CN117630242A - 高效液相色谱法分离并检测克霉唑中间体中杂质a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物分析化学技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法分离并检测克霉唑中间体中杂质a的方法。克霉唑中间体具体指邻氯苯基‑二苯基‑氯甲烷，杂质a为二苯基‑(2‑氯苯基)甲醇。该高效液相色谱法包括：采用衍生试剂处理待测样品，得到样品溶液；以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱固定相，采用水作为流动相A，甲醇作为流动相B，通过线性梯度洗脱将杂质a和克霉唑中间体的衍生物进行分离；然后进入检测器进行检测；根据色谱结果，采用外标法对杂质a进行定性和定量。本发明方法专属性强、耐用性好、检测限低，对邻氯苯基‑二苯基‑氯甲烷及克霉唑产品的质量控制具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于药物分析化学技术领域，具体涉及一种高效液相色谱法分离并检测克霉唑中间体中杂质a的方法。
背景技术
克霉唑是一种高效、价廉的广谱抗真菌药物，对白色念珠菌、红色毛癣菌、石膏样毛癣菌、新型隐球菌、曲菌、藻菌等具有显著抑制作用。邻氯苯基-二苯基-氯甲烷，为合成克霉唑的关键中间体，其合成路线主要由两条，一是以邻氯三氯甲苯为原料，在苯中经无水三氯化铝催化发生傅克反应，再与氯化亚砜进行氯代反应制得；二是由二苯基-(2-氯苯基)甲醇和二甲亚砜在通入氯气条件下，90℃回流5小时反应生成。邻氯苯基-二苯基-氯甲烷极易水解，如果保存条件不当会生成二苯基-(2-氯苯基)甲醇，即药典杂质Ⅰ，该杂质在USP、EP、JP、BP中均有记载。药典规定在克霉唑中必须将此杂质限度控制在0.3％以下，相关制剂必须将其限度控制在1.0％以下，由此可见在本品中对杂质二苯基-(2-氯苯基)甲醇的控制是非常重要的，这关系到终产物克霉唑是否合格。
邻氯苯基-二苯基-氯甲烷，英文化学名为1-Chloro-2-(chlorodiphenylmethyl)benzene，分子式为C19H14Cl2，分子量为313.22，CAS号为42074-68-0，结构式如式Ⅰ所示。二苯基-(2-氯苯基)甲醇(杂质a)的结构式如式Ⅱ所示。
目前暂未检索到有关邻氯苯基-二苯基-氯甲烷中二苯基-(2-氯苯基)甲醇的分析方法，因此，亟需寻找一种新的方法对邻氯苯基-二苯基-氯甲烷中的二苯基-(2-氯苯基)甲醇进行检测和控制。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种利用柱前衍生化法分离克霉唑中间体中杂质a的方法，该方法可在30分钟内或大于30分钟的时间实现克霉唑中间体中杂质a的分离，具有专属性强、耐用性好，分析时间短的特点。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
利用柱前衍生化法分离克霉唑中间体中杂质a的方法，所述克霉唑中间体为邻氯苯基-二苯基-氯甲烷，其结构式如式Ⅰ所示；所述杂质a为二苯基-(2-氯苯基)甲醇，其结构式如式Ⅱ所示；所述柱前衍生化法包括：采用衍生试剂处理待测样品，得到样品溶液；以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱固定相，采用流动相A和流动相B作为流动相，所述流动相A为水，所述流动相B为甲醇；通过梯度洗脱将所述杂质a和所述克霉唑中间体的衍生物进行分离；
本发明研究发现，若直接进液相系统，杂质a与本品邻氯苯基-二苯基-氯甲烷会在同一位置出峰，且药典相关方法只适用于克霉唑中对此杂质的检测，不适用于本品。所以本发明采用苯胺衍生的方法对本品进行柱前衍生，使本品(衍生物)与二苯基-(2-氯苯基)甲醇进行有效分离。本发明方法对克霉唑的合成及质量控制具有重要的意义。
进一步，所述衍生试剂为苯胺和乙腈的混合溶液，其中苯胺和乙腈的体积比为1：1。
进一步，衍生处理的温度为40-60℃，优选为50℃。
进一步，所述梯度洗脱程序如下：
在0分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为25-40：60-75；
在2分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为25-40：60-75；
在20分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为10-20：80-90；
在21分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为25-40：60-75；
在30分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为25-40：60-75。
作为优选，所述梯度洗脱程序如下：
在0分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为28-32：68-72；
在2分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为28-32：68-72；
在20分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为10：90；
在21分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为28-32：68-72；
在30分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为28-32：68-72。
作为最优选，所述梯度洗脱程序如下：
在0分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为30：70；
在2分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为30：70；
在20分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为10：90；
在21分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为30：70；
在30分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为30：70。
进一步，柱流速为0.8-1.5ml/min，优选为0.9-1.1ml/min，更优选为1.0ml/min；柱温为15-25℃，优选为18-22℃，更优选为20℃。
作为优选，色谱柱采用GL Sciences AX-C18；色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm。
作为优选，进样体积为10μl。
本发明的目的之二在于提供一种检测克霉唑中间体中是否含有杂质a的方法，该方法成功实现了霉唑中间体中杂质a的定性检测，且检测限低至0.0904μg/ml，具有较高的灵敏度。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
检测克霉唑中间体中是否含有杂质a的方法，利用前述方法将所述杂质a从所述克霉唑中间体中分离；并进入检测波长为225±5nm的检测器进行检测，得到色谱图；根据检测品与对照品的色谱行为的一致性来判断克霉唑中间体中是否含有杂质a。
作为优选，所述检测波长为225nm。
通过保留时间，可以对杂质a进行定性。
进一步，保留时间为11.9±0.5min，判定为所述杂质a；保留时间为19.8±0.5min，判定为所述克霉唑中间体的衍生物。
本发明的目的之三在于提供一种测定克霉唑中间体中杂质a含量的方法，该方法操作简单，重现性好，成功实现了克霉唑中间体中杂质a的定量检测。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
测定克霉唑中间体中杂质a含量的方法，包括如下步骤：
(1)采用衍生试剂处理待测样品，并采用溶剂配制得到样品溶液和对照品溶液；
(2)利用权利要求6-8任一项所述的方法对样品溶液和对照品溶液进行检测，并得到色谱图；
(3)根据步骤(2)获得色谱图，采用外标法以峰面积计算杂质a的含量。
进一步，所述溶剂为乙腈水溶液，其中乙腈和水的体积比为95:5。
进一步，在0.3-30.1μg/ml浓度范围内，所述杂质a的线性方程为y＝0.424x+0.0053，r＝1.0000；其中，x为X轴，表示浓度，y为Y轴，表示峰面积。
作为优选的实施方法：
1.取本品如75mg，精密称定，置10ml量瓶中，立即加入衍生化试剂5ml，超声使溶解，置50℃水浴中加热10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密移取适量，用溶剂稀释制成每1ml中约含0.3mg的溶液，作为样品溶液；
2.精密称取杂质a对照品适量，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含9μg的溶液，作为对照品溶液；
3.精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；并按外标法以峰面积计算杂质含量。
进一步，配制标准品，检测得标准品色谱图；测试样品所得色谱图,按外标法以峰面积进行计算含量计算。
所述标准品为已知组份含量，所述测试样品组份含量为未知。
所得的标准样品色谱图可以储存于数据库中，作为智慧药厂中质量控制的图谱素材，用于帮助机器人判定其生产的产品是否合格，对不合格的产品给出可定量的改进分析建议。
作为优选，若杂质a含量小于3.0％，表示样品合格。
本发明的有益效果在于：
1.本发明选择苯胺-乙腈混合溶液作为衍生液进行加热衍生，用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，水-甲醇洗脱系统，在30分钟内实现了二苯基-(2-氯苯基)甲醇的检测，具有检测时间短的特点。
2.本发明提供的检测方法，与本品中可能存在的其他杂质间分离度均能满足要求，不受其他杂质和供试品干扰，能够准确、高效的对杂质a进行定量，具有较强的专属性和耐用性；同时也可以对混合溶液中其余检出杂质按峰面积归一化法定量。
3.本发明提供的检测霉唑中间体中杂质a的方法，检测限低至0.0904μg/ml，具有灵敏度高的特点。
附图说明
图1为混合溶液的HPLC图；
图2为耐用性-流速0.9ml/min-混合溶液的HPLC图；
图3为耐用性-流速1.1ml/min-混合溶液的HPLC图；
图4为耐用性-柱温18℃-混合溶液的HPLC图；
图5为耐用性-柱温22℃-混合溶液的HPLC图；
图6为耐用性-流动相初始比例(有机相68％)-混合溶液的HPLC图；
图7为耐用性-流动相初始比例(有机相72％)-混合溶液的HPLC图；
图8为检测限溶液的HPLC图；
图9为线性溶液1#的HPLC图；
图10为线性溶液2#的HPLC图；
图11为线性溶液3#的HPLC图；
图12为线性溶液4#的HPLC图；
图13为线性溶液5#的HPLC图；
图14为线性溶液6#的HPLC图；
图15为线性溶液7#的HPLC图；
图16为线性关系图。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，分离并检测克霉唑中间体中杂质a的高效液相色谱法，步骤如下：
1.色谱条件
如表1和表2所示。
表1.色谱条件
表2.梯度洗脱程序表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 25～40 | 60～75 |
| 2 | 25～40 | 60～75 |
| 20 | 10～20 | 80～90 |
| 21 | 25～40 | 60～75 |
| 30 | 25～40 | 60～75 |
2.溶液配制
供试品溶液：取本品75mg，精密称定，置10ml量瓶中，立即加入衍生化试剂5ml，超声使溶解，置50℃水浴中加热10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密移取适量，用溶剂稀释制成每1ml中约含0.3mg的溶液。
对照品溶液精密称取杂质a对照品适量，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含9μg的溶液。
3.测试方法
精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，含杂质a不得过3.0％。
本发明实施例中，实施例测得的图谱结果中，Z1c即为杂质a。
本发明实施例中，如无其他说明，均按如下色谱条件进行检测：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(GL Sciences AX-C18，4.6mm×250mm，5μm，或效能相当的色谱柱)；以水为流动相A，甲醇为流动相B，按表3进行线性梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为20℃；检测波长为225nm；进样体积10μl。
表3.梯度洗脱程序表
实施例1.专属性
1.配制待测试剂
衍生化试剂(当日使用)：苯胺-乙腈(1:1)。
空白溶液：移取衍生化试剂5ml，置10ml量瓶中，置50℃水浴中加热10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，精密移取1ml，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品贮备液：精密称取本品约75mg，置10ml量瓶中，立即加入衍生化试剂5ml，超声使溶解，置50℃水浴中加热10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：精密移取供试品贮备液1ml，置25ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质a贮备液：精密称取杂质a对照品30mg，置50ml量瓶中，加乙溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密移取杂质a贮备液2.5ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。(10％)
杂质a定位溶液：精密移取杂质a贮备液3ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
其他混合贮备液：移取杂质邻氯三氯甲苯、2-氯苯甲酸、三苯基氯甲烷、三苯基甲醇、1-氯-3-(氯二苯基甲基)苯、二苯基-(3-氯苯基)甲醇、1-苄基-2-氯苯、1,1'-[(2-氯苯基)亚甲基]二苯、2-氯苯甲酰氯各5mg，杂质1-氯-2-[二氯(苯基)甲基]苯、1-氯-4-(氯二苯基甲基)苯、二苯基-(4-氯苯基)甲醇、2-氯二苯甲酮各10mg，置50ml量瓶中，立即加入衍生化试剂25ml，超声使溶解，置50℃水浴中加热10分钟，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，再精密移取1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
其他杂质混合溶液：精密移取其他杂质混合贮备液1.5ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
混合溶液：精密移取供试品贮备液0.4ml，置10ml量瓶中，加入对照品贮备液3ml、其他杂质混合贮备液0.3ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
2.检测
取上述空白溶液、供试品溶液、杂质a定位溶液、其他杂质混合溶液和混合溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见图1和如下表4，图1中，第四个峰为杂质a，最高峰为主成分衍生物。
表4.专属性试验检测结果表
实施例2.耐用性
取“实施例1.专属性”项下混合溶液，分别微调各色谱条件(包括柱流速±0.1ml/分钟，柱温±2℃，流动相B初始比例±2％)进行实验，考察各峰之间的分离度。
试验结果见图2-图7和如下表5，当流速、柱温、流动相比例微小的波动时，各组分峰间分离度均大于1.5，表明本发明具有良好的耐用性。
表5.色谱系统耐用性测定结果
实施例3.检测限
1.溶液配制
检测限贮备液：精密称取杂质a对照品30mg，置,50ml量瓶中，加乙溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密移取杂质a贮备液2.5ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限溶液：精密移取检测限贮备液0.3ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
2.检测
精密量取检测限溶液10μl，连续进样3次，记录色谱图，并计算各峰的信噪比。结果见图8和如下表6。
表6.检测限试验结果
实施例4.线性
1.配制待测溶液
线性贮备液：精密称取杂质a对照品30mg，置50ml量瓶中，加乙溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密移取杂质a贮备液2.5ml，置50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液1#～3#：精密移取线性贮备液各1ml，分别置100ml、25ml、10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液4～6#：精密移取线性贮备液3ml、5ml、8ml，置3个不同的10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
线性溶液7#：即线性贮备液。
2.检测
取上述各线性溶液，按浓度由低到高依次进样，记录色谱图，以浓度X(μg/ml)对峰面积Y用最小二乘法线性回归，计算回归方程及相关系数。试验结果见图9-图16及如下表7。
表7.线性试验结果表
Claims (10)
1.利用柱前衍生化法分离克霉唑中间体中杂质a的方法，其特征在于，所述克霉唑中间体为邻氯苯基-二苯基-氯甲烷，其结构式如式Ⅰ所示；所述杂质a为二苯基-(2-氯苯基)甲醇，其结构式如式Ⅱ所示；所述柱前衍生化法包括：采用衍生试剂处理待测样品，得到样品溶液；以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱固定相，采用流动相A和流动相B作为流动相，所述流动相A为水，所述流动相B为甲醇；通过梯度洗脱将所述杂质a和所述克霉唑中间体的衍生物进行分离；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生试剂为苯胺和乙腈的混合溶液，其中苯胺和乙腈的体积比为1：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，衍生处理的温度为40-60℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序如下：
在0分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为25-40：60-75；
在2分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为25-40：60-75；
在20分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为10-20：80-90；
在21分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为25-40：60-75；
在30分钟，设置所述流动相A和所述流动相B的体积比为25-40：60-75。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，柱流速为0.8-1.5ml/min；柱温为15-25℃。
6.检测克霉唑中间体中是否含有杂质a的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述的方法将所述杂质a从所述克霉唑中间体中分离；并进入检测波长为225±5nm的检测器进行检测，得到色谱图；根据检测品与对照品的色谱行为的一致性来判断克霉唑中间体中是否含有杂质a。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，保留时间为11.9±0.5min，判定为所述杂质a；保留时间为19.8±0.5min，判定为所述克霉唑中间体的衍生物。
8.测定克霉唑中间体中杂质a含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用衍生试剂处理待测样品，并采用溶剂配制得到样品溶液和对照品溶液；
(2)利用权利要求6-7任一项所述的方法对样品溶液和对照品溶液进行检测，并得到色谱图；
(3)根据步骤(2)获得色谱图，采用外标法以峰面积计算杂质a的含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述溶剂为乙腈水溶液，其中乙腈和水的体积比为95:5。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在0.3-30.1μg/ml浓度范围内，所述杂质a的线性方程为y＝0.424x+0.0053，r＝1.0000；其中，x为X轴，表示浓度，y为Y轴，表示峰面积。
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