CN113884584A - 一种氟比洛芬和/或氟比洛芬酯含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种氟比洛芬酯注射液的检测方法，所述方法包括采用高效液相色谱仪对待检测样品进行检测，其中检测所用的色谱柱为CAPCELL PAK C18色谱柱，流动相为甲醇‑水‑冰醋酸。本发明能提供一种改进的氟比洛芬和氟比洛芬酯含量测定分析方法，该方法具有较好的专属性、准确性及灵敏度。

Description

一种氟比洛芬和/或氟比洛芬酯含量的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种氟比洛芬和氟比洛芬酯含量测定分析方法。

背景技术

氟比洛芬酯是氟比洛芬的前体，是一种在临床上应用十分广泛的非甾体抗炎药物，具有解热、抗炎以及止痛的作用。其作用机理主要是抑制花生四烯酸环氧酶的活性，从而抑制疼痛和炎症反应的前列腺素的合成，起到镇痛的作用。

其化学名为(±)2-(2-氟-4-联苯基)丙酸-1-乙酰氧基乙酯(FP83)，结构式如下：

而氟比洛芬酯中会含有氟比洛芬(FP)、氟比洛芬脱氟物、氟比洛芬酯脱氟物，它们的具体结构如下：

如何有效的检测氟比洛芬酯注射液中的氟比洛芬(FP)、氟比洛芬脱氟物、氟比洛芬酯脱氟物的含量对于判断氟比洛芬酯注射液质量是非常重要的。目前上市的氟比洛芬酯产品为(5ml:50mg)氟比洛芬酯注射液，(5ml:50mg)氟比洛芬酯注射液中氟比洛芬和氟比洛芬酯含量测定分析方法参见有注册标准YBH15412004-2014Z。

但发明人在实际研究中发现，采用已有方法进行检测时，FP与FP83各自的脱氟物干扰待测物，分离度不能满足基线分离，影响结果的准确性其含量通常包括部分或全部的脱氟物，已有检测方法不能更加准确有效的进行检测，特别在对药品质量和用药安全要求大幅提升的情况下，原有检测方法已不能有效满足对药品质量提升以及新增高规格的氟比洛芬酯注射液产品的检测要求。

因此，开发一种更加有效的氟比洛芬酯注射液中的氟比洛芬和氟比洛芬酯含量的检测方法是非常必要的。

发明内容

针对以上技术现状，本发明提供一种氟比洛芬和氟比洛芬酯含量测定分析方法。

所述氟比洛芬酯注射溶液制剂中氟比洛芬和/或氟比洛芬酯的含量检测方法，所述方法包括通过高效液相色谱法进行测定，所述高效液相条件为：

色谱柱为：CAPCELL PAK C18色谱柱，

流动相为：甲醇-水-冰醋酸的体积比为(1095～1105)：(905～895)：3。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述色谱柱为CAPCELL PAK C18色谱柱，规格为3.0×50mm，3μm。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述流动相甲醇-水-冰醋酸体积比为1095:905:3、1100:900:3或1105:895:3；优选为甲醇-水-冰醋酸体积比为1100:900:3。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括高效液相色谱法检测的柱温为38～42℃；优选为40℃。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括高效液相色谱法检测的流速为0.9～1.1mL/min；优选为1.0mL/min。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括高效液相色谱法检测的检测波长为245～249nm，优选为247nm。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法中的溶液制剂为氟比洛芬酯注射剂；优选规格为5ml:50mg或10ml:100mg氟比洛芬酯注射液。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括高效液相色谱法检测FP83所用氟比洛芬酯注射液供试品溶液的浓度为0.02mg/mL，检测FP所用氟比洛芬酯注射液供试品溶液的浓度为0.08mg/mL；优选用无水乙醇稀释待检测样品。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括高效液相色谱法检测时，所述氟比洛芬对照品溶液的浓度为0.008mg/mL；所述氟比洛芬酯对照品溶液的浓度为0.02mg/mL；作为实施方案之一，优选用含内标联苯的无水乙醇稀释对照品溶液。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括高效液相色谱仪法检测的进样体积为2～10μL，优选为5μL。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括，所述待检测样品为氟比洛芬酯注射剂；优选规格为10ml:100mg氟比洛芬酯注射液。

本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括以下步骤：

高效液相条件为：

色谱柱为：CAPCELL PAK C18色谱柱，规格为3.0×50mm，3μm；

流动相为：甲醇-水-冰醋酸的体积比为(1100)：(900)：3；

流速为1.0mL/min；

进样量为5μL；

柱温40℃；

检测波长为247nm；

内标溶液的制备：取联苯500mg，置500mL量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；

标准对照品溶液制备：

FP对照品溶液制备：取氟比洛芬(FP)对照品(减压干燥4小时)约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置50mL量瓶中，精密加入内标溶液2mL，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取2mL，置5mL量瓶中，摇匀，作为对照品溶液，平行配制两份，其中制得FP对照品溶液的浓度为0.008mg/mL；

FP83对照品溶液制备：取氟比洛芬酯对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，精密加入上述内标溶液2mL，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置10mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，平行配制两份，其中制得FP83对照品溶液的浓度为0.02mg/mL。

待测供试品溶液制备

FP待测供试品溶液的制备：精密量取氟比洛芬酯注射液1mL，置50mL量瓶中，精密加入内标溶液2mL，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取2mL，置5mL量瓶中，摇匀，作为供试品溶液，平行配制两份，其中制得FP待测供试品溶液的浓度为0.08mg/mL；

FP83待测供试品溶液制备：精密量取氟比洛芬酯注射液1mL，置50mL量瓶中，精密加入内标溶液2mL，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置10mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平行配制两份，其中制得FP83待测供试品溶液的浓度为0.02mg/mL；

分别进行FP和FP83的检测，并按以下进行检测结果统计：

使用如下公式通过计算最终获得FP和FP83的含量

FP(mg/mL)＝Q_SP/Q_{ST1(1-5)平均}×C_ST1-FP×n_SP

式中：

Q_SP为供试品溶液色谱图中氟比洛芬峰面积与内标峰面积比；

Q_{ST1(1-5)平均}为对照品溶液中前5针色谱图中氟比洛芬峰面积与内标峰面积比的均值；

C_ST1-FP(mg/mL)为对照品溶液中FP的浓度(mg/mL)；

n_SP为供试品稀释倍数。

FP83(％)＝Q_SP/Q_{ST1(1-5)平均}×C_ST1-FP83×n_SP/10×100％

式中：

Q_SP为供试品溶液色谱图中氟比洛芬酯峰面积之和与内标峰面积比；

Q_{ST1(1-5)平均}为对照品溶液中前5针色谱图中氟比洛芬酯峰面积之和与内标峰面积比均值；

C_ST1-FP83为对照品溶液中FP83的浓度(mg/mL)；

n_SP为供试品稀释倍数。

本发明方法能够避免传统检测方法中FP与FP83各自的脱氟物对待测物的干扰，分离度能够满足基线分离，具有更好的专属性、准确性及灵敏度，可以适应不同规格、特别是高规格的氟比洛芬酯注射液的检测，同时，本发明方法检测时间短，可以有效提高检测效率，解决了原有方法存在的技术缺陷。

附图说明

图1为实施例1的FP83对照品溶液色谱图。

图2为实施例1的FP对照品溶液色谱图。

图3为实施例2的FP与FP脱氟物混合对照色谱图。

图4为实施例2的FP83与FP83脱氟物混合对照色谱图。

图5为实施例3的FP对照品溶液色谱图。

图6为实施例3的FP83对照品溶液及与FP83脱氟物的混合对照溶液色谱图(叠加)。

图7为实施例4的FP83供试品溶液(1μg和0.1μg)色谱图(叠加)。

图8为实施例5的FP对照品溶液及与FP脱氟物混合对照品溶液色谱图(叠加)。

图9为实施例5的FP83对照品溶液及与FP83脱氟物混合对照品溶液色谱图(叠加)。

图10为实施例6的FP对照品溶液色谱图。

图11为实施例6的FP83对照品溶液色谱图。

图12为实施例7的FP对照品溶液及与FP脱氟物混合对照品溶液色谱图(叠加)。

图13为实施例7的FP83对照品溶液及与FP83脱氟物混合对照品溶液色谱图(叠加)。

具体实施方式

以下实施例和试验例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。

下文实施例和对比例所采用的材料或仪器具体如下：

仪器、设备

对照品和物料

试剂、试液

名称	批号	厂家
			乙腈	K51142730911	Merck
甲醇	I1042307932	Merck
			冰醋酸	15060087	TEDIA
无水乙醇	K50919727850	Merck

实施例1(对比实施例)凯纷5ml:50mg氟比洛芬和氟比洛芬酯含量测定分析方法(参见注册标准YBH15412004-2014Z的检测方法)

色谱条件：

实验方法：

实验结果：参见图1-2，该方法在FP和FP83对照品溶液中的主峰前均有杂质干扰峰，分离度分别为0.957和0.969，均不大于1.5，影响积分及含量计算的准确性。

实施例2未知干扰峰的定性研究

研究发现，FP83-1峰前的干扰峰可能是FP83脱氟物-1峰，结合原料的合成工艺路线，其脱氟物主要源于其前体FP中的脱氟物，因此，推测附图2中在FP主峰前的干扰峰可能是FP脱氟物，对其分别定性研究。

实验方法：分别取FP和FP脱氟物对照品各适量，用无水乙醇配制成1mL中分别约含0.5μg/mL的混合溶液。分别取FP83和FP83脱氟物对照品各适量，用无水乙醇配制成1mL中分别约含5μg/mL的混合溶液。

实验结果：参见图3-4，通过FP和FP83脱氟物杂质定位，表明原方法条件下在FP及FP83前出现的未知干扰峰即为各自脱氟物。

实施例3

在实施例1方法基础上，仅改变色谱柱柱长，由150*4.6mm,5μm调整为250*4.6mm,5μm，其他条件未变。

实验结果：参见图5-6，改变色谱柱柱长后，FP对照品溶液中，主峰与其脱氟物的分离度可达到1.522，FP83对照品溶液中，FP83脱氟物-1与FP83-1的分离度可达到1.177，但FP83脱氟物-2仍包含于FP83的两个色谱峰中。

实施例4

在实施例1方法基础上，FP83对照品及供试品溶液浓度降低10倍后，即由1μg降低至0.1μg，FP83脱氟物主要由原料引入的工艺杂质，含量较低，且在稳定性阶段不会随着时间增长，故尝试通过降低对照品及供试品溶液的浓度，确保FP83定量的准确。此实施例的重点是通过降低浓度，避免了FP83脱氟物对FP83含量测定的干扰，色谱条件与实施例1相同。

实验结果：参见图7，结果显示，FP83脱氟物不干扰FP83的含量测定。

实施例5(对比实施例)已有检测方法

色谱条件：

实验方法：

实验结果：参见图8-9，FP与FP脱氟物的分离度较原方法降低，FP83脱氟物完全包埋于FP83的色谱峰中。

实施例6

在实施例5方法基础上，尝试将流动相比例调整为与实施例1方法一致(即1200:800:3)，其他条件未变。

实验结果：参见图10-11，FP与FP脱氟物的分离度略有改善，分离度为1.133，但仍未达到1.5。

实施例7

在实施例5方法基础上，对流动相比例进一步进行了调整(即1100:900:3)，其他条件未变。

实验结果：参见图12-13，FP与FP脱氟物的分离度为1.777(如图12所示)，FP和FP脱氟物能有效分离，且FP83及与其脱氟物分离度也有明显改善，1、3峰为FB83脱氟物，2、4峰为FP83，分离度1.275、1.301、1.255(如图13所示)。

实施例8本发明检测方法及验证

色谱条件及实验方法：

(1)准确度

准确度是通过回收率来考察，FP的验证范围覆盖了LOQ～150％限度浓度范围，FP83的验证范围覆盖50％～150％限度浓度范围，按内标法计算。回收率结果如下。

FP及FP83准确度测定结果

结果显示，FP在LOQ～150％范围内的三个浓度水平下，回收率均在80.0％～120.0％范围内；FP83在50％～150％范围内的三个浓度水平下，回收率均在98.0％～102.0％范围内。

(2)耐用性

耐用性测试结果

结果显示，改变柱温±2℃、流速±0.1mL/min、比例±0.25％的条件下，FP与FP脱氟物的分离度均大于1.5。

结论：本发明方法具有较好的专属性、准确性及灵敏度。

实施例9

对不同批次氟比洛芬酯注射液放置12个月(30℃±2)的样品(待检测样品)进行检测。

高效液相条件为：

色谱柱为：CAPCELL PAK C18色谱柱，规格为3.0×50mm，3μm；

流动相为：甲醇-水-冰醋酸的体积比为1100：900：3；

流速为1.0mL/min；

进样量为5μL；

柱温40℃；

检测波长为247nm；

内标溶液的制备：取联苯500mg，置500mL量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；

标准对照品溶液制备：

FP对照品溶液制备：取氟比洛芬对照品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置50mL量瓶中，精密加入内标溶液2mL，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取2mL，置5mL量瓶中，摇匀，作为对照品溶液，平行配制两份；

FP83对照品溶液制备：取氟比洛芬酯对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，精密加入上述内标溶液2mL，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置10mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，平行配制两份。

待测供试品溶液制备：

检测FP所用注射液供试品溶液的制备：精密量取待检测样品1mL，置50mL量瓶中，精密加入内标溶液2mL，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取2mL，置5mL量瓶中，摇匀，作为供试品溶液，平行配制两份；

检测FP83所用注射液供试品溶液的制备：精密量取待检测样品1mL，置50mL量瓶中，精密加入内标溶液2mL，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置10mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平行配制两份。

3.检测结果统计：

使用如下公式通过计算最终获得FP和FP83的含量

FP(mg/mL)＝Q_SP/Q_{ST1(1-5)平均}×C_ST1-FP×n_SP

式中：

Q_SP为供试品溶液色谱图中氟比洛芬峰面积与内标峰面积比；

Q_{ST1(1-5)平均}为对照品溶液中前5针色谱图中氟比洛芬峰面积与内标峰面积比的均值；

C_ST1-FP(mg/mL)为对照品溶液中FP的浓度(mg/mL)；

n_SP为供试品稀释倍数。

FP83(％)＝Q_SP/Q_{ST1(1-5)平均}×C_ST1-FP83×n_SP/10×100％

式中：

Q_SP为供试品溶液色谱图中氟比洛芬酯峰面积之和与内标峰面积比；

Q_{ST1(1-5)平均}为对照品溶液中前5针色谱图中氟比洛芬酯峰面积之和与内标峰面积比均值；

C_ST1-FP83为对照品溶液中FP83的浓度(mg/mL)；

n_SP为供试品稀释倍数。

结果参见下表

结果显示，本发明方法适用于不同规格的氟比洛芬酯注射液，准确、高效的检测出氟比洛芬酯注射液中氟比洛芬和氟比洛芬酯的含量。

Claims (12)

1.一种氟比洛芬酯注射液制剂中氟比洛芬和/或氟比洛芬酯的含量检测方法，其特征在于，所述方法包括通过高效液相色谱法进行测定，所述高效液相条件为：

色谱柱为：CAPCELL PAK C18色谱柱，

流动相为：甲醇-水-冰醋酸的体积比为(1095～1105)：(905～895)：3。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱为CAPCELL PAK C18色谱柱，规格为3.0×50mm，3μm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相甲醇-水-冰醋酸体积比为1095:905:3、1100:900:3或1105:895:3；优选为甲醇-水-冰醋酸体积比为1100:900:3。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括高效液相色谱法检测的柱温为38～42℃；优选为40℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括高效液相色谱法检测的流速为0.9～1.1mL/min；优选为1.0mL/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括高效液相色谱法检测的检测波长为245～249nm；优选为247nm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中的氟比洛芬酯注射液制剂为5ml:50mg或10ml:100mg规格的氟比洛芬酯注射液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括高效液相色谱法检测FP83所用氟比洛芬酯注射液供试品溶液的浓度为0.02mg/mL，检测FP所用氟比洛芬酯注射液供试品溶液的浓度为0.08mg/mL；优选用无水乙醇稀释待检测样品。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括高效液相色谱法检测时，所述氟比洛芬对照品溶液的浓度为0.008mg/mL；所述氟比洛芬酯对照品溶液的浓度为0.02mg/mL；优选用含内标联苯的无水乙醇稀释对照品溶液。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括高效液相色谱法检测的进样体积为2～10μL，优选为5μL。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括，所述待检测样品选择规格为10ml:100mg氟比洛芬酯注射液。

12.根据权利要求1～11任一所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括以下步骤：

高效液相条件为：

色谱柱为：CAPCELL PAK C18色谱柱，规格为3.0×50mm，3μm；

流动相为：甲醇-水-冰醋酸的体积比为(1100)：(900)：3；

流速为1.0mL/min；

进样量为5μL；

柱温40℃；

检测波长为247nm；

内标溶液的制备：取联苯500mg，置500mL量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；

标准对照品溶液制备：

FP对照品溶液制备：取氟比洛芬对照品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置50mL量瓶中，精密加入内标溶液2mL，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取2mL，置5mL量瓶中，摇匀，作为对照品溶液，平行配制两份，其中制得FP对照品溶液的浓度为0.008mg/mL；

FP83对照品溶液制备：取氟比洛芬酯对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，精密加入上述内标溶液2mL，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置10mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，平行配制两份，其中制得FP83对照品溶液的浓度为0.02mg/mL；

待测供试品溶液制备：

检测FP所用待测供试品溶液的制备：精密量取氟比洛芬酯注射液1mL，置50mL量瓶中，精密加入内标溶液2mL，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取2mL，置5mL量瓶中，摇匀，作为供试品溶液，平行配制两份，其中制得FP待测供试品溶液的浓度为0.08mg/mL；

检测FP83所用待测供试品溶液制备：精密量取氟比洛芬酯注射液1mL，置50mL量瓶中，精密加入内标溶液2mL，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置10mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平行配制两份，其中制得FP83待测供试品溶液的浓度为0.02mg/mL；

分别进行FP和FP83的检测，并按以下进行检测结果统计：

分别使用如下公式通过计算最终计算FP和FP83的含量

FP(mg/mL)＝Q_SP/Q_{ST1(1-5)平均}×C_ST1-FP×n_SP

式中：

Q_SP为供试品溶液色谱图中氟比洛芬峰面积与内标峰面积比；

Q_{ST1(1-5)平均}为对照品溶液中前5针色谱图中氟比洛芬峰面积与内标峰面积比的均值；

C_ST1-FP(mg/mL)为对照品溶液中FP的浓度(mg/mL)；

n_SP为供试品稀释倍数；

FP83(％)＝Q_SP/Q_{ST1(1-5)平均}×C_ST1-FP83×n_SP/10×100％

式中：

Q_SP为供试品溶液色谱图中氟比洛芬酯峰面积之和与内标峰面积比；

Q_{ST1(1-5)平均}为对照品溶液中前5针色谱图中氟比洛芬酯峰面积之和与内标峰面积比均值；

C_ST1-FP83为对照品溶液中FP83的浓度(mg/mL)；

n_SP为供试品稀释倍数。

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