咪唑并吡啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经芳基醚取代的咪唑并吡啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经杂环醚取代的咪唑并吡啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经酰氨基醚取代的咪唑并吡啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经亚磺酰氨基醚取代的咪唑并吡啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经脲取代的咪唑并吡啶醚。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是经硫醚取代的咪唑并吡啶胺。
在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是1，2-桥联咪唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是6，7-稠合的环烷基咪唑并吡啶胺。
在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是咪唑并萘啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是四氢咪唑并萘啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是噻唑并喹啉胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是唑并吡啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是噻唑并吡啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是唑并萘啶胺。在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是噻唑并萘啶胺。
在另一个替代实施方案中，TLR8激动剂是与吡啶胺、喹啉胺、四氢喹啉胺、萘啶胺或四氢萘啶胺稠合的1H-咪唑二聚物。
在一些实施方案中，TLR8激动剂是选择性TLR8激动剂，例如，激动剂通过TLR8调节细胞活性，但不通过TLR7调节细胞活性。TLR8选择性激动剂包括美国专利公开2004/0171086中的那些。这样的TLR8选择性激动剂化合物包括但不限于美国专利公开No.2004/0171086中所示的化合物，其包括N-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}喹啉-3-甲酰胺、N-{4-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]丁基}喹喔啉(quinoxoline)-2-甲酰胺和N-[4-(4-氨基-2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]吗啉-4-甲酰胺。
其他合适的TLR8选择性激动剂包括但不限于2-丙基噻唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(美国专利6,110,929)、N1-[2-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4，5-c][1，5]萘啶-1-基)乙基]-2-氨基-4.-甲基戊酰胺(美国专利6,194,425)、N1-[4-(4-氨基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)丁基]-2-苯氧基-苯甲酰胺(美国专利6,451,810)、N1-[2-(4-氨基-2-丁基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)乙基]-1-丙酰基磺酰胺(美国专利6,331,539)、N-{2-[2-(4-氨基-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基)乙氧基]乙基}-N′-苯基脲(美国专利公开2004/0171086)、1-{4-[3，5-二氯苯基)硫代]丁基}-2-乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(美国专利公开2004/0171086)、N-{2-[4-氨基-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]乙基}-N′-(3-氰基苯基)脲(WO 00/76518和美国专利公开No.2004/0171086)和4-氨基-α，α-二甲基-2-甲氧基乙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇(美国专利5,389,640)。包括美国专利公开No.2004/0171086中的化合物用作TLR8选择性激动剂。同样适合使用的是化合物2-丙基噻唑并-4，5-c]喹啉-4-胺(Gorden等，2005，同上)。
TLR9激动剂。合适的TLR9激动剂包括分离的天然存在的TLR9激动剂和合成的TLR9激动剂。从TLR9激动剂的天然存在来源分离的TLR9激动剂通常是经纯化的，例如，经纯化的TLR9激动剂为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。合成的TLR9激动剂通过标准方法制备，并且通常为至少约80％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或超过99％纯。
TLR9激动剂包括不与任何其他化合物连接的TLR9激动剂。TLR9激动剂包括与第二化合物共价或非共价连接的TLR9激动剂。在一些实施方案中，TLR9激动剂与另一种化合物直接连接。在另一些实施方案中，TLR9激动剂通过接头与另一种化合物连接。
TLR9激动剂(本文中也称为“TLR9配体”)的实例包括包含序列5′-CG-3′(“CpG核酸”或“ODN”)的核酸，在某些方面，C是未甲基化的。本文中在TLR9配体分子的情况下可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的多核苷酸，并且尤其涵盖单链和双链寡核苷酸(包括脱氧核苷酸、核糖核苷酸或者二者)、经修饰寡核苷酸、和寡聚核苷其单独或作为较大核酸构建体的部分或作为与非核酸分子(例如多肽)的缀合物的部分。因此，TLR9配体可以是例如，单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)。TLR9配体还涵盖粗制的，脱毒细菌(例如，分枝杆菌(mycobacterial))RNA或DNA，以及富含TLR9配体的富集质粒。在一些实施方案中，“富含TLR9配体的质粒”是指线型或环状质粒，其包含或经改造以包含比通常见于哺乳动物DNA中的更大数目的CpG基序。已经鉴定了三种类型的刺激性CpG ODN，A、B和C型，它们的免疫刺激活性不同(Krug等，2001.Identification ofCpG oligonucleotide sequences with high induction of IFNalpha/beta inplasmacytoid dendritic cells.Eur J Immunol，31(7)：2154-63；Marshall等，2005.Superior activity of the type C class of ISS in vitro and in vivo acrossmultiple species.DNA Cell Biol.24(2)：63-72)。A型CpG ODN的特征在于包含磷酸二酯中心CpG的回文基序和硫代磷酸酯3′多聚G链(string)。它们从浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cells，pDC)诱导高的IFN-α产生，但是是TLR9依赖性NF-kB信号传导的弱刺激物。B型CpG ODN包含具有一个或更多个CpG二核苷酸的硫代磷酸酯骨架。它们强烈地激活B细胞但微弱地刺激IFN-α分泌。C型CpG ODN组合了A型和B型二者的特征。它们包含硫代磷酸酯骨架和包含CpG的回文基序。C型CpG ODN诱导来自pDC和B细胞刺激的强IFN-α产生。
富含TLR9配体的质粒的非限制性实例描述于Roman等(1997)中。寡核苷酸的修饰包括但不限于3′OH或5′OH基团的修饰、核苷酸碱基的修饰、糖组分的修饰和磷酸基团的修饰。
TLR9配体可包含至少一种包含L-糖的核苷。L-糖可以是脱氧核糖、核糖、戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖或糖“类似物”环戊基。L-糖可以为吡喃糖基呋喃糖基形式。
TLR9配体通常不提供，也没有任何要求它们提供由多核苷酸编码的任何氨基酸序列的表达，并因此TLR9配体的序列可以是并且通常是非编码的。TLR9配体可包含线型双链或单链分子、环状分子，或者可包含线型区段和环状区段二者。TLR9配体可以是单链的，或者可以是完全地或部分地双链的。
在一些实施方案中，用于主题方法中的TLR9配体是寡核苷酸，例如，由以下长度的序列组成：约5个核苷酸至约200个核苷酸、约10个核苷酸至约100个核苷酸、约12个核苷酸至约50个核苷酸、约15个核苷酸至约25个核苷酸、20个核苷酸至约30个核苷酸、约5个核苷酸至约15个核苷酸、约5个核苷酸至约10个核苷酸或约5个核苷酸至约7个核苷酸。在一些实施方案中，长度小于约15个核苷酸、小于约12个核苷酸、小于约10个核苷酸或小于约8个核苷酸的TLR9配体与较大分子相关。
在一些实施方案中，TLR9配体不提供在真核细胞中肽或多肽的表达，例如，将TLR9配体引入真核细胞不会导致肽或多肽的产生，因为TLR9配体不提供编码肽或多肽的mRNA的转录。在这些实施方案中，TLR9配体缺乏在真核细胞中用于转录所必需的启动子区和其他控制元件。
TLR9配体可以从细菌分离，例如，从细菌来源分离；通过合成方法产生(例如，通过用于多核苷酸的化学合成的标准方法产生)；通过标准重组方法产生，然后从细菌来源分离；或前述的组合。在许多实施方案中，TLR9配体是经纯化的，例如，为至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、或者更纯例如99.5％、99.9％或更纯。在许多实施方案中，化学合成TLR9配体，然后对其进行纯化。
在另一些实施方案中，TLR9配体是较大核苷酸构建体(例如，质粒载体、病毒载体或其他这样的构建体)的部分。多种质粒和病毒载体是本领域中已知的，并且在此处不需要详细说明。大量这样的载体已描述于多种出版物中，包括例如Current Protocols inMolecular Biology，(1987，和更新)。
通常，用于主题组合物中的TLR9配体包含至少一个未甲基化的CpG基序。在某些哺乳动物物种(例如，啮齿动物)中多核苷酸中任何CpG序列的相对位置是5′-CG-3′(即，C位于5’位置，相对于G位于3′位置)。
在一些实施方案中，TLR9配体包含中心回文核心序列，其包含至少一个CpG序列，其中中心回文核心序列包含磷酸二酯骨架，并且其中中心回文核心序列在一侧或两侧侧翼与包含硫代磷酸酯骨架的多鸟苷序列相接。
在另一些实施方案中，TLR9配体在或靠近核酸的5′端处包含一个或更多个TCG序列和至少两个另外的CG二核苷酸。在这些实施方案的一些中，至少两个另外的CG二核苷酸被三个核苷酸、两个核苷酸或一个核苷酸间隔开。在这些实施方案的一些中，至少两个另外的CG二核苷酸彼此相邻。在这些实施方案的一些中，TLR9配体在核酸的5′端处包含(TCG)n，其中n＝1至3。在另一些实施方案中，TLR9配体包含(TCG)n，其中n＝1至3，并且其中(TCG)n序列在(TCG)n序列的5′端上侧翼与一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸、四个核苷酸或五个核苷酸相接。
可用于本文中的TLR9配体的示例性共有CpG基序包括但不必须限于：5′-嘌呤-嘌呤-(C)-(G)-嘧啶-嘧啶-3′，其中TLR9配体包含侧翼与至少两个嘌呤核苷酸(例如，GG、GA、AG、AA、II等)和至少两个嘧啶核苷酸(CC、TT、CT、TC、UU等)相接的CpG基序；5′-嘌呤-TCG-嘧啶-嘧啶-3′；5′-TCG-N-N-3′；其中N是任何碱基；5′-Nx(CG)nNy，其中N是任何碱基，其中x和y独立地是0至200的任何整数，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11至15、16至20、21至25、25至30、30至50、50至75、75至100、100至150或150至200；并且n是1或更大的任何整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。5′-Nx(TCG)nNy，其中N是任何碱基，其中x和v独立地是0至200的任何整数，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11至15、16至20、21至25、25至30、30至50、50至75、75至100、100至150或150至200；并且n是1或更大的任何整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。5′-(TCG)n-3′，其中n是1或更大的任何整数，例如，以提供基于TCG的TLR9配体(例如，其中n＝3，多核苷酸包含序列5′-TCGNNTCGNNTCG-3′)；5′Nm-(TCG)n-Np-3′，其中N是任何核苷酸，其中m是0、1、2或3，其中n是1或更大的任何整数，并且其中p是1、2、3或4；5′Nm-(TCG)n-Np-3′，其中N是任何核苷酸，其中m是0至5，并且其中n是1或更大的任何整数，其中p是4或更大，并且其中序列N-N-N-N包含至少两个CG二核苷酸，它们彼此相邻或被一个核苷酸、两个核苷酸或三个核苷酸隔开；以及5′-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-TCG-3′。
其中核酸TLR9配体包含式：5′-Nm-(TCG)n-Np-3′的序列，其中N是任何核苷酸，其中m是0至5，并且其中n是1或更大的任何整数，其中p是4或更大，并且其中序列N-N-N-N包含至少两个CG二核苷酸，它们彼此相邻或被一个核苷酸、两个核苷酸或三个核苷酸隔开，可以使用的示例性TLR9配体包括但不必须限于：(1)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是NNCGNNCG；(2)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是AACGTTCG；(3)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是TTCGAACG；(4)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是TACGTACG；(5)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是ATCGATCG；(6)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是CGCGCGCG；(7)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是GCCGGCCG；(8)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是CCCGGGCG；(9)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是GGCGCCCG；(10)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是CCCGTTCG；(11)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是GGCGTTCG；(12)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是TTCGCCCG；(13)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是TTCGGGCG；(14)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是AACGCCCG；(15)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是AACGGGCG；(16)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是CCCGAACG；以及(17)所述式的序列，其中n＝2，并且Np是GGCGAACG；并且其中在1至17的任何一个中，m＝0、1、2或3。
其中核酸TLR9配体包含式：5′Nm-(TCG)n-Np-3′的序列，其中N是任何核苷酸，其中m是0、1、2或3，其中n是1或更大的任何整数，并且其中p是1、2、3或4，可以使用的示例性TLR9配体包括但不必须限于：(1)所述式的序列，其中m＝0，n＝1，并且Np是T-T-T；(2)所述式的序列，其中m＝0，n＝1，并且Np是T-T-T-T；(3)所述式的序列，其中m＝0，n＝1，并且Np是C-C-C-C；(4)所述式的序列，其中m＝0，n＝1，并且Np是A-A-A-A；(5)所述式的序列，其中m＝0，n＝1，并且Np是A-G-A-T；(6)所述式的序列，其中Nm是T，n＝1，并且Np是T-T-T；(7)所述式的序列，其中Nm是A，n＝1，并且Np是T-T-T；(8)所述式的序列，其中Nm是C，n＝1，并且Np是T-T-T；(9)所述式的序列，其中Nm是G，n＝1，并且Np是T-T-T；(10)所述式的序列，其中Nm是T，n＝1，并且Np是A-T-T；(11)所述式的序列，其中Nm是A，n＝1，并且Np是A-T-T；以及(12)所述式的序列，其中Nm是C，n＝1，并且Np是A-T-T。
TLR9配体的核心结构可在上游和/或下游侧翼与任何数量的核苷酸或核苷或者核苷酸或核苷的组合物相接。在一些实施方案中，TLR9配体的核心序列长度为至少6个碱基或8个碱基，并且完全TLR9配体(核心序列加上侧翼序列5′，3′或两者)的长度通常为6个碱基或8个碱基至多至约200个碱基。
基于DNA的TLR9配体包括但不必须限于包含一种或更多种以下核苷酸序列的多核苷酸：AGCGCT，AGCGCC，AGCGTT，AGCGTC，AACGCT，AACGCC，AACGTT，AACGTC，GGCGCT，GGCGCC，GGCGTT，GGCGTC，GACGCT，GACGCC，GACGTT，GACGTC，GTCGTC，GTCGCT，GTCGTT，GTCGCC，ATCGTC，ATCGCT，ATCGTT，ATCGCC，TCGTCG和TCGTCGTCG.
另外的TLR9配体包括但不必须限于包含一种或更多种以下核苷酸序列的多核苷酸：TCGXXXX，TCGAXXX，XTCGXXX，XTCGAXX，TCGTCGA，TCGACGT，TCGAACG，TCGAGAT，TCGACTC，TCGAGCG，TCGATTT，TCGCTTT，TCGGTTT，TCGTTTT，TCGTCGT，ATCGATT，TTCGTTT，TTCGATT，ACGTTCG，AACGTTC，TGACGTT，TGTCGTT，TCGXXX，TCGAXX，TCGTCG，AACGTT，ATCGAT，GTCGTT，GACGTT，TCGXX，TCGAX，TCGAT，TCGTT，TCGTC，TCGA，TCGT，TCGX和TCG
(其中“X”是任何核苷酸)。
基于DNA的TLR9配体包括但不必须限于包含以下八聚体核苷酸序列的多核苷酸：AGCGCTCG，AGCGCCCG，AGCGTTCG，AGCGTCCG，AACGCTCG，AACGCCCG，AACGTTCG，AACGTCCG，GGCGCTCG，GGCGCCCG，GGCGTTCG，GGCGTCCG，GACGCTCG，GACGCCCG，GACGTTCG和GACGTCCG.
TLR9配体可包含任何上述CpG基序中的一种或更多种。例如，TLR9配体可包含相同CpG基序的单个实例或多个实例(例如，2、3、4、5或更多)。作为替代地，TLR9配体可包含多个CpG基序(例如，2、3、4、5或更多)，其中多个CpG基序中的至少两个具有不同的共有序列，或者其中TLR9配体中的所有CpG基序具有不同的共有序列。
TLR9配体可包括或可不包括回文区。如果存在的话，回文序列可以仅延伸至核心六聚体或八聚体序列中的CpG基序(如果存在的话)，或者可以包括更多的六聚体或八聚体序列以及侧翼核苷酸序列。
在某些方面，TLR9激动剂可以是TLR9寡核苷酸激动剂，包括但不限于A型CpG寡脱氧核苷酸、B型CpG寡脱氧核苷酸、C型CpG寡脱氧核苷酸或其他寡脱氧核苷酸。在某些方面，TLR9激动剂是C型寡脱氧核苷酸(ODN)，例如ODN2395(5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’(22mer)SEQ ID NO：)或ODNM362(5’-tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat-3’(25mer)SEQ ID NO：)或ODN10101(5’-tcgtcgttttcgcgcgcgccg-3’SEQ ID NO：)或9mer(5’-cgcgaagcg-3’SEQ IDNO：)或H-Tel 22(5’-agggttagggttagggttaggg-3’SEQ ID NO：)或其类似物。在一些特定方面，TLR9寡核苷酸具有硫代磷酸酯或磷酸二酯骨架。
多聚体TLR9配体。在一些实施方案中，TLR9配体是多聚体。多聚体TLR9配体包含通过非共价键连接的、通过共价键连接的、以及彼此直接连接或者通过一个或更多个间隔区连接的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个如上所述的单独(单体)核酸TLR9配体。合适的间隔区包括核酸和非核酸分子，只要它们是生物可相容的即可。在一些实施方案中，多聚体TLR9配体包含单体TLR9配体的线型阵列。在另一些实施方案中，多聚体TLR9配体是单体TLR9配体的支化或树枝状聚合物阵列。
在一些实施方案中，多聚体TLR9配体具有通式结构(X1)n(X2)n，其中X是如上所述的核酸TLR9配体，并且长度为约6个核苷酸至约200个核苷酸，例如，约6个核苷酸至约8个核苷酸、约8个核苷酸至约10个核苷酸、约10个核苷酸至约12个核苷酸、约12个核苷酸至约15个核苷酸、约15个核苷酸至约20个核苷酸、约20个核苷酸至约25个核苷酸、约25个核苷酸至约30个核苷酸、约30个核苷酸至约40个核苷酸、约40个核苷酸至约50个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约60个核苷酸至约70个核苷酸、约70个核苷酸至约80个核苷酸、约80个核苷酸至约90个核苷酸、约90个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约125个核苷酸、约125个核苷酸至约150个核苷酸、约150个核苷酸至约175个核苷酸或约175个核苷酸至约200个核苷酸；并且其中n是1至约100的任何数字，例如，n＝l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10至约15、15至约20、20至约25、25至约30、30至约40、40至约50、50至约60、60至约70、70至约80、80至约90或90至约100。在这些实施方案中，X和X2在核苷酸序列上彼此相差至少一个核苷酸，并且在核苷酸序列上彼此可相差2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基。
如上所述，在一些实施方案中，主题多聚体TLR9配体包含通过间隔区与邻近TLR9配体隔开的TLR9配体。在一些实施方案中，间隔区是非TLR9配体核酸。在另一些实施方案中，间隔区是非核酸部分。合适的间隔区包括美国专利公开20030225016中描述的那些。使用任何已知方法使TLR9配体多聚化。
TLR9配体修饰。适合用于主题组合物的TLR9配体可以以多种方式进行修饰。例如，TLR9配体可包含骨架磷酸基团修饰(例如，甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键联)，这些修饰可以例如增强它们在体内的稳定性，使得它们在治疗应用中特别有用。特别有用的磷酸基团修饰是转化为核酸TLR9配体的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯形式。硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯在体内比其未经修饰的寡核苷酸对应物对降解更具有抗性，提高TLR9配体的半衰期并使其更可用于所治疗的对象。
其他经修饰TLR9配体包括在5′端、3′端或5′端和3′端二者处都具有修饰的TLR9配体。例如，5′和/或3′端可以与分子(核酸、非核酸或两者)共价或非共价缔合，以例如提高TLR9配体的生物利用度，在可期望时提高摄取效率，促进向目的细胞的递送等。用于与TLR9配体缀合的分子包括但不必限于胆固醇、磷脂、脂肪酸、甾醇、寡糖、多肽(例如，免疫球蛋白)、肽、抗原(例如，肽、小分子等)、线型或环状核酸分子(例如，质粒)、不溶性支持物、治疗性多肽等。适合于与TLR9激动剂连接的治疗性多肽包括但不限于树突细胞生长因子(例如，GM-CSF)、细胞因子、干扰素(例如，IFN-α、IFN-β等)、IFN-α拮抗剂等等。
在一些实施方案中，TLR9配体与不溶性支持物连接(例如，缀合、共价连接、与其非共价缔合或吸附在其上)。不溶性支持物的示例性非限制性实例是阳离子聚(D，L-丙交酯-乙交酯)共聚物。
另外的TLR9配体缀合物以及用于制备其的方法是本领域中已知的，并描述于例如WO 98/16427和WO 98/55495中。因此，术语“TLR9配体”包括包含核酸TLR9配体的缀合物。
多肽(例如，治疗性多肽)可以与TLR9配体直接地或间接地(例如通过接头分子)缀合。多种接头分子是本领域中已知的并且可以用于缀合物中。从肽到寡核苷酸的连接可以通过肽反应性侧链或者肽的N端或C端。从寡核苷酸到肽的连接可以在3′或5′端或者内部。接头可以是有机、无机或半有机分子，并且可以是有机分子、无机分子或包含无机分子和有机分子二者的共聚物的聚合物。
如果存在的话，接头分子通常具有足够的长度以允许寡核苷酸和/或多核苷酸和连接的多肽允许寡核苷酸与多肽之间的一些灵活移动。连接分子通常为约6至50个原子长。接头分子还可以是例如芳基乙炔、包含2至10个单体单元的乙二醇低聚物、二胺、二酸、氨基酸或者其组合。根据本公开内容，可以使用可以与寡核苷酸结合的其他接头分子。
III.制剂和施用
本发明人已将小鼠用作用于研究通过本文中所述组合物的刺激的模型。已经确定了将对象单次和重复暴露于本文中所述组合物的效果，并且已观察到不明显的大体病理学(gross pathology)，例如过早死亡、重量减轻或行为改变。
本文中所述实施方案的一个非限制性益处是其可以快速且容易地递送并起作用。而且，组合物可以经济地大量生产并且容易地储存，以及由医院环境以外的人容易地运输。
本文中公开的药物组合物可以通过对象的呼吸系统施用。在某些方面，通过本领域中已知的方法和装置将组合物沉积在肺中。组合物可以在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。分散体还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中，和在油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。适合于吸入的药物形式包括无菌水性溶液或分散体和用于临时制备无菌可吸入溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式通常是无菌的并且能够直接吸入或通过一些中间过程或装置吸入。它必须在制造和储存的条件下稳定，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和/或植物油。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现防止微生物的作用。
剂量必然会根据所治疗的对象的状况和涉及暴露或潜在暴露的具体情况而发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定用于个体对象的适当剂量。此外，对于人施用，制剂应符合FDA生物制品办公室标准或者其他类似组织所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
通过将适当溶剂中所需量的活性组分与上面列举的多种其他成分根据需要合并、随后例如过滤灭菌来制备无菌组合物。通常来说，通过将多种无菌活性成分并入到包含基础分散介质和来自上面列举的那些所需其他成分的无菌载剂中来制备分散体。在用于制备无菌组合物的无菌粉末的情况下，一些制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外的期望成分的粉末。
可以通过不同方法，包括液体雾化器(nebulizer)、基于气雾剂的定量吸入器(metered dose inhaler，MDI)、喷雾器(sprayer)、干粉分散装置等来实施肺/呼吸药物递送。这些方法和组合物是本领域技术人员公知的，如美国专利6,797,258、6,794,357、6,737,045和6,488,953所示，所有这些专利都通过引用并入。根据一些实施方案，可通过本领域中已知的用于通过吸入施用治疗剂的多种吸入或鼻装置中的任一种递送至少一种药物组合物。适合于指导肺或鼻施用的其他装置也是本领域中已知的。通常来说，对于肺施用，以有效地到达肺或鼻窦的下气道的粒径来递送至少一种药物组合物。适合于实践方法的市售吸入装置的一些具体实例是TurbohalerTM(Astra)、(Glaxo)、(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、由Inhale Therapeutics销售的装置、AERxTM(Aradigm)、雾化器(Mallinckrodt)、Acorn雾化器(Marquest Medical Products)、定量吸入器(Glaxo)、粉末吸入器(Fisons)等。
所有这样的吸入装置可用于在气雾剂中施用药物组合物。这样的气雾剂可包含溶液(水性和非水性)或固体颗粒。定量吸入器通常使用喷射剂气体并且在吸气期间需要致动。参见例如，WO 98/35888、WO 94/16970。干粉吸入器使用混合粉末的呼吸驱动。参见美国专利5,458,135、4,668,218、PCT公开WO 97/25086、WO 94/08552、WO 94/06498和欧洲申请EP 0237507，其各自通过引用整体并入本文。雾化器从溶液产生气雾剂，而定量吸入器、干粉吸入器等产生小颗粒气雾剂。用于施用的合适制剂包括但不限于鼻喷剂(spray)或滴鼻剂，并且可包括StIR组合物的水性或油性溶液剂。
可以通过在压力下迫使组合物的混悬液或溶液经由喷嘴产生包含药物组合物的喷剂。可以选择喷嘴尺寸和配置、所施加的压力以及液体进给(feed)速率以实现期望的输出和颗粒尺寸。可以例如通过与毛细管或喷嘴进给相连接的电场产生电喷雾。
药物组合物可以通过雾化器(例如喷射雾化器或超声雾化器)施用。通常来说，在喷射雾化器中，压缩空气源用于通过孔口产生高速空气射流。当气体膨胀到喷嘴之外时，产生低压区，其通过连接至液体储存器的毛细管吸取组合物。来自毛细管的液体流在离开管时被剪切成不稳定的丝状物(filament)和液滴，产生气雾剂。可以采用一些配置、流量和挡板类型以实现来自给定喷射雾化器的期望性能特征。在超声雾化器中，高频电能用于产生振动的机械能，通常采用压电换能器。该能量被传输至组合物，产生气雾剂。
在定量吸入器(MDI)中，喷射剂、组合物和任何赋形剂或其他添加剂作为与压缩气体的混合物包含在罐中。计量阀门的启动将混合物释放为气雾剂。
用于与计量吸入器装置一起使用的药物组合物通常将包括精细分散的粉末，其包含本文中所述的组合物作为非水介质中的混悬剂，例如借助于表面活性剂混悬在喷射剂中。喷射剂可以是用于此目的的任何常规材料，例如，氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烃，或包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a(氢氟烷-134a)、HFA-227(氢氟烷-227)等的烃。
方法可包括向患者或对象施用至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂的治疗组合物。剂可以是组合物，其包含约、至少约或至多约以下的每种TLR激动剂或者TLR激动剂组合的总量或者抗原或变应原：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、550、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000毫克(mg)或微克(mcg)或μg/ml或微克/ml或mM或μM(或其中可推导出的任何范围)。
剂量可以根据需要或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24小时(或其中可推导出的任何范围)或每天1、2、3、4、5、6、7、8、9或次(或其中可推导出的任何范围)施用。可以在患者表现出感染的迹象或觉察到感染之前或之后或者在临床医生评价患者感染之后第一次施用剂量。在一些实施方案中，在患者经历或表现出感染的迹象或症状之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12小时(或其中可推导出的任何范围)或1、2、3、4或5天(或其中可推导出的任何范围)将方案的第一剂量施用于患者。患者可被治疗1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天(或其中可推导出的任何范围)，或者直至感染的症状已消失或降低，或者在感染的症状已消失或降低之后的6、12、18或24小时或1、2、3、4或5天之后。
在包含两种TLR激动剂的组合物中，两种TLR激动剂的比例可以为约1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1或更大，或者其中可推导出的任何范围。在一些特定实施方案中，TLR激动剂是TLR2/6和TLR9激动剂(反之亦然)。
用雾化器治疗的长度可以为至少或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110或120分钟(或其中可推导出的任何范围)。雾化器储存器可含有溶液，其包含约、至少约或至多约以下的每种TLR激动剂或TLR激动剂组合的总量：0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000μg/ml或mg/ml(或其中可推导出的任何范围)。
在每个剂量中施用的体积可以为约、至少约或至多约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μl或ml(或其中可推导出的任何范围)。
本文中使用的“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、载剂、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬剂、胶体等。这样的介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域中公知的。除非在任何常规介质或药剂与活性成分不相容的情况下，否则考虑将其用于治疗组合物中。补充的活性成分也可并入组合物之中。
短语“可药用”是指当施用于对象时不产生变应性或类似不良反应的分子实体和组合物。包含多肽或肽作为活性成分的水性组合物的制备在本领域中是充分理解的。
组合物和方法可用于许多治疗或预防性应用的情况下。为了提高用本文所述组合物治疗的有效性或增强对另一种治疗(第二治疗)(例如抗变态反应治疗)的保护。作为替代地，考虑到在对象已尝试传统治疗但没有收效或收效甚微之后考虑使用包含TLR激动剂的治疗。考虑到治疗的毒性(如果有的话)，向对象施用组合物将遵循用于通过呼吸系统施用的一般方案，并且也将遵循用于施用特定的第二治疗的一般方案。预期必要时将重复治疗周期。还考虑到可将多种标准治疗以及疫苗接种与所述治疗组合应用。
在某些方面，抗炎剂可以与TLR或O/P组合物组合使用。在一些特定实施方案中，用哮喘治疗剂(例如一种或更多种快速作用药物以治疗急性症状)和/或长期控制药物来对患者进行治疗。快速作用药物的实例包括但不限于β2-肾上腺素受体激动剂(SABA)(例如柳丁胺醇或沙丁胺醇)、抗胆碱能药物(例如异丙托溴铵)和肾上腺素能激动剂(例如肾上腺素)。长期控制药物的实例包括但不限于糖皮质激素、长效β肾上腺素能受体激动剂(1ongacting beta adrenoceptor agonists，LABA)、白三烯拮抗剂或肥大细胞稳定剂。
用于本文的甾体抗炎剂包括但不限于氟替卡松、倍氯米松，其任何可药用衍生物，及其任意组合。本文中使用的可药用衍生物包括其任何盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、酸、碱、溶剂合物或水合物。这样的衍生物可由本领域技术人员使用用于这这样的衍生化的已知方法制备。
氟替卡松-丙酸氟替卡松是合成的皮质类固醇并且具有经验式C25H31F3O5S。它的化学名称为S-(氟甲基)6α，9-二氟-11β-17-二羟基-16α-甲基-3-氧代雄甾-1，4-二烯-17β-硫代羟酸酯，17-丙酸酯。丙酸氟替卡松是白色至灰白色粉末，分子量为500.6，并且几乎不溶于水，易溶于二甲基亚砜和二甲基甲酰胺，并且微溶于甲醇和95％乙醇。
在一个实施方案中，制剂可包含甾体抗炎剂(例如，丙酸氟替卡松)。
倍氯米松-在某些方面，甾体抗炎剂可以是二丙酸倍氯米松或其一水合物。二丙酸倍氯米松的化学名称为9-氯-11b，17，21-三羟基-16b-甲基孕甾-1，4-二烯-3，20-炔基17，21-二丙酸盐。该化合物可以是白色粉末，分子量为521.25；并且微溶于水(PhVsicians′Desk Reference)，极易溶于氯仿，并且易溶于丙酮和酒精。
提供甾体抗炎剂可以通过例如使任何不需要的炎症减弱来增强组合物和方法。用于本文的其他甾体抗炎剂的实例包括但不限于倍他米松、去炎松、地塞米松、强的松、莫米松、氟尼缩松和布地奈德。
根据另一个实施方案，非甾体抗炎剂可包括阿司匹林、水杨酸钠、对乙酰氨基酚、非那西汀、布洛芬、酮洛芬、吲哚美辛、氟比洛芬、双氯芬酸、萘普生、吡罗昔康、特丁非隆(tebufelone)、依托度酸、萘丁美酮、替尼达普、氨克酚酸、安替比林、阿米莫比林(amimopyrine)、安乃近、阿尼莫比龙(animopyrone)、保泰松、氯非宗、羟基保泰松、丙沙宗(prexazone)、阿扎丙宗、苄达明、布可隆、辛可仿、氯尼新(clonixin)、地拉唑(ditrazol)、依匹唑、非诺洛芬、氟苯那(floctafeninl)、氟苯那酸、格拉芬(glaphenine)、吲哚芬(indoprofen)、甲氯芬那酸、甲灭酸、尼氟酸、盐地磺胺(salidifamide)、舒林酸、舒洛芬、托美丁、萘丁美酮、噻拉米特、普罗喹宗、丁苯羟酸、氟鲁咪唑、氨苄噻吡酯、替美加定、氨苯砜、二氟尼柳、贝诺酯、磷柳酸、芬氯酸、依托度酸、芬替酸、噻氯咪索、卡洛芬、芬布芬、奥沙普秦、噻洛芬酸、吡洛芬、非泼拉酮、吡罗昔康、舒多昔康、伊索昔康、赛来昔布、和/或替诺西康。
合适的可药用赋形剂可以是挥发性的或非挥发性的。挥发性赋形剂在加热时同时挥发、雾化和吸入。这样的赋形剂的种类是本领域中已知的，并且包括但不限于气态、超临界流体、液体和固体溶剂。以下是这些种类中的示例性载体的列表：水；萜烯，例如薄荷醇；醇类，例如乙醇、丙二醇、甘油和其他类似醇类；二甲基甲酰胺；二甲基乙酰胺；蜡；超临界二氧化碳；干冰；及其混合物。在某些方面，甘油用作赋形剂。
IV.药盆
本文中所述的任何组合物可包含在药盒中。在一个非限制性实例中，用于生产和/或递送TLR或O/P组合物的试剂包含在药盒中。在某些方面，药盒是便携式的并且可以携带在人身上，就像携带哮喘吸入器一样。
药盒的组分可以以水性、粉末状或冻干形式包装。药盒的容器装置通常将包括至少一个吸入器、罐、小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，其中可放置组分，并且优选适当地等分。当药盒中存在多于一种组分(第二药剂等)的情况下，药盒通常还将包含第二、第三或其他另外的容器，其中可单独放置另外的组分。然而，组分的多种组合可包含在小瓶、罐或吸入器中。容器可包括罐或吸入器，其可佩戴在带上或容易地携带在口袋、背包或其他储存容器中。药盒还可以包含用于所述组合物或其变体的容器，以及用于商业销售的严格限制的任何其他试剂容器。这种容器可包括注射或吹塑塑料容器，其中容纳期望的小瓶。
当药盒的组分在一种和/或更多种液体溶液中提供时，例如，液体溶液是水溶液，特别优选的是无菌水溶液，但不是必需的。然而，药盒的组分可以作为干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，粉末可以通过添加合适的溶剂进行重构或以粉末形式施用。预想溶剂还可以在另一容器装置中提供。
药盒还将包含用于使用药盒组分的说明书以及药盒中未包含的任何其他试剂的用途。说明书可包含可实施的变化。
考虑这样的试剂是药盒的一些实施方案。然而，这样的药盒不限于以上确定的特定项目，并且可包含直接或间接用于检测致病性微生物或施用StIR组合物的任何试剂。
实施例
以下实施例以及附图包括在内以说明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，实施例或附图中公开的技术代表本发明人发现的能很好实施本发明的技术，并因此可以认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案中进行多种改变并仍然获得相同或相似的结果。
实施例1激活肺固有免疫以调节哮喘免疫应答
在本研究中，本发明人使用实验性哮喘小鼠模型研究了在哮喘免疫应答的调节中可诱导固有抗性的可能作用。血清免疫球蛋白和支气管肺泡灌洗(BAL)液的差异细胞计数的分析揭示，O/P与OVA的气雾剂施用显著降低了OVA特异性IgE水平以及BAL中的嗜酸性粒细胞。相反，本发明人观察到血清IgG2a(Th1免疫的标志物)水平的提高。总之，我们的发现表明，用与特异性抗原组合的O/P激活肺固有免疫可以将变应性免疫应答转换为非变应性免疫应答。
A.结果
雾化的OVA-O/P降低总IgE血清水平和OVA-IgE血清水平。用雾化的O/P的初步研究已证明气道上皮的强有力的防御应答，其可防止由多种病毒引起的呼吸道感染(Evans等，Annu Rev Physiol(2010)，72：413-35；Clement等，Am J Respir Crit Care Med(2008)，177：1322-30；Evans等，Am J Respir Cell Mol Biol(2010)，42：40-50；Tuvim等，PLoS ONE(2009)4：e4176)。为了评估O/P对变应性哮喘的可能的有益或有害作用，本发明人使用了常规小鼠(BALB/c)卵白蛋白致敏和攻击模型(图1A)。本发明人通过测量血清IgE评估了特应性(变应性表型)。用雾化的OVA+/-O/P进行免疫接种和攻击的小鼠中总IgE水平的检查揭示了在气雾剂攻击的小鼠(图1B，组4至8)与仅进行免疫接种的小鼠(图1B，组2至3)之间的显著提高。然而，尽管本发明人未观察到用单独的OVA与OVA-O/P(6X)(组4相对于组6)进行免疫接种和攻击的小鼠之间的显著变化，但在用OVA-O/P气雾剂攻击9X的小鼠中观察到总IgE的显著降低(图1B，组3相对于组6)。
血清中OVA特异性IgE的测量也显示出用OVA气雾剂攻击的组(图1C，组4至8)与仅进行免疫接种的那些(图1C，组2至3)之间的这种变应性同种型稳健提高。然而，与单独的OVA(图1C，组6，星号，4.36±0.82)相比，这次在用OVA-O/P(6X)(图1C，组4，1.26±0.26)气雾剂攻击的小鼠中观察到OVA特异性IgE显著降低，其具有统计学显著性(P＝0.005)。此外，当用雾化的OVA-O/P对小鼠进行9X攻击时，与单独的OVA相比，OVA-IgE的降低甚至更大(图1C，组6：4.36±0.82相对于组3：0.35±0.7，P＝0.0008)。
该结果表明，与O/P组合的抗原(OVA)的气雾剂递送导致总IgE和抗原特异性IgE(变应性免疫球蛋白)二者的降低。值得注意的是，通过气雾剂与卵白蛋白一起给予的O/P的辅助效果弱，其需要进一步研究(图1B和1C，组5)。
雾化的OVA-O/P提高血清IgG2a和IgG1水平。接下来，本发明人通过测量总IgG、IgGl和IgG2a血清水平，评估了IgG免疫球蛋白亚类以确定OVA-O/P气雾剂攻击模型是否调节免疫应答(图2)。用OVA进行免疫接种和气雾剂攻击的所有小鼠显示总IgG的血清水平提高(图2，顶侧，组3至4、6至8)，而通过气雾剂给予单独的O/P(PUL-042)的小鼠没有(图2，顶侧，组5)。提高的总IgG水平反映了成功的免疫接种方案。此外，用单独的OVA(顶侧，组6)处理的小鼠与用OVA-O/P(顶侧)处理的小鼠的比较未显示出两个组之间总IgG的显著性差异(图2，顶侧，组4相对于组6)。
相比之下，IgG1的测量确实显示，与单独的OVA(组6，6.01±0.66)相比，OVA-O/P处理的小鼠(组4，n＝10，9.16±1.18)中IgGl水平略微提高(P＝0.035)。此外，IgG2a的测量显示，与单独的OVA(组6，25±3)相比，OVA-O/P处理的小鼠(组3，8.4±21)中IgG2a水平略微提高(P＝0.02)。
在人中，血清IgG4水平(小鼠中的IgG1)的测量已被用作成功免疫治疗的生物标志物(James等，J Allergy Clin Immunol(2011)，127：509-16；Karsten等，Nat Med(2012)，18：1401-06)，并且小鼠中的血清IgG2a水平通常用作Th1免疫的生物标志物。连同总IgE和OVA-IgE结果(图1)，数据表明这些小鼠将其变应性应答(IgE)转换为非变应性应答(IgG2a和IgG1)。
OVA变应性致敏模型的最优化。常规的变应性致敏模型通常用于研究变应性炎症。然而，尚不清楚这种致敏/攻击方案对于用雾化的O/P的免疫调节研究是否是最佳的。为了定义最佳时间和定量变应性致敏模型，设计研究以确定产生稳健变应性应答所需的OVA气雾剂攻击的最小数量(图3A)。用OVA/明矾间隔一周给予小鼠一次(组2，4至6)或两次(组3，7至9)IP注射，随后在第7天开始多种OVA气雾剂攻击，如图3A(顶侧)中所示。
来自BAL的总细胞计数的分析揭示，与其他组相比，组8和9中的小鼠具有最高的总白细胞计数(图3B)。另外，与其他组相比，该同一组具有最高的总嗜酸性粒细胞(EOS)计数(图3B)。通过ELISA检查总IgE、OVA IgE、OVA IgG1和IgG2a血清水平类似地揭示组8中的总IgE水平(图4，上侧，11.05±2.39)相应地高于组5中的(图4，上侧，5.36±1.70，P＝0.09)，尽管没有统计学显著性。最后，观察到来自组8小鼠中血清水平，IgG2a显示出降低的趋势，其与稳健的变应性应答(IgE)和抑制的Th1免疫应答准确地相关(图4，底侧)。在该致敏模型中OVA-IgG1血清水平没有明显差异(图4，第三侧)。
总之，本发明人定义了用于用O/P干预的最佳变应性致敏模型需要2次OVA IP注射，间隔一周，随后每周2次OVA气雾剂攻击，持续3周。
用雾化的OVA-O/P确定最有效的干预。在建立最佳变应性致敏/气雾剂攻击模型之后，本发明人寻求定义关于OVA-O/P的气雾剂施用的以下参数：(1)最小数量的气雾剂施用；和(2)气雾剂处理的时间选择。为此，设计了综合性实验，其中以多种间隔用OVA对小鼠进行两次免疫接种并用单独的OVA(组2)或用OVA-O/P进行气雾剂攻击，如图5A中所示。
为了评价雾化的OVA-O/P对气道炎症的作用，在气雾剂攻击的小鼠的BAL中进行总细胞计数和特异性细胞计数(图5B)。然而用OVA攻击的所有五组小鼠具有提高的总细胞计数(图5B)，仅组3中的小鼠显示气道EOS的显著降低，表明成功阻断了嗜酸性粒细胞浸润。另外，肺组织切片的黏蛋白密度分析相应地显示，与所有其他组相比，组3中的小鼠具有最低的黏蛋白密度评分(图5C)。
OVA处理的小鼠中的总IgE(图6，顶侧，组2，24.66±8.23)与OVA-O/P(组3 11.15±2.61)的比较相应地揭示了IgE水平的降低。OVA处理的小鼠中的OVA-IgE(图6，第二侧，组2，3.77±1.00)与OVA-O/P(组3，2.14±0.34)的分析显示相同的趋势。最后，在这两组(组2和组3)中观察到血清IgG2a水平的互惠趋势，表明用雾化的OVA-O/P处理的小鼠中Th1免疫应答提高。
总之，这些数据表明，给予超过两周半的O/P+OVA的气雾剂处理调节对较少变应性表型的变应性Th2应答并降低气道炎症。
B.材料和方法
小鼠。雌性BALB/c小鼠(6至10周龄)购自Charles River，Wilmington，MA，并且在12/12小时光/暗循环中每笼饲养5只小鼠，随意获得食物和水。所有实验操作均得到TexasA&M HSC生物科学与技术研究所的动物伦理委员会(Institutional Animal EthicsCommittee，IAUCUC)的批准。
用OVA-O/P致敏和气道攻击。合成的TLR配体(称为O/P)购自InvivoGen(SanDiego，CA)，在不含内毒素的水中重构，并以下列浓度混悬于8ml无菌PBS中：Pam2 10μg/ml；ODN2395 20μg/ml。使小鼠对卵白蛋白(OVA)(20g OVA，V级，盐水中的2.25mg明矾，pH7.4；Sigma，St.Louis，MO)致敏，每周一次通过腹膜内(IP)注射施用，持续一周或两周。在存在补充有5％CO2的室内空气以促进整个肺部的最大通气和均匀的气雾剂暴露的情况下，通过Aerotech II雾化器(CIS_US，Inc.)将致敏小鼠暴露于与O/P组合或不与O/P组合的、0.9％盐水中的2.5％(wt/vol)卵白蛋白的气雾剂中30分钟。
用于免疫球蛋白测量的酶联免疫吸附测定。使用96孔Easywash高结合平底板(Corning)通过标准夹层ELISA技术确定血清免疫球蛋白浓度。除包被试剂(其仅在TBS中稀释)之外，所有试剂都在测定稀释剂(TBS+0.1％BSA[Calbiochem])中进行稀释。所有孔用洗涤缓冲液(TBS+0.1％吐温-20)洗涤3X，每次洗涤5分钟，并通过在黑暗中添加TMB底物试剂(BD Biosciences)30分钟使所有样品显色。通过添加2N H2SO4使反应终止，并在450nm处读取吸光度。数据中使用的所有读数均落在标准曲线的线性部分内。
对于OVA IgE ELISA，在4℃下将孔用2μg/mL山羊抗小鼠IgE(AbD Serotec，STAR166)包被过夜。洗涤之后，将小鼠抗OVA IgE标准品(AbD Serotec，克隆2C6)或经稀释的小鼠血清样品(通常1∶50)在37℃下孵育1小时。洗涤之后，将10μg/mL生物素缀合的OVA(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，Thermo Scientific)在37℃下孵育1小时。如文所示洗涤孔，并将1∶5,000中性抗生物素蛋白(Neutravidin)-HRP(Thermo Scientific)在37℃下孵育30分钟，随后用TBS再洗涤两次，然后使样品显色。
使用以下量的试剂遵循相同的方案用于确定总IgE：2μg/mL山羊抗小鼠IgE(AbDSerotec，STAR166)，2μg/mL生物素大鼠抗小鼠IgE(BD Biosciences，克隆R35-118)。对于OVA IgG1，使用以下量的试剂：100μg/mL OVA(Sigma)和0.1μg/mL生物素大鼠抗小鼠IgG1(eBioscience，克隆M1-14D12)。对于总IgG1：2μg/mL大鼠抗小鼠IgG1(BioLegend，克隆RMG1-1)，0.05μg/mL生物素大鼠抗小鼠IgG1(eBioscience，克隆M1-14D12)。对于IgG2a：2μg/mL大鼠抗小鼠IgG2a(BioLegend，克隆RMG2a-62)和0.05μg/mL生物素山羊抗小鼠IgG2a(AbD Serotec，108008)。对于总IgG：2μg/mL山羊抗小鼠IgG(AbD Serotec，103001)和0.025μg/mL生物素绵羊抗小鼠IgG(AbD Serotec，AAC10B)。
支气管肺泡灌洗(BAL)液制备和细胞分析。通过气管插管(luer接管适配器，BDBiosciences)灌注和取出PBS的两个1ml等分试样来获得BAL。用血细胞计数器(HouserScientific，Horsham，PA)确定总白细胞计数，并通过在500×g下对300μl BAL液进行离心涂片5分钟，随后通过Wright-Giemsa染色来制备用于差异细胞计数的载片。
统计分析。使用Student t检验比较两组的数据。用于显著性的P值设定为小于0.05。除非另有说明，否则所有结果表示为平均值±SEM，并且所有组均具有10只小鼠/实验条件(n＝10)。
序列表
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Evans, Scott E.
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Huston, David P.
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 2
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 3
tcgtcgtttt cgcgcgcgcc g 21
<210> 4
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 4
cgcgaagcg 9
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 5
agggttaggg ttagggttag gg 22

Claims (25)

1.用于在对象中减弱I型超敏反应的方法，其包括向易感于变应原诱导的哮喘的对象施用有效量的包含至少两种TLR激动剂的组合物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述对象已暴露于变应原。
3.权利要求2所述的方法，其中所述变应原与所述TLR激动剂组合施用。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述TLR激动剂选自TLR2/1、TLR2/6、TLR3、TLR4、TLR5、TLR9和TLR7激动剂。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述组合物包含TLR9激动剂和TLR2/6激动剂。
6.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述TLR激动剂中至少一种是TLR2/6激动剂。
7.权利要求5或6所述的方法，其中所述TLR2/6激动剂是二酰化脂多肽。
8.权利要求5或6所述的方法，其中所述TLR2/6激动剂是PAM2CSK4。
9.权利要求1至4或6至9中任一项所述的方法，其中所述TLR激动剂中至少一种是TLR9激动剂。
10.权利要求9所述的方法，其中所述TLR9激动剂是TLR9寡核苷酸激动剂。
11.权利要求10所述的方法，其中所述TLR9寡核苷酸激动剂是C型寡脱氧核苷酸(ODN)，例如ODN2395(5’-tcgtcgttttcggcgcgcgccg-3’(22mer)SEQ ID NO：)或ODNM362(5’-tcgtcgtcgttcgaacgacgttgat-3’(25mer)SEQ ID NO：)或ODNl0101(5’-tcgtcgttttcgcgcgcgccg-3’SEQ ID NO：)或9mer(5’-cgcgaagcg-3’SEQ ID NO：)或H-Tel22(5’-agggttagggttagggttaggg-3’SEQ ID NO：)或其类似物。
12.权利要求10所述的方法，其中所述TLR9寡核苷酸具有硫代磷酸酯或磷酸二酯骨架。
13.权利要求9所述的方法，其中所述TLR9激动剂是C型寡脱氧核苷酸(ODN)。
14.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述至少两种TLR激动剂是PAM2CSK4和C型寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)。
15.权利要求15所述的方法，其中所述CpG-ODN是ODNM362。
16.权利要求15所述的方法，其中PAM2CSK与CpG-ODN的摩尔比为4∶1。
17.权利要求1所述的方法，其还包括施用变应原。
18.权利要求18的方法，其中所述变应原与所述至少两种TLR激动剂同时施用。
19.可药用组合物，其包含TLR9寡核苷酸激动剂和TLR2/6激动剂、抗炎剂，或者一种或更多种药用赋形剂，其中所述组合物是无菌的并且基本上不含致病性微生物。
20.权利要求20所述的组合物，其中所述TLR2/6激动剂是PAM2CSK4。
21.权利要求20所述的组合物，其中所述TLR9寡核苷酸激动剂是ODN2395或ODNM362或ODN10101或9mer或H-Tel 22。
22.权利要求20所述的组合物，其中所述TLR9寡核苷酸激动剂具有硫代磷酸酯或磷酸二酯骨架。
23.权利要求20所述的组合物，其中所述组合物包含2、3或4种TLR9寡核苷酸激动剂。
24.权利要求20所述的组合物，其中所述抗炎剂是布地奈德。
25.权利要求20所述的组合物，其中所述药用赋形剂是甘油。
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