CN117568227B - 一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株、灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株、灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117568227B
CN117568227B CN202311609457.8A CN202311609457A CN117568227B CN 117568227 B CN117568227 B CN 117568227B CN 202311609457 A CN202311609457 A CN 202311609457A CN 117568227 B CN117568227 B CN 117568227B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycoplasma
mycoplasma synoviae
culture
vaccine
synoviae
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202311609457.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117568227A (zh
Inventor
郑朝朝
王承玉
田祖光
刘涛
郁宏伟
赵玉龙
马子夜
李卫东
马明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ringpu Baoding Biological Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Ringpu Baoding Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ringpu Baoding Biological Pharmaceutical Co ltd filed Critical Ringpu Baoding Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202311609457.8A priority Critical patent/CN117568227B/zh
Publication of CN117568227A publication Critical patent/CN117568227A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117568227B publication Critical patent/CN117568227B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/35—Mycoplasma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株、灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。所述鸡滑液囊支原体疫苗菌株命名为RPMSA1302，保藏编号为CCTCC M20232236，所述灭活疫苗的制备方法包括将所述的鸡滑液囊支原体疫苗菌株RPMSA1302复苏后进行传代培养和发酵培养，获得发酵菌液；在所述传代培养的过程中加入补料1，在所述发酵培养的过程中加入补料2；对获得的发酵菌液进行抗原含量定量检测、灭活；根据测定结果对灭活的菌液稀释，加入乳化剂，乳化，制备成所述鸡滑液囊支原体灭活疫苗。本发明的鸡滑液囊支原体RPMSA1302株具有良好的免疫原性，使用安全，遗传性能稳定。

Description

一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株、灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别是涉及一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株、灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae，MS)引起以关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎为主要特征的传染病。造成雏鸡的弱雏率升高，蛋鸡的产蛋率、肉鸡的体重及饲料转化率均下降，使用药物治疗时，易产生耐药性，效果也不理想。鸡滑液囊支原体与鸡毒支原体常常混合感染，还常与其它细菌或病毒混合感染，致使鸡群饲料利用率和产蛋率低下，加之昂贵的药物治疗费用，使支原体病原成为制约养鸡业快速发展的瓶颈。防治支原体病主要采用药物治疗和免疫接种，临床实践证明MS极易产生耐药性，抗生素治疗不能清除鸡群的支原体感染；因此免疫接种疫苗是控制该病更为有效的措施。
临床常用的鸡支原体疫苗主要分为灭活疫苗和弱毒疫苗两种，多年的临床应用实践证明，鸡毒支原体疫苗能够降低鸡毒支原体的垂直传播，减少排毒，减轻感染症状，国内外已有多家鸡毒支原体疫苗生产企业，而鸡滑液囊支原体疫苗仅澳大利亚的MS-H株和青岛易邦的YBF-MS1株在售。
近年来国内鸡群鸡滑液囊支原体感染情况呈现普遍性，且危害性远超鸡毒支原体。获得一种安全性好、免疫原性强的鸡滑液囊支原体疫苗菌株、成功建立MS动物感染模型、研制鸡滑液囊支原体灭活疫苗，对于有效预防和控制支原体病十分必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株、灭活疫苗及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题。本发明中鸡滑液囊支原体RPMSA1302株为发明人自行分离、鉴定和筛选的优势菌株，具有培养滴度高、免疫原性好的优良特性，以该菌株为抗原制备的灭活疫苗对滑液囊支原体引起的疾病有良好的保护效果。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株RPMSA1302，所述鸡滑液囊支原体疫苗菌株RPMSA1302的保藏编号为CCTCCM20232236。
本发明还提供所述的鸡滑液囊支原体疫苗菌株RPMSA1302在制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗中的应用。
本发明还提供一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗，有效成分包括所述的鸡滑液囊支原体疫苗菌株RPMSA1302。
本发明还提供一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1.将所述的鸡滑液囊支原体疫苗菌株RPMSA1302复苏后进行传代培养和发酵培养，获得发酵菌液；
在所述传代培养的过程中加入补料1，在所述发酵培养的过程中加入补料2；
所述补料1的组分按质量体积百分含量计，包括明胶1～5％、烟酰胺1～3％、精氨酸1～2％、葡萄糖5～10％和丙酮酸钠0.1～0.5％；
所述补料2的组分按质量体积百分含量计，包括氢氧化钠2～4％、PEG600010～20％、烟酰胺1～3％和DMEM10～20％；
S2.对步骤S1获得的发酵菌液进行抗原含量定量检测，检测方法为核酸定量法或蛋白定量法；
S3.对步骤S1获得的发酵菌液灭活；所述灭活的方式为菌体破碎，所述菌体破碎为超声破碎或均质破碎中的一种；
S4.根据步骤S2检测结果稀释步骤S3灭活菌液，加入乳化剂，乳化，制备成所述鸡滑液囊支原体灭活疫苗。
进一步地，在步骤S1中，在所述传代培养过程中，pH降至6.9时，加入所述补料1，加入量为总培养体积的0.1～0.5％。所述传代培养的条件为37℃恒温培养。
进一步地，在步骤S1中，在所述发酵培养过程中，pH降至6.7时，加入所述补料2，继续培养10～20h后，第二次加入所述补料2，再培养10～20h后，第三次加入所述补料2；补料2在发酵培养过程中三次的加入量均为总培养体积的0.1～0.5％；所述发酵培养的条件为0.04MPa，转速100r/min，37℃恒温培养。
进一步地，在步骤S2中，核酸定量法检测鸡滑液囊支原体菌液抗原含量，优选荧光定量PCR法；先高速离心或膜过滤对抗原进行10～50倍浓缩，再定量检测，上下游引物和探针分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；根据检测结果稀释浓缩菌液，使鸡滑液囊支原体抗原含量为(0.5～1.5)×107.0拷贝数/羽份。
进一步地，在步骤S2中，蛋白定量法检测鸡滑液囊支原体菌液抗原含量，先高速离心或膜过滤法对抗原进行10～50倍浓缩，再定量检测；根据检测结果稀释浓缩菌液，使鸡滑液囊支原体抗原含量为200～500μg/羽份。
进一步地，在步骤S3中，所述超声破碎的时间为5～15min；所述均质破碎的压力为800～1500Bar。
进一步地，在步骤S4中，乳化剂包括注射用白油、铝胶佐剂或其他可用于家禽灭活疫苗的佐剂。
本发明公开了以下技术效果：
本发明中鸡滑液囊支原体RPMSA1302株，是发明人自行分离、鉴定和筛选的优势菌株，具有培养滴度高、免疫原性好的优良特性，可以有效地预防鸡滑液囊支原体的感染。
本发明在培养鸡滑液囊支原体过程中，通过适时添加两种营养液(补料1和补料2)，提高MS发酵培养滴度至1010.0CCU/ml以上，高效的培养工艺有利于提升鸡滑液囊支原体疫苗免疫效果。
鸡滑液囊支原体菌液抗原含量定量检测方法为核酸定量法或蛋白定量法，先高速离心或膜过滤法对抗原进行10～50倍浓缩，再定量检测，根据检测结果稀释浓缩菌液；在配苗前对抗原进行准确定量，有利于提升疫苗批间稳定性。
本发明通过高压均质或者超声破碎的方式对MS抗原进行破碎，替代传统的甲醛灭活工艺，有利于暴露支原体抗原表位，提升支原体疫苗免疫抗体水平和免疫效果。
本发明鸡滑液囊支原体灭活疫苗制备过程加入的乳化剂可以是注射用白油、铝胶或其他复合佐剂，铝胶佐剂和其他复合佐剂免疫应激小、吸收效果好，符合动物食品安全和动物福利要求。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例中采用的常规禽支原体培养基为Frey氏固体或液体培养基，发明人依据《中华人民共和国兽药典》(2020年版三部)附录32～33页配方自行配制。
实施例1鸡滑液囊支原体分离鉴定
1、病料
病料为无菌采集的疑似鸡滑液囊支原体感染病鸡气管和肿胀跗关节腔拭子或啄壳不全的鸡胚和弱胚。
2、病原分离培养及菌落形态观察
将采集样品在Frey氏液体培养基中进行支原体的分离培养，置于37℃温箱培养，待培养液变为橙色时，接种到新的Frey氏液体培养基中传代，传代3-5次，待其生长稳定，对培养物进行分离。
分离的培养物，其菌落经瑞氏染色，在油镜下呈球形或椭圆形。菌落在在Frey氏固体培养基上表现为细小、光滑且致密的小菌落，半凹陷于培养基内，在低倍镜下观察到菌落形态为特征性的“煎蛋状”。
3、鉴定
分离的培养物可通过0.45μm的滤器，能够分解葡萄糖和麦芽糖，但不能水解精氨酸和尿素。经16SrRNA基因扩增可得到461bp的目的片段，测序鉴定为鸡滑液囊支原体。
平板凝集试验结果显示该分离菌能够与鸡滑液囊支原体标准阳性血清呈凝集反应，而与鸡毒支原体标准阳性血清不产生凝集反应，表明该菌体为鸡滑液囊支原体。
4、纯培养
挑取固体培养基中的“煎蛋样”菌落置于液体培养基中培养，置37℃温箱培养，待培养液变为橙色时，接种到新的培养液中传代，按照10％接种比例连续传代5次，获得第6代鸡滑液囊支原体菌液，测定鸡滑液囊支原体活菌浓度。
5、回归实验
以纯化培养的鸡滑液囊支原体菌液分别注射7日龄SPF鸡胚和SPF鸡，以等量Frey氏液体培养基注射为对照。
结果表明，纯化培养的鸡滑液囊支原体菌液可致7日龄SPF鸡胚死亡，死亡鸡胚表现为弱小或肿胀，且死亡鸡胚卵黄液中可重新分离出该菌株；对照组鸡胚发育正常，未分离到鸡滑液囊支原体。
纯化培养的鸡滑液囊支原体菌液亦可致SPF鸡出现鸡滑液囊支原体特征性病变，病鸡表现为爪垫、跗骨关节肿胀，滑膜组织有淡黄色粘性渗出物，肿胀关节处的关节液中能再次分离到鸡滑液囊支原体；对照组SPF鸡食欲正常，关节处均未见明显肿胀，关节液中未分离到鸡滑液囊支原体。
实施例2鸡滑液囊支原体分离株毒力测定
分别培养实施例1中分离的不同MS菌株至F6代，测定活菌浓度，结果表明各MS分离株活菌浓度在107.0～1010.0CCU/mL范围内。
取各MS分离株菌液，经爪垫注射49日龄SPF鸡，注射剂量为0.2mL×107.0CCU/只，每组10只；另设空白对照组10只，经爪垫注射Frey氏液体培养基，0.2mL/只。攻毒后常规饲养并观察，记录实验鸡发病情况。各MS分离株及毒力测定结果见表1。
表1MS分离株毒力试验结果
MS分离株毒力测定结果显示：注射MS培养基组(空白对照组)SPF鸡未发病，注射MS分离株的组出现不同程度的发病，主要表现为爪垫(趾关节)肿胀，剖检鸡肿胀部位可见脓性粘液或干酪样渗出物，发病高峰集中在第7-13天。
MS-12#菌株活菌培养滴度为109.0CCU/ml，49日龄SPF鸡脚垫注射0.2mL×107.0CCU/只，9天可致10/10发病(含2只死亡)，且发病程度明显重于其他MS分离株，毒力较强，是良好的攻毒用强毒株。MS-12#菌株命名为RPMSA1303株，该菌株的分类命名为Mycoplasmasynoviae，已于2023年11月15日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M20232237，保藏地址为中国武汉·武汉大学。
实施例3鸡滑液囊支原体攻毒模型的建立
培养MS-12#菌株(RPMSA1303株)至F6代，测定活菌浓度为108.0CCU/mL。
取F6代新鲜培养物菌液，经不同途径攻毒49日龄SPF鸡，每组10只；另设空白对照组10只；攻毒后常规饲养并观察，记录实验鸡发病情况。实验结果见表2。
表249日龄SPF鸡MS-12#攻毒模型实验结果
注：发病位点包括左爪垫及趾关节、左跗关节、右爪垫及趾关节、右跗关节、龙骨、左翅和右翅关节。
本次实验结果显示：不同途径、不同剂量攻毒实验鸡发病时间、发病程度各有不同，症状主要表现为滑液囊炎和关节肿大(一处或多处)，剖检可见脓性黏液或干酪样渗出物。
其中，经爪垫注射组9～14天可致(8～10)/10发病，但发病症状仅限于爪垫，与临床症状不完全符合；经肌肉注射攻毒组和静脉注射攻毒组，均于攻毒后7天开始发病，攻毒后10～14天到达发病高峰，发病症状表现为爪垫、跗关节或翅关节肿胀，胸骨囊肿，且发病程度与攻毒剂量呈现明显的正相关。其他途径攻毒组发病仅为(1～2)/10，未达发病模型标准。
确定攻毒模型为：10只49日龄SPF鸡，以肌肉注射或静脉注射方式攻毒MS-12#菌株(RPMSA1303株)0.2mL×107.0～8.0CCU/只，至少7只发病。
实施例4筛选鸡滑液囊支原体灭活疫苗候选菌株
分别培养各MS分离株至F10代，测定活菌浓度，结果表明各MS分离株活菌浓度在107.0～1010.0CCU/mL范围内。
取各MS分离株菌液常规方法灭活、纯化，制成灭活疫苗，0.3mL/羽份免疫21日龄SPF鸡10只，另取10只不免疫，作为空白对照。28天后，免疫鸡和对照鸡同时静脉注射攻毒鸡滑液囊支原体MS-12#菌株培养物0.2mL×107.0CCU/只，观察14日，记录实验鸡发病情况。
MS分离株免疫原性测定结果见表3。
表3MS分离株免疫原性试验结果
免疫原性测定结果显示：分离株MS-15#活菌浓度为1010.0CCU/ml，攻毒相对保护率为80％，培养滴度和相对保护率均高于其他分离株，具有良好的培养效果和免疫原性，因此可作为鸡滑液囊支原体灭活疫苗候选菌株。将MS-15#菌株命名为RPMSA1302株，该菌株的分类命名为Mycoplasma synoviae，于2023年11月15日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 20232236，保藏地址为中国武汉·武汉大学。
实施例5鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备
1、配制禽支原体培养基补液
配制支原体培养基补料1：分别称取适量烟酰胺、精氨酸、葡萄糖和丙酮酸钠，溶于水，以质量体积百分比(W:V)计，使烟酰胺为2～6％，精氨酸为2～4％，葡萄糖为10～20％，丙酮酸钠为0.2～1.0％，经0.22μm膜过滤除菌，为溶液1；质量体积百分比(W:V)2～10％的明胶溶液经高压灭菌，为溶液2；溶液1与溶液2等比例混合均匀即为补料1。
配制禽支原体培养基补料2：分别称取适量PEG6000和氢氧化钠，溶于水，以质量体积百分比(W:V)计，使PEG6000为20～40％，氢氧化钠为4～8％，高压灭菌后为溶液3；分别称取适量烟酰胺和DMEM溶于水，使烟酰胺为2～6％，DMEM为20～40％，经0.22μm膜过滤除菌，为溶液4；溶液3和溶液4等比例混合均匀即为补料2。
根据以上方法分别配制如表4～5的禽支原体培养基补料1、补料2。
表4禽支原体培养基补料1
表5禽支原体培养基补料2
2、培养鸡滑液囊支原体菌液
培养鸡滑液囊支原体，应用禽支原体改良Frey氏液体培养基，培养过程中需要补充营养液补料1或补料2。在传代培养时当PH降至6.9时，按总培养体积(V:V)0.1～0.5％加入补料1；在发酵培养时当PH降至6.7时，按总培养体积(V:V)0.5～1.0％加入补料2，共补料3次。
将鸡滑液囊支原体RPMSA1302株复苏后，按体积比1：10的比例接种于Frey氏液体培养基中，调节pH值至7.7～7.8，37℃恒温进行传代培养培养，当培养液pH降至6.9时(培养时间8～12h)，按总培养体积(V:V)0.1～0.5％加入补料1，调节pH值至7.7～7.8，继续培养；培养物pH降至6.7时收获菌液，作为一级种子液。以同样方法将一级种子液按1：10的比例再接种传代1次，收获菌液作为二级种子液。
按体积比1：10的比例将二级种子液接种至Frey氏液体培养基中，在机械搅拌发酵罐中发酵培养，调节pH值至7.7～7.8，37℃恒温培养，罐压为0.04MPa，转速为100r/min；待pH降至6.7时(培养时间10～15h)，首次加入补料2，加入量为总培养体积的0.5～1.0％，并调节pH值至7.7～7.8，继续培养；再重复加入补料2两次(第二次补液时间为首次加入补料2后10～20h、第三次补液时间为第二次补料后10～20h)，再继续培养8～15h，待pH降至6.4时收获发酵菌液。
根据以上方法分别获得如表6的所示的发酵菌液。
表6不同培养方法获得的菌液
注：补料1和补料2的加入量均以总培养体积的百分数计。
3、制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗
对表6中收获的不同发酵菌液含量定量检测，检测方法为核酸定量法或蛋白定量法。本次实验采用核酸定量法，鸡滑液囊支原体MS发酵菌液采用膜过滤法进行浓缩，经10μm过滤除杂后，用0.1μm中空纤维柱浓缩50倍，取样，用核酸定量法检测抗原含量，上下游引物和探针分别为：
上游引物F:5’-CTGCTAAAACAGAAGCTAAAACTGCTAT-3’，SEQ ID NO.1；
下游引物R:5’-GCAGATTCTGTTGTAGTTGCTTCAA-3’，SEQ ID NO.2；
探针P:5’-CTGCAGCAGAATTATCAGA-3’，SEQ ID NO.3。
结果显示菌液-1、菌液-2和菌液-3抗原含量分别为2.9×108.0拷贝数/mL、3.2×108.0拷贝数/mL和3.1×108.0拷贝数/mL。根据检测结果稀释浓缩菌液，使鸡滑液囊支原体MS抗原含量为1.2×107.0拷贝数/羽份。
鸡滑液囊支原体菌液抗原灭活的方式为菌体破碎，具体是指超声破碎或均质破碎。本次实验采用均质破碎，破碎压力为800～1500Bar。
以重量份计，取95份灭活菌液，加入5份吐温-80，混匀后作为水相溶液；取95份注射用白油，加入5份司班-80，混匀后作为油相溶液；将水相溶液和油相溶液按照体积比1:(2～3)混和均匀，乳化制备成鸡滑液囊支原体灭活疫苗。
4、疫苗免疫效果评价
取20只21日龄SPF鸡，通过颈部皮下注射免疫本发明鸡滑液囊支原体灭活疫苗，0.3mL/羽份，同时设置10只SPF鸡作攻毒对照。疫苗免疫28天后，分别取免疫鸡和对照鸡采用静脉注射的方式进行鸡滑液囊支原体攻毒。
攻毒方法：将免疫鸡和对照鸡置于3m3的隔离器(温度为22℃，相对湿度为60％)内，静脉注射鸡滑液囊支原体RPMSA1303株新鲜培养物，0.2mL×107.0CCU/羽，观察14日，剖检，判定发病情况，计算相对保护率。攻毒对照组应至少有7只鸡发病，免疫组相对保护率应不低于70％。
试验结果：攻毒对照组9只鸡发病，本发明鸡滑液囊支原体灭活疫苗攻毒保护率为80％，本发明鸡滑液囊支原体灭活疫苗对流行强毒株具有良好的保护效果。结果见表7：
表7鸡滑液囊支原体活疫苗效力检验结果
注：胸骨、左跗关节、右跗关节、左脚垫、右脚垫、左翅关节、右翅关节任意一点出现病变均判为发病。
附注：鸡滑液囊支原体发病标准及相对保护率计算方法。
相对保护率计算公式：
相对保护率＝(免疫组攻毒未发病只数—对照组攻毒未发病只数)/免疫组免疫攻毒总只数×100％。其中，鸡滑液囊支原体发病判定标准如表8所示。
表8鸡滑液囊支原体发病判定标准
判定 判定标准
无病变 外观正常或稍微肿大，剖检可见少量清亮黏液，无浑浊和黄色干酪样物质；
病变 外观明显肿大，剖检可见浑浊液体或黄色干酪样渗出物；实验鸡攻毒后出现死亡。
实施例6鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备及免疫效果评价
1、支原体菌液培养
分别培养鸡毒支原体MG(R株、购自中国兽医药品监察所)菌液和鸡滑液囊支原体MS(RPMSA1302株)菌液。培养方法同实施例5。
2、鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗的制备
鸡毒支原体(MG)菌液和鸡滑液囊支原体(MS)菌液抗原含量定量检测，本次试验采用蛋白定量法，将发酵菌液用连续流离心机进行高速离心，刮取菌泥并用菌液1/10体积PBS重悬。取样，用蛋白定量法检测抗原含量，结果显示鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体抗原含量分别为1600μg/mL、1300μg/mL。
本发明中抗原菌液灭活的方式为菌体破碎法，本次实验采用超声破碎，功率设置为50％，时间为5～15min。根据检测结果稀释浓缩灭活菌液，使鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体抗原含量均为200μg/羽份。将菌液和铝胶佐剂按照体积比1:(2～3)混和均匀，乳化制备成鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗。
3、疫苗效果评价
取21日龄SPF鸡60只，分成3组；其中A组20只颈背部皮下注射本发明二联灭活疫苗0.3mL，B组20只颈背部皮下注射鸡毒支原体、鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗(未进行菌体破碎、常规甲醛灭活疫苗)，C组20只不免疫作攻毒对照。疫苗免疫后28日，取免疫鸡和对照鸡同时采用肌肉注射攻毒的方式进行强毒攻毒试验。
本发明A组二联疫苗鸡毒支原体攻毒保护率和鸡滑液囊支原体攻毒保护率分别为83％和80％；B组二联疫苗鸡毒支原体攻毒保护率和鸡滑液囊支原体攻毒保护率分别为72％和70％；本发明A组二联灭活疫苗对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体均具有更好的保护效果。
本发明疫苗制备方法适用于制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗，不限于制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗单苗，同时适用于制备与其他病原微生物的二联或者多联灭活疫苗。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae）RPMSA1302，其特征在于，所述鸡滑液囊支原体RPMSA1302的保藏编号为CCTCC NO:M 20232236。
2.如权利要求1所述的鸡滑液囊支原体RPMSA1302在制备鸡滑液囊支原体灭活疫苗中的应用。
3.一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗，其特征在于，有效成分包括权利要求1所述的鸡滑液囊支原体RPMSA1302。
4.一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将权利要求1所述的鸡滑液囊支原体RPMSA1302复苏后进行传代培养和发酵培养，获得发酵菌液；
在所述传代培养的过程中加入补料1，在所述发酵培养的过程中加入补料2；
所述补料1的组分按质量体积百分含量计，包括明胶1~5%、烟酰胺1~3%、精氨酸1~2%、葡萄糖5~10%和丙酮酸钠0.1~0.5%；
所述补料2的组分按质量体积百分含量计，包括氢氧化钠2~4%、PEG6000 10~20%、烟酰胺1~3%和DMEM 10~20%；
S2.对步骤S1获得的发酵菌液进行抗原含量定量检测，检测方法为核酸定量法或蛋白定量法；
S3.对步骤S1获得的发酵菌液灭活；所述灭活的方式为菌体破碎，所述菌体破碎为超声破碎或均质破碎中的一种；
S4.根据步骤S2检测结果稀释步骤S3灭活菌液，加入乳化剂，乳化，制备成所述鸡滑液囊支原体灭活疫苗。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，在所述传代培养过程中，pH降至6.9时，加入所述补料1，加入量为总培养体积的0.1~0.5%。所述传代培养的条件为37℃恒温培养。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，在所述发酵培养过程中，pH降至6.7时，加入所述补料2，继续培养10～20h后，第二次加入所述补料2，再培养10～20h后，第三次加入所述补料2；补料2在发酵培养过程中三次的加入量均为总培养体积的0.1~0.5%；所述发酵培养的条件为0.04MPa，转速100r/min，37℃恒温培养。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，核酸定量法检测鸡滑液囊支原体菌液抗原含量时，采用荧光定量PCR法；先高速离心或膜过滤对抗原进行10~50倍浓缩，再定量检测，上下游引物和探针分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；根据检测结果稀释浓缩菌液，使鸡滑液囊支原体抗原含量为（0.5~1.5）×107.0拷贝数/羽份。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，蛋白定量法检测鸡滑液囊支原体菌液抗原含量，先高速离心或膜过滤法对抗原进行10~50倍浓缩，再定量检测；根据检测结果稀释浓缩菌液，使鸡滑液囊支原体抗原含量为200~500μg/羽份。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，所述超声破碎的时间为5~15min；所述均质破碎的压力为800~1500Bar。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，乳化剂包括注射用白油、铝胶佐剂或其他可用于家禽灭活疫苗的佐剂。
CN202311609457.8A 2023-11-29 2023-11-29 一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株、灭活疫苗及其制备方法 Active CN117568227B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311609457.8A CN117568227B (zh) 2023-11-29 2023-11-29 一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株、灭活疫苗及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311609457.8A CN117568227B (zh) 2023-11-29 2023-11-29 一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株、灭活疫苗及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117568227A CN117568227A (zh) 2024-02-20
CN117568227B true CN117568227B (zh) 2024-08-16

Family

ID=89895318

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311609457.8A Active CN117568227B (zh) 2023-11-29 2023-11-29 一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株、灭活疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117568227B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105733987A (zh) * 2016-03-21 2016-07-06 青岛易邦生物工程有限公司 一种鸡滑液囊支原体
CN105770881A (zh) * 2016-04-15 2016-07-20 青岛易邦生物工程有限公司 一种鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗
CN108949605A (zh) * 2017-06-29 2018-12-07 南京天邦生物科技有限公司 一种用于鸡滑液囊支原体高密度培养的培养基及其制备方法
CN109385385A (zh) * 2018-12-26 2019-02-26 瑞普（保定）生物药业有限公司 一种禽支原体培养基、禽支原体菌液的制备方法及其应用
CN117568226A (zh) * 2023-11-29 2024-02-20 瑞普（保定）生物药业有限公司 一种鸡滑液囊支原体强毒株及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002080396A (ja) * 2000-09-06 2002-03-19 Nippon Inst For Biological Science 鶏用ワクチン製剤
CN105816868B (zh) * 2016-03-21 2020-01-03 青岛易邦生物工程有限公司 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗
CN112779193B (zh) * 2021-02-24 2022-09-27 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一株滑液囊支原体强毒株及其应用
CN113957007B (zh) * 2021-10-12 2022-09-27 福建农林大学 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗
CN113957012B (zh) * 2021-11-14 2023-09-08 江苏南农高科技股份有限公司 一种鸡滑液囊支原体培养基及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105733987A (zh) * 2016-03-21 2016-07-06 青岛易邦生物工程有限公司 一种鸡滑液囊支原体
CN105770881A (zh) * 2016-04-15 2016-07-20 青岛易邦生物工程有限公司 一种鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体二联灭活疫苗
CN108949605A (zh) * 2017-06-29 2018-12-07 南京天邦生物科技有限公司 一种用于鸡滑液囊支原体高密度培养的培养基及其制备方法
CN109385385A (zh) * 2018-12-26 2019-02-26 瑞普（保定）生物药业有限公司 一种禽支原体培养基、禽支原体菌液的制备方法及其应用
CN117568226A (zh) * 2023-11-29 2024-02-20 瑞普（保定）生物药业有限公司 一种鸡滑液囊支原体强毒株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN117568227A (zh) 2024-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105816868B (zh) 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗
CN105985966B (zh) 基因vii型新城疫病毒株、其疫苗组合物、制备方法及应用
CN1940063A (zh) 一种伪狂犬病gEˉ/gIˉ基因缺失毒株、含有该毒株的灭活疫苗及应用
CN111000993B (zh) 一种鸭病毒性肝炎、鸭呼肠孤病毒病二联灭活疫苗及其制备方法
CN104946600B (zh) 一种h9亚型禽流感病毒株
CN112779193B (zh) 一株滑液囊支原体强毒株及其应用
CN111500482B (zh) 一种羊a型产气荚膜梭菌菌株及其灭活疫苗和疫苗制备方法
CN102816740B (zh) 一种禽流感病毒、灭活疫苗及其制备方法
CN111420042A (zh) 一种鸭圆环病毒和腺病毒二联灭活疫苗及其卵黄抗体的制备方法
CN102805864B (zh) 鸡新城疫和h9n2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法
CN113957007B (zh) 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗
CN110680914B (zh) 一种三联灭活疫苗及其制备方法
CN109097340B (zh) 一种禽腺病毒、一种四联疫苗及其制备方法
CN117568226A (zh) 一种鸡滑液囊支原体强毒株及其应用
CN108465107B (zh) 一种鸭2型腺病毒和番鸭细小病毒病二联灭活疫苗
CN113957012A (zh) 一种鸡滑液囊支原体培养基及其制备方法
CN116042537B (zh) 禽呼肠孤病毒株qyh2020-qd、病毒液及制备方法、应用
CN109055320B (zh) 一株传染性支气管炎病毒分离株及在疫苗制备中的应用
CN117568227B (zh) 一种鸡滑液囊支原体疫苗菌株、灭活疫苗及其制备方法
CN104130981A (zh) 鸡传染性支气管炎病毒疫苗株及其在制备灭活疫苗中的应用
CN112920976B (zh) 一株绵羊肺炎支原体强毒株及其应用
CN115068600A (zh) 抗病毒蛋白免疫增强剂在h9n2禽流感灭活苗中的应用
CN104940921A (zh) 一种包含鸡α-干扰素蛋白的H9亚型禽流感病毒灭活疫苗
CN112646750A (zh) 一种血清18型鸭疫里默氏杆菌及应用
CN117511816A (zh) 一种鸡滑液囊支原体活疫苗菌株、活疫苗及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant