CN117630252B - 一种虾蟹类血样中法尼酸的提取及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种虾蟹类血样中法尼酸的提取及检测方法。提取方法由虾蟹类血样，以乙酸乙酯为溶剂提取制得。检测方法包括以下步骤：（1）以虾蟹类血样法尼酸的提取液为样品液，称取法尼酸标准品粉末溶于甲醇中制备标准品液；（2）采用高效液相色谱与质谱联用方法检测标准品液和样品液；高效液相色谱使用C18色谱柱，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液；所述质谱采用电喷雾离子源MRM多反应检测模式；（3）进行峰面积定量，得到样品中法尼酸浓度。本发明采用高效液相色谱‑质谱联用的方法，检测限低，所用检测量少(5μl)，短时间(10min)内实现可选择的、准确的、高效的完成对FA的检测。
Description
技术领域
本发明涉及提取检测技术领域，特别涉及一种虾蟹类血样中法尼酸的提取及检测方法。
背景技术
虾蟹是一大类典型的经济甲壳动物，例如目前世界上养殖产量最高的虾类凡纳滨对虾(Penaeus vannamei），常见食用蟹拟穴青蟹（Scylla Paramamosain）、榄绿青蟹（Scylla olivacea）蓝蟹(Callinectes sapidus)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)等，其兼具宝贵的经济及科学研究双重价值，因此虾蟹的繁育工作一直是水产养殖与育种研究中的重要环节。过往经验与研究表明，在虾蟹的繁育工作中，掌控蜕皮生长及性腺发育等核心环节往往是保证育种成功率的关键，研究显示，此类过程皆受到激素内分泌系统的精密调控。因此，对激素相关物质的提取检测，有助于了解虾蟹育种核心环节的代谢规律，进而提高各环节的人工可控性。
法尼酸(Farnesoic acid， FA)是甲基法尼酯(Methyl Farnesoate， MF)的直接前体物质，在甲壳动物中由大颚器官合成后部分释放到血液中发挥作用，近年来的研究显示FA展现出与MF类似的功能，即直接或间接地参与到促进甲壳动物性腺发育、幼体生长和蜕皮等生理活动中，目前在多种甲壳动物的研究中，如锈斑蟳(Charybdis feriatus)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)、斑节对虾(Penaeus monodon)、美洲龙虾(Homarus americanus)等，FA的生物学功能均得以证明。不仅如此，根据对FA和MF的生物合成速率及含量测定的研究结果表明，FA相较于MF甚至表现出更为连续且有效的调控作用，具有重要研究价值。
此前对昆虫和甲壳动物中的激素类等的提取检测研究较多，如蜕皮激素提取检测手段不断优化，现已较为广泛采取高效液相色谱或高效液相色谱质谱联用(LiquidChromatograph Mass Spectrometer， LC-MS)等高效准确的方法。反观FA的检测还多采用放射化学检测(Radiochemical assay， RCA)及酶联免疫吸附实验(Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)的方法，然而由于RCA价格昂贵耗时长仅适用于特定情景并且ELISA检测方法存在灵敏度较低以及定量准确性不足等弊端，FA相关研究仍受到技术条件限制。
目前尚未发表一种方法能够有效解决上述问题，即实现虾蟹血中FA的高效准确检测的目标。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种虾蟹类血样中法尼酸的检测方法，实现虾蟹类血中FA的高效准确检测，而且降低了检测成本。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种虾蟹类血样中法尼酸的提取方法，包括以下步骤：
1）取乙酸乙酯于离心管中，冰浴，备用；
2）取虾蟹类血于上述管中；
3）涡旋混匀后，3-5℃低温离心；
4）弃去离心管内沉淀，将其余液体全部转移至硅化瓶中；
5）使用氮气吹干上述液体；
6）将上述硅化瓶内干燥后样品用乙腈复溶后经有机滤膜过滤，得到虾蟹类血样中法尼酸的提取液。
发明人研究过程发现，采用如将乙酸乙酯替换为正己烷，需要多步处理。但本发明利用乙酸乙酯一步提取，快速达到提取目的，提取充分，而且提取效率高。
进一步的，步骤1）乙酸乙酯与步骤2）虾蟹类血的体积比1-5：1；
步骤2）中，所述虾血为采取经抗凝剂浸润过的一次性注射器（1ml）抽取鲜样，抽取量为50-100 μl；
步骤3）中，涡旋时间为1-2min，离心条件：离心力14000-16000g，离心时间10-15min；
步骤4）中，所述硅化瓶为经硅化的棕色玻璃瓶。
进一步的，步骤6）乙腈与步骤2）虾血的体积比为200-300：50-100。
进一步的，所述抗凝剂配方：25-30nM柠檬酸钠、300-350nM氯化钠、110-120mM葡萄糖、8-10mMEDTA，pH值为6.8-7.2。
进一步的，所述有机滤膜的规格为0.2-0.3μm有机滤膜。
一种虾蟹类血样中法尼酸的检测方法，包括以下步骤：
（1）以虾蟹类血样法尼酸提取液为样品液，称取法尼酸标准品粉末溶于甲醇中制备标准品液；
（2）采用高效液相色谱与质谱联用方法检测标准品液和样品液；高效液相色谱使用C18色谱柱，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液；所述质谱采用电喷雾离子源MRM多反应检测模式；
（3）通过SCIEX OS软件进行峰面积定量，得到样品中法尼酸浓度。
发明人研究过程发现，如采用GC-MS测定，不但测量时间长，而且样品处理更为复杂。采用本发明LC-MS检测方法，更好实现对法尼酸的快速高效定性定量检测。
进一步的，步骤（1）中，所述标准品液的制备方法：精密称取法尼酸标准品，以甲醇为溶剂，制备浓度为1-2μg/ml的标准品液。
进一步的，高效液相色谱的检测条件：流动相A为0.08-0.12%v/v甲酸水溶液，流动相B为0.08-0.12%v/v甲酸乙腈溶液，流动相A和流动相B的梯度体积比例为75：25~90：10。
进一步的，高效液相色谱的检测条件：最大压力限制设置为15-16Mpa，进样量为4-6μl，流速为0.2-0.4mL/min，运行总时长为10-15min；所述C18色谱柱的长度为49-51mm，内径为2.0-2.2 mm，填料粒径为2.5-2.7μm ，填料孔径为90-110A。
进一步的，所述梯度洗脱程序，按体积百分比计：
进一步的，所述电喷雾离子源MRM多反应检测模式的检测条件：气帘气30-40psi、喷撞气Medium、离子化温440-460℃、喷雾气38-42psi、辅助加热气44-46 psi、离子化电压4900-5100V、去簇电压78-82V、射入电压9-11V，碰撞电压28-32V、碰撞室射出电压9-11V。
进一步的，正离子模式下[M+H]+,设置3个离子对，同时鉴定法尼酸，取最优，3对母离子/子离子分别为237.2/191.0、237.2/121.2*、237.2/109.1,根据设备运行条件，标准品/虾样品保留时间为4.02min或4.07min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明以虾蟹类血样为材料提取FA，抽提所用试剂单一且用量少，操作简单，利用简易低成本方式即可实现FA的提取，回收率可达97%以上，有利于降低检测成本。
（2）本发明采用高效液相色谱-质谱联用的方法，检测限低，所用检测量少(5μl)，短时间(10min)内实现可选择的、准确的、高效地完成对FA的检测。
（3）本发明实现最低限50μl 抽血检测，保证对虾持续存活，为同批虾中FA的连续性检测创造条件。
附图说明
图1为质谱扫描法尼酸标准品子离子的结果。
图2为法尼酸标准品的洗脱峰及其保留时间。
图3-1为虾类血样品中法尼酸的洗脱峰及其保留时间。
图3-2为蟹类血样品中法尼酸的洗脱峰及其保留时间。
图4为用于实施例2计算的法尼酸标准曲线图。
图5为用于实施例4计算的法尼酸标准曲线图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然所描述的实施例仅是本发明权利要求范围内的部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，在本领域普通技术人员没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例反向高效液相色谱检测条件为SCIEX Exion LC液相仪器，Kinetex2.6μ C18 100A LC Column 50 × 2.1 mm色谱柱，最大压力限制设置为15Mpa，进样量为5μl，流动相A为0.1%v/v甲酸水溶液，流动相B为0.1%v/v甲酸乙腈溶液，流速为0.3 mL/min，运行总时长为10min，梯度洗脱程序具体为下表（%，体积百分比）所示：
本发明实施例质谱检测使用SCIEX QTRAP4500型号仪器，质谱的检测条件为电喷雾离子源MRM多反应检测模式，气帘气35psi、喷撞气Medium、离子化温度450℃、喷雾气40psi、辅助加热气45 psi、离子化电压5000V、去簇电压80V、射入电压10V，碰撞电压30V、碰撞室射出电压10V，正离子模式下[M+H]+，设置3个离子对分别用于定量及定性，3对母离子/子离子为237.2/191.0、237.2/121.2*、237.2/109.1，根据系统即时运行状态，标准品和虾样品保留时间为4.02min或4.07min。
实施例1 凡纳滨对虾血和青蟹中FA的提取及LC-MS定性检测
1、待检测标准品及样品制备
（1）精密称取1.0mg FA标准品(Echelon Bioscience)溶于1.0ml甲醇，得浓度为1.0mg/ml的标准品液，取1μl该浓度标准品于999μl甲醇中，最终得到1.0μg/ml的标准品液，待检测使用。
（2）取500μl乙酸乙酯于1.5ml低吸附离心管中置于冰上备用；
（3）取100μl凡纳滨对虾血和青蟹鲜样于上述管中；
（4）迅速涡旋1min后，于4℃ ×15000g离心10min；
（5）弃去管内沉淀，将其余液体全部转移至硅化管中；
（6）使用氮气吹干上述液体；
（7）将上述管内干燥后样品用200μl乙腈完全复溶后经0.22μm有机滤膜过滤，获得虾、蟹血中FA提取物作为待测样品液。
2、标准品LCMS检测方法建立
（1）首先使用SCIEX QTRAP4500型号仪器对FA标准品进行质谱检测以确定检测所选离子对，按照前述质谱检测条件设置电喷雾离子源MRM多反应检测模式，气帘气35psi、喷撞气Medium、离子化温度450℃、喷雾气40psi、辅助加热气45 psi、离子化电压5000V、去簇电压80V、射入电压10V，碰撞电压30V、碰撞室射出电压10V，正离子模式下[M+H]+下，母离子设置237.2，子离子结果如图1所示，随后确定3对母离子/子离子分别为237.2/191.0、237.2/121.2*、237.2/109.1。
（2）将已置于1.5ml硅化瓶配套的250μl内插管内的标准液装入SCIEX Exion LC高效液相色谱的待检样品架上，按照前述色谱检测条件进行参数设置，随后开始检测。
（3）检测结果如图2显示，FA标准品的保留时间为4.02min，即完成对FA的检测方法建立。3个离子对中237.2/121.2检测灵敏度最优选为定量离子对，在此基础上，通过SCIEXOS软件对检测结果进行峰面积定量，结合适当浓度的标准品检测样设置标准曲线，可实现对FA的定量计算。
（4）将装有待测样品的硅化瓶置于SCIEX Exion LC高效液相色谱的待检样品架上，按照前述色谱检测条件进行参数设置，随后开始检测，血样中FA检测结果如图3-1、图3-2所示，保留时间为4.07min，即完成对虾血(图3-1)和蟹血(图3-2)中FA的定性检测。
实施例2 LC-MS定量计算检测FA提取方法的回收率
1、待检测标准品及样品制备
(1)将已有1.0μg/ml的标准品液稀释十倍，取100μl该浓度标准品于900μl甲醇中，制成100pg/μl的标准品液，以其作为母液按照下表制成对应的标准品液，待检测后以绘制标准曲线。
(2)取500μl乙酸乙酯于1.5ml低吸附离心管中置于冰上备用；
(3) 取100μl浓度为100pg/μl的标准品液于上述管中；
(4) 迅速涡旋1min后，于4℃ ×15000g离心10min；
(5) 弃去管内沉淀，将其余液体全部转移至硅化管中；
(6) 使用氮气吹干上述液体；
(7) 将上述管内干燥后样品用200μl乙腈完全复溶后经0.22μm有机滤膜过滤，获得提取物作为待测样品液。
2、标准品及样品液LC-MS检测
（1）将浓度分别为20、40、60、80、100pg/μl的标准品以及标准品回收样品液分别装入SCIEX Exion LC高效液相色谱的待检样品架上，按照前述色谱检测条件进行参数设置，随后开始检测。
（2）经检测后，通过SCIEX OS软件进行峰面积定量，得出下表所示检测结果，同时绘制FA的标准曲线如图4所示，标准品回收提取样品中，理论浓度为50pg/μl，根据标准曲线所得公式y = 1919x + 12082(R² = 0.9911)计算其回收浓度均值为48.61 pg/μl，最终检验回收率为97.2%。
实施例3 FA提取方法中乙酸乙酯用量测试优化
1、待检测样品制备
(1) 分别取100、200、500μl乙酸乙酯于1.5ml低吸附离心管中置于冰上备用；
(2) 分别取100μl凡纳滨对虾血鲜样于上述管中；
(3) 迅速涡旋1min后，于4℃ ×15000g离心10min；
(4) 弃去管内沉淀，将其余液体全部转移至硅化管中；
(5) 使用氮气吹干上述液体；
(6) 将上述管内干燥后样品用200μl乙腈完全复溶后经0.22μm有机滤膜过滤获得提取物，取提取物95μl加入5μl浓度为lμg/ml(乙腈溶解)的FA标准液，充分混合后作为最终待测样品液。
2、标准品及样品液LC-MS检测
（1）将乙酸乙酯与样品体积比例分别为1:1、1:2、1:5的提取样品液分别装入SCIEXExion LC高效液相色谱的待检样品架上，按照前述色谱检测条件进行参数设置，随后开始检测。
（2）经检测后，通过SCIEX OS软件进行峰面积定量，得出下表所示检测结果：
（3）使用Graphpad Prism 8.0.2 对上表中三组数据进行单素方差分析(One-wayAnova)，根据Brown-Forsythe test 结果，P>0.05(P=0.9454)符合方差齐性，Anova结果显示P>0.05(P=0.7430)三组结果之间无显著差异，同时Tukey’s多重比较结果显示任意两组之间均无显著差异，总结上述表明该抽提试剂可选1:1-1:5皆可获取较好提取效果。
实施例4定量计算检验本发明检测方法对低量血样的检测效果
1、待检测标准品及样品制备
(1)将已有1.0μg/ml的标准品液稀释十倍，取100μl该浓度标准品于900μl甲醇中，制成100pg/μl的标准品液，以其作为母液按照下表制成对应的标准品液，待检测后以绘制标准曲线。
(2) 分别取250、500μl乙酸乙酯于1.5ml低吸附离心管中置于冰上备用；
(3) 分别取50、100μl凡纳滨对虾血鲜样于上述管中；
(4) 迅速涡旋1min后，于4℃ ×15000g离心10min；
(5) 弃去管内沉淀，将其余液体全部转移至硅化管中；
(6) 使用氮气吹干上述液体；
(7) 将上述管内干燥后样品用200μl乙腈完全复溶后经0.22μm有机滤膜过滤获得提取物，取提取物95μl加入5μl浓度为lμg/ml(乙腈溶解)的FA标准液，充分混合后作为最终待测样品液。
2、标准品及样品液LC-MS检测
(1)将浓度分别为10、40、60、75、90pg/μl的标准品以及血样量分别为50、100μl的提取样品液分别装入SCIEX Exion LC高效液相色谱的待检样品架上，按照前述色谱检测条件进行参数设置检测。
(2)经检测后，通过SCIEX OS软件进行峰面积定量，绘标准曲线如图5所示，根据方程y=2365.8x+1766.7(R2=0.9968)进行浓度计算，得出结果如下表所示：
(3)对上表中计算浓度数据进行处理，减掉理论浓度值50 pg/μl，计算浓度虾样50的浓度值~1.19±0.24，虾样100的浓度值~4.14±0.95，二者之间存在浓度比~1:2结果，因此表明本发明检测方法适用于虾血量50-100μl的FA检测。
本发明的检测方法适用于虾类血样法尼酸检测，同时适用于蟹类血样法尼酸检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种虾蟹类血样中法尼酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以虾蟹类血样中法尼酸的提取方法制备的血样法尼酸提取液为样品液，称取法尼酸标准品粉末溶于甲醇中制备标准品液；
（2）采用高效液相色谱与质谱联用方法检测标准品液和样品液；高效液相色谱使用C18色谱柱，使用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸乙腈溶液；所述质谱采用电喷雾离子源MRM多反应检测模式；
（3）进行峰面积定量，得到样品中法尼酸浓度；
所述虾蟹类血样中法尼酸的提取方法包括以下步骤：
1）取乙酸乙酯于离心管中，冰浴，备用；
2）取血样于上述管中；
3）涡旋混匀后，3-5℃低温离心；
4）弃去离心管内沉淀，将其余液体全部转移至硅化瓶中；
5）使用氮气吹干上述液体；
6）将上述硅化瓶内干燥后样品用乙腈复溶后经有机滤膜过滤，得到血样法尼酸提取液；
步骤1）乙酸乙酯与步骤2）血样的体积比1-5：1。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
步骤2）中，所述血样为采取经抗凝剂浸润过的注射器抽取鲜样，抽取量为50-100 μl；
步骤3）中，涡旋时间为1-2min，离心条件：离心力14000-16000g，离心时间10-15min；
步骤4）中，所述硅化瓶为经硅化的棕色玻璃瓶。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤6）乙腈与步骤2）虾血的体积比为200-300：50-100。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述标准品液的制备方法：精密称取法尼酸标准品，以甲醇为溶剂，制备浓度为1-2μg/ml的标准品液。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，高效液相色谱的检测条件：流动相A为0.08-0.12%v/v甲酸水溶液，流动相B为0.08-0.12%v/v甲酸乙腈溶液，流动相A和流动相B的梯度体积比例为75：25~90：10。
6.根据权利要求1或5所述的检测方法，其特征在于，高效液相色谱的检测条件：最大压力限制设置为15-16Mpa，进样量为4-6μl，流速为0.2-0.4mL/min，运行总时长为10-15min；所述C18色谱柱的长度为49-51mm，内径为2.0-2.2 mm，填料粒径为2.5-2.7μm ，填料孔径为90-110A。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序，按体积百分比计：
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述电喷雾离子源MRM多反应检测模式的检测条件：气帘气30-40psi、喷撞气Medium、离子化温440-460℃、喷雾气38-42psi、辅助加热气44-46 psi、离子化电压4900-5100V、去簇电压78-82V、射入电压9-11V，碰撞电压28-32V、碰撞室射出电压9-11V。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，正离子模式下[M+H]+，设置3个离子对，同时鉴定法尼酸，3对母离子/子离子分别为237.2/191.0、237.2/121.2、237.2/109.1，其中237.2/121.2为用于定量的离子对，根据设备运行条件，标准品/虾样品保留时间为4.02min或4.07min。
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115792012A (zh) * | 2022-11-30 | 2023-03-14 | 兰州海关技术中心 | 一种检测玫瑰花露香气成分的方法、玫瑰花露香气成分含量的测定方法 |
Family Cites Families (1)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| STAGE-DEPENDENT BIOSYNTHESIS OF METHYL FARNESOATE AND JUVENILE HORMONE III AND METABOLISM OF JUVENILE HORMONE III IN EMBRYOS OF THE COCKROACH, NA UPHOETA CINEREA;CHRISTA BURGIN等;《Insect Biochem》;19881231;第18卷(第1期);第4页左栏第3段 * |
| 养殖三疣梭子蟹中甲基法尼酯的GC/MS分析;侯云丹;沈洁;徐继林;朱冬发;严小军;;宁波大学学报(理工版);20111010(04);第25-28页 * |
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