CN103608036B - 包含菊粉颗粒的免疫佐剂组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含或由菊粉颗粒组成的用于减少或抑制炎症用途的组合物，和/或在受试者中治疗或预防炎性疾病的用途。本发明还提供了一种药学上可接受的组合物，包括：菊粉颗粒，和一种包含或由一种或多种病原体相关分子模式（PAMP）组成的物质，或包含同样成分的等效试剂盒和方法，以及所述组合物和试剂盒的用途，用于诱导或调节受试者的免疫应答，例如调节针对抗原或致敏原，和/或疫苗的免疫应答。本发明还提供了包含菊粉颗粒，抗原和任选的抗原结合载体材料的单剂量疫苗组合物，以及该疫苗的使用方法和用途。

Description

包含菊粉颗粒的免疫佐剂组合物

技术领域

本发明涉及一种适用于刺激、调制或增强免疫应答的新颖组合物。

引用并入

本说明书引用了以下的国际专利申请：

PCT/AU86/00311（WO87/02679），标题为“免疫治疗的方法”；

PCT/AU89/00349（WO90/01949），标题为“γ-菊粉组合物”，和PCT/AU2005/001328（WO2006/024100）标题为“菊粉的新型多晶型物及其用途”；

PCT/AU2010/001221（WO2011/032229）标题为“一种新型菊粉多晶型物及其组合物”。

所有这些申请的全部内容在此通过引用并入。

背景技术

如本领域已知的，可以激活天然免疫应答的微生物衍生的化合物，可以同时提高针对一个共同施用的疫苗抗原的适应性免疫应答。目前已知这类化合物含有或模拟病原体相关分子模式（PAMP），其中PAMP是由病原体衍生的结构上保守的模体，不同于宿主自身分子，可以被天然免疫受体识别（Heine等，2005）。PAMP可出现于以下物质中，如蛋白质、脂质、脂蛋白、碳水化合物、糖脂、糖蛋白，三酰基脂肽、孔蛋白、多糖、单链和双链RNA、鞭毛蛋白、脂磷壁酸、N-甲酰甲硫氨酸和细菌或病毒DNA，以及其他。PAMP通过结合PAMP特异的天然免疫受体，如Toll-样受体（TLR），NOD样受体，RIG连接酶样受体和C-型凝集素而作为天然免疫激活剂。这导致免疫细胞中炎症反应基因通路的激活。

PAMP化合物的共同点是，它们都激活天然免疫系统以及炎症基因通路，后者主要是通过激活核因子-κB（NFkB）这一主效转录因子而实现。这种炎症反应可以作为副产物或天然免疫激活的下游效应而可能提高针对一个共同施用的抗原的适应性免疫应答。通过一个单独物质提高对一个共同施用抗原的适应性免疫应答被认为是一种“佐剂”效果。

不希望受理论限制，本领域技术人员认为具有佐剂活性的所有化合物的共同因素是，它们诱导免疫“危险信号”（Matzinger，2002），从而导致激活天然免疫并激活NFKB等炎症通路。具有佐剂效应的危险信号可以通过局部组织损伤实现，比如局部注射炎性物质如油乳剂，或更直接地通过PAMP结合天然免疫受体，这一效应是通过宿主检测病原体的侵袭和组织损伤引起的。感受危险信号的PAMP特异受体会激活包括NFKB在内的信号通路并最终导致炎症效应细胞，例如单核细胞，分泌肿瘤坏死因子（TNF）-α，白细胞介素（IL）的单核细胞–1、IL-6、IL-8和IL-12及其他细胞因子。目前本领域的研究认为由PAMP激活而释放的炎症介质是PAMP增强适应性免疫应答的关键因素。基于这一基础，已经有高通量的细胞实验可以用来通过检测炎症性细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-8或IL12来筛选潜在的免疫佐剂（Buckner等人，2008）的读出。

从概念上讲，两个或多个这样的天然免疫激活剂组合在一起时可诱导更强的危险信号，产生较高水平的炎症基因的激活，从而显示更高的佐剂效应（Querec等，2006；Kasturi等，2011）。然而，本领域技术人员已经知道，单独或组合使用PAMP作为免疫调节剂或疫苗佐剂而引起的炎症反应是高毒性的。因此，通过这一方式实现增强适应性免疫的用途因严重的剂量限制性的局部和全身炎症相关毒性而受阻。例如，相比于单独使用氢氧化铝（“明矾”）佐剂的乙肝表面抗原（HBsAg）疫苗，一个以部分减毒的PAMP类似物单磷酰脂质A（MPL）以及氢氧化铝为共同佐剂的HBsAg组合疫苗会引发更为显著的局部炎症反应及发热等全身性副作用（Tong等，2005）。

虽然两个或以上的天然免疫激活剂结合使用可能增加疫苗的免疫原性，但同时会增加反应原性和毒性，而这是监管机构审批此类佐剂的主要障碍（Petrovsky等，2008）。此外，从免疫原性的角度来看并非所有天然免疫激活剂的组合都是有促进作用的。某些组合并没有比单一的天然免疫激活剂具有更好的适应性免疫应答，而其他一些天然免疫激活剂的组合，甚至差于单独使用某一个激活剂下的抗原特异性应答。例如，在人类受试者中，接受氢氧化铝单一佐剂辅助的C-末端重组疟疾环子抗原免疫者显示了优于氢氧化铝与MPL联合使用的特异性抗体反应（Gordon等，1995）。

疫苗研究领域知道某些被称为佐剂的物质在与抗原一起使用时能够增强免疫应答。如本文所用，术语“佐剂”将被理解为指任何物质或材料，当共同施用时，或与抗原结合而增加针对该抗原的免疫应答。现代疫苗在使用纯的重组蛋白或合成抗原时遇到的问题是与不纯的传统活疫苗或灭活疫苗比其免疫原性更弱，而这一特点决定了对有效的免疫佐剂的需求。佐剂还用于加快免疫应答的速度或增加强度。此外，佐剂可节约抗原用量，而同时提高具有免疫保护作用的特定免疫球蛋白亚类的滴度或增强特定的细胞免疫应答（例如，CD4+或CD8+T细胞记忆免疫应答）（Petrovsky等，2004）。

已知的佐剂包括铝盐（统称为“明矾”佐剂）。除了少数例外，明矾佐剂依然是许多国家批准的人类使用的唯一佐剂。虽然明矾佐剂通常是有效的，可以诱导针对共同施用抗原的良好的体液免疫应答（Th2细胞），但它们在很大程度上对刺激细胞（Th1细胞）免疫应答没有效果，而后者对防御很多病原体至关重要。此外，明矾有可能引起罕见的严重的局部和全身不良反应，包括无菌脓肿，嗜酸性粒和细胞巨噬细胞性肌筋膜炎（Israeli等，2010）。也有关于铝盐在神经变性疾病如阿尔茨海默氏病（Bondy，2011）中的可能作用引起学界关注。其他已批准佐剂包括MF59，可在欧洲作为流感疫苗的一部分使用；角鲨烯油乳剂佐剂（Durando等人，2010）和AS04（氢氧化铝和单磷酸脂质A（MPL）的组合），可以在欧洲乙肝疫苗中使用。

然而，阻碍人类佐剂发展得最大问题是其引起的局部和全身毒性与不良反应。这对开发儿童使用的疫苗尤为重要。疫苗介导的不良反应包括注射局部的炎症和肉芽肿、致热原性、恶心、佐剂性关节炎、葡萄膜炎、嗜酸粒细胞增多、变态反应、过敏性休克、器官特异性毒性或免疫毒性（即释放有毒性的炎性细胞因子）（Petrovsky等）。这种严重的毒性阻碍了原本高度有效的佐剂如弗氏完全佐剂（CFA）的使用，这种毒性主要反映在天然免疫激活剂过度活化炎症相关通路。能够提高适应性免疫应答而同时耐受性好，安全，无毒的化合物或组方依然难以找到。而已知的上百种天然免疫激活剂中没有几个被批准用于人体，目前只有两种化合物，明矾和MPL，被美国食品与药品监督管理局批准在美国市场上的人类疫苗中使用。

理想情况下，佐剂制剂应适应于广泛的疫苗抗原并对低反应者人群安全，包括儿童，老人及免疫受损者。因此，在疫苗研究领域的挑战之一仍然是如何提高疫苗效价而不增加诱导局部或全身毒性。明矾佐剂在被发现90年以后，依然统治人类疫苗佐剂的使用，为实现这一目标的难度做了最好的诠释。

因为在大多数情况下的佐剂作用的机制尚不清楚，本领域尚不能对特定化合物或组合是否具有佐剂活性进行经验预测。同样，现有技术也无法经验预测特定佐剂或佐剂的组合物是否是安全和耐受性良好的。

此外，每个佐剂-抗原组合物可以产生不同类型的免疫应答，这可能会或可能不会提供增强防御相关的病原体的保护作用。例如，已知有多种不同类型的适应性免疫应答存在，例如T辅助（Th）1、Th2和Th17细胞的反应。对于一个特定的病原体，相比于其他细胞类型，Th1适应性免疫应答可能是更有利的。例如，对于一个利什曼原虫疫苗的Th1应答是保护性的，而Th2应答可能导致不利的结果。对其他病原体可能恰好相反，Th2细胞疫苗的反应是有利的，而Th1应答是有害的，甚至有可能在其他情况下Th17免疫应答是更好的。

这意味着，为了找到成功的佐剂-抗原疫苗的组合，本领域一直依靠广泛的尝试性试验。然而即使在动物模型中广泛验证有效的组合方式，在人类中可能是无效的，甚至有害的。前者的例子是在人类流感疫苗中明矾佐剂无效，尽管其在动物模型中可以增强保护作用。另一个例子是呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗，与明矾佐剂共同施用可以在动物模型中增强免疫原性和保护作用，但在给予儿童的临床试验中却使得疾病恶化和RSV感染死亡人数增加，而这一效应可能是错误的免疫应答途径介导的，即该疫苗诱导了Th2细胞而非Th1应答（Prince等，1986）。

（2-1）聚呋喃果糖基α－D-葡萄糖（俗称菊粉）是一种多糖（公开于WO87/02679、WO2006/024100和WO2011/032229，它们各自的内容通过引用并入本文），当结晶成稳定的颗粒结构时具备某些有用的性质。菊粉具有相对疏水性，类似聚氧乙烯的骨干，这个特殊的结构，加上其非电离特性允许其被再结晶和高度纯化。菊粉在其原始状态，一般是溶解于温水中，但是，在已公开的专利申请WO87/02679、WO2006/024100和WO2011/032229中，可以通过特定处理使其结晶成更稳定的多晶型，包括前面所述的γ（gIN）、δ（dIN）和ε（eIN）的形式。

这种菊粉颗粒（在下文中统称为“菊粉颗粒'）在正常哺乳动物体温的温度下基本上不溶，并具有优良的佐剂特性。不希望受理论的束缚，这些菊粉形式的稳定构象对保持其完整性以及结合并与免疫细胞相互作用非常重要。因此，当菊粉颗粒的悬浊液被加热到很高的温度而解离和溶解后，所得到的菊粉溶液失去所有的免疫学和疫苗的佐剂活性。不同菊粉颗粒形式均具备佐剂活性，增强免疫细胞的抗原呈递，而可溶性菊粉则无此特性。

不希望受理论的束缚，我们已观察到，菊粉多晶型物的免疫效果随着溶解所需温度的增加而增加，这样，dIN的颗粒比gIN具有更高的温度稳定性和佐剂效应，而相应地eIN比dIN具有更高的温度稳定性和佐剂效应。因此，gIN、dIN和eIN形式活性递增。在已公开的WO87/02679、WO2006/024100和WO2011/032229申请中，稳定的菊粉颗粒制剂包括合适粒径的gIN、dIN和eIN颗粒，它们可以增强针对共同施用的疫苗抗原的体液和/或细胞免疫应答。

如在本申请中进一步描述的，研究的菊粉颗粒的生物效应时，我们发现菊粉颗粒还令人吃惊地具有抗炎作用。更具体地，我们已经发现，与人外周血单个核细胞（PBMC）或小鼠脾细胞共同培养时，菊粉颗粒将上调而非下调的抗炎基因的表达。反过来，它们会下调的许多促炎性基因的表达，尤其是菊粉微粒不会激活NFkB通路。

这是一个非常令人吃惊的发现，因为它似乎违背了被广泛接受的“危险模式”。根据该模式，所有的佐剂被认为是通过激活促炎症性天然免疫途径进而激活NFκB而诱发炎症因子的产生，如肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-1。危险模式理论主要基于已知PAMP的佐剂作用，例如TLR激动剂能够激活天然免疫系统也直接或间接地增加针对共同施用抗原的适应性免疫应答。PAMP源的免疫佐剂共同点是它们通过激活的NFκB这一主要转录因子而诱导促炎性细胞因子，包括肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1和IL-6的产生（Werling等，2003）。同样，明矾佐剂和油乳剂佐剂会激活炎症小体，进而导致产生包括IL-1在内的炎性细胞因子（Eisenbarth等人，2008）。相比之下，菊粉颗粒在与人PBMC培养中，没有激活NFκB而是下调促炎症基因的表达，包括白细胞介素（IL）-1、IL1RAP、IL18RAP、环氧合酶（COX）-2、NALP3、NLRP3、NLRP12、CARD12、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IDO、CXCL5、CXCL6、CXCR7、CD14、TLR4、NOD2、甲酰基受体1、2和3，并上调与天然免疫应答的下调与抑制促炎细胞因子IL1的相关基因途径，包括IL-1受体拮抗剂（IL-1RA）、IL1RN和IL1R2以及IL18BP、CD33、ATF3、TREM1、PPAR–γ、FCRL2和CD36。此数据表明，菊粉颗粒具有抗炎活性，如下面讨论的，成为此发明的第一方面。因此，我们试图检验菊粉颗粒抑制炎症的能力，以期用于治疗或预防炎性疾病。

为了测试菊粉颗粒是否可以减少促炎性免疫激活剂和佐剂制剂的副作用，我们进行了体外和体内测试，在与一系列的PAMP和天然免疫激活剂，包括范围广泛的TLR激动剂联合使用时，我们预期菊粉颗粒在抑制炎症同时会抑制PAMP和其他天然免疫激活剂的佐剂活性。结果出乎意料，并成为本发明的第二方面。与预测一致的是，在共同给药时，菊粉颗粒会抑制由经典PAMP天然免疫激活剂如含有CpG基序的寡核苷酸（ODN）介导的炎性基因的激活。然而意想不到的是，尽管成功地抑制了PAMP的炎性信号，菊粉颗粒实际上增强的适应性免疫应答中PAMP的佐剂活性，增加了针对共同施用的抗原的保护性记忆免疫应答的能力。这一发现令人吃惊，因为依据危险模式理论，菊粉颗粒下调促炎“危险信号”也会降低PAMP的佐剂活性。

其后，我们使用其他PAMP佐剂进一步重复了这个实验，并持续观察到菊粉颗粒的相同的有益效果，即减少炎症同时增强佐剂活性。考虑到前面提到的本领域尚无法预测佐剂组方的免疫效果，我们观察到菊粉颗粒与其他PAMP联用而产生一致的效应就更加出乎意料了。不希望受到理论的限制，菊粉颗粒下调PAMP的炎症反应而同时增加佐剂效应表面看是矛盾的，但观察到的现象说明PAMP激活的炎性因子如IL-1在量上已经超过了活化免疫系统所需要的剂量而具有了抑制作用。因此，菊粉颗粒和天然免疫激活剂，如PAMP连同疫苗抗原的共施用，产生了协同作用从而使针对一个共同施用的疫苗抗原的免疫记忆反应得到增强。菊粉颗粒与PAMP的联合使用还可以起到节约PAMP剂量的作用。再次强调一下，菊粉颗粒的这种效果危险模型理论来预测。这一发现提供了使用菊粉颗粒降低天然免疫激活剂剂量但实现同样的适应性免疫增强效应的机会。菊粉颗粒的共同给药有可能进一步通过阻断或减弱炎症基因表达而降低天然免疫激活剂和PAMP不利的炎症相关的副作用。

因此，本申请人发现菊粉颗粒与一个PAMP天然免疫激活剂的组合使用会产生有利的协同免疫应答。

发明内容

本发明涉及一种用于诱导有利的抗炎和/或免疫应答的制品和方法。本发明基于全新的发现，即菊粉颗粒可用于提供，迄今未知的，抗炎作用。

本发明的另一个实施方案是基于如下的意外发现，即菊粉颗粒与天然免疫激活剂联合使用导致天然和适应性免疫反应之间的平衡的一个有利的和协同调解机制，使得针对一个共同施用的抗原免疫记忆反应得到增强，同时，如果有炎症存在的话，减少炎症相关的副作用。

因此，在第一方面，本发明提供包含菊粉粒子的，在受试者中减少或抑制炎症的用途的组合物，和/或用于治疗或预防炎性疾病都方法。

换言之，本发明的第一方面提供了一种用于在受试者中降低或抑制炎症和/或用于治疗或预防（包括对预防）炎性疾病的方法，这一方法包括给予受试者治疗剂量的包含菊粉颗粒的组合物。

再换言之，本发明的第一方面提供了包含菊粉颗粒的组合物的药物制备方法，用于在受试者中减少或抑制炎症反应，和/或用于治疗或预防炎症性疾病。

在本发明中的第一方面的实施例中，炎症的减轻或抑制和/或治疗或预防炎症性疾病，表现在上调的一种或多种抗炎基因的表达和/或蛋白质和/或用于下调受试者一种或多种促炎性基因和/或蛋白质的表达，或者任选，而这些变化特定地发生在被检者的骨髓或淋巴样细胞，包括单核细胞，树突状细胞，粒细胞，NK细胞和/或淋巴细胞。典型的促炎基因都下调可能包括白细胞介素（IL）-1、IL1RAP、IL18RAP、IL6、环氧合酶（COX）-2、FPR2、MYD88、NALP3、NLRP3、NLRP12、CARD12、IFIT1、IFIT2、IFIT3、IDO、CXCL5、CXCL6、CXCR7、CD14、TLR4、NOD2、甲酰基受体1、2或3和CXCL趋化因子家族和/或TLR家族成员。典型的抗炎基因的表达上调在此申请中可包括IL-1受体拮抗剂（IL-1RA）、IL1RN和IL1R2，IL18BP、CD5L、CD33、ATF3、TREM1、PPAR–γ、FCRL2和CD36。

因此，菊粉颗粒可以根据本发明的第一方面都目的在受试者中减少或抑制炎症。受试者的炎症可以有多种因素引起，例如，通过暴露于一种或多种促炎性物质，包括病原性感染（包括细菌，病毒，真菌或原生动物感染，示例性感染，包括大流行或季节性流感，吸入性炭疽，革兰氏阴性败血症，全身病毒血症，脑炎，Q热，tuluraemia，小痘，慢性乙型或丙型肝炎病毒感染，传染性非典型肺炎，百日咳，疟疾，艾滋病，结核病，脊髓灰质炎，狂犬病，呼吸道合胞病毒（RSV），志贺氏菌，单核细胞，巨细胞病毒和有毒休克综合症，过敏原物质，示例性变应原作为昆虫毒液，猫或狗皮屑，黑麦草，尘螨抗原和花粉，或其他促炎物质或组合物，包括，例如，疫苗组分或脱敏变应原组分，或抗癌治疗组分。菊粉颗粒可以在受试者暴露于上述一个或多个促炎物质前、暴露同时或暴露后给药。

在根据本发明的第一方面目的的实施方案是使用菊粉颗粒的减少或抑制受试者因暴露于（例如给药）促炎物质或组合物而引起的炎症，其中包含的物质包含或由一个天然免疫激活剂，特别是病原体相关分子模式（PAMP），及其功能性变体、衍生物或类似物。促炎组合物可以是药学上可接受的组合物，其包含有计划地施用于受试者，或在另一实施例中，受试者有意或无意地暴露于促炎细胞组分（例如生物或致病物质或生物体）。在此背景下，菊粉颗粒给受试者之前或同时（包括作为与单一混合物）的施用，施用或暴露于促炎组合物可能是最有利的。因此，在本实施方式中，所述含有菊粉颗粒的组合物是用来减少或抑制促炎物质或组合物引起的炎症反应。

例如，当促炎症的组合物是包含PAMP时，菊粉颗粒可被用于减少、抑制或防止一个或以上的佐剂组合物PAMP引起的受试者的不良反应，包括头痛，乏力，肌痛，腹泻，发烧，炎症，注射局部肉芽肿，发热，恶心，佐剂性关节炎，眼色素层炎，嗜酸粒细胞增多，过敏，过敏性休克，器官特异性毒性或免疫毒性（释放大量有毒炎性细胞因子）。

菊粉颗粒也可以按照本发明第一方面都方法在受试者中用于治疗或预防炎性疾病。本文由其感兴趣地治疗或预防的炎症性疾病的类型特征是与NFkB的活化、和/或升高的IL-1基因或蛋白质水平或信号相关联，或与IL-1调节异常关联。示例性的炎症性疾病包括偏头痛，慢性疲劳综合征，类风湿关节炎，哮喘，慢性阻塞性气道疾病，炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病，慢性疲劳综合症，cryopyrin相关周期性综合症，包括新生儿发病多系统炎性疾病和穆克勒韦尔斯综合征，炎性相关疾病，银屑病，动脉粥样硬化，1型或2型糖尿病，遗传性发热综合征，肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征，施尼茨勒综合征，系统性红斑狼疮，自身免疫性肝炎，Behget病和特发性复发性心包炎。

因此，由本发明的第一方面的方法用于治疗的受试者可以包括那些曾经或者将要（在这个意义上，他们将会，或者正处在增加的风险中，优选地在随后的一个月内，一周，6天，5天，4天，3天，2天或1天，或小于24，12，6，5，4，3，2或1小时），或正在暴露于一种或多种促炎物质包括致病性感染（包括细菌，病毒，真菌或原生动物感染），过敏原物质，或其他促炎性的组合物，其中包括，例如，促炎佐剂，疫苗组合物或变应原的脱敏的组合物，和/或那些患有或确定即将罹患炎性疾病的患者，包括炎性疾病，其特征是与升高的IL-1水平或信号通路，或IL-1的失调相关联，并可以选自偏头痛，慢性疲劳综合征，类风湿关节炎，炎性肠病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病，慢性疲劳综合症，cryopyrin相关周期性综合症，包括新生儿发病多系统炎性疾病和穆克勒韦尔斯综合征组成的组中，炎性相关疾病，银屑病，动脉粥样硬化，2型糖尿病，遗传性发热综合征，肿瘤坏死因子受体相关周期性综合征，施尼茨勒综合征，Behget病和特发性复发性心包炎。

本发明的第二方面提供了一种免疫学和/或药学上可接受的组合物，其包括：

（a）一种抗炎成分，如菊粉颗粒和/或IL-1和/或一种或多种其他抗炎的NFκB活化抑制剂的一种或多种其他抗炎剂；

（b）一种物质，其包含或由病原体相关分子模式（PAMP）的一种或更多种，和任意地进一步包括

（c）一种或多种另外的物质，例如，从由抗体组成的组中所选择，反义寡核苷酸，蛋白，抗原，变态反应原，一个多聚核苷酸分子，重组病毒载体，全微生物，或全病毒。

病原体相关分子模式（PAMP），如在本发明的第一方面和第二方面的上下文中使用时，是指具有激活天然免疫系统能力的分子。PAMP是由一种或多种天然免疫受体直接或间接地识别，和/或激活免疫细胞的炎性基因的通路。PAMP激活一种或多种免疫细胞中促炎基因表达和蛋白合成，包括，例如单核细胞，粒细胞，NK细胞，树突细胞。促炎性基因包括一种或多种细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α，G-CSF，GM-CSF，从IL-1到IL-33，尤其是IL-1，IL-4，IL-5，IL-6，IL-12，IL-13，IL-18，IL-20；干扰素包括1型干扰素和γ干扰素；趋化因子包括CXC家族趋化因子，包括CXCL1到CXCL17，CC家族趋化因子包括CCL1到CCL28，CX3C趋化因子包括fractalkine的，C族趋化因子包括XCL1到XCL2。诱导这些促炎基因表达通常与活化的NFκB转录因子相关。

在本申请的上下文中，术语PAMP不仅包括在自然界中发现的PAMP，还包括功能上等同的模拟物，变体，衍生物和类似物，以及合成的PAMP。许多天然存在的和合成的PAMP是本领域已知的，其中很多会在下文更详细地讨论。

本发明的第二方面的组合物的组分（a）是一种抗炎成分，如IL-1或抗炎剂的NFkB的抗炎剂。在特别有意义的用于本发明的一个实施方案中，抗炎成分是或包括菊粉颗粒。所关注的IL-1的其他抗炎剂在功能上等价于菊粉颗粒，具有基本上等同的抗炎性质，活性和/或特异性和/或具有实质上等价佐剂属性。这些方式可以包括一个IL1受体拮抗剂或更多，IL1RA，阿那白滞，Rilonacept，IL-1R/IL1RacP/Fc-fusion蛋白，Canakinumab（IL－1β单抗），大规模的IL-1β阻断抗体，IL1受体拮抗剂，IL-RII，消炎痛，非甾体抗炎药（NSAID），包括吲哚美辛，糖皮质激素，蛋白酶抑制剂，包括半胱天冬酶1抑制剂，炎性酶抑制剂，氯喹，P2X7受体抑制剂，ST2受体抑制剂，姜黄素，白藜芦醇，和类花生酸的生物合成的抑制剂。

本发明的第二方面的组合物的组分（b）是包含或由一种或多种病原体相关分子模式（PAMP）组成的物质。在一个实施方案中，该物质可包括不超过10种不同的分子PAMP，如9或更小，8或更小，7或更小，6或更小，5或更小，4或更小，3或更低，2或少，或PAMP只有一个单独的分子。在一种选择中，在PAMP的组分（b）不同的分子物种的数量的限制可能只与菊粉颗粒或由菊粉的一个特定类型的组合被应用。

因此，例如，在特定实施例中，组分（b）可以包括不大于10，9，8，7，6，5，4，3，2或者单独的PAMP分子，其中在组件中的菊粉颗粒（a）包含或由γ-菊粉构成。

在另一个具体实施方案中，组分（b）可以包括不大于10，9，8，7，6，5，4，3，2或者单独的PAMP分子，其中在组件中的菊粉颗粒（a）包含或由δ－菊粉构成。

在另一个具体实施方案中，组分（b）可以包括不大于10，9，8，7，6，5，4，3，2或者单独的PAMP分子，其中在组件中的菊粉颗粒（a）包含或由ε－菊粉构成。

PAMP的独特分子种类，例如在本发明的第二方面的情况下，可以是结构不同的。这样的结构的区别可以是，例如，可以通过已知的和常规的结构分析的方法，如质谱法，核磁共振，红外光谱，圆二色谱，或差示扫描量热法测定。

此外，或可选地，病原体相关分子模式（PAMP）的独特分子种类，在本发明的第二方面的情况下，可以是功能上不同的。PAMP的功能不同的分子种类特点可以通过天然免疫受体结合位点不同而区分。这可以通过实验进行评估，例如，通过测量PAMP对一组不同天然免疫受体都结合力，这些受体包括TLR受体，如人或动物的TLR-1，TLR-2，TLR-3，TLR-4，TLR-5，TLR-6，TLR-7，TLR-8，TLR-9，鼠TLR-11；NOD-1，NOD-2，其它的NOD样受体（最接近现代种）如NLRP1，NLRP3，NLRP12，NLRC4；树状细胞凝集素-1，DC-SIGN，AIM-2，C-型凝集素，MD2，CD14，LBP，CD36，RIG-I样受体包括RIG-I，MDA5，LGP2和/或ASC。PAMP分子对这些受体的结合可以通过常规的方法，例如表面等离子共振（Schasfoort，2008）进行评估。本领域技术人员将能够确定合适的条件进行实验，以评估从中到高严谨度的结合特异性。此外，或可选地，本领域技术人员已知，一个PAMP的属性可以通过THP-1或RAW免疫细胞株进行功能性实验而检测或定量，例如使用ThermoScientific公司萤光素酶NFkB活化报告系统检测试剂盒（Hughes，2012），或通过测定PAMP活性的物质在培养的细胞系中诱导的炎性基因或蛋白水平。

在本发明中，PAMP的总和是存在于该组合物的组分（b）（和任选地，所有的PAMP在组合物中，在该事件是组分（c）包含的第二个方面的一个实施例进一步PAMP）将不会结合超过20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1种上述的天然免疫受体，而尤其关注不结合超过3个、2个或者1个受体的PAMP。

虽然某些具有佐剂性质的抗原结合载体材料能够通过吞噬细胞中溶酶体裂解，炎性体的活化，天冬蛋白酶的活化，免疫细胞死亡，和释放内源性的DNA而间接地激活天然免疫系统，如明矾（或释放其他金属盐类或沉淀物，如镁，钙，铝磷酸盐，硫酸盐，氢氧化物或水合物），但还没有证明它们可以结合一个特定的PAMP受体，也不能模拟由病原体表达的分子模式，因为它们可能以不同的方式发挥作用，因而它们并不属于本应用中使用的PAMP的定义的一部分。

本发明的第二方面的组合物（c）任选成分可以，例如，包括一个或一个选自抗体的组中选择的多个附加的物质，反义寡核苷酸，蛋白，抗原，变态反应原，一个多聚核苷酸分子，重组病毒载体，整体的微生物，或一个全病毒，因此组分（c）可以有助于一个或多个额外的PAMP的组合物。例如，全微生物，全病毒，内毒素等会包含多种（当然比10更大）分子，结构，物理和/或功能上不同的PAMP分子。因此，PAMP的独特分子种类在本发明的第二方面的组合物中的总数目可大于10。但这不会改变在一个本发明的第二方面的实施方案中，要求组合物的组分（b）将包括不大于10种或更少的不同PAMP分子。因此，通常情况下，任选地存在于组分（c）的物质，将在结构和/或功能上区别于组分（b）的分子。

本发明的第二方面的组分（b）组合物中一种或多种的PAMP（优选地包括所有的PAMP）的分子量可达到但不超过200,000KDa，比如达到但不超过15万kDa、100,000kDa、50,000kDa、40,000kDa、20,000kDa、10,000kDa、5,000kDa、2,000kDa、1，000kDa、500kDa、450kDa、400kDa、350kDa、300kDa、250kDa、200KDa、，150KDa、100kDa、50KDa、40KDa、30KDa、20KDa、10KDa、9KDa、8KDa、7KDa、6KDa、5KDa、4kDa、3KDa、2KDa或1KDa或更少。

根据本发明的第二方面的组合物可以是药学上可接受的组合物。在这种情况下，其药学上可接受的组合物是安全的，可通过注射，如静脉内，皮下或肌内注射施用给受试者，例如人类受试者。在一个实施方案中，如果它不包含或基本上没有内毒素，则所述组合物可被定义为是安全的。内毒素是常用词，术语为脂多糖，是革兰氏阴性菌细胞外壁的主要成分。它包括一种多糖（糖）链和被称为脂质A的脂质部分，后者是负责与内毒素所观察到的毒性效应的。多糖链是高度可变的，在不同的细菌中，内毒素的血清型和脂质成分也变化很大，例如，一个单一的内毒素的样品可以含有10到100种不同分子。内毒素约10kDa的大小，但可以形成大的聚合物高达1000kDa。内毒素通常是有害，欧盟监管部门对组合物中内毒素水平有严格限制。因此，内毒素的组合物根据本发明的第二方面其水平应最小化并应小于100个内毒素单位（EU）/剂量，诸如小于90，80，70，60，5040，30，20，10，5，4，3，2，1或更低。根据本发明的第二方面组合物中的内毒素的浓度可以小于200EU/立方米，诸如小于150，100，90，80，70，60，50，40，30，20，10，5，4，3，2，1或更低EU/立方米。在一些实施例中，这些限制可以应用到本发明的第二方面的组合物的菊粉颗粒（a）组分，该组分仅包含一种或两种γ、δ或ε－菊粉型。用于测定内毒素水平的方法，如鲎的血细胞吸附试验（LAL）方法，是众所周知的现有技术。

本发明的第二方面的组合物可任选地被包装和/或显示在一个方便的或单位剂型。

本发明PAMP在第二个方面的组合物的组分（b）的量和/或浓度（和任选的量和/或PAMP存在于整个组合物的浓度），优选地低于包含PAMP的等效组合物中的浓度，其不同之处仅在于等效组合物不包括菊粉颗粒（或其它等效的抗炎成分）。换句话说，本发明的第二方面的组合物（a）组分中所含菊粉颗粒（或其它等效的抗炎成分）能够使在（b）成分中更少量的PAMP在受试者中诱导或调节免疫应答的效果与对应的等效组合物相同，其不同之处仅在于等效组合物不包括菊粉颗粒（或其它等效的抗炎成分）。

因此，本发明的第二方面的组合物（和任选地，所述一种或多种的PAMP量和/或存在于整个组合物中的的浓度）的一种或多种的PAMP的（b）的量或浓度可以少于等效组合物中PAMP的最适浓度，例如少于90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％，0.1％，0.05％，0.04％，0.02％，0.01％或更少（按重量计），其不同之处仅在于等效组合物不包括菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）。PAMP在等效组合物的最佳量是达到诱导或调节免疫应答，起到一个典型佐剂增强免疫应答的效应，但有不至于引起显著的炎症或其它副作用。本领域中已知使用常规方法这可以凭经验确定每个PAMP的用量，例如通过动物模型进行剂量梯度的毒性研究，或通过使用替代的措施，例如检测NFkB在报告细胞系统的活化程度。事实上，在没有菊粉颗粒的情况下，这样的等效组合物可能完全不能达到相同水平的诱导或免疫调节。在一些实施例中，这些限制可以应用到菊粉颗粒（a）组分仅包含一种或两种γ菊粉、δ菊粉或ε菊粉的第二方面的组合物。

菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）的成分（a）和PAMP存在于在本发明的第二方面的组合物中，为了达到理想的效果，需要对组分（b）的合适的或最佳的比例进行调整，这可以由本领域技术人员对菊粉颗粒和PAMP使用常规方法的每个特定组合凭经验确定。然而，通常，菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）和PAMP的重量/重量比可在从10000:1至1：1的范围内，从1000:1到1:1，从100：1到1：1，或从100:1至10:1。

因此，根据本发明的第二方面的免疫学组合物可以包括有效量的用于诱导所需免疫应答的组合，其中所述组合包括至少一种菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）和至少一种PAMP天然免疫激活剂。在免疫学组合物中的PAMP天然免疫激活剂可以是本领域中已知的任何类型的PAMP天然免疫激活剂。例如，PAMP天然免疫激活剂可以由任何组的已知天然免疫受体的激动剂的物质中选择。因此，用于本发明中使用的PAMP天然免疫激活剂可结合并具有任何一种或多种天然免疫受体的激动剂活性，Toll样受体，RNA解旋酶，NOD1，NOD2，其它的NOD样受体（最接近现代种）如NLRP1，NLRP3，NLRP12，NLRC4，树状细胞凝集素-1，DC-SIGN，AIM-2，C-型凝集素，MD2，CD14，LBP，RIG-迈克包括受体RIG-I，MDA5，LGP2和/或ASC，C型凝集素受体，补体受体，Fc受体和清道夫受体。

本发明的第三方面提供部件包括一个试剂盒：（a）含有或由一种抗发炎成分构成，如菊粉和/或一种或多种其他抑制IL-1或NFkB的抗炎剂（如上文中关于本发明的第二方面的讨论）组成第一容器，和（b）包含或由一个PAMP物质构成的第二容器。

以上在本发明的第二方面的组合物的各种组分的某些实施例的公开的相关名称、类型、数量和浓度等，可比照适用于本发明的第三方面的试剂盒的第一和第二容器中。

因此，在一个本发明的第三方面的实施方案中，存在于第二容器中的物质可包括不超过10种不同的PAMP分子，如9或更小，8或更小，7或更小，6或更少，5或更小，4或更小，3或更低，2或更低，或PAMP的只有一个不同的分子种类。在一种选择中，在第二容器中的PAMP物质不同的分子种类数量的限制仅应用于特定试剂盒中，即第一容器仅含有一种菊粉颗粒，例如如只有γ、δ或ε－菊粉。

在另一个本发明的第三方面的实施例中，第二容器中PAMP的总和，不应结合超过20，19，18，17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1种上述的天然免疫受体。

无论是在本发明的第三方面的试剂盒的第一容器和/或第二容器中的一个或两个任选地还可以包括一种或多种其它物质，例如，选自抗体，反义寡核苷酸，蛋白组成的组中所选择，抗原，变应原，一个多聚核苷酸分子，重组病毒载体，全微生物，或全病毒。

所述本发明的第三方面的试剂盒的第二容器中一种或多种的PAMP（优选地包括所有的PAMP）的分子量可达到但不超过200,000KDa，比如达到但不超过15万kDa、100,000kDa、50,000kDa、40,000kDa、20,000kDa、10,000kDa、5,000kDa、2,000kDa、1，000kDa、500kDa、450kDa、400kDa、350kDa、300kDa、250kDa、200KDa、，150KDa、100kDa、50KDa、40KDa、30KDa、20KDa、10KDa、9KDa、8KDa、7KDa、6KDa、5KDa、4kDa、3KDa、2KDa或1KDa或更少。

无论是在本发明的第三方面的试剂盒的第一容器和/或第二容器中的中的材料可能构成一个单位剂量。

无论是在本发明的第三方面的试剂盒的第一容器和/或第二容器中的组合物应是如上文定义的药学上可接受的组合物。因此，内毒素的试剂盒中的第一个容器和/或第二容器中的任一个或两个的水平应为每剂量小于100EU，诸如小于90，80，70，60，50，40，30，20，10，5，4，3，2，1或更少。内毒素的试剂盒中的第一个容器和/或第二容器中的任一个或两者的浓度应小于200EU/立方米，诸如小于150，100，90，80，70，60，50，40，30，20，10，5，4，3，2，1或更少EU/立方米。在一些实施例中，这些限制可以应用到菊粉颗粒（a）组分仅包含一种或两种γ菊粉、δ菊粉或ε菊粉的第三方面的组合物。

在本发明的第三方面的试剂盒的第二容器中PAMP的量和/或浓度应优选为小于单独使用的PAMP的最佳值，或更小，例如小于90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％，0.1％，0.05％，0.04％，0.02％，0.01％或更少（按重量计），其中单独使用PAMP时的最佳浓度在诱导或调节免疫反应上应达到期望水平或类型。

在本发明的第三方面的实施例中，菊粉的颗粒（或其它等效的抗发炎成分）在所述第一容器和PAMP在第二容器的重量/重量比可在范围为10000:1至1：1，从1000:1到1:1，从100:1至1:1，或者从100:1到10:1。

任何一种本发明的第一，第二或第三方面的一个进一步的实施方案中包含的PAMP物质可以是天然免疫激活剂，结合并活化如下的TLR：RNA解旋酶，NOD1，NOD2，其它的NOD样受体（最接近现代种）如NLRP1，NLRP3，NLRP12，NLRC4或多种的激动剂；树状细胞凝集素-1，DC-SIGN，AIM-2，C-型凝集素，MD2，CD14，LBP，RIG-I样受体包括RIG-I，MDA5，LGP2和/或ASC，C型凝集素受体，补体受体，Fc受体和清除受体。

任何一种本发明的第一，第二或第三方面的一个进一步的实施方案中，所述每个PAMP可以是选自二酰基脂肽所组成的组中选择的一种物质，三酰基脂肽，PAM3CSK4，脂磷壁酸，肽聚糖，HSP70，酵母多糖，单链RNA，双链RNA，双链DNA，聚（I：C），聚（I：C-LC），Hiltonol^TM，的PolyI：PolyC12-U，Ampligen^TM，MPLA，热休克蛋白，纤维蛋白原，硫酸乙酰肝素片段，透明质酸片段，合成TLR4激动剂，咪唑喹啉，嘎德莫特，洛索立宾，溴匹立明，CL264，R848，CL075聚（U），咪喹莫特，雷西莫特，ssPolyU/LyoVec，ssRNA40/LyoVec，非甲基化CpG寡核苷酸，B类ODN，C类ODN，CpG2006，CpG1826，CpG7909C12-IE-DAP，即磷酸二铵，三磷酸二铵，胞壁酰二肽（MDP），L18-MDP，M-TriDAP，莫拉，PGN-ECndi，PGN-ECndss，PGN-三迪，孔蛋白，脂阿拉伯甘露聚糖，白色念珠菌组件，新生隐球菌荚膜多糖，糖基（GPI）锚定蛋白，疟原虫色素，病毒双链DNA，双链DNA的合成，病毒dsRNA，含有胞壁酰二肽NAG-NAM-γ-D-谷氨酰-内消旋二氨基庚二酸，含胞壁酰二肽肽聚糖合成的双链RNA肽NAG-NAM-L-丙氨酰-异谷氨酰胺，N-甲酰甲硫氨酸，胞壁酰三肽，β-1，3-葡聚糖，酵母多糖，编码因子，海藻糖-6,6-二山嵛酸酯，聚（DA：DT），聚（dG的：DC），5’-PPP-双链RNA，低密度脂蛋白（LDL），氧化低密度脂蛋白，化学修饰的LDL，疟原虫色素，ATP。

任何一种本发明的第一、第二或第三方面的一个进一步的实施例中，菊粉颗粒可以包含或由一个或一个以上的γ、δ和ε－菊粉构成，或其中任一或多项与磷酸铝或氢氧化铝组合，包括phosgammulin，phosdeltin，phosepsilin，algammulin，algammulin，aldeltin，alepsilin。该组合通过本文进一步描述的方法获得。另外，α和/或β菊粉或其他修饰的菊粉颗粒也可以额外使用或替代γ、δ和ε－菊粉使用，但它们必须是在一个合适的颗粒形式。

在另一个涉及第一方面，第二方面和/或第三方面方法的实施例中，若其中菊粉颗粒组分包含两种或以上晶体形式，则该制剂可能不同于的抗原结合载体材料中存在的菊粉多晶型形式。例如，

·菊粉颗粒可以包括γ－菊粉（和/或γ－菊粉与磷酸铝或氢氧化铝的组合）与δ－菊粉混合；可选地

·菊粉颗粒可以包括γ－菊粉（和/或γ－菊粉与磷酸铝或氢氧化铝的组合）与ε－菊粉混合；可选地

·菊粉颗粒可以包含δ－菊粉（和/或δ－菊粉与磷酸铝或氢氧化铝的组合）与γ-菊粉混合，可选地

·菊粉颗粒可以包含δ－菊粉（和/或δ－菊粉与磷酸铝或氢氧化铝的组合）与ε－菊粉混合；可选地

·菊粉颗粒可以包含ε－菊粉（和/或ε－菊粉与磷酸铝或氢氧化铝的组合）与γ-菊粉混合，可选地

·菊粉颗粒可以包含ε－菊粉（和/或δ－菊粉与磷酸铝或氢氧化铝的组合）与δ－菊粉混合。在前述名单，γ、δ和/或ε－菊粉类型也可任选取代的α菊粉和/或β菊粉。

任何一种本发明的第一，第二或第三方面的一个进一步的实施方案中，在第一方面中所用的组合物，第二方面和/或第三方面的试剂盒的第一和/或第二容器的组合物，可以进一步包含一种或多种另外的物质，例如，选自抗体，反义寡核苷酸，蛋白，抗原，变态反应原，一个多聚核苷酸分子的重组病毒载体，全微生物，或全病毒组成的组中选定。

因此，任何的本发明在第一方面中所用的组合物中的第一，第二或第三方面的一个进一步的实施方案中，第二方面和/或第三的试剂盒的第一和/或第二容器中的组合物一方面，可以进一步包含一种或多种抗原。所述或每个抗原可以是任何类型的抗原本领域已知的，并且可以从包括蛋白质，糖蛋白，肽，多肽，细胞，细胞提取物，多糖，多糖偶联物，脂质，糖脂，核酸和糖类的组中选择的，或碳水化合物或脂质与蛋白质，多肽/肽抗原，多糖的肽模拟物，或抗原的结合物还可核酸序列内进行编码。抗原可以粗提物，纯化或重组的形式提供。抗原可衍生自一种传染性病原体如病毒，细菌，真菌或寄生虫，或抗原可以由肿瘤抗原衍生，变应原，或自身蛋白。

其中一种或多种抗原，特别是一种或多种疫苗抗原包含在任一本发明的第一，第二或第三方面的一个进一步的实施方式，那么进一步包括一种或多种抗原作为该或各抗原在同一混合物结合剂可能是合适的。

本发明的第二和第三方面还提供了第二方面组合物和第三方面试剂盒的制备方法。该方法可包括提供所述部件，然后把它们一起组成第二个方面的组合物或第三方面的试剂盒的步骤。

本发明还提供了通过对所述受试者施用第二方面的免疫学组合物的治疗有效量或使用第三方面试剂盒用于刺激或调节免疫应答，包括抗原特异性免疫反应的方法。该方法包括向所述受试者施用第二方面组合物和第三方面试剂盒的步骤，包括所述组合物，或各组成部分，施用的有效量，有效的时间和给药途径以诱导所期望的免疫应答或效果。

因此，本发明的第四方面，提供了用于诱导或调节受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括同时，依次或分开给予治疗有效量的本发明的第三方面的试剂盒的第一和第二容器中的内容或者向受试者施用治疗有效量的第二方面所述组合物。

换言之，本发明的第四方面根据本发明的第二方的一种组合物或根据本发明的第三方面的试剂盒，提供一种用于诱导或调节受试者免疫应答的用途。

再换言之，本发明的第四方面提供了根据本发明第二个方面的组合物和/或第三方面的试剂盒，制备用于诱导或调节受试者中免疫应答的药物。

在本发明的第四方面的实施方案中，与等效组合物比，免疫反应的调节可以包括提高受试者免疫应答的速度，而等效组合物的不同之处仅在于它不包括菊粉颗粒。有关的免疫应答可以是，例如，对一种或多种抗原的适应性免疫应答。适应性免疫应答可以来自一个或多个T细胞（包括一种或多种的CD4+和/或CD8+T细胞）和/或B-细胞，并可以通过一个或多个免疫球蛋白亚型的产量来确定，如IgA，IgE，lgG1，IgG2a，IgG2b，lgG3，IgG4或IgM的水平；或者通过一个或多个细胞因子的产生量来确定，如任何一个或多个IFN-γ，TGF-β，GM-CSF，肿瘤坏死因子，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL7，IL-8，IL10，IL12，IL13，IL-17，IL-20。

在另一个本发明的第四方面的实施方案中，免疫反应的调节包括在受试者中增加相对于等效组合物的免疫反应的特异性，等效组合物的不同之处仅在于所获得的特异性它不包括菊粉颗粒。有关的免疫应答可以是，例如，适应性免疫应答。适应性免疫应答可以来自一个或多个T细胞（包括一种或多种的CD4+和/或CD8+T细胞）和/或B-细胞，并可以通过一个或多个免疫球蛋白亚型的产量来确定，如IgA，IgE，lgG1，lgG3，IgG4或IgM的水平。增加的特异性可以，例如，增加的B和/或T细胞应答水平。

在另一项本发明的第四方面的实施方案中，相对于免疫应答的受试者与等效组合物，免疫反应的调节可包括增加受试者的免疫应答的强度，等效组合物的不同之处仅在于它不包括菊粉颗粒。有关的免疫应答可以是，例如，适应性免疫应答。适应性免疫应答可以来自一个或多个T细胞（包括一种或多种的CD4+和/或CD8+T细胞）和/或B-细胞，并可以通过一个或多个免疫球蛋白亚型的产量来确定，如IgA，IgE，lgG1，lgG3，IgG4或IgM的水平。增加的特异性可以，例如，增加的B和/或T细胞应答水平。

在另一本发明的第四方面的实施方案中，相比于免疫应答的受试者与等效组合物，免疫反应的调节可包括增加受试者的免疫应答的持续时间，其不同之处仅在于等效组合物不包括菊粉颗粒。有关的免疫应答可以是，例如，适应性免疫应答。适应性免疫应答可以来自一个或多个T细胞（包括一种或多种的CD4+和/或CD8+T细胞）和/或B-细胞，并可以通过一个或多个免疫球蛋白亚型的产量来确定，如IgA，IgE，lgG1，lgG3，IgG4或IgM的水平。增加的特异性可以，例如，增加的B和/或T细胞应答水平。

在另一本发明的第四方面的实施方案中，相对于免疫应答的受试者与等效组合物，免疫反应的调节可以包括改变受试者的免疫应答的类型，其不同之处仅在于等效组合物不包括菊粉颗粒。免疫应答的类型可以是，例如，适应性免疫应答。适应性免疫应答的类型可被表示为速度，幅度，特异性，和/或适应性免疫应答。适应性免疫应答可以来自一个或多个T细胞（Th1细胞，Th2细胞，Th17细胞和Treg细胞包括一种或多种的CD4+和/或CD8+T细胞）和/或B-细胞，并可以通过一个或多个免疫球蛋白亚型的产量来确定，如IgA，IgE，lgG1，lgG3，IgG4或IgM的水平。

改变受试者的免疫应答类型的更具体的实例，根据本发明的第四方面包括改变天然和适应性免疫反应之间的平衡、增强免疫记忆反应、改变免疫应答的类型。比如通过增强或抑制Th1细胞，Th2细胞，Th17细胞或调节性T细胞的反应而改变应答类型；可以抑制IgE应答，或增强IgA、IgM或IgG的亚型反应的一种或多种。换言之，本发明的第四方面提供了一种方法，以获得最佳的免疫反应类型，包括最佳的T细胞或B细胞应答的疫苗抗原。使用等量的等效组合物有可能达不到同样的促进作用，其不同之处仅在于等效组合物不包括菊粉颗粒（或其它等效的抗炎成分）。

本发明的第五方面提供了用于诱导或调节抗原，其中所述方法包括一个免疫反应的方法，

（一）根据本发明的第二方面向受试者施用一种组合物的治疗有效量，其特征在于，所述组合物还包含抗原和任选地，还包含结合抗原的载体材料；或

（二）同时，依次或分别给受试者施用治疗有效量的本发明的第三方面，其特征在于，所述的试剂盒的第一和第二容器的内容物的试剂盒的第一和/或第二容器中的内容还包括抗原和任选地，还包含结合抗原的载体材料。

换言之，本发明的第五方面，其特征在于，所述组合物还包含抗原和任选地，还包含结合抗原的载体材料，用于调制一个第二个方面提供一种组合物免疫应答的抗原的方法；还包括根据第三方面，其中所述试剂盒的第一和/或第二容器的内容物还包含抗原和任选地，还包含结合抗原的载体材料的第三方面的试剂盒，在诱导或调节对抗原的免疫应答的使用。

再换言之，本发明的第五方面提供了根据本发明的方法，其中所述组合物还包含抗原和任选地，还包含结合抗原的载体材料的第二方面的一种组合物的用途在制备用于诱导或调节对抗原的免疫应答药物中的用途；以及提供了使用本发明的第三方面的试剂盒，其中所述试剂盒的第一和/或第二容器的内容还包含抗原和任选地，还包含结合抗原的载体物质，用于诱导或调节对抗原的免疫应答药物中的用途。

本发明的第六方面提供了一种用于受试者的免疫接种，其中所述方法包括：

（一）根据本发明的方法向受试者施用一种治疗有效量的组合物，其中所述组合物还包含抗原和任选地，还包含结合抗原的载体材料的第二个方面；或

（二）同时，依次或分别给受试者施用治疗有效量的本发明的第三方面，其特征在于，所述的试剂盒的第一和第二容器的内容物的试剂盒的第一和/或第二容器中的内容还包含抗原和任选地，还包含结合抗原的载体材料。

换言之，本发明的第六方面，其特征在于，所述组合物还包含抗原和任选地，还包含结合抗原的载体材料，用于受试者疫苗接种的第二个方面组合物；以及提供了本发明的第三方面的试剂盒，其中所述试剂盒的第一和/或第二容器的内容物还包含抗原和任选地，还包含结合抗原的载体材料，用于在受试者中的免疫接种中使用。

再换言之，本发明的第六方面提供了根据本发明的方法，其中所述组合物还包含抗原和任选地，还包含结合抗原的载体材料的第二方面的一种组合物在制备用作受试者疫苗药物中的用途；以及提供了使用本发明的第三方面的试剂盒，其中所述试剂盒的第一和/或第二容器的内容物还包含抗原的和任选地，还包含结合抗原的载体材料，在制备用作受试者疫苗药物中的用途。

合适的疫苗抗原用于本发明的第五和/或第六方面的用途可包括那些在本申请其它地方描述的，包括如上所述的有关本发明的第一，第二和第三方面的内容。

在本发明的第五和第六方面所用抗原的量和/或浓度可以小于等效的组合物和/或试剂盒所需抗原的量，其不同之处仅在于，等效组合物或试剂盒不包括量菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）。换言之，菊粉颗粒（或其它等效的抗炎成分）的组合物和/或试剂盒的存在可以提供按照第五方面诱导或调节免疫反应，或按照第六方面对受试者接种疫苗，并使用较少抗原的方法和用途。

因此，在本发明的第五和/或第六方面中使用的组合物和/或试剂盒的一个或多个抗原的量或浓度相对于使用等效组合物达到标准免疫应答所需抗原量可以更小，例如小于90％，80％，70％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％，0.1％，0.05％，0.04％，0.02％，0.01％或更少（按重量计），等效组合物或试剂盒的不同之处仅在于其不包括菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）。

在等效组合物中的最佳量是达到诱导的免疫应答或调节所需要的效果，而不会高到引起炎症和/或其他副作用的不可接受的水平所需的量。这可凭经验通过本领域技术人员对于每种抗原和PAMP使用常规方法来确定。事实上，这样的等效组合物可能因不含菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）而无法达到实现相同水平或类型的免疫应答。

本发明还提供了下调受试者中不利的免疫应答的方法，例如通过对过敏原特异性IgE的表达下调阻断过敏原的特异性IgG而阻断过敏反应或慢性炎性病症。该方法包括向所述受试者施用第二方案，或第三方面的试剂盒，以及任选的其它组分，如抗原或变应原，其特征在于各成分的给药有效量，并在有效的时间和通过有效的给药途径，抑制或下调不希望的免疫应答和/或诱导有利的反调节免疫应答。

因此，本发明的第七个方面提供了一种用于受试者的过敏原脱敏的方法，其中所述方法包括

（一）根据本发明的第二方面向受试者施用一种治疗有效量的组合物，其中所述组合物还包含变应原和任选地，还包括变应原结合的载体材料；或

（二）同时，依次或分别给受试者施用治疗有效量的本发明的第三方面的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的第一和第二容器的内容物的试剂盒的第一和/或第二容器中的内容还包括变应原和任选地，包括变应原结合的载体材料。

换言之，本发明的第七方面，其特征在于，第二个方面提供一种组合物还包含变应原和任选地，还包括变应原结合的载体材料，用于将受试者的脱敏；并且提供了用于本发明的第三方面的试剂盒方法，其中所述试剂盒的第一和/或第二容器的内容还包括变应原和任选地，还包括变应原结合的载体材料，用于在受试者中的变应原脱敏中使用。

再换言之，本发明的第七方面提供了使用本发明第二个方面组合物，其特征在于，所述组合物还包含变应原和任选地，包括变应原结合的载体材料，在制备用于治疗受试者的过敏原脱敏的方法；以及提供了使用本发明第三方面的试剂盒的方法，其中所述试剂盒的第一和/或第二容器的内容还包括变应原和任选地，还包括变应原结合的载体材料，用于治疗受试者的过敏原脱敏的方法。

本发明的第八方面提供了一种用于治疗癌症的方法，其中所述方法包括根据权利要求书的第二个方面给予受试者的组合物的治疗有效量，或者同时，依次或分开给予受试者治疗有效量的本发明的第三方面的试剂盒的第一和第二容器中的内容。

换言之，本发明的第八方面，提供了在癌症治疗中使用的第三方面的试剂盒和第二个方面的一种组合物。

换言之，本发明的第八方面提供了使用第二方面组合物和第三方面试剂盒制备抗肿瘤药物的方法。

在本发明的第八方面的实施方案中，所用的本发明的第二方面的组合物进一步包含癌症抗原。

在另一本发明的第八方面的实施方案中，所用的本发明的第三方面的试剂盒的第一和/或第二容器中的内容还包括癌抗原。

本发明的第九方面提供了一种方法，用于疫苗制备，所述方法包括本发明第二方面部件的组合物（a）和（b）结合抗原的步骤，以及任选地结合抗原的载体材料的步骤，从而产生一种疫苗组合物。

因此，本发明的第九方面还提供了使用本发明的第二方面的组合物，如在疫苗中的佐剂。

值得注意的是，在下面的例子中，我们证明了使用本发明的组合物能够对其他致死性感染提供单剂量疫苗的保护。我们还发现，本发明的组合物中，当作为针对流感的疫苗配方，可在小鼠模型中提供有效的单剂量的保护。单剂量疫苗的保护是极其理想的，并且迄今为止，在疫苗领域难以实现。然而，本申请的组合物已被发现可以提供单剂量疫苗的保护。

因此，在另一个本发明的第九方面的实施例中，单剂量的疫苗组合物提供了一种根据本发明或第三的试剂盒的第二个方面，其包含或由菊粉颗粒（任选地在组合物的形式方面），抗原和任选的抗原结合的载体材料。这样的单剂量的疫苗组合物可有效地在被检疫苗提供的保护与疫苗的剂量仅单次施用。

本发明还提供受试者疫苗接种的方法，其包含对所述受试者施用单剂量的疫苗的方法。虽然该方法可以包括一个或多个其它的步骤，但在初次免疫施行后不再进行再次免疫接种。

因此，换言之，本发明还提供一种单剂量中的一种方法，其包含或包括向所述受试者施用单剂量的疫苗的接种。

换言之，本发明还提供了使用如上定义的单剂量用于治疗用途的一个方法，包括受试者疫苗接种或对所述受试者施用一个单一剂量的疫苗。

本发明的另一个有利的特征是，它的组合物，物质，试剂盒和方法根据本发明的其它方面对特定受试者非常有效，而这些受试者通常对普通佐剂和疫苗不能产生良好的反应。这样的受试者群体可能包括年轻人，老年人和孕妇。在一个实施方案中，本发明的流感疫苗可以施用给此类受试者。

因此，可以通过该组合物，物质，试剂盒和方法根据本发明的其它方面治疗的受试者可以是男性或女性的儿童，例如，相对他们的出生日期小于18岁，17岁，16岁，15岁，14岁，13岁，12岁，11岁，10岁，9岁，8岁，7岁，6岁，5岁，4岁，3岁，2岁，1岁11个月，10个月大，9个月，8个月，7个月，6个月，5个月，4个月，3个月，2个月，或1个月。

或者，也可以通过该组合物，物质，试剂盒和方法根据本发明的其它方面治疗的受试者可以是一个年龄较大的男性或女性。年长的人可能是至少40岁，至少45岁，至少50岁，至少55岁，至少60岁，至少65岁，至少70岁，至少75岁，至少80岁，至少85岁，或至少90岁。

或者，也可以通过该组合物，物质，试剂盒和方法根据本发明的其它方面治疗的受试者可以是怀孕的女性。女性可以达到，或者至少达到5，10，15，20，25，30，35或40周的孕妇。

本发明的第十方面提供了确定最佳的（a）和（b）组合物浓度和成分比例的方法。根据本发明的第二方面，该方法包括将一个可选抗原，以及任选地结合抗原的载体材料，根据本发明的第二方面，对一系列不同剂量的（a）和（b）组合物通过测量所产生的免疫反应，或者在免疫后使用活病原体感染宿主，从而发现最优的组合。

在另一本发明的第十方面的实施方案中，根据本发明的第三方面，所述试剂盒第一和/或第二容器的内容物，以及可选地包括一种抗原，构成一种测定试剂盒用于发现最佳的免疫组合物。

在另一本发明的第十方面的实施方案中，提供了一个制备检测试剂盒的方法，该方法包括结合抗原的步骤，以及任选地结合抗原的载体材料的方法，以及组分（a）和（b）的组合物从而构成一个试剂盒。

本发明的实施例各个方面将在这里更加详细地进行说明。

附图说明

图1从A到D的四个图形出示了针对三价流感疫苗（TIV）与TLR9激动剂PAMPCpG2006制剂在小鼠中的免疫原性，突出了菊粉颗粒与CpG2006的协同作用。实验使用6-8周龄雌性BALB/c小鼠（每组n=5-8）分别肌肉注射间隔14天免疫两次，免疫制剂为商品化人流感病毒TIV疫苗50μl含有100ng剂量HA，单独加入2，7，20或60微克CpG2006或混合使用1mg的PDmix（1：5）。图A显示了血清中的抗流感总IgG水平，图B显示了血清中的抗流感IgM水平，图C显示了血清中的抗流感lgG1水平，图D显示了血清中的抗流感的IgG2a水平。抗体水平通过酶联免疫吸附试验在第二次免疫42天后测定。显示的是组平均吸光度+标准差。

图2A到F诸图显示了TLR9激动剂PAMP（CpG1668）和菊粉颗粒（PDmix1：36）在新生小鼠对TIV疫苗的免疫反应中的协同作用。新生BALB/c小鼠（每组5到7只）在14天龄和23天龄接受肌肉注射TIV（100ng的总HA蛋白）。末次注射后14天采集血清进行酶联免疫吸附试验实验。免疫组包括接受单独TIV或联合PDmix1：36（1mg），CpG1668（20微克），或PDmix（1mg）+CpG1668（20微克）。图A显示接受TIV+PDmix+CPG（每个图中最后一栏）有显著更高的抗流感总IgG，图B显示了较高的IgM，图C显示降低的lgG1，图D显示更高的IgG2a，图E显示了较高的抗流感的CD4+T细胞，图F显示了更高的CD8+T-细胞记忆应答。

图3出示了从A到D四个图，显示了酶联免疫吸附试验在血清中测得的200-300日龄的雌性Balb/c小鼠（每组10只）间隔14天肌肉免疫两次三价灭活流感疫苗后产生的抗流感IgM抗体，IgG2a，IgG1和总IgG水平。图A显示了血清中的抗流感总IgG水平，图B显示了血清中的抗流感IgM水平，图C显示了血清中的抗流感lgG1水平和图D显示了血清中的抗流感的IgG2a水平。抗体水平在第二次免疫42天后通过酶联免疫吸附试验测定。数据出示为每组平均吸光度+标准差。菊粉颗粒（PDmix）加上一个TLR9激动剂PAMP（CpG2006）的组得到了最高的抗流感抗体滴度。

图4显示了三价流感疫苗（TIV）不同制剂，单独菊粉颗粒制剂PDmix或结合TLR9激动剂的PAMP在小鼠中的免疫原性。图A显示了血清中的抗流感总IgG水平，图B显示了血清中的抗流感IgM水平，图C显示了血清中的抗流感lgG1水平和图D显示了血清中的抗流感的IgG2a的水平。抗体水平在第二次免疫后28天通过酶联免疫吸附试验测定。数据显示为每组平均吸光度+标准差。TIV加PDmix，再加上CpG1668，CpG2006或CpG2395任一种都显示优于单个组分的协同作用，而提高抗流感总IgG，IgG2a和IgM滴度。CpG2216和CpG2237对抗体应答没有任何效果。

图5中四个图显示狂犬病疫苗（MIRV）制剂，单独包含两种菊粉颗粒制剂（DIN或PDmix）或结合TLR9激动剂CpG1668在小鼠中的免疫原性。图A显示了血清抗狂犬病总IgG水平，图B显示了血清抗狂犬病IgM水平，图C显示了血清抗狂犬病lgG1水平和图D显示了血清抗狂犬病的IgG2a水平。抗体水平在第二次免疫后14天通过酶联免疫吸附试验测定。数据显示为每组平均吸光度+标准差。无论是DIN或PDmix与CpG1668加MIRV的组合均提高了抗狂犬病总IgG，lgG1，的IgG2a和IgM。

图6四个曲线图表示的三价流感疫苗（TIV）制剂，单独包含菊粉颗粒制剂PDmix或结合TLR2激动剂的PAMP（酵母聚糖，脂磷壁酸，Lipomannan和PamCSK4小鼠中的免疫原性）或者结合TLR9激动剂PAMPCpG2006。图A显示了血清抗流感总IgG水平，图B显示血清中抗流感总IgM水平，图C显示血清中抗流感lgG1水平和图D显示血清中抗流感的IgG2a水平。抗体水平在第二次免疫后14天通过酶联免疫吸附试验测定。数据显示为每组平均吸光度+标准差。

图7出示了三个曲线图展示了菊粉颗粒与TIV疫苗及不同PAMP组合在小鼠中的免疫原性。图A显示了血清中的抗流感总IgG水平，图B显示了血清中的抗流感lgG1水平和图C显示了血清中的抗流感的IgG2a水平。抗体水平在第二次免疫后42天通过酶联免疫吸附试验测定。数据显示为每组平均吸光度+标准差。

图8的六个图形显示了菊粉颗粒（DIN）的抗原节约效果和与TLR9激动剂PAMP，CpG2006联用于重组流感疫苗rH5在小鼠中的免疫原性。6-8周龄Balb/c小鼠（每组5到8只）间隔21天接受两次肌肉注射免疫，体积50微升，包括3纳克到3微克重组H5（rH5）加上或者是DIN1毫克或1毫克DIN与5微克CpG2006的组合物。图A显示了血清抗rH5总IgG，图B显示抗H5的IgM，图C显示抗H5IgG1，图D显示抗H5的IgG2a，图E显示了抗H5IgG2b的，图F显示抗H5IgG3。抗体水平在第二次免疫后14天通过酶联免疫吸附试验测定。数据显示为每组平均吸光度+标准差。

图9中两个图显示了菊粉颗粒（DIN）与TLR9激动剂PAMPCpG2006组合的免疫增强效应。实验显示了致死剂量PR8病毒的攻击后不同H1N1PR8疫苗制剂对小鼠存活的影响。图A显示了接受菊粉颗粒的组合（DIN）与TLR9激动剂PAMPCpG2006加上PR8疫苗的小鼠表现为有没有体重减轻或临床疾病的完全保护，而PR8+DIN没有的CpG只有部分保护。图B再次显示，接受菊粉颗粒（DIN）与TLR9激动剂PAMPCpG2006的组合加上甲型H1N1流感疫苗PR8小鼠没有死亡，而PR8+CpG2006的组合没有保护作用。

图10中四图展示了免疫雪貂中血凝抑制滴度（HI）和微量中和（MN）滴度。滴度在加强剂给予时和给予14天后测定。雪貂接种两剂的H5N1病毒与Ad2的有最高的中和抗体滴度，与H5N1病毒抗原加结合菊粉颗粒及TLR9激动剂制剂增强免疫反应是一致的。

图11出示了雪貂在接受AD1或AD2-佐剂化的H5N1疫苗后增强的存活能力。其中包括接受一次免疫22.5微克H5N1疫苗+Ad2的组。全部10组分别记录存活率：疫苗剂量（或盐水）+佐剂名称（或盐水）。五个佐剂疫苗组的生存期显著大于两个非佐剂疫苗组（对数秩检验，P=0.05），更显著大于三个未接种疫苗的对照组（对数秩检验，P<0.001）。

图12的7个图显示免疫后雪貂在H5N1禽流感病毒感染后该组平均体重的变化。接种两剂的H5N1病毒与Ad2的雪貂没有任何体重下降，与H5N1病毒抗原结合菊粉颗粒加上TLR9激动剂制剂增强的保护是一致的。

图13的7个图显示免疫后雪貂在H5N1禽流感病毒感染后该组平均体温变化。4只AD1（单独菊粉颗粒）佐剂疫苗组雪貂表现出发烧，而Ad2（菊粉颗粒+CPG）佐剂组则没有发热，与H5N1病毒抗原结合菊粉颗粒加上TLR9激动剂制剂增强的保护是一致的。

图14的三个图显示gIN，dIN或eIN在与CpG联用时均具有协同增强作用。这反映在抗HBsAglgG1，IgG2a和IgM的滴度上。成年BALB/c小鼠肌肉注射免疫两次，间隔21天，免疫制剂为乙肝表面抗原连同单独gIN，dIN或eIN菊粉颗粒或连同TLR9的PAMPCpG2006。图A显示了血清抗-HBsAglgG1，图B显示了血清抗-HBsAg的IgG2a水平，图C显示在第二次免疫后的血清抗-HBsAgIgGM水平。数据显示为每组平均吸光度+标准差。

具体实施方式

在本发明的实践将采用的，除非明确表示，为病毒学，免疫学，微生物学，分子生物学和本领域中的常规的方法。参见，例如，Sambrook等，分子克隆：实验室手册（第二版，1989）；Maniatis等，分子克隆实验指南（1982）；DNA克隆：实用方法，第一卷。I＆II（D.格洛弗，编辑）；寡核苷酸合成（N.Gait编辑，1984）；核酸杂交（B.Hames及S.Higgins编辑，1985）；转录和翻译（B.Hames及S.Higgins编辑，1984）；动物细胞培养（R.Freshney编，1986）；Perbal，分子克隆实用指南（1984）；现代免疫学方法，国际标准书号9780471522768（出版社：JohnWiley和Sons公司）；疫苗佐剂和给药系统（ManmohanSingh编，2007），分子生物学方法，国际标准书号9781607615842（出版社：Springer）；疫苗研发历史，2011，ISBN：1441913386（出版社：施普林格）

除非另有定义，所使用的所有技术和科学术语在本文中具有相同的含义并通常为本发明所属领域的普通技术人员所理解。虽然任何方法和类似或等同于本文描述的材料可以在实践或本发明的试验中使用，但优选的方法和材料将在下文描述。

本领域有经验的人们已知，天然免疫的激活可以用来增强适应性免疫记忆反应的类型或大小。增强适应性免疫应答或调节是有利的，在接种疫苗或在变应原去敏化的，因为它可以提供以放大或扩大针对特定病原体的免疫记忆反应的持续时间的装置，或者改变到更有益的免疫应答的类型。例如，对于某些病原体，它可能是有利的诱导强的抗体（Th2细胞）应答免疫抗原，而对其他病原体，它可能是有利的诱导强的Th1应答或强烈的Th17应答。另一方面，对于抗原如过敏原可能是有利抑制现有的IgE反应，而是诱导Th1反应的过敏原。根据目前的发明，菊粉颗粒的天然免疫激活剂的组合可以实现各种免疫反应，以得到独特模式，可以，例如，用于调节适应性免疫记忆反应以获得希望的免疫应答类型。

本发明提供了在受试者中，通过第一方面组合物包含或由菊粉粒子在减少或抑制炎症的用途，和/或用于治疗或预防炎性疾病，。

本发明的第二方面提供了一种免疫学和/或药学上可接受的组合物，其包含（a）一种抗炎成分，如菊粉颗粒和/或IL-1的一种或多种拮抗剂，与（包含或由天然免疫激活剂的一种或多种诸如病原体相关分子模式（PAMP）的物质（b）。不希望受理论的束缚，有利的免疫相互作用发生，因为每个免疫学组合物的两种组分的调节转录的一组独立的免疫基因，使得叠加后产生了独特的基因表达模式。

本发明的第三方面提供部件包括一个试剂盒：（a）在含有包含或由一种抗炎成分构成，例如菊粉和/或一种或多种其他抗炎剂的第一容器；和（b）包含或由一种病原体相关分子模式（PAMP）构成的物质的第二容器。

因此，本发明或本发明的第三方面的试剂盒，或第二方面的组合物的组分（a）包含或由一种抗发炎成分构成，如IL-1的抗炎剂的或NFkB的抗炎剂

在特别有意义的用于本发明的一个实施方案中，抗炎成分包含或由菊粉颗粒构成。如本文所用，术语“菊粉颗粒”不仅是指由从（2-1）聚呋喃果糖基α－D-葡萄糖（也称为菊粉），而且还对它们的衍生物如（2-1颗粒），其可以通过酶促去除菊粉末端葡萄糖的方式获得，例如使用蔗糖或菊粉酶酶能够除去末端葡萄糖的多聚果糖。术语菊粉颗粒还指的是由构成任何天然或合成的颗粒，含有或由菊粉，或其衍生物或模拟物构成。合适的菊粉衍生物，包括在此术语范围内的是菊粉，其中游离羟基已被乙酰化衍生物，甲基化，醚化或酯化，例如通过化学取代烷基，芳基或酰基，通过已知的方法。稳定的菊粉颗粒可以是实心的或空心的，可以全由菊粉分子或可替换地具有非糖芯，骨骼或外壳，包括，例如，糖类化合物，金属化合物，蛋白质或脂类，但它在其表面表达菊粉分子共价或非共价地键合到构成芯的组件。优选地，菊粉颗粒将被选自gIN，dIN和eIN。最优选地，该菊粉颗粒为dIN。优选地，该菊粉颗粒将具有的直径在20纳米至20微米的大小范围。更优选地，该菊粉颗粒将有一个直径为0.1到5微米的大小范围。最优选的菊粉颗粒将有一个直径为0.5到5微米的大小范围。

在一个实施方案中，本发明中所用的菊粉颗粒是稳定的菊粉颗粒。如本文所用，术语“稳定”指的是菊粉颗粒是完全不溶于水或绝大部分不溶的或部分不溶解于水，温度为人类受试者施用的体温。在这种情况下，稳定性可任选包括的含义是，当在高达25℃的温度下或向上保温至30℃，37℃，40℃，42℃，45℃的菊粉颗粒是不溶性的。在48℃，50℃，52℃，55℃，58℃或60℃时，至少孵育10，20，30，40，50或60分钟后在蒸馏水或生理盐水或磷酸盐缓冲盐中的溶解度不大于0.5mg/ml或1mg/ml或2mg/ml的。不溶菊粉的量可以通过使用分光光度计，在300nm的，400nm的，500nm处，600nm波长，700nm的波长（OD700）变化菊粉悬浮液的光密度来测量。在特定温度孵育后如果OD700不低于一个值，该值是50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％，99.5％，99.9％或基本上100％的粒子制剂在相同的溶剂中，则认为菊粉颗粒是稳定的（优选的温度是在低于孵化温度10℃以上测量的OD700）。

可以在第二方面的组合物中组分（a），或者试剂盒中使用其他抗炎成分，除菊粉颗粒，可以包括

（i）IL-1途径的基因或蛋白质，特别是那些在功能上等价于菊粉颗粒，具有基本上等同的抗炎性质，活性和/或特异性和/或具有实质上等价作用的免疫调节剂或辅助性质，

（ⅱ）一种IL1受体拮抗剂或更多，IL1RA，阿那白滞，Rilonacept，IL-1R/IL1RACP/Fc融合蛋白，canakinumab，人IL-1β抗体，IL1受体拮抗剂，IL-1升我，吲哚美辛，非甾体抗炎药（NSAID），糖皮质激素，蛋白酶抑制剂，包括半胱天冬酶1抑制剂，炎性体抑制剂，包括NALP3拮抗剂，姜黄素，白藜芦醇，氯喹，P2X7受体抑制剂，ST2受体抑制剂，和/或三磷酸腺苷拮抗剂；

（ⅲ）上调或激活抗炎蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）或上调基因或蛋白质中的PPAR-γ通路的物质，特别是在单核细胞和树突状细胞（PPAR-γ途径基因还通过菊粉颗粒上调）。PPAR-γ的上调先前已显示出抑制炎症反应，包括抑制LPS诱导的IL-和肿瘤坏死因子和反过来IL1和肿瘤坏死因子的PPAR-γ。合适的试剂可以包括一个或多个罗格列酮，吡格列酮，前列腺素J2，姜黄素，白藜芦醇，thiazolidenediones，黄连素，全氟壬酸，RS5444，游离脂肪酸，维生素D，和/或类花生酸类物质的。

（ⅳ）抗炎药，例如阿司匹林，布洛芬，萘普生，水杨酸，颌下腺肽-T，苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸（FEG），姜，姜黄，倍半萜内酯，ω-3脂肪酸，前列腺素-E，前列腺素-E3，姜黄素，美沙拉嗪，选择性糖皮质激素受体激动剂，Lisofylline，Mofezolac，Oleocanthal，异丁普生，环戊烯酮前列腺素，大麻二酚，BMS-345541，BMS-470，539，Amiexanox，Amixetrine，大蒜素，Actarit.Butylpyrazolidines，例如保泰松；Mofebutazone；羟基保泰松；氯非宗；Kebuzone；Suxibuzone；，乙酸衍生物和相关的物质，如吲哚美辛；舒林酸；托美丁；佐美酸；双氯芬酸；阿氯芬酸；布马地宗；依托度酸；氯那唑酸；芬替酸；阿西美辛；Difenpiramide；奥沙；丙谷；酮咯酸；醋氯芬酸；丁苯羟酸；吲哚美辛，双氯芬酸，昔康类，如吡罗昔康；替诺昔康；屈恶昔康，氯诺昔康；美洛昔康；丙酸衍生物，如布洛芬，萘普生，酮洛芬；非诺洛芬；芬布芬；苯恶洛芬；舒洛芬；吡洛芬；氟比洛芬；吲哚洛芬；噻洛芬酸，奥沙普秦，丁普生，右旋布洛芬；Flunoxaprofen，阿明洛芬，右旋酮洛芬；Naproxcinod，萘普生和埃索美拉唑，萘普生和米索前列醇；Vedaprofen；卡洛芬；替泊沙林。芬那酸类，例如甲芬那酸；托芬那酸；氟芬那酸；甲氯芬那酸；氟尼辛，昔布类，如塞来昔布；罗非昔布；伐地考昔；帕瑞昔布；依托考昔；罗美昔布；非罗考昔；Robenacoxib；Mavacoxib；Cimicoxib，其他抗炎药和抗风湿剂，如萘丁美酮，尼氟灭酸，阿扎丙，葡萄糖胺，苄达明；Glucosaminoglycan聚硫，普罗喹宗，肝蛋白，尼美舒利，非普拉宗，双醋瑞因；马尼氟酯，替尼达帕；Oxaceprol，硫酸软骨素，鳄梨和大豆油，不皂化物，尼氟灭酸，非普拉宗，组合；戊聚糖多硫酸；氨基丙腈；Anti-inflammatory/antirheumatic剂与皮质类固醇，如保泰松和皮质类固醇的组合；Dipyrocetyl和皮质类固醇；乙酰水杨酸和皮质类固醇；具体的抗风湿剂，包括喹啉，如Oxycinchophen，金制剂，如金硫丁二钠；钠aurothiosulfate；金诺芬；金硫葡糖；Aurotioprol，和/或青霉胺和类似药物，如布西拉明。

作为一般规则，菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）可以0.001到100毫克每公斤体重的剂量使用。例如，本发明的组合物的菊粉颗粒（或其它等效的抗炎成分）可以存在于0.1毫克至100.0毫克每千克体重的范围内的浓度。在另一实例中，所述组合物的菊粉颗粒（或其它等效的抗炎成分）可以施用于在一定范围内的每剂量为1到100毫克，诸如每剂量一次20mg的成年人受试者。

术语“佐剂”是指一种物质或混合物，增强对抗原的免疫应答。通常，单独用抗原的初次免疫，在没有佐剂的，将不能引起免疫应答。

术语“激动剂”是指一种蛋白质，核酸，脂质，碳水化合物或化学物质与一种细胞受体，以产生细胞应答进行交互。刺激天然免疫受体激动剂可以是本发明中特别感兴趣的。

术语“天然免疫激活剂”应被理解为是指直接或间接地激活参与天然免疫系统的功能在细胞中的任何物质。但不限于天然免疫活化可在细胞水平上被一个改变基因表达或蛋白质的生产，诱导细胞因子或趋化因子的产生或分泌，细胞形态的变化的一个或多个表现，分化，细胞分裂，改变细胞表面蛋白表达，趋化性，吞噬作用，胞吐作用，自噬或凋亡。

术语“疫苗”定义为免疫刺激治疗旨在引起的有益免疫应答针对特定抗原，无论给药预防或对已存在的病症的治疗。

术语“免疫原性”是指抗原引发免疫反应，包括任何体液和/或细胞介导免疫的能力。

如在相对于抗原或天然性免疫激活剂本文所使用的术语“免疫学有效量”是指抗原或天然性免疫激活剂足以引发免疫应答通过已知的本领域技术人员在标准测定法测得的量。抗原作为免疫原的效力，既可以通过测量T细胞增殖或细胞因子分泌测定法，由细胞毒性测定法，如铬释放测定法来测量T细胞的裂解其特异性靶细胞的能力，或通过通过测量循环抗体的水平特异性的血清中的抗原，或者通过测量抗体斑点形成的B细胞的数量测量的B细胞活性的水平，例如通过酶联免疫斑点。此外，保护的免疫应答的水平可以通过挑战与含有已免疫接种的抗原的复制病毒，病原体或细胞的免疫宿主来测量。例如，如果向其中免疫应答所需的抗原是病毒或肿瘤细胞，保护诱导抗原的“免疫原性有效量”的电平是由病毒或肿瘤细胞攻击后检测的存活水平测量的动物。可替代地，保护也可以测量作为以下的动物挑战在病毒复制或肿瘤生长的减少。必要的是提供一种具有免疫原性的抗原的量可容易地由普通技术人员所确定的领域中，例如，通过制备一系列本发明的疫苗与不同浓度的抗原，施用的疫苗制剂，以合适的实验室动物（如小鼠，大鼠，豚鼠，或兔），并测定通过测定血清或粘膜抗体滴度的产生免疫反应，抗原诱导的皮肤（迟发型超敏感性试验）肿胀，T-细胞增殖，细胞因子产生或细胞毒活性，防止病原体挑战等。

术语“肠胃外”是指通过本领域中公认的常规方法和给药装置注射疫苗进入人体的任何组织，包括肌肉内，皮下，皮内，腹膜内和疫苗给药的眼内途径。

在本发明的各方面的重要实施方案中，受试者是人。在其它实施例中，受试者选自动物，狗，猫，马，骆驼，牛，猪，绵羊，山羊，鸡，隼，兔和鱼的组中选择。术语“动物”包括所有的家畜和野生哺乳动物，鱼类，家禽，包括但不限于牛，马，猪，绵羊，山羊，骆驼，狗，猫，兔，鹿，貂，鸡，鸭，鹅，火鸡，母鸡，等等。

在一个实施例中，作为附加组分，本发明的组合物还可任选地包含一种化学物质的激活一种或多种类型的天然免疫细胞，如单核细胞，树突状细胞，NK细胞，淋巴细胞的免疫学有效量。如本领域已知的，化学诱导激活天然免疫细胞的实例包括白三烯，前列腺素，细胞因子，趋化因子，干扰素，激肽，维生素D，佛波醇肉豆蔻醋酸酯，离子霉素，促细胞分裂剂，调理素，组胺，缓激肽，血清素，白三烯，环磷酸腺苷，抗菌肽，和前药或上述物质的诱导剂。

在一个重要的实施方案中，本发明的PAMP天然免疫激活剂是可以结合天然免疫受体的免疫学有效量物质。目前已知的天然性免疫受体包括TLR-1，TLR-2，TLR-3，TLR-4，TLR-5，TLR-6，TLR-7，TLR-8，TLR-9，小鼠TLR-11；NOD-1，NOD-2，其它的NOD样受体（最接近现代种）如NLRP1，NLRP3，NLRP12，NLRC4；树状细胞凝集素-1，DC-SIGN，AIM-2，甘露糖受体，包括C-型凝集素，MD2，CD14，LBP；卡（胱天蛋白酶活化和募集结构域）的含蛋白质，例如RIG-1（视黄酸可诱导的基因-1）和MDA-5（黑素瘤分化相关基因5），LGP2和ASC，清道夫受体包括CD-36，CD-68和SRB-1，C反应蛋白，甘露糖结合凝集素，补体因子包括C3a和C4b的和补体受体，和N-甲酰基蛋氨酸受体包括FPR和FPRL1的。对于本发明特别感兴趣的是结合并激活TLR-1，-2，-3，-5，-6，-7和-9和NOD样受体的PAMP。更优选的是TLR3，TLR9和NOD2受体激动剂。最优选的是TLR9激动剂。

在一个重要的本发明实施例中，一个或一个以上的PAMP（病原相关的分子模式）的免疫学有效量被使用。PAMP是自病原体衍生的结构保守的分子，区别于宿主自身分子，并且识别并特异性结合天然免疫受体。PAMP是存在于某些蛋白，脂类，脂蛋白，碳水化合物，糖脂，糖蛋白，并通过特定的病原体表达的，并且包括TLR2激动剂，包括二-和三-酰基脂肽，脂磷壁酸，酵母多糖，肽聚糖，孔蛋白，脂阿拉伯甘露聚糖，Phospholipomannan核酸在寄生虫Glucuronoxylomannan，糖基（GPI）锚定蛋白，TLR3激动剂，包括双链RNA，包括合成的dsRNA例如聚肌苷：聚胞苷酸（聚升：C），Toll样受体激动剂，包括甘露聚糖，glucuronoxylomannan，热休克蛋白，纤维蛋白原和合成MPL，TLR5激动剂，包括鞭毛蛋白，TLR6激动剂，包括脂磷壁酸，TLR7和TLR8激动剂，包括病毒的或合成的单链（ss）RNA，例如咪喹莫特和瑞喹莫德（R848），和TLR9激动剂，包括未甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的寡核苷酸序列（CpG寡核苷酸）和疟原虫色素，RIG-1激动剂，如病毒或合成的双链（DS）的RNA，MDA5激动剂如病毒或合成的双链DNA，NOD1激动剂，包括含有胞壁酰二肽NAG-NAM-γ肽聚糖-D-谷氨酰-内消旋二氨基庚二酸，NOD2激动剂包括含有胞壁酰二肽NAG-NAM-L-丙氨酰-异谷氨酰胺，RIG1和MDA5激动剂包括单链RNA和双链RNA，N-甲酰甲硫氨酸受体激动剂，包括N-甲酰蛋氨酸的肽聚糖。因此，如使用通过本发明一个PAMP天然免疫激活剂可以由任何激动剂或合成的类似物或衍生物的上述基团中选择。

在一个重要的包括本发明各方面实施例中，该物质包含或由一种或多种病原体相关分子模式（PAMP）构成，免疫学有效量和/或浓度在0.01到500微克每公斤体重范围内。

在一个重要的本发明的各方面实施例中，每种物质包含或由一种病原体相关分子模式（PAMP）的存在，或给药时，作为一个纯粹的，独特的，单分子和化学实体。

在一个本发明的各方面实施例中，该物质包含或由一种病原体相关分子模式（PAMP）的可能在或给药时以高度纯化的状态存在，由此每个不同和单分子和化学PAMP实体是在至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.9％，99.99％，99.999％，实质上100％的纯度。

在一个重要的实施方案中，本发明的PAMP为TLR激动剂。目前认为有大约10-15种不同的TLR存在于大多数哺乳动物物种中。不同的TLR结合并通过一系列天然和合成的配体激活。不同的TLRs通过不同的信号分子的信号，尽管在一个共同的特点是，它们都激活炎症转录因子NFkB。

在一个实施方案中，本发明的PAMP是TLR1受体激动剂，如TLR1受体激动剂选自一个三酰基脂肽和PAM3CSK4的绘制。最优选的是PAM3CSK4。

在一个实施方案中，本发明的PAMP是TLR2激动剂，如TLR2激动剂选自糖脂，脂磷壁酸，肽聚糖，HSP70，酵母聚糖，并PAM3CSK4的绘制。

在一个实施方案中，本发明的PAMP是TLR3激动剂，例如TLR3激动剂选自双链的RNA，聚绘制（升：C），聚（I：C-LC）（Hiltonol^TM）和聚L：polyC12U（的Ampligen^TM）。最优选的是聚（I：C）。

在另一个实施方案中，本发明的PAMP是TLR4激动剂，如Toll样受体4激动剂选自单磷酰脂A（MPLA），热休克蛋白，纤维蛋白原，硫酸乙酰肝素片段，透明质酸片段，以及合成的Toll样受体4激动剂的绘制包括E6020，GLA和毒素肽模拟表位。最优选的是合成的Toll样受体4激动剂，通过TIR-结构域的适配器诱导干扰素-β（TRIF）信号通路。由于毒性和法规要求，脂多糖（LPS），Toll样受体激动剂和含有LPS（如内毒素）的物质，应避免在本发明中。在本发明的各方面中使用的物质和组合物中的LPS和/或内毒素的量可以是每剂量小于100EU，诸如每剂小于90，80，70，60，50，40，30，20，10，5，4，3，2，1或更低。在本发明的各方面中使用的物质和组合物中的LPS和/或内毒素的浓度可以小于200EU/立方米，诸如小于150，100，90，80，70，60，50，40，30，20，10，5，4，3，2，1或更少。

在另一个实施方案中，本发明的PAMP是TLR5激动剂，如TLR5激动剂选自细菌或合成的鞭毛蛋白绘制。最优选的是合成的鞭毛蛋白。

在另一个实施方案中，本发明的PAMP是TLR6激动剂，如TLR6激动剂选自二酰基脂肽的绘制。最优选的是二酰基脂肽。

在另一个实施方案中，本发明的PAMP是TLR7激动剂，诸如TLR7激动剂选自病毒单链RNA，咪唑并喹啉，嘎德莫特，洛索立宾，溴匹立明，CL264，R848，和CL075绘制。最优选的是R848。

在另一个实施方案中，本发明的PAMP是TLR8的激动剂，诸如TLR8激动剂选自单链RNA，多聚U，咪喹莫特，瑞喹莫德，ssPolyU/LyoVec和ssRNA40/LyoVec。

在一个重要的优选实施方案中，本发明的PAMP是TLR9激动剂。更优选地，TLR9激动剂是CpG寡核苷酸。术语“CpG”或“CpG寡核苷酸分子”，如本文所用，应理解为是指一个寡核苷酸分子，包含一个基序，其中胞嘧啶核苷后面是鸟嘌呤核苷，通过以正常的方式观察的磷酸盐分子相连在多核苷酸序列（即“CpG基序），其中所述胞嘧啶核苷是未甲基化的。CpG基序是普遍存在于细菌和病毒的基因组，但罕见于脊椎动物基因组中。另外，CpG基序通常是未甲基化的原核有机体，而在真核生物，DNA甲基转移酶甲基化通常在CpG基序存在的70-80％，它也指一种合成的寡核苷酸分子，其含有至少一个未甲基化的CpG基序。通常情况下，有多于一个的CpG基序的存在。有多种CpG寡核苷酸分子可以购买。它们通常在18-24个核苷酸长度之间，但是本领域技术人员认为，其它长度的CpG寡核苷酸分子也可能适用。CpG的寡核苷酸分子可包括围绕所述至少一个CpG基序，因为不同的各种核苷酸序列显示出刺激TLR9的程度不同。B类ODN是人B细胞和单核细胞的成熟的强刺激剂。B类ODN还可以刺激浆细胞树突状细胞的成熟（PDC），但程度低于A类ODN，只诱导极少量的IFNa。C类ODN兼具A类和B类ODN的特点。在本发明中，优选的是B类或C类CpGODN。该领域技术人员已知，CpG骨架可从天然磷酸二酯键骨架，替换为合成的硫代磷酸酯链骨架，以增加寡核苷酸的稳定性。在本发明的一个优选实施方案中，所述CpGPAMP具有硫代磷酸酯键骨架，并且是18到28个核苷酸长。在本发明的另一个优选的实施方案中，TLR9激动剂是B类或CCpG寡核苷酸与一种合成硫代磷酸酯主链，并且是18至28个核苷酸长，在一个优选的实施方案中，PAMP选自CpG2006的绘制，CpG1826，以及最优选地，CpG7909。

在另一个实施方案中，本发明的PAMP是NOD样受体激动剂。优选地，所述激动剂是对NOD1受体是选自下组，即-DAP的酰化衍生物）（C12-IE-DAP）的绘制，D-γ-谷氨酸-MDAP（即-DAP），L-丙氨酸-γ-D-谷氨酸-MDAP（三DAP）。更优选地，所述激动剂是对NOD2受体与选自胞壁酰二肽（MDP），胞壁酰三肽，L18-MDP，M-TriDAP，莫拉丁酯，PGN-ECndi，PGN-ECndss，N-乙醇muramyldipeptide，并得出PGN-三弟。最优选的是，NOD2受体激动剂是莫拉丁酯。

在另一个实施方案中，本发明的PAMP是一种C型凝集素受体的激动剂。更优选地，该C-型凝集素受体的激动剂结合到该组的巨噬细胞甘露糖受体之一，CLEC-2，DEC205/CD205，DC-SIGN状，DC-ASGPR（MGL）/CD301，树状细胞凝集素-1，Langerin/CD207，Mincle与CLRBDCA-2/CD303。最优选的是C型凝集素受体激动剂选自β-1的绘制，3-葡聚糖，酵母聚糖，热杀死白色念珠菌，编码因数和海藻糖-6,6-二山嵛酸酯。

在另一个实施方案中，本发明的PAMP是核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族（NLR）的蛋白质，包括视黄酸可诱导的基因为基础-1样解旋酶受体家族，包括RIG-1和MDA-激动剂5。优选的包括聚（dA：dT），聚（DG：DC）和5'ppp–dsRNA。

在另一个实施方案中，本发明的PAMP是选自干扰素调节因子（DAI）的DNA感受蛋白激活剂和AIM2的激动剂。首选为聚（dA：dT）。

在另一个重要的实施方案中，本发明的PAMP是A类激动剂，表达于天然免疫细胞，其可以，例如，该组SCARA1的B或C的清道夫受体，SCARA2，SCARA3，SCARA4，SCARA5，SCARB1，SCARB2，SCARB3，MARCO，CD36，SR-B1，CD68，和LOX-1。优选的是低密度脂蛋白（LDL），氧化低密度脂蛋白，低密度脂蛋白的乙酰化或化学修饰的LDL。

在另一个实施方案中，本发明的PAMP是NLRP1或NALP3的激动剂。首选是疟原虫色素或ATP。

当前发明的选定PAMP天然免疫激活剂可加入到用于本发明的各方面，其中，“免疫学有效”剂量取决于物种，品系，年龄，体重和动物或人的性别，如本领域的技术人员所知其剂量会发生变化。

术语“免疫增强量”是指，以实现增加的免疫应答所需的免疫学制剂的量，可由本领域技术人员通过标准测定法测定。如可以理解的，含有菊粉颗粒（或其它等效的抗炎成分）各免疫制剂可具有可不同，依赖于PAMP天然免疫激活剂和特定的菊粉的多晶型（或其它等效的抗炎成分）中使用的有效剂量范围。因此，单一的剂量范围很难精确适用于不同菊粉颗粒（或其它等效的抗炎成分）与PAMP天然免疫激活剂的组合。然而，免疫增强量可以容易地由本领域的普通技术人员确定。免疫激活的效力可以被测量的一种免疫细胞增殖测定或测定法测量的变化的细胞表面活化标记的表达水平，例如，通过流式细胞仪或荧光显微镜，或细胞毒性测定法，或通过测量分泌细胞因子或趋化因子或由活化的免疫细胞所分泌的其他物质，或者通过实时定量聚合酶链反应或基因表达阵列测定中的免疫细胞的基因表达的激活引起的变化，例如。必要的是提供一种免疫学上有效量的免疫学制剂的各组分的量可容易地由本领域中普通技术人员确定的，方法是通过制备一系列本发明的免疫制剂具有不同的PAMP天然免疫激活剂浓度和菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分），然后加入这些制剂对免疫细胞的培养物并测定免疫细胞活化。同样地，需要提供增强对疫苗抗原的免疫反应的各成分的量可以容易地由本领域中普通技术人员所确定，例如，方法是通过制备一系列本发明的免疫学制剂的不同浓度的PAMP天然免疫激活剂和菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）加疫苗抗原，并与菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）一起施用的疫苗，以合适的实验动物（例如，小鼠或豚鼠），然测定抗原特异性血清或粘膜抗体滴度，迟发型免疫反应（DTH），或抗原刺激的T细胞增殖或细胞因子产生。

PAMP在本发明中使用的天然免疫激活剂，可有效的任何动物，优选哺乳动物，最优选人。不同的PAMP天然免疫活化可导致最佳的免疫刺激取决于物种。因此，一个PAMP免疫激活剂，如特定CpG寡核苷酸，通过结合人TLR9提供最佳刺激在人体中可能不会导致最佳刺激的小鼠表达小鼠TLR9，或反之亦然。一个本领域的普通技术人员能够确定最佳的PAMP天然免疫激活剂对感兴趣利用本文所述或本领域中已知的常规免疫测定法的特定种类是有用的。

本发明的各方面的组合物和物质的含水部分可能被缓冲在等渗盐水中。因为该组合物和物质可用于肠胃外或粘膜给药，因此在配制时最好使用等于生理渗透压的溶液，以避免溶胀和由于离子强度差造成的快速吸收。另外最好使用合适的缓冲液以维持pH值与正常生理条件相容。例如，缓冲的pH值可适当地在4至10的范围，5到9的范围，6至8.5的范围，或7到8.5的范围。另外，在某些情况下，可能有必要将pH保持在一个特定的水平，以保证一定的组合物组分，如菊粉颗粒，PAMP或蛋白抗原制剂的稳定性。任何生理上可接受的缓冲液均可用于本发明，但已发现，最方便的是使用碳酸氢盐缓冲液（1％）维持pH在6到8.5之间。合适的防腐剂包括苯扎氯铵（0.003-0.03％重量/体积）；氯丁醇（0.3-0.9％重量/体积）；对羟基苯甲酸酯类（0.01-0.25％重量/体积）和硫柳汞（0.004-0.02％重量/体积）。

在其它方面中，本发明包括调节包括诱导或抑制非抗原特异性免疫应答的方法。在一个方面中，本发明提供了用于增强保护，防止病原体的方法，其中所述方法包括给受试者施用本发明的组合物或物质的治疗有效量。这可提供对多种病原体包括病毒，细菌，寄生虫，真菌和原生动物，用于治疗癌症，或预防或治疗的自身免疫性疾病，哮喘或过敏暂时保护。该方法包括给受试者施用在免疫学上有效量的本发明的免疫学组合物的步骤。对于更长期的保护，免疫学组合物可以施用一次以上。

在各种实施方式中，本发明的免疫学组合物用于治疗多种疾病或预防。因此，在各种实施例中，免疫学组合物以治疗或预防感染性疾病，癌症，或过敏有效量提供。因此，本文提供的方法可用于对被摄对象具有或处于发展的感染性疾病的危险，因此，该方法是用于治疗或预防感染性疾病的方法。该方法也可以用于对被摄对象具有或处于发展哮喘的风险，并且所述方法是在受试者中治疗或预防哮喘的方法。该方法也可以用于对被摄对象具有或处于发展过敏的风险，并且该方法是一种治疗或预防过敏症的方法。该方法也可以用于对被摄对象具有或处于发展癌症的风险，并且该方法是一种治疗或预防癌症的方法。

在本发明的各方面使用的组合物和物质可用于在一些实施例中，以改变针对一个共同施用的抗原免疫应答的类型或大小。因此，建议的组合物和物质可广泛用作疫苗佐剂，例如，通过将它/它们与一个或多个相关的抗原形成的预防或治疗性疫苗。因此，在一个重要的实施方案中，本发明的各方面的组合物和物质进一步包括疫苗抗原。可选地，待治疗的受试者进一步施用一种疫苗抗原在同一时间或作为的免疫学组合物中的免疫有效量的施用。该抗原可以选自一种微生物抗原，自身抗原，癌抗原，和变应原组成的组中，但它并不局限于此。在一个实施方案中，微生物抗原选自细菌抗原，病毒抗原，真菌抗原和寄生虫抗原的组中选择。在另一个实施方案中，所述抗原可以是肽抗原。在另一个实施方案中，所述抗原是由一个核酸载体编码。在另一个实施方案中，所述组合物进一步包含细胞因子，或该受试者进一步被施用的细胞因子。

术语“抗原”是指任何物质，通常是一种蛋白质或糖蛋白，脂蛋白，糖，多糖或脂多糖，其在给药后刺激特异性抗体或记忆T细胞的形成。抗原能够刺激T-淋巴细胞与受体对抗原的增殖，并能与淋巴细胞反应，以启动一系列的指定细胞介导的免疫应答。

在本发明中使用的合适的抗原包括由微生物（细菌，真菌，原生动物或病毒）或内源性物质对能够产生特异性免疫应答的物质。抗原可从失活的生物体制备的或可以通过重组蛋白的技术来产生，或直接合成。对于这个描述的目的，抗原被定义为任何蛋白质，碳水化合物，脂质，核酸，或它们的混合物，或多个这些中，向其中免疫应答是需要的。如本文所用，术语抗原亦包括半抗原与载体的组合。半抗原是抗原分子或抗原复合物，用于确定其免疫特异性的一部分，但不足以刺激免疫反应在无载体的。通常，半抗原是一个相对较小的肽或多糖，并且可以是天然存在的抗原的片段。阿半抗原将在体内和体外特异性反应与同源的抗体或T淋巴细胞。半抗原通常被连接到一个大载体分子如由任何共价或非共价的制剂之前结合作为疫苗破伤风类毒素或钥孔血蓝蛋白（KLH）。

抗原可用于疫苗中以治疗或预防的疾病。它们也可以被用于产生特异的免疫物质，如抗体，它可以在诊断试验或试剂盒中使用。一种含有抗原的疫苗的受试者通常是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。要注意的是，抗原的分子特征并不总是必要的。例如，可以在不知道任何事先或事后哪些分子的免疫应答是针对产生免疫反应的肿瘤。在这些情况下，术语抗原指的是一种或多种物质，已知的或未知的，朝向哪一个特定的免疫应答被引导。免疫反应的特异性提供了一种抗原的操作性定义，如针对一种类型的肿瘤的免疫反应，对其他肿瘤就没有特异性。

在一个重要的本发明的各方面实施方案中，所编码的抗原可以由病毒衍生的，如流感，其中灭活的流感病毒或流感血凝素，神经氨酸酶或M2蛋白或流感病毒的其它部件。其他RNA病毒在脊椎动物抗原的例子包括，但不限于以下各项：在呼肠弧病毒家族的成员，包括正呼属（哺乳动物和禽逆转录病毒的多种血清型），该环状病毒属（蓝舌病毒，Eugenangee病毒，克麦罗沃病毒，非洲马瘟病毒和科罗拉多蜱热病毒），属轮状病毒（人轮状病毒，内布拉斯加小牛腹泻病毒，鼠轮状病毒，猿猴轮状病毒，牛或羊的轮状病毒，禽轮状病毒）；小核糖核酸病毒科，包括属肠病毒（脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A和B，肠细胞病变人孤儿（ECHO）病毒，甲型肝炎病毒，肠道病毒猴，鼠脑脊髓炎（ME）的病毒，脊髓灰质炎病毒穆里，牛肠，猪肠道病毒，属Cardiovirus（脑心肌炎病毒（EMC），Mengovirus），属鼻病毒，属Apthovirus（手足口病；家庭Calciviridae，包括猪流感病毒的水疱疹，圣米格尔海狮病毒，猫小核糖核酸病毒和诺瓦克病毒，披膜病毒科甲，包括属甲病毒（东方马脑炎病毒，塞姆利基森林病毒，辛德毕斯病毒，基孔肯雅病毒，O'Nyong-倪翁病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒），属Flavirius（蚊子传播的黄热病病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易斯脑炎病毒，墨累谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库京病毒，中欧蜱传播的病毒，远东蜱传播的病毒，科萨努尔森林病毒，羊跳跃三世病毒，波瓦生病毒，鄂木斯克出血热病毒），属风疹病毒（风疹病毒），瘟病毒属（粘膜病病毒，猪瘟病毒，边界病病毒）；布尼亚病毒科，包括属Bunyvirus（Bunyamwera和相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒组），属白蛉（白蛉热西西里病毒，裂谷热病毒），属Nairovirus（克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕绵羊病病毒），和属Uukuvirus（Uukuniemi和相关病毒）；正粘病毒科，包括属流感病毒（A型流感病毒，许多人亚型）；猪流感病毒，以及禽和马流感病毒；B型流感（许多人亚型），以及流感C型（可以独立的属）；家族副粘病毒科，包括副粘病毒属（副流感病毒1型，仙台病毒，血细胞吸附病毒，副流感病毒类型2至5，新城疫病毒，流行性腮腺炎病毒），属麻疹病毒属（麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，犬瘟热病毒，牛瘟病毒），属肺病毒（呼吸道合胞病毒（RSV），牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒）；森林病毒，辛德毕斯病毒，基孔肯雅病毒，O'Nyong-倪翁病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒），属Flavirius（蚊子传播的黄热病病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易斯脑炎病毒，墨累谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库京病毒，中欧蜱传播的病毒，远东蜱传播的病毒，科萨努尔森林病毒，羊跳跃三，病毒，波瓦生病毒，鄂木斯克出血热病毒），属风疹病毒（风疹病毒），瘟病毒属（粘膜病病毒，猪瘟病毒，边界病病毒）；布尼亚病毒科，包括属Bunyvirus（Bunyamwera和相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒组），属白蛉（白蛉热西西里病毒，裂谷热病毒），属Nairovirus（克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕绵羊病病毒），并属Uukuvirus（Uukuniemi及相关病毒）；正粘病毒科，包括流感病毒（A型流感病毒，许多人亚型）；猪流感病毒，以及禽和马流感病毒；B型流感（许多人亚型），以及流感C型（可以独立的属）；家族副粘病毒科，包括副粘病毒属（副流感病毒1型，仙台病毒，血细胞吸附病毒，副流感病毒类型2至5，新城疫病毒，流行性腮腺炎病毒），属麻疹病毒属（麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，犬瘟热病毒，牛瘟病毒），属肺病毒（呼吸道合胞病毒（RSV），牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒）；家庭弹状病毒，包括水泡性病毒属（VSV），金迪普拉病毒，芒-哈特公园病毒），狂犬病病毒属（狂犬病病毒），鱼弹状病毒，和两个可能的弹状病毒（马尔堡病毒和埃博拉病毒）；的沙粒病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCM），塔卡里伯病毒复杂，拉沙病毒；家庭Coronoaviridae，包括传染性支气管炎病毒（IBV），小鼠肝炎病毒，人肠道冠状病毒，与猫传染性腹膜炎（猫冠状病毒）。

脊椎动物典型的DNA病毒的抗原包括，但不限于：家庭痘病毒科，包括正痘属（天花主要，次要天花，猴痘牛痘，牛痘，Buffalopox，Rabbitpox，鼠痘），属Leporipoxvirus（粘液瘤，纤维瘤），属Avipoxvirus（鸡痘，其它禽痘病毒），属羊痘病毒（sheeppox，山羊痘），属Suipoxvirus（猪痘），属副痘病毒（传染性postular皮炎病毒，pseudocowpox，牛丘疹性口炎病毒），家庭虹彩病毒科（非洲猪瘟病毒，蛙病毒2和3，淋巴鱼类的病毒）；家族疱疹病毒，包括α-疱疹病毒（单纯疱疹病毒1型和2，水痘-带状疱疹，马流产病毒，马疱疹病毒2和3中，伪狂犬病病毒，牛传染性角膜结膜炎病毒，牛传染性鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒），β-herpesvirises（人巨细胞病毒以及猪，猴和啮齿动物巨细胞病毒），而γ-疱疹病毒（Epstein-Barr病毒（EBV），马立克氏病病毒，疱疹松鼠，疱疹病毒ateles，疱疹病毒sylvilagus，豚鼠疱疹病毒，乐其肿瘤病毒）；家庭腺病毒科，包括属Mastadenovirus（人亚组A，B，C，D，E和不分组；猴腺病毒（至少有23个血清型），犬传染性肝炎，和牛腺病毒，猪，羊，青蛙和其他许多物种，属Aviadenovirus（禽腺病毒）和非养殖的腺病毒；家庭Papoviridae，包括属乳头状瘤病毒（人类乳头状瘤病毒，牛乳头状瘤病毒，舒普兔乳头状瘤病毒，以及不同的致病性乳头状瘤其他种类的病毒），属多瘤病毒（多瘤病毒，猴空泡剂（SV-40），兔空泡剂（RKV），K病毒，BK病毒，JC病毒，和其他灵长类动物多瘤病毒，如淋巴性乳头状瘤病毒），而细小病毒科家族包括属腺相关病毒，属细小病毒（猫泛白细胞减少症病毒，牛细小病毒，犬细小病毒，阿留申水貂病病毒等）。DNA病毒还包括库鲁病和克-雅病病毒和慢性感染性神经性剂（中国病毒）。

上述列举是说明性的，并不旨在进行限制。

适用于本发明的抗原的其它实例包括，但不限于，其中的保护性免疫应答可能是期望包括人类的免疫原性病毒（HIV）抗原的gag，env，pol，tat，rev，nef，或逆转录酶和其他HIV组件或其一部分；人类乳头状瘤病毒的E6和E7蛋白；单纯疱疹病毒的疱疹的抗原EBNA1；肝炎病毒抗原，如乙型肝炎病毒的S，M和L蛋白以及pre-S抗原，和其他肝炎病毒成分，如丙型肝炎病毒RNA；流感病毒抗原如血凝素，神经氨酸酶，核蛋白，M2和其他流感病毒成分；麻疹，如麻疹病毒融合蛋白和其它麻疹病毒成分；风疹病毒抗原，例如蛋白E1和E2以及其他风疹病毒成分；轮状病毒抗原，例如VP7sc和其它轮状病毒部件；巨细胞病毒抗原，例如包膜糖蛋白B和其他巨细胞病毒抗原成分；呼吸道合胞病毒抗原，如呼吸道合胞病毒融合蛋白，M2蛋白和其他呼吸道合胞病毒抗原成分；单纯疱疹病毒抗原，例如立即早期蛋白质，糖蛋白D和其他单纯疱疹病毒抗原成分；水痘带状疱疹病毒抗原如GPL，GPLL和其它水痘带状疱疹病毒抗原成分；日本脑炎病毒抗原，如蛋白质E，ME，ME-NS1，NS1，NS-1-NS2A；狂犬病病毒抗原，例如狂犬病病毒糖蛋白，狂犬病核蛋白和其他狂犬病病毒抗原成分；西尼罗河病毒的prM和E蛋白；和埃博拉病毒包膜蛋白。参见基础病毒学，第二版，（LippincottWilliams和Wilkins，纽约，2001年）对病毒抗原的其它示例。此外，细菌抗原也被公开。细菌抗原可在本发明的组合物和方法可用于包括，但不限于，百日咳菌抗原，例如百日咳毒素，丝状血凝素，百日咳杆菌粘附素，FIM2，FIM3，腺苷酸环化酶和其他百日咳细菌抗原成分；白喉细菌抗原如白喉毒素或类毒素以及其他白喉细菌抗原成分；破伤风细菌抗原，例如破伤风毒素或类毒素以及其他破伤风细菌抗原成分；链球菌细菌抗原，例如M蛋白和其他链球菌细菌抗原成分；金黄色葡萄球菌的细菌抗原，例如ISDA，ISDB，SDRD，并SDRE；革兰氏阴性杆菌细菌抗原，例如脂多糖，鞭毛蛋白，以及其他革兰氏阴性细菌抗原成分；结核分枝杆菌的细菌抗原，例如霉菌酸，热休克蛋白65（HSP65）的30kDa的主要分泌蛋白，抗原85A，ESAT-6和其他分枝杆菌抗原成分；幽门螺杆菌细菌抗原成分；肺炎球菌细菌抗原，例如肺炎球菌，肺炎球菌荚膜多糖和其他肺炎球菌细菌抗原成分；流感嗜血杆菌细菌抗原，例如荚膜多糖以及其他嗜血杆菌流感细菌抗原成分；炭疽热细菌抗原，例如炭疽保护性抗原，炭疽致死因子，和其它的炭疽细菌抗原成分；由鼠疫耶尔森氏菌的F1和V蛋白；立克次体细菌抗原，例如家伙们和其他立克次体细菌抗原成分。还包括与这里所描述的细菌抗原是任何其它细菌，分枝杆菌，支原体，立克次氏体，衣原体或抗原。原生动物和其他寄生虫抗原的例子包括，但不限于恶性疟原虫抗原，例如裂殖子表面抗原，子孢子表面抗原，环子抗原，配子母细胞/配子表面抗原，血液阶段抗原粉煤155/RESA和其它疟原虫抗原部件；弓形虫抗原如SAG-1，P30和其它弓形虫抗原成分；schistosomae抗原，例如谷胱甘肽-S-转移酶，副肌球蛋白，以及其它血吸虫抗原成分；硕大利什曼原虫和其他leishmaniae抗原如GP63，脂磷聚糖及其相关蛋白和其它利什曼原虫抗原成分；和克氏锥虫抗原，例如在75-77kDa的抗原，在56kDa的抗原和其他锥虫抗原成分。真菌抗原的实例包括，但不限于，从念珠菌属，曲霉菌属，芽生菌属种，组织胞浆菌属种，球孢子菌病物种，糠秕马拉色菌和其他物种，外瓶霉werneckii和其他物种，Piedraiahortai和其他物种，白吉尔毛孢子菌和抗原其他物种，小孢子种，种毛癣菌，表皮种，申克孢子丝等品种，Fonsecaeapedrosoi等品种，Wangiella皮炎等品种，Pseudallescheria鲍氏等品种，Madurella菌和其他物种，根霉，犁头霉属的物种，和毛霉种。朊病毒疾病的抗原例子包括朊病毒，β-淀粉样蛋白，和其他朊病毒相关蛋白。

除了使用本发明的各方面的组合物和物质诱发的人类抗原特异性免疫应答，优选的实施例的方法是特别适合用于治疗马和其它动物。本发明的方法可以用于防止感染的家畜，包括牛，骆驼，马，猪，绵羊和山羊。马很容易受到黄病毒，包括日本脑炎，西尼罗河病毒。在一个优选的实施方案中，本发明的免疫学组合物可以连同灭活日本脑炎病毒抗原施用于马，以保护它们免受日本脑炎和相关的黄病毒感染。

除了上面提到的传染病和寄生虫剂，另一个区域为期望的增强的免疫原性的非传染性病原体是在癌症的领域，以其将达的癌抗原的癌细胞从体内清除。如本文中使用的“癌抗原”是一种化合物，如肽或蛋白质中，存在于一个肿瘤或癌细胞和其能够当在抗原呈递细胞的表面上的MHC分子表达时引起的免疫应答。癌抗原可以从癌细胞制备或通过制备癌细胞的粗提取物，例如，如Cohen等人所述（CancerResearch，1994，54:1055），通过部分纯化该抗原，通过重组技术，或通过从头合成已知的抗原。癌抗原包括但不限于被重组表达抗原的免疫原性部分或全部肿瘤或癌症。这些抗原可以通过重组DNA表达的技术或通过本领域中已知的其他手段进行分离或制备。在一个实施方案中，所述癌症选自下述组中：胆管癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；结缔组织癌；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；胃癌症；何杰金氏淋巴瘤；上皮内肿瘤；喉癌；淋巴瘤；肝癌；肺癌（例如小细胞和非小细胞）；黑素瘤；神经母细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰脏癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤；皮肤癌；睾丸癌；甲状腺癌；和肾癌。癌抗原可在本发明的组合物和方法可用于包括，但不限于，前列腺特异性抗原（PSA），乳腺癌，卵巢癌，睾丸癌，黑素瘤，端粒酶；多药耐药蛋白如P-糖蛋白；MAGE-1，甲胎蛋白，癌胚抗原，突变的p53，乳头状瘤病毒抗原，神经节苷脂或黑素瘤或其他癌细胞的其它含碳水化合物的组件。可以设想通过从任何类型的肿瘤细胞的抗原可以在本文所述的组合物和方法可用于本发明。该抗原可以是肿瘤细胞，或从肿瘤细胞中分离免疫原性的材料，如膜蛋白。包括的是细胞存活和端粒酶通用抗原和睾丸癌抗原MAGE的家族。

在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物和方法包括参与自身免疫的抗原可用于诱导免疫耐受。这样的抗原包括，但不限于，髓鞘碱性蛋白，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白和多发性硬化的蛋白脂质蛋白，类风湿关节炎，谷氨酸脱羧酶，胰岛素和1型糖尿病的酪氨酸磷酸酶蛋白的CI予胶原蛋白，醇溶蛋白。

在另一个优选实施方案中，组合物，物质和本发明的各方面的方法可用于与被称为参与变态反应诱导耐受性和抑制变应原特异性IgE的“变应原”抗原。一个“过敏原”是可以诱导易感受试者过敏或哮喘反应的任何物质。过敏原包括花粉，昆虫毒液，动物皮屑灰尘，真菌孢子和药物（如青霉素）。自然，动物和植物变应原的实例包括但不限于以下种属特异的蛋白质：犬（家犬）；Dermatophagoides（例如粉尘螨）；猫属（猫属domesticus），豚草（豚草artemiisfolia；黑麦草属（如黑麦草还是多花黑麦草），柳杉（柳杉），链格孢（链格孢），桤木，桤木（Alnusgultinoasa）；桦（疣状桦）；栎（栎阿尔巴）；油橄榄（木犀EUROPA）；蒿（艾）；车前子（如车前子杉木）；墙草（如墙草巴戟或Parietaria犹太）；蠊（如德国小蠊），蜜蜂（如蜜蜂何首乌），柏木（例如柏杉，柏arizonica和大果柏），刺柏（如刺柏sabinoides，刺柏virginiana，刺柏群落和兔眼蓝莓刺柏）；Thuya（如Thuya侧柏），红桧（如扁柏）；大蠊（如美洲大蠊），冰草（如偃麦草），黑麦（如黑麦），小麦（如小麦）；鸭（如鸭茅），高羊茅（如高羊丽格），早熟禾（如草地早熟禾或早熟扁穗牛鞭草），燕麦（如燕麦）；Holcus（如Holcus西瓜）；黄花（如黄花玉竹）；Arrhenatherum（如PArrhenatherumelatius），剪股颖（如翦股阿尔巴），梯牧草（如猫尾草）；法拉里斯（如草芦）；雀稗（如百喜草），高粱（高粱如halepensis）；和雀麦（如无芒雀麦），最优选的本发明是一种昆虫毒液过敏原。

在另一个优选实施方案中，组合物，物质和本发明的各方面的方法可用于免疫针对参与了哮喘的抗原。这样的抗原包括但不限于IgE和组胺。

如本文所用，术语“治疗”包括针对一种鸟，鱼或哺乳动物，特别是人类，并且包括任何疾病的治疗：

（i）防止疾病在可能易患但尚未诊断为患有受试者中发生；

（ii）抑制该疾病，即，减缓或阻止其发展；或

（iii）缓解疾病，即引起疾病消退。（应当注意的是，疫苗接种可能加快疾病消退，其中该疾病会因受试者的免疫系统不能有效识别抗原而持续，但免疫后则可以有效的呈递抗原。）

术语“任选地”是指随后描述的事件或情形可能会或可能不会发生，并且该描述包括其中所述事件或情况发生和它不发生的实例。

术语“调节免疫应答”应被理解为任何诱发的变化中的免疫细胞，它可由本领域的普通技术人员通过已知方式进行测量。优选地，来表示免疫细胞的行为或功能的改变的参数可来自以下方面：基因表达的变化，蛋白质的表达，细胞形态，分化，细胞分裂，细胞表面蛋白的表达，趋化，吞噬作用的选择胞吐作用，吞噬，趋化因子的分泌，细胞因子的分泌和细胞凋亡。

在本发明的另一个实施例中，菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）与PAMP天然免疫激活剂的共同施用允许剂量节约的PAMP的天然免疫激活剂。因此，在一个菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）的存在下，一PAMP天然免疫激活剂的较低剂量，可用于获得免疫激活的相同的水平。考虑到不同菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）和PAMP天然免疫激活剂的不同效应，菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）的剂量节约效应允许的PAMP免疫激活剂的较低剂量，以可用于实现期望的免疫应答或佐剂作用，从而提供了一种手段，以减少任何剂量相关的副作用或毒性，同时仍然实现所需的免疫结果。考虑到PAMP剂量相关毒性激活天然免疫和炎症是PAMP天然免疫激活剂的主要剂量限制性副作用，本发明提供了一种新颖的组合，以减少PAMP天然免疫激活剂的剂量相关的副作用。

本发明的各方面的组合物和物质可以任选地被以其单独组分同时或顺序地施用，但优选的是菊粉颗粒组分（或其它等效的抗发炎成分）与抗原同时施用或者先于抗原单独施用。当该组合物或本发明的各方面的物质的成分同时施用时，它们可以存在于相同或不同的制剂中，而在后一种情况下，在相同的或单独的注射位点，并在同一时间与疫苗抗原共同施用。PAMP的天然免疫激活剂组分可以连同抗原成分在菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）施用之前、之后或同时给药。抗原的加强剂量，随后可以与PAMP天然免疫激活剂和菊粉颗粒组分（或其它等效的抗炎成分）的任一个或两个共同施用。“初次免疫”是对受试者给药的首次剂量。“增强免疫”是第二，第三或随后的剂量的抗原施用给是已经免疫的受试者。其中各组分按顺序给药时，各组分的施用之间的时间间隔可以是几分钟之内，或者更长。在时间上的间隔，优选少于7天，3天，2天，最优选少于1天。

本发明的各方面的组合物或物质可用于增强在与使用DNA疫苗的关联的疫苗应答。在一个优选实施例中，用蛋白质或其它物理抗原的本发明的各方面的组合物或物质作为增强免疫，在初次免疫的DNA疫苗之后施用。在另一实施方案中，所述组合物或本发明的各方面的物质在同一时间与DNA疫苗及一种或多种抗原在不同的注射部位或混合在一起，并施用在同一注射位点。

在有或没有另外一个物理抗原的本发明的各方面的组合物或物质也可以用编码抗原的载体一起给药。在其最广泛的意义上，“载体”是能够促进由一个编码的或封闭的抗原的感染细胞的转移和表达的任何携带体。在一般情况下，该载体可用于本发明包括，但不限于，质粒，噬菌体，病毒，和从已经被操纵的抗原的核酸序列的插入或掺入病毒或细菌来源的其他载体。病毒载体是载体的优选类型，并且包括但不限于，来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒，哈维鼠肉瘤病毒，小鼠乳腺肿瘤病毒，和劳斯肉瘤病毒；腺病毒，腺相关病毒；SV40-型病毒；多瘤病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒；乳头状瘤病毒，疱疹病毒，牛痘病毒，脊髓灰质炎病毒，逆转录病毒，慢病毒和仙台病毒。本领域中已知如何容易地使用其它载体以类似的方式，向细胞中导入抗原。参见Sanbrook等，“分子克隆实验指南”（第二版，冷泉港实验室出版社，1989）。

本发明的各方面的组合物中的物质的制剂的一个或多个可以包括抗原结合的载体物质或变应原结合的载体材料。抗原结合载体物质或变应原结合的载体材料可包括，例如，一种或多种金属盐，例如那些选自由氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝，磷酸钙，硫酸钙，铁和磷酸铁组成的组中的，铁和硫酸铁，磷酸铬和铬的硫酸盐。其它合适的抗原结合的载体材料和变应原结合的载体的材料包括蛋白质，脂质和碳水化合物（例如，肝素，葡聚糖和纤维素衍生物），以及有机碱，如几丁质（聚N-乙酰葡糖胺）和脱乙酰化的衍生物，这些为那些本领域的普通技术人员所知。

在一个重要的实施方案中，免疫学组合物中的PAMP天然免疫激活剂是物理结合到菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）或与菊粉颗粒（或其它等效的抗炎结合的抗原结合的载体材料分量）共同施用的抗原结合载体上。在一个优选的实施方案中，PAMP天然免疫激活剂是由选自共价键，静液压和静电键组成的组中选择的键结合到菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）。另外，在PAMP天然免疫激活剂，可在空间结构上埋于菊粉颗粒（或其他等效的抗炎成分）中。在进一步的实施方案中，可通过接头序列连接PAMP天然免疫激活剂和菊粉颗粒（或其它等效的抗炎成分）。

此外，在本发明的该方面的组合物或物质，包括抗原结合材料，优选菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）被结合或结合到抗原结合的载体材料。菊粉颗粒与抗原结合的载体物质的共晶体可以通过以下方式制备，例如，一种方法包括：

（a）制备的菊粉颗粒的悬浮液；

（b）加热暂停，直到菊粉颗粒溶解；

（c）加入到所述溶液中一定量的抗原结合的载体材料；

（d）从所述悬浮液重结晶析出的菊粉颗粒；和

（e）分离含有菊粉颗粒和一种或多种抗原结合的载体材料形成的颗粒

作为这项工作的一个进一步发展，菊粉颗粒可以配制与抗原结合的载体物质，特别是氢氧化铝或磷酸铝（统称为“明矾”）的凝胶。明矾凝胶已被广泛地用作佐剂的疫苗，其特征在于它是已知的诱导强的抗体（Th2细胞）的免疫应答，但只有弱的细胞（Th1细胞）的免疫应答。因此，已经发现可以形成的gIN，dIN或eIN或连同铝盐的共结晶颗粒（例如氢氧化氧化铝或磷酸铝），以分别形成一个dIN/明矾制剂（也称为“Algammulin”）（参见WO90/01949，WO2006/024100），dIN/明矾制剂（也称为“Aldeltin”）或eIN/明矾氢氧化制剂（也称为“Alepsilin”）。而体内研究已经表明，含有菊粉颗粒和铝盐的复合物疫苗的耐受性良好，其增加针对共同给药抗原的抗体反应与菊粉颗粒或单独的明矾佐剂相比更高，但仍温和，而且两者没有协同作用，只显示出了叠加效应。与单独施用明矾佐剂类似，菊粉颗粒与明矾的组合物仍倾向激活Th2细胞，而不是Th1反应。这对需要诱导Th1免疫反应的疫苗可能是不理想的。特别地，不希望被理论所限制，倾向增强Th1免疫反应的佐剂通常抑制Th2应答。反之亦然，通过涉及因素，如Th1型细胞因子IFN-γ，通过复杂的反馈通路抑制Th2应答，而Th2细胞因子，IL-4和IL-10，会抑制Th1应答。朝向Th2应答的偏向可能是不可取的，如果它意味着更少的Th1应答，反之亦然。在本发明的一个实施方案中，已经发现，菊粉颗粒与铝盐，如在Algammulin，Aldeltin或Alepsilin，或phosgammulin，phosdeltin或phosepsilin所表现的Th2免疫偏向，在与PAMP天然免疫激活剂结合施用的情况下减少或不再明显。相反地，通常在一些天然免疫激活剂中观察到的强的Th1免疫偏向，例如用TLR9激动剂时，当与菊粉颗粒联合施用时得到降低或不在明显。在菊粉颗粒的存在下，Th1和Th2免疫反应的发展平行，从而实现针对共同给予抗原在单独使用的各个组件时无法实现的优化的免疫应答。结合的抗原结合载体材料的菊粉颗粒（或其它等效的抗发炎成分）中，菊粉（或其它等效的抗发炎成分）相对抗原结合载体材料的质量比在1：20至200:1之间，如1:5至50:1，或1:2至20:1。

在另一个实施方案中，根据本发明的各方面的组合物或物质可进一步包括治疗剂并选自以下各组：抗微生物剂，抗肿瘤剂和过敏或哮喘的药物中选择，或主体进一步施用从同一组中选择的治疗剂。在一个相关实施方案中，所述抗微生物剂是选自抗细菌剂，抗病毒剂，抗真菌剂和抗寄生虫剂。

在一个相关的实施方案中，抗癌剂包括在免疫学组合物选自：化学治疗剂，癌症疫苗，以及免疫治疗剂。

在一个相关的实施方案中，过敏或哮喘的药物中包含的免疫学组合物选自PDE-4抑制剂，bronchodilator/beta-2激动剂，钾通道开放剂，VLA-4拮抗剂，NEUROKIN拮抗剂，血栓素A2合成酶抑制剂组成的组中，xanthanine，花生四烯酸拮抗剂，5脂氧合酶抑制剂，血栓素A2受体拮抗剂，血栓素A2受体拮抗剂，5-lipox活化蛋白抑制剂和蛋白酶抑制剂。

本发明的各方面的组合物或物质可被配制用于肠胃外给药，或者用于制备缓释给药系统。缓释给药系统可以是一种微粒，基质或可植入的泵，但并不局限于此。

在另一个实施方案中，本发明的各方面的组合物和物质被配制用于粘膜表面给药。在相关的实施方案中，本发明的各方面的组合物和物质的用量能有效地刺激粘膜免疫应答。粘膜表面可以选自口服，经鼻，直肠，阴道，和眼表面，但并不限于此。在一个实施例中，本发明的各方面的组合物和物质被配制用于口服给药。本发明的各方面的组合物和物质也可以配制成营养补充剂。在一个相关的实施方案中，营养补剂被配制为胶囊剂，丸剂，或舌下片剂。在另一个实施方案中，免疫学组合物被配制用于局部给药。

在受试者的治疗实施方案中，所述方法或用途可以进一步包括从受试者分离免疫细胞而与本发明中免疫学有效量各方面的物质接触，从而产生离体活化的免疫细胞，以及任选地再重新向受试者施用活化的免疫细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是单核细胞和在另一个实施方案中，免疫细胞是树突状细胞。在另一个实施方案中，所述方法或用途可以进一步包括在免疫细胞与抗原接触之前或之后加入的本发明的免疫学有效量的各方面的组合物或物质。

在另一个方面，本发明提供了一种发现免疫组合物的方法。具体地，通过比较施用待测组合物与施用本发明中各方面组分和/或物质而产生的免疫激活效应，从而可以发现新的免疫组合物。与固定剂量的本发明中各方面组分和/或物质比能够产生类似或更强免疫反应的待测组合物被认为是有效的。

免疫应答可包括免疫激活通过改变基因表达或蛋白产生如应答细胞因子或趋化因子的产生或分泌的，改变的表型，细胞增殖或存活能力或调节免疫效应细胞。免疫反应还可以包括诱导、增强和调节适应性免疫应答，表现为增强针对內源和外源抗原的抗体产生和效应T细胞和记忆T细胞反应。

在一个进一步的方面，本发明提供了一种用于调节免疫应答的方法，其中所述方法包括给受试者施用的本发明的各方面的组合物或物质的治疗有效量。

如本文所用，术语“有效量”是指无毒但足够的本发明的目的是提供所希望的效果的各个方面的组合物和物质的量。所需的确切量将随主体而这取决于各种因素，如被治疗物种，患者的年龄和受试者的一般状况，病情的严重程度，具体的组合物或本发明即本方面的物质和给药方式。因此，不可能指定确切的“有效量”。然而，对于任何给定的情况下，适当的“有效量”通常可由本领域普通技术人员来确定。

本发明进一步提供了调节应答疫苗免疫而产生的细胞因子的模式的方法。术语“调节”设想当较低水平是理想的时候可以抑制其表达，或当较高水平有利时增加其表达。一个特定的细胞因子的调节可发生局部或全身。PAMP用作疫苗佐剂的天然免疫激活剂可以直接激活巨噬细胞和树突细胞分泌细胞因子如TNF-α和IL-1。诱导的PAMP天然免疫活化的细胞因子谱决定了的免疫应答的调节T细胞和效应T细胞反应，也可能增加不良反应。在一般情况下，PAMP天然免疫激活剂诱导与炎症和发热，包括TNF和IL-1相关的细胞因子，而且还可以诱导抑制性细胞因子如IL-10，提供抑制性反馈，并且可以由此限制或抑制针对一个共同抗原的适应性免疫应答。本发明的各方面的组合物和物质是能够调节PAMP天然免疫激活剂诱导的细胞因子的产生，并由此引发更有利的免疫应答。

在其它方面中，本发明包括用于防止在受试者免疫应答中因施用抗原和PAMP天然免疫激活剂而产生的过度偏向的方法。先前已表明，PAMP天然免疫激活剂，例如CpG寡核苷酸，一个TLR9激动剂的组合，产生了Th1免疫偏向并抑制相应的Th2型反应。因此，一个令人惊讶的发现是，当菊粉颗粒结合偏向Th1的PAMP天然免疫激活剂施用时，例如CpG寡核苷酸，也能够保持较强的Th2应答，而在同一时间也诱导针对共施用抗抗原的Th1细胞免疫反应，从而产生了协同增加Th2和Th1反应，在一定程度上，在没有菊粉颗粒的成分不可能产生这一效果。

本发明的各方面的组合物和药物可配制在药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂在适合注射的形式，或适合于口服，直肠，阴道，局部，经鼻，经皮或经眼施用的形式。本发明的各方面的组合物和药物还可包含其他活性成分，例如，接种疫苗的抗原（包括重组抗原）的抗原肽序列，或免疫球蛋白。或者，活性组分可以是巨噬细胞刺激因子，多核苷酸分子（例如编码疫苗接种剂）或重组病毒载体。

疫苗和本发明的佐剂组合物的组分可以通过商业途径购买获得，或可以利用本领域的普通技术进行制备。菊粉颗粒制剂可以通过已在美国公开的方法来制备（临时专利申请号61/243975和国际专利申请PCT/AU86/00311（WO87/02679），PCT/AU89/00349（WO90/01949）及PCT/AU2005/001328（WO2006/024100）），也可从澳大利亚阿德莱德Vaxine有限公司购得。PAMP天然免疫激活剂适用于本发明的使用可从市场上获得或使用本领域熟知的方法进行制备。例如，合成的未分离三酰基化的脂蛋白，PAM3CSK4（0.25克/小鼠），热灭活李斯特菌（2.5x10e7细胞/小鼠），从耻垢分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖（0.25毫克/小鼠），从牙龈LPS-PG超纯脂多糖（2.5mg/只），由金黄色葡萄球菌（2克/只），由金黄色葡萄球菌（PGN-SA）（2微克/鼠标）肽聚糖，合成二酰基脂蛋白（0.25微克/鼠标）标准的脂磷壁酸（LTA-SA），酵母多糖（1mg/只）。在本发明中使用的CpG2006（20微克/鼠标）从美国Invivogen公司购买。合成的天然或具备硫代磷酸酯键骨架的CpG寡核苷酸，从澳大利亚GENEWORKS公司购买，并且可以从其它供应商处购得。MPLA可以从美国Sigma公司或Invivogen公司购买。质粒DNA也可使用本领域熟知的方法制备，例如使用Qiagen公司（Qiagen公司，美国）的DNA纯化试剂。用于免疫的灭活或重组抗原可以通过商业性化学或蛋白质供应商如Sigma获得，或者可以使用本领域熟知的方法来制备。

疫苗的生物活性可以使用标准的实验室技术进行测定，具体地通过使用测试免疫制剂接种的标准实验室动物（例如，小鼠或豚鼠），用标准的抗原（例如，破伤风类毒素），在初次免疫或增强免疫后免疫反应完成后对动物进行放血或脾摘除，进而进行免疫反应的检测。该反应可以通过本领域公认技术测定，例如，血清，唾液，阴道，粪便抗体对标准抗原滴度（对于体液免疫测定）和T细胞增殖，细胞因子的ELISPOT或细胞因子的酶联免疫吸附试验等措施来定量测定（用于T细胞免疫测定）。

很显然对本领域的普通技术人员来说产生一个给定的免疫效果所需要的蛋白质抗原和免疫学组合物的精确的量会因特定的化合物和抗原而变化，并与受试者个体大小，年龄，物种和个体条件相关。因此，就不可能精确地说明所需要的数量。然而，这些量可以很容易地用已知的对于本领域的普通技术人员的方法来确定。在一般情况下，初次免疫会给予一个或多个肌肉，皮下或皮内注射，然后再一段时间后（通常为1-12个月，例如6个月），使用包含本发明的免疫学组合物的疫苗制剂通过胃肠外注射用而加强免疫反应。一般用于成年人的抗原剂量在0.001到0.1毫克之间，最常用的为每剂0.001到0.1毫克，或0.005到0.05毫克。

通常，施用本发明的实践中给药体积在0.1至5.0毫升范围内，在人类受试者中优选地在0.1至1毫升之间。

本发明的各方面的组合物和物质优选地通过肌肉或皮内注射，或其它非肠道途径，或通过球囊应用到表皮给药。它们也可以通过鼻内应用，吸入给药，局部，静脉内，口服，或作为植入物，甚至直肠或阴道使用也是可能的。合适的液体或固体药物制剂形式包括如下种类，例如，用于注射或吸入，水溶液或盐溶液微胶囊化，encochleated，包被到显微金颗粒，包含在脂质体中，雾化剂，气雾剂，沉淀用于植入到皮肤上，或干燥到被尖锐物体上从而划到皮肤上。所述药物组合物还包括颗粒剂，散剂，片剂，包衣片剂，（微）胶囊，栓剂，糖浆剂，乳剂，混悬剂，乳膏，滴剂或长期释放活性化合物的制剂，其制备赋形剂和添加剂和/或辅料，例如作为崩解剂，粘合剂，包衣剂，溶胀剂，润滑剂，调味剂，甜味剂或增溶剂通常使用如上所述。所述药物组合物适合于在各种药物递送系统中使用。对于本发明的方法用于药物递送的简要综述，参见参考文献Langer，1990。

免疫学组合物优选地制备为给药剂量单位。液体剂量单位的小瓶或安瓿中用于注射或其它非肠道给药。固体剂量单位是片剂，胶囊剂和栓剂。给定剂量的给药可以通过一个单独的剂量单元的形式单次给药或通过几个较小的剂量单位多次给药。间隔几周或几个月的多次给药通常是为了刺激抗原特异性免疫应答。

本发明中，各方面的组合物和物质以及有用的不用种类抗原，可以多于两种组分的混合物被递送。混合物可以由包括一种或多种类型的菊粉颗粒（或其它等效的抗炎成分）的免疫组合物和一种或多种PAMP天然免疫激活剂及一种或多种抗原组成。

为了更清楚地理解本发明的本质，各优选形式将在以下非限制性实施例中具体说明。所有的参考文献（包括文献参考文献，已授权的专利，公开的专利申请，和尚待批准专利申请）的全部内容在参考文献部分明确引入。

实施例

使用疫苗或单独使用或与其它免疫激活剂组合的菊粉颗粒进行评价。重组乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和流感病毒抗原被用作下文所述的实施例的示例性的模型系统。

材料与方法

实施例1：

佐剂组合物的制备

在下列实施例中提到的菊粉颗粒的配方如下所述进行制备。

Gammulin（γ-菊粉;gIN），Algammulin（AG）和Phosgammulin（PG）：γ菊粉（gIN）和Algammulin的制备如先前在PCT/AU86/00311（WO87/02679）所述，标题为“免疫治疗的方法”，和PCT/AU89/00349（WO90/01949），标题为“γ-菊粉组合物”，在此引用并入。为了生产Phosgammulin（PG），γ菊粉的5％水悬浊液首先在80-85℃加热溶解，然后使之与适量磷酸铝凝胶的细悬浮液（ADJU-PHOS^TM磷酸铝凝胶佐剂0.44％，BrenntagBiosector，Frederickssund，丹麦）混合，最终使得菊粉/ADJU-PHOS^TM的重量比在2到200之间。然后将悬浮液在5℃下结晶，然后转化成γ-形式（1小时，45℃），得到Phosgammulin杂合颗粒，洗涤后可以用于制备其他制剂。

Deltin（γ-菊粉;dIN）：Deltin（dIN）制备自γ-菊粉，方法同前面在WO2006/024100所述，在此引用并入。简言之，γ-菊粉标准配方的水溶液（200毫升，50毫克/毫升），在55℃水浴中温育1小时，然后将其升温至60℃温浴30分钟。然后离心回收颗粒状不容物，再重悬于55℃水中，55℃温育，按上述方式再次洗涤。最后重悬在50毫升冷水中。这些处理足以除掉大部分以α和γ形式存在的菊粉。富集了δ-菊粉的悬浊液在80-85℃会完全溶解。样品折射率表明浓度为48毫克/毫升。在这些实验中使用的δ-菊粉悬浊液的浓度（重量/体积）为5％。

Phosdeltin（dIN/磷酸铝制剂（PD））：5%的Deltin悬浊液按照前面描述制备，加热到80-85℃溶解，然后与磷酸铝凝胶（Adju-Phos^TM铝磷酸盐，含凝胶佐剂0.44％，BrenntagBiosector，丹麦）的微细悬浊液混合，保持dIN：Adju-Phos^TM的比例在2到200之间（质量/质量）。然后将悬浮液在5℃下结晶，然后转化为gIN（1小时，45℃），然后转化为dIN形式（1小时，55℃），最终产生Phosdeltin杂合颗粒，洗涤后可用于合适制剂的制备。

Aldeltin（dIN/氢氧化铝的制备）：制备Aldeltin(AD)的步骤与上述制备Phosdeltin基本相同，唯一不同之处在于使用氢氧化铝凝胶微细悬浊液（Alhydrogel^TM，氢氧化铝凝胶佐剂，铝（计算值）为3.0％，BrenntagBiosector的微细悬浮液，Frederickssund，丹麦）代替磷酸铝凝胶。5%的Deltin悬浊液按照前面描述制备，加热到80-85℃溶解，然后与适量氢氧化铝凝胶微细悬浊液混合，最终达到dIN：Alhydrogel^TM的的比例在2到200之间（质量/质量）。然后，将此悬浊液在5℃结晶，转化为γ-菊粉（45℃下1小时），然后再转化为δ-菊粉（1小时，55℃），最终产生Aldeltin杂交颗粒，洗涤后可用于合适制剂的制备。

Epsilin（eIN）：Epsilin是由δ-菊粉制备而来，方法详见PCT/AU2010/001221标题为"一种新型菊粉多晶型物及其组合物"。简言之，eIN是通过在60℃加热浓度大于50毫克/毫升的δ-菊粉悬浊液1小时得来。

Phosepsilin（PE）：为了制备Phosepsilin（PE）先将上述5%的eIN水悬液加热到80-85℃溶解，然后与磷酸铝凝胶（Adju-Phos^TM铝磷酸盐，含凝胶佐剂0.44％，BrenntagBiosector，丹麦）的微细悬浊液混合，保持eIN：Adju-Phos^TM的比例在2到200之间（质量/质量）。然后将悬浮液在5℃下结晶，然后转化为gIN（1小时，45℃），然后转化为dIN形式（1小时，55℃），然后转化为eIN形式得到Phosepsilin混合颗粒。洗涤后可用于合适制剂的制备。

PGmix、PDmix和Pemix的制备：如上所述的Phosdeltin（DIN/磷酸铝）和dIN制剂进行混合，以形成一些含有纯菊粉和其他含有菊粉与磷酸铝（PDmix）颗粒的混合悬浊液。在本文所描述的实验中，Pdmix组合佐剂制备中，Phosdeltin：Deltin的质量比在1：1至1：36之间（分别简称PDmix1:1至PDmix1:36）。这使含有磷酸铝颗粒的量相对dIN颗粒的量具备可变性。PGmix和PEmix被以同样的方式制备。Phosdeltin与Deltin颗粒的质量比表示为X:YPD:D，这意味着，x份的PD与y份的菊粉颗粒，形成PdmixX:Y。

AGmix、ADmix和Aemix的制备：为了制备AD组合，将上述的Aldeltin和Deltin制剂进行混合以形成混合的悬浊液。本文所描述的实验中，Aldeltin：Deltin组合佐剂制备其质量比在1:1至1:36之间，从而使铝胶颗粒的量相对于dIN颗粒的量具有可变性。AG和AE的组合分别以相同的方式制备。

PAMP先天免疫激活剂：PAMP先天免疫激活剂包括合成未分离三酰基脂蛋白（Pam3CSK4）（0.25微克/鼠），热灭活李斯特菌（2.5x10e7细胞/鼠），从耻垢分枝杆菌（0.25微克/鼠），牙龈卟啉单胞菌来源的LPS-脂阿拉伯甘露聚糖（2.5微克/鼠标），金黄色葡萄球菌来源的标准脂磷壁酸（LTA-SA）（2微克/鼠），金黄色葡萄球菌来源的肽聚糖（PGN-SA）（2微克/鼠），合成二酰化脂蛋白（0.25微克/鼠），酵母多糖（1mg/鼠），CpG2006（20微克/鼠）和单磷酸脂质A均购买自Invivogen（美国，圣地亚哥），并按照制造商的说明使用。此外，合成的寡聚脱氧核苷酸（例如ODN182，序列为TCCATGACGTTCCTGACGTT，具有硫代磷酸酯键骨架）订购自Geneworks（澳大利亚）。PAMP先天免疫激活剂，按照制造商的说明书溶解，并在使用前用前生理盐水稀释。

带有PAMP先天免疫激发剂菊粉颗粒配方：gIN,dIN,eIN,AG,AD,AE,PG,PD,PE,PGmix,PDmix,PEmix,AGmix,ADmixorAEmix的水悬浊液（统称为“菊粉粒子”），按照前面所述的方法制备。单个的TLR激动剂和如上详述的其他PAMP先天免疫激活剂分别加入相关的菊粉颗粒的悬浊液，得到所需的最终浓度。按照同样的方式，疫苗抗原的溶液，例如流感血凝素或乙肝表面抗原，被加入到相关的免疫学制剂，得到所需的最终疫苗浓度。在即将进行免疫接种的时候，把抗原、PAMP先天免疫激活剂和菊粉颗形成的混合物后吸入注射器准备注射。

小鼠免疫接种：不同年龄的BALB/c小鼠在被分成5-10小鼠/组,在后肢肌肉内免疫注射50毫升疫苗（生理盐水溶液为赋形剂）。注射所采用的是0.3毫升胰岛素注射器，有内置29G针头（BectonDickenson,FranklinLakes,N.J.)。

评价体液反应性抗原：肝素化血液通过眼球后穿刺采自轻度麻醉的小鼠，方法已被详细描述过（Micheletal.,1995）。血浆通过离心回收（在13,000rpm7分钟）。抗原特异性的抗体是利用标准步骤的ELISA检测并定量的。血浆的稀释液首先被添加到抗原包被的96孔酶标板，室温（RT）过夜。继而在37℃与辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠的IgG，IgM，lgG1、IgG2a孵育1小时(1:2000inPBS-Tween,10%FCS;100μΙ/孔)，然后与TMB溶液（100μΙ/孔，Sigma公司，圣路易斯，密苏里州），孵育室温30分钟。加入1M硫酸终止反应，用酶标仪测吸光度。以此来检测结合在板上的抗体。

要确定TLR9激动剂（CpG2006ODN）和菊粉颗粒制剂（PDmix）之间是否有良好的剂量反应关系，雌性BALB/c小鼠6-8周龄（N=5-8每组）分别肌肉注射免疫两次（14天间隔）以下混合物：商品化三价灭活流感疫苗（TIV）（每剂100ng流感病毒血凝素），分别单独加入2、7、20或者60微克CpG2006，或这在此基础上再与1mg的PDmix（1:5）混合。小鼠在第二次免疫42天后放血，并通过ELISA测定和抗流感抗体（图1）。CpG从2至60微克的剂量增加抑制了抗流感lgG1响应，同时为增强抗流感的IgG2a应答。但是，由于CpG对lgG1的抑制，即使在最高的CpG剂量60微克，与不含佐剂的TIV相比，总体的抗流感抗体依然没有显著性差异。但是，受到CpG2006和PDmix菊粉颗粒共同处理的小鼠表现出协同增益的抗流感IgG1应答，尤其是在2微克和7微克剂量，这与仅有CpG2006没有PDmix菊粉颗粒所产生的对于抗流感的IgG1应答抑制产生了强烈对比。CpG2006和菊粉颗粒的组合增强了总IgG说明菊粉颗粒可以节约PAMP先天免疫激活剂的使用，使之在较低的剂量与菊粉颗粒结合后，即可以产生免疫应答。同时，CpG对于IgG2a的应答的增强在菊粉颗粒存在时被保留甚至强化下来。总抗流感IgG应答在接受TIV、PDmix菊粉颗粒结合PAMPCpG60微克这一组最为显著。相似的，抗流感IgM也在CpG和PDmix组合的处理组中得到最大程度的增强。

实施例2：

为了确定PDmix和CpG的协同效果是否是与年龄相关，采用了与实施例1中类似的实验。小鼠为雌性Balb/c（n=10/group），年龄为14天（新生模型）或者200-300天（老人模型）。首先，第14日龄新生雌性BALB/c小鼠（n=5-7/组），肌注免疫注射后肢50μΙ三价灭活流感疫苗（TIV）（CSL澳大利亚），即每只动物100ng剂量的HA。TIV单独给药或者与dIN1mg,PDmix(1:36PD:Dw/w)1mg,CpG166820ug,orPDmix(1:36PD:Dw/w)1mg+CpG166820ug组合给药。小鼠免疫注射两次，中间相隔9天，在第二次免疫后14天采血用ELISA检测抗流感抗体（图2）。跟单独的流感抗原相比，给TIV添加CpG1668并不能增加流感特异性的总IgG；尽管的确产生了从以IgG1为主到IgG2a为主的抗体应答转换，这与TLR9的激动剂引起的Th2到Th1免疫应答的转换是一致的。当TIV和CpG1688加PDmix共同给药的时候，可以产生最大程度的总抗流感IgG水平的升高，这种协同效应反映在总IgG和IgM的增加大于TIV和CpG1668或者TIV和PCmix的组合。与仅注射TIV的小鼠相比，只有当小鼠同时接受PDmix和CpG处理时，才会产生流感血凝抑制（HI）滴度的显著升高。第二次免疫后52天，处死小鼠饼通过CSFE=basedT-cell增殖测定检测流感特异的T细胞记忆应答。小鼠在接受了PDmix合并CpG1668处理后，仅有最高的针对流感抗原的总体CD4和CD8T细胞的增殖应答。因此，PDmix（菊粉颗粒配制剂）和CpG（一种PAMP先天免疫激活剂，激活TLR9），协同促进了对TIV的免疫反应，产生了最高的总体抗流感IgG和IgM，是唯一一组诱导了高水平的IgGa，在新生小鼠中增加了保护性的流感血凝抑制试验（HI）滴度。同样，CD4+和CD8+的T细胞增殖记忆应答也在这一组合时最大。这表明，菊粉颗粒和TLR9激动剂。

实施例3：

为确定PDmix和CpG的协同效应是否依赖于该CpG的序列，我们使用6到8周龄的雌性Balb/c小鼠（每组5到7只）中的重复了实施例1中的实验。间隔14天给予两次肌肉注射免疫，疫苗为TIV（100纳克HA）加1毫克Pdmix（1:3），以及CpG1668（B类ODN），CpG2216（A类ODN），CpG2006（B类ODN），CpG2395（C类ODN）或非CpG序列CpG2237之一（剂量为10纳摩尔）。CpG序列如下，CpG1668-tccatgacgttcctgatgct；CpG2216-ggGGGACGATCGTCgggggG；CpG2006-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt；CpG2395-tcgtcgttttcggcgcgcgccg；CpG2237–tgctgcttttgtgcttttgtgctt。其中小写字母代表磷酸二酯键而大写字母表示硫代修饰的位点。第二次免疫后28天采血通过酶联免疫吸附试验检测抗体滴度（图4）。与CpG1668、CpG2006或者CpG2395联和的免疫组均显示了协同效应，其血清IgG、IgG2a及IgGM滴度均升高。而CpG2216和CpG2237对抗体反应没有促进作用。这证明了菊粉颗粒与CpG寡核苷酸的协同作用对含有TLR9结合模体的序列是一般存在的，而优选地属于B类和C类寡核苷酸序列。

实施例4：

为确定菊粉颗粒(dIn或者PDmix)与CpG寡核苷酸的协同作用是否依赖同时给予的抗原,我们重复了狂犬病疫苗(MIRV)的免疫实验。6到8周的雌性Balb/c小鼠（每组5到7只）间隔14天给予两次肌肉注射免疫，疫苗为单独的MIRV或者添加1毫克dIN颗粒或1毫克PDmix（1:5），或进一步添加5微克CpG。在第二次免疫14天后采血通过酶联免疫吸附试验检测血清抗MIRV的抗体的滴度（图5）。dIN颗粒或者PDmix与CpG1668以及MIRV三者联合免疫的小鼠其抗MIRV的总IgG、IgG1、IgG2a和IgGM的水平最高。这表明协同效应对不同菊粉颗粒是一般性存在的，无论有无铝盐成分，而且该协同作用除流感病毒外对狂犬病疫苗同样有效，表明菊粉颗粒与CpG的协同作用可以扩展到更广泛的抗原种类，例如疟疾MSP4或MSP蛋白，重组的或灭活的SARS冠状病毒抗原，暴发型流感的H5N1抗原，以及日本的脑炎抗原。而这与已知的TLR9激动剂增强总IgG、IgG2a和IgGM滴度但已知IgG1的结果相符合。

实施例5：

为确定菊粉颗粒与CpG的协同作用是否可以扩展到一般的天然免疫激活剂PAMP中，我们使用6到8周的BALB/c小鼠（每组5到10只）进行间隔14天的两次肌肉注射免疫，疫苗为TIV2007（含有45纳克总HA蛋白）。实验组包括：TIV加PDmix（1:5），或者进一步加入20微克CpG，或一系列TLR2激动剂，包括1毫克酵母多糖，2微克脂磷壁酸（LTA），0.25微克Lipomannnan或0.25ugPAM3CSK4之一。在第二次免疫两周后采集血清通过酶联免疫吸附试验检测针对流感病毒的抗体滴度（图6）。在菊粉颗粒加TIV疫苗制剂的基础上，添加任意一种PAMP均可增加总的IgG抗体滴度，而效果最佳的是TLR9激动剂CpG和TLR2激动剂酵母多糖。不同的是，添加CpG一直IgG1反应，而与酵母多糖联用则加强IgG1反应，但二者均可显著增加IgG2a和IgM水平。而脂磷壁酸和PamCSK也可增加IgG2a和IgM水平，但程度略低。这表明菊粉颗粒与TLR9激动剂的协同作用可以扩展到与其他PAMP的组合，包括一系列TLR2的激动剂。

实施例6：

为确定菊粉颗粒的有利的协同效应是否能一般化到其它的PAMP先天免疫激活剂，雌性Balb/c6-8周龄小鼠（N=5-10/组）肌肉内免疫两次（间隔14天）1克重组酵母乙肝表面抗原（HBsAg），联合给药TLR2激动剂PamCSK40.1g/鼠、TLR3激动剂聚（I：C）25克/鼠、合成的TLR4激动剂MPLA、TLR5激动剂鞭毛蛋白、TLR6激动剂MALP-20.04克/鼠、TLR7激动剂PolyU2.5Mg/mouse或者TLR9激动剂CpG200620微克/鼠，同时合并或不合并1mg的PDmix（1:3）。小鼠在第二次免疫后第42天采血，用ELISA法测定抗-HBsAg的抗体（图7）。接受乙肝表面抗原，加上各PAMP先天免疫激活剂的组存在低水平或不可检测的抗HBsAg总IgG、lgG1、IgG2a和IgM。相比之下，接受各PAMP免疫激活剂加PDmix的组表现出显着增强的抗-HBsAg的总IgG应答，与之前检测到的菊粉颗粒和PAMP先天免疫激活剂之间的协同效应一致

实施例7：

6到8周龄的BALB/c小鼠（每组5到8只）接受间隔21天的两次肌肉注射免疫，疫苗体积50微升，包括3纳克到3微克之间的重组rH5蛋白（蛋白质科学公司，ProteinSciencesCorp），同时单独添加1毫克dIN颗粒，或进一步加入5微克CpG。在第二次免疫14天后采血并通过酶联免疫吸附试验检测抗体水平（图8）。实验结果显示，在添加1毫克dIN颗粒以及5微克CpG的小鼠中，仅10纳克的rH5重组蛋白即可产生比单独给予3微克rH5的小鼠更高的IgG水平，相当于300倍节约了抗原的使用量。这一抗原节约效果对IgG2a、IgG2b和IgM更为明显，例如对IgG2a而言，可以3000倍节约抗原的使用量。

实施例8：

22月龄雌性BALB/c小鼠接受间隔两周的肌肉注射免疫，疫苗为单独的0.1微克灭活H1N1流感病毒PR8，或者添加1毫克dIN颗粒，或者再额外加入10微克CpG2006。其他对照组接受生理盐水或单独的dIN或dIN加CpG注射。在第二次免疫5周后使用20倍半数致死量的PR8病毒感染小鼠（图9A）。所有对照组以及仅接受PR8疫苗而没有添加佐剂的组中小鼠均发生体重下降和死亡。PR8和dIN联合免疫的小鼠虽然开始体重下降，但随后恢复。不同的是，接受PR8加dIN颗粒以及CpG三者免疫的小鼠没有发病、体重下降或死亡，这说明菊粉颗粒联合CpG可以在免疫能力下降年长动物中发挥协同作用而获得有效的抗病毒免疫力。为证明这一效果不是单独由CpG提供的，我们使用6到8周龄的BALB/c小鼠间隔两周接种PR8疫苗，添加生理盐水、1毫克dIN颗粒和/或10微克CpG，并在第7周时给予致死剂量的PR8感染（图9B）。结果表明只有接受PR8加dIN颗粒以及CpG三者免疫的小鼠可以存活，这证明了保护作用是由菊粉颗粒和CpG协同提供的。

实施例9：

11到14周龄的阉割雪貂（购买自Mustelaputoriousfuro,TripleFFarms,Sanger,PA），体重0.7到1.9千克之间，在使用前进行14天的驯化和检疫。这些雪貂对当时流行的甲型流感病毒H1和H3，乙型流感病毒以及H5抗原的血清反应呈阴性。甲型H5N1流感病毒（越南1203/2004）的单价亚病毒颗粒疫苗（Fisher储存库货号CLAG-1170，批号U007827）来自美国国立变态反应与传染病研究所（NIAID）的储存库，保存在2到8℃。疫苗通过大腿肌肉注射接种，体积0.5毫升，第二次免疫在另一只腿上进行。对照组动物接受单独的佐剂注射或者生理盐水注射。两个剂型的菊粉颗粒在本研究中使用，分别为批号VAX-SPL-0910003（dIN颗粒，浓度50毫克/毫升，碳酸盐缓冲液，此处称为Ad1），以及批号VAX-SPL-0910-04（dIN菊粉颗粒，浓度50毫克/毫升，碳酸盐缓冲液，还含有0.3毫克/毫升的CpG2006）的制剂。这两种制剂分别与H5N1抗原混合后用于免疫接种，体积为每只雪貂250微升。随机分组后，Ad1组的雪貂接受10毫克dIN颗粒，而Ad2组的雪貂接受10毫克dIN颗粒加75微克CpG2006注射。CpG2006的序列为5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'，其骨架完全由硫代修饰（购买自澳大利亚阿德莱德Geneworks公司）。佐剂在2到8℃保存，在即将注射前与疫苗混合。甲型H5N1流感病毒（越南1203/2004）（VN/1203）来自美国疾病控制中心（CDC）。根据体重对动物进行随机分组（使用例如PathTox的数据系统）。全部49只雪貂随机分为10组。四组各7只雪貂接受两次免疫，中间间隔21天，包括：7.5微克疫苗加Ad1；7.5微克疫苗加Ad2；22.5微克疫苗加Ad1；以及22.5微克疫苗加Ad2。两组各3只雪貂接受两次无佐剂的免疫接种，包括：22.5微克疫苗不含佐剂；和7.5微克疫苗不含佐剂。另外一组6只雪貂接受22.5微克疫苗加Ad2的免疫接种，仅在其他各组初次免疫的同时接种一次。接受两次免疫的雪貂在加强免疫后3周，仅接受一次免疫的雪貂在初次免疫后6周接受活病毒感染测试。活病毒感染测试前，肌肉注射氯胺酮（20mg/kg的）和甲苯噻嗪（4毫克/千克）进行麻醉，然后将10倍EID50（50%鸡胚感染量）的VN/1203病毒500微升滴入到每个鼻孔，同时对稀释的活病毒进行培养以确保一致的感染剂量。鼻洗液收集：每个鼻孔滴入1.0毫升生理盐水，含有1％牛血清白蛋白，100单位青霉素/毫升，100微克/毫升链霉素和0.25微克/毫升两性霉素B。用于血细胞计数的全血在病毒感染4天后通过上腔静脉穿刺获得。每日两次观测记录眼分泌物，鼻腔分泌物，喷嚏，咳嗽，大便性状和活动度评分。符合以下任一条件时该动物被认为即将死亡：温度低于33.3℃，体重下降大于25％，对触摸反应迟钝，自残，瘫痪，运动障碍，或呼吸窘迫。感染后在动物存活期间获得上呼吸道样本，其中鼻洗液在感染后第2和4天采集；咽拭子在感染后第1，2，3，4和6天获得。在尸检时获取组织样本进行流感病毒的培养，包括尾叶肺的灌洗液；4份250毫克的肺，脑，脾及气管支气管淋巴结匀浆（组织匀浆器，QIAGEN，美国），和2份气管环匀浆。经腔静脉穿刺的血清收集在第一次接种疫苗时和之后的14，21，及28天进行。第一次接种后的14天接种后对应病毒感染前28，接种后第28天对应感染前14天。血清样品通过受体破坏酶（Denka-Seiken，东京，日本）在37℃下失活16-20小时，然后在56℃下加热灭活30分钟。血细胞凝集抑制试验（HI）使用马红细胞进行。中和抗体滴度的采用微量中和测定法（MN）测定。100个50%组织感染剂量的VN/1203病毒与等体积连续稀释的血清在96孔板中混合，包括4个复孔，在37孵育1小时，然后取100微升混合物加入到单层MDCK细胞的培养孔中，孵育三天后使用倒置显微镜观察细胞病理效应。能够保护半数培养孔细胞不发生病理改变的最高血清稀释倍数被作为该样品的中和抗体滴度。使用滴度的几何平均数来报告数据，如果滴度为负数则标记为10。病毒感染后6到8天垂死的雪貂，通过解剖获得肺组织和包括嗅球的脑组织，对于感染后没有症状的雪貂则在感染后14天通过解剖获得组织样本。在福尔马林固定后，从左侧脑、右中和右肺尾页组织获得标准的组织切片。统计学分析通过使用GraphPadPrism（版本5.03，美国）完成。血清抗体反应的分析通过变异系数分析以及Bonferroni后检验校正完成。生存分析采用对数秩检验完成。患病率通过活动性指数反映，使用Fisher's精确概率检验进行分析。病毒负荷通过变异系数分析完成。

单独使用分离病毒颗粒免疫而没有佐剂的雪貂，不论抗原用量的高低，在使用活病毒感染测试前均无可检测到的H5N1中和抗体。接受两次包含佐剂Ad1或Ad2的H5N1疫苗免疫的雪貂均在活病毒感染测试前和初次免疫后21天显示具有中和抗体，而Ad2佐剂组的中和抗体滴度显著高于Ad1佐剂组（p<0.03，对数秩和检验），这与已知的菊粉颗粒和CpG增强免疫反应的协同作用是一致的（图10）。对照组动物在活病毒测试后均死亡，接受两次单独抗原免疫的动物死亡率约30%，而添加Ad1或Ad2佐剂的动物则没有发生死亡（图11）。接受两次无佐剂添加的疫苗免疫的雪貂在病毒攻击后5天内体重下降超过15%，添加Ad1佐剂的雪貂体重下降5%并随后恢复，而添加Ad2佐剂的雪貂则无任何体重下降。这与菊粉颗粒加PAMP天然免疫激活剂组合可增强针对抗原的免疫反应时一致的（图12）。类似的，4只接受Ad1佐剂添加的疫苗免疫的雪貂出现了发热，而添加Ad2的免疫组雪貂则无发热现象。这与已知菊粉颗粒和PAMP天然免疫激活剂的协同作用是一致的（图13）。接受添加Ad2佐剂疫苗免疫的雪貂其咽拭子流感病毒滴度在病毒攻击后的第2、3和4天均显著低于接受无佐剂添加的抗原免疫组（Mann-Whitney检验，p=0.0018），而添加了Ad1佐剂的免疫组其咽拭子流感病毒滴度与单独抗原的免疫组比没有显著差异。接受添加Ad2佐剂疫苗单次免疫的雪貂，在病毒攻击后2到4天，其病毒负荷与接受单独抗原两次免疫的雪貂组比没有显著差异。

因此菊粉颗粒（dIN）与PAMP天然免疫激活剂（CpG2006）可以协同增强针对共同施用的抗原的抗体免疫反应，即使单次免疫，也可提供对致死剂量病毒攻击的保护作用。在小鼠中进行的类似实验表明，给予5微克PR8病毒和dIN菊粉颗粒以及10微克CpG的单次免疫即可产生抵抗致死剂量PR8病毒攻击的保护作用，而添加dIN或CpG2006单一佐剂的疫苗则分别只有部分保护作用或完全没有保护作用。

实施例10：

为确定菊粉颗粒与PAMP之间的协同作用是否是dIN颗粒的独特属性，或者是不同晶体型菊粉颗粒的共同属性，我们间隔21天给予成年Balb/c小鼠乙肝表面抗原HBsAg免疫，佐剂为gIN、dIN或eIN，同时给予TLR9激动剂CpG2006。第二次免疫14天后，采集血清用于抗体滴度检测（图14）。三种菊粉颗粒均显示了与CpG的协同作用，增加了抗HBsAg的IgG、IgG2a和IgM的抗体滴度，这说明该协同作用是不同菊粉颗粒的共同属性。

实施例11：

为确定菊粉颗粒与PAMP之间的协同作用是否可以扩展到大型动物中，日本脑炎病毒血清反应阴性的4到8岁的雌性马（每组3匹）接受颈部皮下注射日本脑炎病毒疫苗。Vero细胞中扩增的灭活日本脑炎病毒疫苗（ccJE，北京-1株）（Toriniwa和Komiya，2008）来自日本Kitasato研究所。免疫剂量为6微克，单独免疫或者与20微克dIN颗粒联合，或者40微克dIN颗粒外加200微克CpG7909，总注射体积为1毫升。5周后给予加强免疫。在第一次和第二次免疫后分别采集血清。然后半数病毒噬斑抑制试验（PRNT50）检测中和抗体滴度。使用110微升约400噬斑形成单位（PFU）的日本脑炎病毒（Nakayama株）、MVEV（1-51株）和西尼罗河病毒（KunjinMRM61C株）在96孔板中与倍比稀释的马血清在37摄氏度孵育1个小时。然后取0.1毫升孵育物加入到6孔板培养的Vero细胞中。通过与未免疫血清相比计算噬斑减少的百分比。PRNT50滴度指能够产生50%噬斑减少时的血清稀释倍数。与标准抗原免疫相比，添加菊粉颗粒的免疫组中和抗体的滴度升高约4倍。然而，同时添加菊粉颗粒和CpG7907的免疫组其中和抗体进一步升高2到3倍（参见表1）。值得注意的是，接受菊粉和CpG免疫的马在第一次免疫后均获得了超过10的PRNT50滴度。而菊粉颗粒与CpG联合免疫的动物也获得了最高的种属交叉保护抗体滴度。这提示这一组合会增加针对病毒的种属交叉中和抗体滴度。

表1:

实施例12：

菊粉颗粒的抗炎作用可通过使用人全血或纯化的人外周血单个核细胞（PBMC）检测，或可选的，使用小鼠脾脏细胞，或者可选的使用大型实验动物如兔子的全血或纯化的外周血单个核细胞。总之，使用系列浓度的菊粉颗粒，从1毫克/毫升的下降到1纳克/毫升，加入到细胞培养板的孔中，然后在37℃下孵育或物种的相关体温孵育。结果通过细胞因子IL-1的测量给出。在孵育4到24小时后，可以通过实时定量PCR方法检测基因表达的变化，或者在孵育24到72小时候通过酶联免疫吸附试验检测分泌的细胞因子的蛋白质水平。在这个例子中，来自三名成年人健康受试者的PBMC在与100微克/毫升dIN颗粒共同孵育5小时之后，RNA使用TRIZOL提取，然后通过基因表达微阵列系统（Illumina）上检测基因表达变化。作为对照，来自同一受试者的PBMC还与促炎性的PAMP，包括聚（I：C）和LPS孵育。与预期一致，与聚（I：C）或LPS孵育后，IL-1α和IL-1β的平均基因表达分别上调4.1和4.4倍。相比之下，在与100微克/毫升dIN共同孵育后，IL1α基因表达下降2.88倍，IL1β基因表达下降2.17倍。dIN颗粒也下调IL1受体基因的表达，即IL1RAP，幅度为1.46倍下调。此外，进一步突出其抗炎作用，dIN颗粒导致IL-1的拮抗基因表达上调，包括IL1F5（1.49倍上调），IL1R2（1.11倍上调），和IL1RN（2.9倍上调）。接下来我们对dIN颗粒和TLR9的激动剂PAMPCpG的组合的效果进行了研究。dIN与CpG同时存在时，IL1α和IL1β的表达依然下调，但有趣的是的IL1拮抗基因的上调水平甚至高过dIN单独使用的情况。因此，联合刺激对拮抗IL-1基因的作用包括IL1F5（dIN单独与DIN+CPG）的效果（1.9比1.49倍上调），IL1R2（1.35倍与1.11倍的上调），和IL1RN（3.47倍，2.94倍上调）。因此，菊粉颗粒与TLR9激动剂PAMP的组合导致了菊粉颗粒的抗炎特性更大的改进。相反的，在同一实验中，抗炎效应相关的基因水平一致上调。抗炎基因PPARγ在PAMCSK,聚(I:C),LPS和其他TLR激动剂处理的PBMC中一致下调，但是dIN处理的来自三名受试者的PBMC中其表达水平平均升高1.24倍。一致的是，当使用酶联免疫吸附试验或蛋白质斑点杂交方法在孵育24到48小时候检测抗炎细胞因子的蛋白质水平显示了类似的结果。实验结果还显示，在使用活的或灭活得日本脑炎病毒和纯化的PAMP处理PBMC后会上调炎症相关细胞因子的表达，而菊粉颗粒存在的情况下则降低。gIN和eIN在抑制IL1基因和蛋白质表达并同时上调抗炎成分表达上具有和dIN同样的作用，这使得菊粉颗粒的抗炎作用扩展到一般化程度。

作为一个人H1N12009年暴发型流感疫苗研究的一部分，20毫克dIN与重组H1N1血凝素抗原（rHA）联合给药。接受ADVAX^TM佐剂受试头痛的频率显著降低（4/137：2.9％）（P<0.05Fishers精确检验），而单独的rHA组更高（15/137：10.9％）。第二次免疫后该趋势（P=0.06）依然存在，即相比于单独的rHA组（8/137：5.8％），接受ADVAX^TM佐剂组头痛频率更低（2/135：1.5％）。减少头痛与菊粉颗粒诱导抑制IL-1的产生相一致，因为IL-1的血清水平在丛集性头痛者血清中升高，而IL-1基因多态性（3953C/T）与偏头痛相关联（Martelletti等，1993；Rainero等，2002）。这表示在一个已证明的人类佐剂有效剂量下，菊粉颗粒具有抗炎作用。

实施例13：

为确定菊粉颗粒的有利的协同效应是否可以一般化到其它PAMP天然免疫激活剂，6-8周龄雌性Balb/c小鼠（每组5到10只）间隔14天肌肉注射免疫1微克重组酵母表达的乙肝表面抗原（HBsAg），同时给予任一TLR2激动剂PamCSK40.1微克/小鼠，在TLR3激动剂聚（I：C）25微克/小鼠，合成的Toll样受体4激动剂MPLA中，TLR5激动剂鞭毛蛋白，的TLR6激动剂MALP-20.04微克/小鼠，TLR7激动剂理2.5微克/小鼠或TLR9激动剂CpG200620微克/小鼠，有或没有1mg的PDmix（1:3）。小鼠采血抗-HBsAg的抗体在第二次免疫后42天采用酶联免疫吸附试验法测定。仅接受乙肝表面抗原，加上各PAMP天然免疫激活剂的组有低的抗HBsAg总IgG，IgG1，IgG2a和IgM。相比之下，接受各PAMP免疫激活剂加PDmix的组显示了增强的抗-HbsAg的IgG反应，这与已被观察到的菊粉颗粒与PAMP免疫激活剂的协同作用是一致的。

在整个说明书中，词语“包含”，或其变化形式例如“包括”或“含有”将被理解为意指包括一个所称元素，整数或步骤，或元素，整数或步骤的组，但不排除任何其他元素，整数或步骤，或元素，整数或步骤。

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Claims (6)

1.一种用作疫苗的组合物，其包含：

(a)菊粉颗粒；

(b)抗原，以及

(c)病原体相关分子模式(PAMP)，

其中所述PAMP选自Toll样受体(TLR)激动剂和NOD样受体激动剂。

2.一种药学上可接受的组合物，其包含：

(a)菊粉颗粒；

(b)包含一种或多种但不多于十种PAMP的物质或者由一种或多种但不多于十种PAMP组成的物质；以及

(c)抗原，

其中所述PAMP选自Toll样受体(TLR)激动剂和NOD样受体激动剂。

3.如权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中所述包含PAMP或者由PAMP组成的物质包含选自以下的物质或者由选自以下的物质组成：RNA、DNA、CpG寡核苷酸和未甲基化的多核苷酸分子，其中所述PAMP选自Toll样受体(TLR)激动剂和NOD样受体激动剂。

4.如权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中所述菊粉颗粒包含菊粉或者由菊粉组成，所述菊粉选自γ菊粉、δ菊粉和ε菊粉中的一种或多种。

5.一种用于生产疫苗的方法，所述方法包括将权利要求1或其任一从属权利要求所述组合物中的组分(a)、(b)和(c)进行组合从而生产疫苗组合物的步骤。

6.如权利要求1或2任一项所述的组合物或权利要求5所述的方法，其中所述菊粉颗粒与磷酸铝或氢氧化铝形成复合物。