CN117587158A - 与水稻稻曲病抗性qtl的紧密连锁ssr分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水稻抗病育种和分子生物学领域，涉及与水稻稻曲病抗性QTL(quantitative trait loci)连锁的SSR分子标记RM28196和RM5341，还涉及与水稻分子标记辅助育种的应用，具体为与水稻稻曲病抗性QTL的紧密连锁SSR分子标记及其应用。一种与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的SSR分子标记，是指在12号染色体上获得与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的SSR分子标记，该分子标记为RM28196和RM5341。利用这些标记预测植株对水稻稻曲病的抗性，在苗期进行筛选淘汰感病植株，节约了成本，提高了效率，还为水稻稻曲病抗病分子标记辅助育种提供了可能。
Description
技术领域
本发明属于水稻抗病育种和分子生物学领域，涉及与水稻稻曲病抗性QTL(quantitative trait loci)连锁的SSR分子标记RM28196和RM5341，还涉及与水稻分子标记辅助育种的应用，具体为与水稻稻曲病抗性QTL的紧密连锁SSR分子标记及其应用。
背景技术
水稻是全世界主要的粮食作物之一，稻曲病(Rice false smut，RFS)是水稻穗部重要的真菌病害，严重时可导致水稻产量损失达50％以上。稻曲病不仅影响水稻的产量，还威胁水稻的质量，受害的病粒表面覆盖着成千上亿的稻曲病菌厚垣孢子，且产生大量的真菌毒素，对人类和动物具有毒害作用。近些年，在我国由于优质杂交稻的大面积种植、稻田氮肥使用量增加以及气候变化，导致我国稻区的稻曲病逐渐加重，已成为水稻三大真菌病害之一。生产实践证明，选育和种植抗病品种是防治稻曲病最环保最经济的措施。因此，筛选与水稻稻曲病抗性连锁的分子标记对水稻生产和稻米安全至关重要。
近些年来，已有研究者们对水稻稻曲病抗性基因和与抗性基因紧密连锁的分子标记进行了研究。虽已有抗性基因和抗性连锁分子标记的报道，但数量很少，尚未见应用于水稻稻曲病抗性检测和分子标记辅助育种的报道。田间稻曲病抗性鉴定大多采用人工注射接种，存在工作量大、费时、费力，效率低；此外，且易受气候条件等因素的影响，常常导致抗性检测不准确。
当前，随着分子生物学和生物技术的发展，基于分子标记辅助育种，利用分子标记与稻曲病抗性目标基因的紧密连锁的特征，可在实验室通过PCR直接检测连锁的分子标记，即可判断目标抗性基因是否存在，达到稻曲病抗性性状鉴定的目的；且在水稻苗期可进行抗性检测，具有鉴定时间早、检测速度快、鉴定结果准确且不受外界环境干扰的优点。
近些年，虽然已有研究者们对水稻稻曲病抗性基因或QTL进行了定位与分子连锁标记的筛选(徐建龙等，2002；李余生等，2011)，但仍少见真正能应用于育种实践的稻曲病抗性基因或QTL分子标记。因此，挖掘新的稻曲病抗性QTL，并开发与之紧密连锁的分子标记成为开展水稻稻曲病抗性育种的关键。
发明内容
本发明的目的是提供12号染色体上与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的SSR分子标记RM28196和RM5341，利用这些标记检测植株对水稻稻曲病的抗性，在苗期进行筛选淘汰感病植株，节约了成本，提高了效率，还为水稻稻曲病抗病分子标记辅助育种提供了可能。
为了实现以上发明目的，本发明的具体技术方案为：
一种与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的SSR分子标记，其以抗病品种IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1为父本，以感病常规籼稻品种9311或桂朝2号为母本，杂交获得杂种F1，F1自交获得F2分离群体；将F2分离群体作为作图群体，通过抗性鉴定结果和SSR标记数据间的连锁分析，在水稻12号染色体上获得与水稻稻曲病基因qRFS12.01紧密连锁的SSR分子标记RM28196和RM5341。
进一步的，利用所述的与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的SSR分子标记用于选育抗稻曲病水稻品种。
作为本申请中一种较好的实施方式，在12号染色体上获得与水稻稻曲病抗性主效基因QTL紧密连锁的分子标记RM28196和RM5341的方法，包括以下步骤：
1)群体构建
以感病常规籼稻品种9311(来自长沙德农正成水稻研究所)或桂朝2号为母本，抗病品种IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1为父本(来自国际水稻研究所，该研究所简称IRRI)，杂交获得杂种F1，F1自交获得F2分离群体，用于遗传分析；
2)抗性鉴定
在水稻孕穗的第7-8期，采用人工注射接种体的方法接种亲本(父本和母本)、F1、F2群体；按照NY/T 3625-2020进行划分抗病和感病；
3)抗感基因池构建
从F2群体中分别筛选出20个高抗单株和30个高感单株，采用CTAB法提取高抗单株和高感单株的DNA，将20个高抗单株DNA和30个高感单株DNA分别等量混合构成抗病基因池和感病基因池；
4)抗性连锁标记筛选
a.采用CTAB法提取亲本(父本和母本)、F2群体各个单株基因组DNA；
b.从已公布的水稻SSR引物中选出在水稻12条染色体均匀分布的871对引物，对抗病亲本IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1和感病亲本9311的基因组DNA进行PCR扩增，筛选出具有多态性的151个SSR分子标记；
c.利用筛选出的151对SSR引物对抗病基因池和感病基因池的DNA进行PCR扩增，筛选出了RM28196和RM5341在抗感基因池中呈多态性；
5)遗传图谱构建与抗病QTL定位
a.进一步在RM5341、RM28196附近设计SSR分子标记，筛选到在亲本间具有多态性的4个标记RM1158、RM1103、RM28472和RM1047；
b.利用RM5341、RM28196、RM1158、RM1103、RM28472和RM1047这6对SSR多态性引物对F2群体进行PCR扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，获得分子标记带型；
c.根据标记带型，用QTL ICiMapping4.0软件计算出标记间的连锁遗传距离并绘制连锁图谱，再根据F2群体田间抗性表型进行复合区间作图定位QTL，LOD阈值设定为3.0；
d.获得水稻稻曲病抗性品种IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1上的抗稻曲病基因位点qRFS12.01，该基因位点位于第12号染色体分子标记RM5341与分子标记RM28196之间。
作为本申请中一种较好的实施方式，步骤2)中接种体为3个以上强致病力且不同来源地的稻曲病菌混合菌，且接种体要过滤掉稻曲病菌在液体培养时产生的毒素等次生代谢产物。
作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤4)b中PCR反应体系：总体积20μL，DNA模板(10ng)1μL，17μL Super PCR Mix，正向引物(10μM)各1μL,反向引物(10μM)1μL。
作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤4)b中PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸6min。
进一步的，所述步骤4)c中的分子标记RM28196正向引物序列为：5’-CCTAGTTCAGCTCCTGCTTACC-3’，反向引物序列为：5’-CTCAGATGTAGGGAATGTTTGC-3’；RM5341正向引物序列为：5’-CATCCGGAGGAAGTTTGAAAGAAGG-3’，反向引物序列为：5’-CAAGGGCAACCTCTTCCACTACGC-3’。
进一步的，所述步骤5)a中的分子标记RM1158的正向引物序列为：5’-GTCCATAATCCGGTTGCTATTAGG-3’，反向引物序列为：5’-ACAGGATCATGTCGCAATCG-3’；RM1103的正向引物序列为：5’-GTCGGTGTGTACTCCGTGTTTGG-3’，反向引物序列为：5’-CATATGCAGTGGTCAGTGGAGTGG-3’；RM28472的正向引物序列为：5’-GCTATGAACCTGTACACATGTAGG-3’，反向引物序列为：5’-GAGCACCATAACAATCAGTTGC-3’；RM1047的正向引物序列为：5’-CACCTGGCTCCTCATCAAGTACC-3’，反向引物序列：5’-TGGCTTAGTCTTGTGGAGACACG-3’。
本申请的另外一个发明目的是保护前面所述的与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的SSR分子标记在水稻分子标记辅助育种中的应用。
进一步的，利用如上所述的与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的SSR分子标记进行植株对水稻稻曲病的抗性的检测方法，其包括以下步骤：通过检测12号染色体上的分子标记RM28196和RM5341的带型，预测该植株对水稻稻曲病的抗性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(一)抗稻曲病基因位点qRFS12.01的发现与定位，提供了新的水稻稻曲病抗性QTL，可用于抗稻曲病水稻品种的育种；
(二)在12号染色体上获得与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的分子标记RM28196和RM5341的方法，利用这些标记预测植株对水稻稻曲病的抗性，在苗期进行筛选淘汰感病植株，节约了成本，提高了效率，还为水稻稻曲病抗病分子标记辅助育种提供了可能；
(三)在水稻12号染色体上获得与水稻稻曲病基因qRFS12.01紧密连锁的SSR分子标记RM28196和RM5341，可用于水稻品种稻曲病抗性的预测，提高了常规育种中稻曲病抗性鉴定准确性和可重复性，节约了时间、人力和物力，提高了抗病育种效率。
附图说明
图1为F2群体单株在穗期对稻曲病的抗性表现分析图。
图2为IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1中水稻稻曲病抗性QTL遗传连锁群体定位分析示意图。A.SSR分子标记连锁图；B.QTL的复合区间图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在以下试验中，未提及的步骤为现有技术。
在本申请中，抗病品种IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1为现有技术，如伏荣桃,陈诚,王剑等发表的抗稻曲病水稻种质资源筛选与评价[J].南方农业学报,2022,53(01):78-87。
父本抗病品种IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1也可以采用抗病品种IR28替代，抗病品种IR28为现有技术，如余功新,张端品,谢岳峰等发表的水稻品种IR28对我国白叶枯病菌系抗病基因定位研究[J].作物学报,1990(02):139-152。
感病品种9311为现有技术，如张月雄,梁海福,秦钢等发表的籼稻品种9311抗白叶枯基因鉴定和定位[J].分子植物育种,2018,16(02):460-465.
实施例1
水稻稻曲病抗性QTL的紧密连锁的SSR分子标记的获得
1、群体构建
2021年在四川省农业科学院试验基地种植感病品种9311(母本)和抗病品种IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1(父本)，杂交获得F1，同年在海南南繁F1自交得F2种子，2022年在农科院试验基地种植F2分离群体，作为作图群体。F2单株编号，孕穗期取亲本、F2群体各单株的部分叶片，-80℃冰箱保存，用于SSR分析。
2、抗性鉴定
(1)稻曲病菌致病力测定：2018-2020年，采用人工注射接种的方法，连续3年对水稻稻曲病菌菌株进行致病力测定(表1)，将连续3年对水稻穗子致病穗率≥60％的菌株鉴定为强致病力菌株，水稻稻曲病菌菌株致病力测定为现有技术，致病力菌株的鉴定可参考文献
Fu RT,Chen C,Wang J,Zhao LY,Lu DH.Diversity analysis of the ricefalse smut pathogen Ustilaginoidea vire ns in Southwest China[J].J.Fungi,2022,8,1204)。
表1稻曲病菌致病力测定结果
(2)稻曲病菌培养
选择在田间鉴定为强致病力的、不同来源地的稻曲病菌菌株6个(如可选取DLZ、GH·BL、XD·GC2、LZ、MY5323、PJ1)分别接种于PSA(Potato Sucrose Agar)培养基上27℃培养10d，取稻曲病菌边缘菌丝块接种于PS液体培养基中，27℃摇床中培养10d，过滤离心收集菌丝和分生孢子。接种时，将6个稻曲病菌的菌丝和分生孢子进行混合，重新悬浮在无菌的PS液体培养基中，制成混合菌的菌丝片段-孢子悬浮液，作为接种体。
(3)水稻稻曲病抗性鉴定
在亲本、F1和F2群体水稻孕穗的第7-8期，进行稻曲病菌人工注射接种穗子，接菌后搭上遮阳网和保湿，以保证相对湿度在85％以上，温度为28～30℃，保湿7d。接种21d后，调查稻曲病的病穗数、每穗病粒数等并统计其发病情况，按照农业行业标准《稻曲病抗性鉴定技术规程》(NY/T 3625-2020)进行评价抗病和感病。评价标准：免疫(I)：病情指数DI＝0；高抗(HR)：0.0＜DI≤5.0；抗病(R)：5.0＜DI≤10.0；中抗(MR)：10.0＜DI≤20.0；中感(MS)：20.0＜DI≤40.0；感病(S)：40.0＜DI≤60.0；高感(HS)：60.0＜DI≤100.0。感病亲本9311的抗性表现级别为感病以上，抗性亲本IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1表现为抗病以上；F1代均表现为感病；F2群体穗期的病情指数呈连续分布(图1)，说明材料抗性是由隐性多基因控制的数量性状。将F2群体中鉴定得到201个单株用于连锁关系分析。
3、水稻稻曲病抗感基因池构建
从F2群体中分别筛选出20个高抗单株和30个高感单株，再用CTAB法(伏荣桃等，2018)分别提取抗病单株和感病单株的DNA，然后分别将20个抗病单株DNA和30个感病单株DNA分别等量混成构成抗病基因池和感病基因池用于连锁分析。
4、抗性连锁标记筛选
a.基因组DNA提取：采用CTAB法提分别取母本9311、父本IR77298-14-1-2::IRGC117374-1和F2群体各个单株的叶片基因组DNA；
b.亲本间多态性分子标记筛选：从水稻生物信息学数据库(http://www.gramene.org)已公布的水稻SSR引物中选出在水稻12条染色体均匀分布的871对引物，对抗病父本IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1和感病母本9311的基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系：总体积20μL，DNA模板1μL，17μL Super PCR Mix，正向引物，10μM，各1μL；反向引物，10μM，1μL。
PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸6min。扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，筛选出具有多态性的151个SSR分子标记。
c.连锁分子标记筛选：利用筛选出的151对SSR引物对抗病基因池和感病基因池的DNA进行PCR扩增，筛选出RM28196和RM5341在抗病基因池、感病基因池中呈多态性。
分子标记RM28196：
正向引物序列为：5’-CCTAGTTCAGCTCCTGCTTACC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向引物序列为：5’-CTCAGATGTAGGGAATGTTTGC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
RM5341：
正向引物序列为：5’-CATCCGGAGGAAGTTTGAAAGAAGG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
反向引物序列为：5’-CAAGGGCAACCTCTTCCACTACGC-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
5、遗传图谱构建与抗病QTL定位
a.进一步在RM5341、RM28196附近设计SSR分子标记，筛选到在亲本间具有多态性的4个分子标记RM1158、RM1103、RM28472和RM1047。
分子标记RM1158：
正向引物序列为：5’-GTCCATAATCCGGTTGCTATTAGG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；
反向引物序列为：5’-ACAGGATCATGTCGCAATCG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
RM1103：
正向引物序列为：5’-GTCGGTGTGTACTCCGTGTTTGG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；
反向引物序列为：5’-CATATGCAGTGGTCAGTGGAGTGG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
RM28472：
正向引物序列为：5’-GCTATGAACCTGTACACATGTAGG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；
反向引物序列为：5’-GAGCACCATAACAATCAGTTGC-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。
RM1047：
正向引物序列为：5’-CACCTGGCTCCTCATCAAGTACC-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；
反向引物序列：5’-TGGCTTAGTCTTGTGGAGACACG-3’，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
b.F2群体分析。
利用RM28196、RM5341、RM1158、RM1103、RM28472和RM1047这6对SSR多态性引物对F2群体进行PCR扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，获得分子标记带型。其中与9311带型相同的赋值“A”，与IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1带型相同的赋值“B”，杂合型的带型赋值为“H”，缺失带型赋值为“-”。
c.利用QTL ICiMapping4.0软件进行连锁分析。根据各标记带型，用QTLICiMapping4.0软件中“group”命令在LOD值大于3.0时，对标记进行分组；应用“ordering”命令转换成染色体组，用“ripple”命令验证；最后用“map”命令得到遗传连锁图谱(图2A)。
d.基于复合区间作图法(QTL ICiMapping4.0)对构建的遗传图谱和F2群体表型数据进行分析，LOD值得阈值设定为2.5，按P＝0.005概率值检测抗性QTL的数目及在染色体上的位置。在12号染色体上检测到1个抗稻曲病得QTL，命名为qRFS12.01，位于第12号染色体分子标记RM5341与分子标记RM28196之间，LOD值为12.76，表型变异贡献率为28.74％(图2B)。
因此，通过检测12号染色体上该两个分子标记RM5341和RM28196的带型，可以预测该植株对稻曲病的抗性。
实施例2
水稻稻曲病抗性QTL的连锁SSR分子标记在以IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1和9311为亲本的杂交组合后代中的应用。
获得的与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的SSR标记，对9311与IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1的F3群体的部分单株进行了水稻稻曲病抗性预测，分别提取各单株的基因组DNA，然后用SSR标记RM5341和RM28196的引物进行PCR扩增分析，通过分析带型存在与否来确定相应的分子标记存在，存在标记的表明该单株水稻稻曲病达到抗性的水平，不存在则是感病。随后采用人工注射接种的方法进行田间稻曲病抗性检测，然后将基因带型检测结果与田间抗性鉴定结果进行对比，结果表明(表2)，基因预测结果与田间检测结果基本一致。
表2与IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1抗性QTL紧密连锁的分子标记预测9311/IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1杂交后代F3的水稻稻曲病抗性
实施例3
水稻稻曲病抗性QTL的连锁SSR分子标记在以IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1和桂朝2号为亲本的杂交组合后代中的应用。
以抗病品种IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1为父本、以感病品种桂朝2号为母本配置了一个新的组合，并获得了一个新的F2分离群体，按照实施例1中步骤2中的方法对新F2群体接菌鉴定，获得了一定数量的F2抗病和感病单株。同时参考实施例1中水稻稻曲病抗性连锁标记筛选的方法，利用这两个SSR分子标记分别对亲本进行多态性分析，发现分子标记RM5341和RM28196在亲本间均呈在多态性，进一步用2个分子标记对F2部分抗病单株和部分感病单株进行检测，发现抗病单株的带型与抗病亲本IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1一致，感病单株的带型与感病亲本桂朝2号一致，将基因带型检测结果与田间抗性鉴定结果进行对比，结果表明(表3)，基因预测结果与田间检测结果基本一致。
表3与IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1抗性QTL紧密连锁的分子标记预测桂朝2号/IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1杂交后代F2的水稻稻曲病抗性
以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的SSR分子标记，其特征在于：以抗病品种IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1为父本，以感病常规籼稻品种9311或桂朝2号为母本，杂交获得杂种F1，F1自交获得F2分离群体；将F2分离群体作为作图群体，通过抗性鉴定结果和SSR标记数据间的连锁分析，在水稻12号染色体上获得与水稻稻曲病基因qRFS12.01紧密连锁的SSR分子标记RM28196和RM5341。
2.利用如权利要求1所述的与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的SSR分子标记在选育抗稻曲病水稻品种中的应用。
3.在12号染色体上获得与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的分子标记RM28196和RM5341的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)群体构建：
以感病常规籼稻品种9311或桂朝2号为母本，抗病品种IR77298-14-1-2::IRGC117374-1为父本，杂交获得杂种F1，F1自交获得F2分离群体，用于遗传分析；
2)抗性鉴定：
在水稻孕穗的第7-8期，采用人工注射接种体的方法接种父本和母本、F1、F2群体；按照NY/T 3625-2020进行划分抗病和感病；
3)抗感基因池构建：
从F2群体中分别筛选出20个高抗单株和30个高感单株，采用CTAB法提取高抗单株和高感单株的DNA，将20个高抗单株DNA和30个高感单株DNA分别等量混合构成抗病基因池和感病基因池；
4)抗性连锁标记筛选：
a.采用CTAB法提取父本和母本、F2群体各个单株基因组DNA；
b.从已公布的水稻SSR引物中选出在水稻12条染色体均匀分布的871对引物，对抗病亲本IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1和感病亲本9311的基因组DNA进行PCR扩增，筛选出具有多态性的151个SSR分子标记；
c.利用选出的151对SSR引物对抗病基因池的DNA和感病基因池的DNA进行PCR扩增，筛选出了RM28196和RM5341在抗感基因池中呈多态性；
5)遗传图谱构建与抗病QTL定位：
a.进一步在RM5341、RM28196附近设计SSR分子标记，筛选到在亲本间具有多态性的4个标记RM1158、RM1103、RM28472和RM1047；
b.利用RM5341、RM28196、RM1158、RM1103、RM28472和RM1047这6对SSR多态性引物对F2群体进行PCR扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，获得分子标记带型；
c.根据标记带型，用QTLICiMapping4.0软件计算出标记间的连锁遗传距离并绘制连锁图谱，再根据F2群体田间抗性表型进行复合区间作图定位QTL，LOD阈值设定为3.0；
d.获得水稻稻曲病抗性品种IR77298-14-1-2::IRGC 117374-1上的抗稻曲病基因位点qRFS12.01，该基因位点位于第12号染色体分子标记RM5341与分子标记RM28196之间。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2)中接种体为3个以上强致病力且不同来源地的稻曲病菌混合菌，接种体要过滤掉稻曲病菌在液体培养时产生的次生代谢产物毒素。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤4)b中PCR反应体系为：总体积20μL；DNA模板，10ng，1μL；17μL Super PCR Mix，正向引物，10μM，各1μL；反向引物，10μM，1μL。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤4)b中PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸6min。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤4)c中的分子标记RM28196正向引物序列为：5’-CCTAGTTCAGCTCCTGCTTACC-3’，反向引物序列为：5’-CTCAGATGTAGGGAATGTTTGC-3’；RM5341正向引物序列为：5’-CATCCGGAGGAAGTTTGAAAGAAGG-3’，反向引物序列为：5’-CAAGGGCAACCTCTTCCACTACGC-3’。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤5)a中的分子标记RM1158的正向引物序列为：5’-GTCCATAATCCGGTTGCTATTAGG-3’，反向引物序列为：5’-ACAGGATCATGTCGCAATCG-3’；RM1103的正向引物序列为：5’-GTCGGTGTGTACTCCGTGTTTGG-3’，反向引物序列为：5’-CATATGCAGTGGTCAGTGGAGTGG-3’；RM28472的正向引物序列为：5’-GCTATGAACCTGTACACATGTAGG-3’，反向引物序列为：5’-GAGCACCATAACAATCAGTTGC-3’；RM1047的正向引物序列为：
5’-CACCTGGCTCCTCATCAAGTACC-3’，反向引物序列：5’-TGGCTTAGTCTTGTGGAGACACG-3’。
9.利用如权利要求1所述的与水稻稻曲病抗性QTL紧密连锁的SSR分子标记进行植株对水稻稻曲病的抗性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：通过检测12号染色体上的分子标记RM28196和RM5341的带型，预测该植株对水稻稻曲病的抗性。
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