CN117625803A - 一种影响绵羊阶段体重的snp分子标记及其应用 - Google Patents

一种影响绵羊阶段体重的snp分子标记及其应用 Download PDF

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李发弟
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赵源
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Abstract

本发明提供了一种影响绵羊阶段体重的SNP分子标记及其应用。其分子标记为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第212位的位点，该位点具有C/T多态性，进一步使用KASPar引物对1067只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对不同基因型与体重性状指标进行关联分析，发现该位点与湖羊的体重呈显著相关，研究发现当基因型为TT和TC型个体的体重显著高于CC型个体。本发明的分子标记可作为检测绵羊阶段体重性状的相关分子标记，可用于绵羊的标记辅助育种上，用于筛选快速生长型绵羊，同时可以在绵羊出生时就通过检测基因型进行选择，加快了育种进程，并能降低育种成本。

Description

一种影响绵羊阶段体重的SNP分子标记及其应用
技术领域
本发明属于绵羊分子标记的筛选与制备技术领域，具体涉及一种影响绵羊阶段体重的SNP分子标记及其应用。
背景技术
在肉羊生产实践中，体重作为重要的经济性状，它与羊肉生产效率、企业的经济效益以及饲养者的积极性密切相关。增加体重是提高肉用性能和盈利能力的有效途径，并且提高肉羊品种的肉用性能是《全国羊遗传改良计划(2021-2035年)》的核心指标。随着分子遗传学和测序技术的发展，分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)已被应用于畜禽遗传改良中。目前已筛选出与绵羊生长性状相关的候选基因及分子标记位点，例如，绵羊PLAG1基因NC-040260.1:g.39071254位点的C/T多态性与初生重和断奶重显著相关(曹少先，王悦，李隐侠等.一个影响绵羊早期生长的分子标记、检测方法及其应用，CN110923332A，2022-07-05)。
成纤维细胞生长因子9(FGF9)作为FGF家族成员之一，在调节胚胎发育、骨骼发育、细胞增殖、细胞分化中起着重要的调控作用，并已有研究表明，该基因基因发生S99N突变会使动物的肘、膝、尾椎关节融合，骨的密度增加(唐凌云.FGF9对骨关节、牙齿发育及骨代谢的调控作用及其分子机制研究[D].上海交通大学,2016年)，FGF9通过影响破骨细胞分化相关基因Trap和Mmp9的转录水平可促进破骨前体细胞向破骨细胞的分化，并且其促进作用与浓度无相关性(马燕.FGF9和维生素D对骨质疏松症作用的基础和临床研究[D].上海交通大学,2015年.)，但与绵羊体重性状是否有关联并不清楚。因此，本发明以FGF9基因作为候选基因，通过PCR扩增、Sanger测序、序列分析和KAspar分型等，探讨其不同基因型与湖羊体重性状之间的关联，旨在筛选影响绵羊体重相关的分子标记位点，为培育体大型湖羊的遗传改良提供新的基因素材，以加速肉羊新品种或新品系的培育进程。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种影响绵羊阶段体重的SNP分子标记及其应用。该分子标记从绵羊FGF9基因中扩增获得，其具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在其第212位的碱基位点的Y为C或T，该位点导致分子标记的C/T多态性。通过扩增绵羊FGF9基因的DNA序列并测序，筛选FGF9基因的多态性位点，从而可以建立绵羊体重性状相关分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于体大型绵羊的新品种或新品种的选育中。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种影响绵羊阶段体重的SNP分子标记在绵羊育种检测中的应用，其分子标记为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第212位的位点，该位点具有C/T多态性，当基因型为TT和TC型个体的体重显著高于CC型个体。进一步地，育种为培育快长型绵羊。
一种用于扩增如上所述影响绵羊阶段体重的SNP分子标记的引物对在筛选优良生长性状的绵羊中的应用。进一步地，所述的生长性状为阶段体重，所述引物对包括PCR引物对和/或KASPar引物对；其中，
PCR引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
KASPar引物对的序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
一种筛选优良生长性状的绵羊中的方法，其包括如下步骤，
1)以绵羊血液为样品提取基因组DNA；
2)利用如上所述用于扩增影响绵羊阶段体重的分子标记的引物对提取的基因组DNA进行扩增；
3)对获得扩增产物的多态性位点进行鉴定。
多态性位点为TT基因型或TC基因型的个体的体重较佳，为快速生长型绵羊。
如上所述的方法，优选地，在步骤2)中，所述用于扩增影响绵羊阶段体重的分子标记的引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列进行PCR扩增，在步骤3)中，鉴定方法采用测序方法对多态性位点鉴定。
如上所述的方法，优选地，在步骤3)中，所述用于扩增影响绵羊阶段体重的分子标记的引物对为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列进行KASPar基因分型扩增，在步骤3)中，鉴定方法BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。
一种用于检测影响绵羊阶段体重的SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述用于扩增影响绵羊阶段体重的分子标记的引物对。
进一步地，所述引物对为PCR扩增的引物对；其中，所述PCR扩增的引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述引物对为KASPar扩增的引物对；其中，KASPar扩增的引物对的序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种影响绵羊阶段体重的SNP分子标记，用于检测该分子标记的引物对在绵羊育种中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对FGF9基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，并初步进行其基因型与绵羊体重性状之间的关联分析的应用，为绵羊的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
本发明提供的筛选优良生长性状的绵羊中的方法，为筛选快速生长型绵羊，提高选择的准确性提供了一种新的技术手段，同时可以在绵羊出生时就通过检测基因型进行选择，加快了育种进程，并能降低育种成本；不仅对进一步提高绵羊阶段生长性状有重要的实际意义，而且对绵羊新品种(系)培育具有重要的实践价值。
附图说明
图1为用于作为分子标记的绵羊FGF9基因片段的凝胶电泳图；其中，M泳道：DL2000Marker，1-9泳道：FGF9基因扩增结果。
图2为绵羊FGF9基因突变位点的测序结果。
图3为本发明中绵羊FGF9基因g.212C>T突变位点KASPar SNP分型结果，其中，靠近左侧的红色点表示TT基因型，靠近中间的绿色点表示CT或TC基因型，靠近右侧的蓝点表示CC基因型。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本发明中所用试剂均为分析纯或以上规格。
实施例1
(1)引物设计
经大量对比选择绵羊FGF9基因DNA，其GenBank收录号：NC_019467.2为模板，利用Oligo7.0软件设计引物，经优化后最终选择的引物对为上游引物M-F，序列如SEQ ID NO.2：5＇-TGAAAATATTCCCCTTGCTCT-3＇和下游引物M-R，序列如SEQ ID NO.3：5＇-CTCAATCTTTTCCCCTGGT-3＇，委托北京生工生物工程有限公司合成后作为PCR反应引物对。
(2)FGF9基因的扩增和测序
利用酚氯仿法从绵羊的全血样本中提取基因组DNA作为模板，并配制PCR反应总体积25μL，其中DNA模板1μL，2×PCR Master Mix 12.4μL，浓度均为10μmol/L的上游引物M-F0.8μL和下游引物0.8μL，ddH2O 10μL。PCR扩增程序是：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环35次，最后72℃延伸10min。将获得的PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示得到366bp特异扩增片段，如图1所示，图中，M泳道：DL2000Marker，1-9泳道：FGF9基因的扩增结果。
将扩增得到的PCR片段进行测序，测序的结果显示该扩增片段共366个碱基，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中在该片段中的第212bp存在一个多态性位点Y，即扩增的FGF9基因片段在第212bp位点存在C/T多态性如图2。
SEQ ID NO.1：TGAAAATATTCCCCTTGCTCTTGCACACCTGGCCCC TTATGTAAGAAAGAAAACCTACAAATATATGTTCACTCAGTTACACACTTGAGGATACAACTCAGAGCACTGATTCACAGCCAGCCTGATGCACAGTGAGGGTAGGGACAAGGGGGGCAAGTCCTGCTGAGGATGCTGAAAACCAGAGAGGACTCATGAGCCAGCTTCCTGACATYGTTCACCAAACGCTTAAACCACCCAAGGCACACAGGACCCACACCTCCTAGGAGGGGCACTTCTAGGTGATCAAAAACACTGAGTGGGTTGGTAACAAAATACGTCCTTGGACAAGTCTCTGTTAAGTGAGTTGAACCAGGGGAAAAGATTGAG
(3)DNA序列同源性检索鉴定：
将测序后获得的SEQ ID NO.1所示序列，应用美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将该序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索比对结果表明所测序列与绵羊FGF9基因DNA(GenBank收录号：NC_019467.2)的部分序列同源性达99％。
实施例2基因分型检测方法的建立
(1)引物序列设计
采用实施例1中扩增片段的C/T多态性位点设计KASPar引物对，从而用于所述多态性位点的特异性检测，经优化设计获得KASPar引物对的核苷酸序列为：
用于检测等位基因C的正向引物A1：
5＇-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGAGCCAGCTTCCTGACATC-3＇(记为SEQ ID NO.4)；
用于检测等位基因T的正向引物A2：
5＇-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCATGAGCCAGCTTCCTGACAT T-3＇(记为SEQ ID NO.5)；
通用反向引物C：5＇-TGTGCCTTGGGTGGTTTAAGCGTTT-3＇(记为SEQ ID NO.6)。
以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成，将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照体积比为12:12:30(正向引物A1：正向引物A2：通用反向引物C)的比例混匀作为引物混合液备用。
(2)DNA质控
通过1.5％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别对从绵羊的全血样本中提取得到的基因组DNA的质量进行检测，得到合格的DNA要求，并稀释DNA浓度成为10～20ng/μL作为待测DNA模板备用。
(3)基因分型
1)利用K-pette分液工作站将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.5uL和空白对照(用灭菌水，不加DNA模板，)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。
2)在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(1536微孔板货号Part No.KBS-1016-011)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜，利用Hydrocyler进行高通量水浴PCR扩增。
3)PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：
94℃预变性，15分钟；
94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；
94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。
4)扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，部分结果如图3所示，图中每个圆点代表一份待测样品，其中靠近左侧的红色圆点表示该位点是纯合基因型“TT”；靠近右侧的蓝色圆点表示该位点是纯合基因型“CC”；靠近中间的绿色圆点表示该位点是杂合基因型“CT”或“TC”；黑色圆点表示NTC(图3中未能显示出来)，即为空白对照。
(4)本发明的分子标记在湖羊体重性状标记性状关联分析中的应用
试验共检测了1067只湖羊的多态性，确定其基因型，并进行基因型与体重性状的关联分析。建立如下所述的最小二乘模型：
Yijk＝μ+Genotypei+Pj+FK+εijk
其中，其中，Yijk为体重的观察值，μ为总体均数，Genotypei为基因型效应，Pj为批次效应，Fk为场次效应，εijk为随机误差，假定εijk相互独立，服从N(0，σ2)分布。
基因型检测结果表明在1067个个体中TT基因型有481个，TC基因型有468个个体，CC基因型有118个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示，其中，表1中BW80表示湖羊第80天的体重kg，BW100表示湖羊第100天的体重kg，以此类推。
表1绵羊FGF9基因多态性与体重性状关联分析
注：同行数据间角标不同字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
结果表明，绵羊FGF9 g.212C>T多态性位点与不同日龄的体重性状呈显著相关(P<0.05)，且携带TT和TC型个体的体重显著高与CC型个体，因此，FGF9 g.212C>T多态性位点可作为影响绵羊体重的潜在分子标记，可选留TT纯合型个体组建核心群体，用于体大型绵羊的培育；此外该位点和技术手段可用于绵羊群体的早期检测，以淘汰携带CC基因的型个体，增加经济效益。

Claims (9)

1.一种影响绵羊阶段体重的SNP分子标记在绵羊育种检测中的应用，其特征在于，其分子标记为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第212位的位点，该位点具有C/T多态性，TT和TC型个体的体重显著高与CC型个体。
2.一种用于扩增权利要求1所述影响绵羊阶段体重的SNP分子标记的引物对在筛选优良生长性状的绵羊中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生长性状为阶段体重，所述引物对包括PCR引物对和/或KASPar引物对；其中，
PCR引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
KASPar引物对的序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
4.一种筛选优良生长性状的绵羊中的方法，其特征在于，其包括如下步骤，
1)以绵羊血液为样品提取基因组DNA；
2)利用如上所述用于扩增影响绵羊阶段体重的分子标记的引物对提取的基因组DNA进行扩增；
3)对获得扩增产物的多态性位点进行鉴定。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述用于扩增影响绵羊阶段体重的分子标记的引物对为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列进行PCR扩增，在步骤3)中，鉴定方法采用测序方法对多态性位点鉴定。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述用于扩增影响绵羊阶段体重的分子标记的引物对为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列进行KASPar基因分型扩增，在步骤3)中，鉴定方法BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。
7.一种用于检测影响绵羊阶段体重的SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求2所述用于扩增影响绵羊阶段体重的分子标记的引物对。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对为PCR扩增的引物对；其中，所述PCR扩增的引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对为KASPar扩增的引物对；其中，KASPar扩增的引物对的序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
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