CN117562893A - Pd-l1抑制的表达和pd1增强的表达 - Google Patents
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Abstract
提供了用于在需要所述表达改变的对象中降低CD274基因和/或PD‑1蛋白表达和增加PDCD1基因和/或PD‑1蛋白表达的方法。所述方法包括给对象施用包括至少0.5％肉桂鞣质D‑1和/或肉桂鞣质B‑1的组合物。所述方法进一步包括通过施用所需浓度或持续所需时间的步骤来降低CD274基因和/或PD‑1蛋白的表达和增加PDCD1基因和/或PD‑1蛋白的表达，其中所述组合物可以增加或降低所述基因或蛋白的相对表达水平，同时还改善、预防或调节对象的心脏事件。
Description
本申请为2018年9月12日提交的、发明名称为“PD-L1抑制的表达和PD1增强的表达”的PCT申请PCT/US2018/050661的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2020年3月12日，申请号为201880059189.8。
相关申请的交叉参考
本申请依赖于2017年9月13日提交的美国临时申请No.62/557,933并要求其优先权，将其完整内容按引用并入本文中。
领域
本公开内容涉及A型聚合物的用途，包括儿茶素和/或表儿茶素的A型双连接原花青素低聚物，以及用于促进对象中降低的CD274基因或PD-L1蛋白表达和增强的PDCD1基因或PD-1蛋白表达的方法。
背景
失调的细胞功能是许多病理状况的基础。为了促进或维持适当或增强的细胞功能，需要鉴定具有适当细胞功能的分子效应子以及防止或逆转细胞功能障碍的方法。失调的基因表达与多种疾病有关，如癌症、糖尿病、肥胖症、心血管疾病和神经变性。辨别哪些分子靶标与疾病或病症最直接相关对于治疗或预防疾病和病症是至关重要的。
程序性死亡1(PD-1)受体以及PD-1配体1和2(PD-L1，PD-L2)在免疫调节中起着不可或缺的作用。在激活的T细胞上表达的PD-1被基质细胞、肿瘤细胞或两者表达的PD-L1和PD-L2激活，从而引发T细胞死亡和局部免疫抑制，从而可能为肿瘤的发展和成长提供免疫耐受环境。相反，在非临床动物模型中，这种相互作用的抑制作用可以增强局部T细胞应答并介导抗肿瘤活性。在临床环境中，据报道，用阻断PD-1-PD-L1相互作用的抗体进行治疗，可使患有晚期或转移性实体肿瘤的患者产生7％至38％的客观应答率，并且具有可耐受的安全性特征。
程序性死亡1(PD-1)受体和程序性死亡配体1(PD-L1)在免疫调节中起着不可或缺的作用。PD-L1(也称为B7-H1或CD274)是由CD274基因编码的290个氨基酸的蛋白受体配体，并且在淋巴和非淋巴组织上广泛表达，如在CD4和CD8 T细胞、巨噬细胞谱系细胞、外周组织以及肿瘤细胞和病毒感染的细胞上表达(Dong等，1999，Nature Med.)。PD-L1结合受体PD-1和B7-1(其属于T细胞共抑制受体的CD28/CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原)/ICOS(诱导型共刺激物)家族)，并通过抑制T细胞激活减弱免疫应答。PD-L1与PD-1或B7-1的结合导致降低的T细胞增殖和细胞因子分泌，从而损害诸如癌症和病毒感染等疾病中的体液和细胞免疫应答。
肿瘤和慢性病毒感染利用PD-L1在肿瘤细胞和病毒感染的细胞上的表达来逃避免疫应答。PD-L1在多种肿瘤上表达，并且对动物模型的研究表明，肿瘤上的PD-L1抑制T细胞激活和肿瘤细胞裂解，并可能导致增加的肿瘤特异性T细胞死亡。在慢性病毒感染中，在病毒感染的细胞上表达的PD-L1结合病毒特异性T细胞上的PD-1，因而这些T细胞被“耗尽”，失去了效应子功能和增殖能力。PD-1-PD-L1系统在诱导T调节细胞发育和维持T调节细胞功能中也起着重要作用。因此，由于PD-L1在肿瘤免疫和传染性免疫中起着重要作用，因此降低CD274基因或PD-L1蛋白表达的组合物是用于免疫治疗的理想靶标。
然而，在导致PD-L1表达降低的治疗中已经观察到了心脏副作用。例如，在一项研究中，用派姆单抗(pembrolizumab)靶向抑制PD-L1与自身免疫性心肌炎引起的急性心力衰竭有关(等，Acute heart failure due to autoimmune myocarditis underpembrolizumab treatment for metastatic melanoma,Journal for ImmunoTherapy ofCancer(2015)3:11)。
PD-1是属于免疫球蛋白家族的免疫抑制受体，并且由PDCD1基因编码。PD-1是具有抑制通过经由抗原受体的刺激而激活的T细胞的免疫激活信号的功能的分子。例如，PD-1敲除小鼠的分析证明了PD-1信号在抑制自身免疫疾病(如自身免疫性扩张型心肌病、狼疮样综合征、自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、I型糖尿病和类风湿关节炎)中起着重要作用。因此，因为PD-1在自身免疫疾病中起着重要作用，因此增强PDCD1基因或PD-1蛋白表达的组合物是用于免疫疗法的理想靶标。
因此，需要在对象中降低CD274基因或PD-L1蛋白表达同时增加PDCD1基因或PD-1蛋白表达的组合物和方法。
概述
应当理解，以下概述和详细描述都是示例性和说明性的，并且旨在提供对所要求保护的公开内容的进一步解释。以下的概述或描述均不是旨在将本公开内容的范围限定或限制为概述或描述中提及的特定特征。
一个目的是提供一种改变CD274基因产物或PD-L1蛋白和PDCD1基因表达产物或PD-1蛋白水平的方法。可以使用这种表达来恢复这些表达产物在对象中的异常表达。
在本公开内容中实现了该目的，其提供了在对象中降低CD274基因或PD-L1蛋白表达同时增加PDCD1基因或PD-1蛋白表达的方法。该方法包括向对象施用包含按重量计至少0.5％的A型聚合物的组合物。A型聚合物包括儿茶素和/或表儿茶素的A型双连接原花青素低聚物。在某些方面中，儿茶素和/或表儿茶素的A型双连接原花青素低聚物包括肉桂鞣质(cinnamtannin)D-1和/或肉桂鞣质B-1。更多方法包括通过施用步骤降低所述对象中CD274基因或PD-L1蛋白的表达，同时增加PDCD1基因或PD-1蛋白的表达。
附图简述
现在参考附图中的说明性示例：
图1图示了用浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml或50μg/ml的从肉桂提取物分离的双连接A型多聚物处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PDCD-1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图2图示了用浓度为0μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml或20μg/ml的肉桂鞣质B-1处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PDCD-1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图3图示了用浓度为0μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml或20μg/ml的肉桂鞣质D-1处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PDCD-1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图4图示了用10μg/ml的LPS和浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml或50μg/ml的从肉桂提取物分离的双连接A型多聚物处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对LPS诱导的PDCD-1超表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图5图示了用10μg/ml的LPS和浓度为0μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml或25μg/ml的肉桂鞣质D-1处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对LPS诱导的PDCD-1超表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图6图示了用浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml或50μg/ml的大蒜酸处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PDCD-1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图7图示了用浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml或50μg/ml的芦丁(结合了黄酮槲皮素和二糖芦丁糖的糖苷)处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PDCD-1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图8图示了用浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml或50μg/ml的槲皮素处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PDCD-1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图9图示了用浓度为0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml或100μg/ml的橄榄叶提取物处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PDCD-1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图10图示了用浓度为0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml或100μg/ml的迷迭香提取物处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PDCD-1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图11图示了用浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml或100μg/ml来自Aronia的北美沙果提取物处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PDCD-1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图12图示了用浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml或50μg/ml的姜黄素提取物处理人巨噬细胞样THP-1细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PDCD-1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图13图示了用浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml或50μg/ml的肉桂鞣质D1处理大鼠C6胶质瘤细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PD-L1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图14图示了用浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml或50μg/ml的肉桂鞣质B1处理大鼠C6胶质瘤细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PD-L1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图15图示了用10ng/ml的TNF-α和浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml或50μg/ml的肉桂鞣质D1处理大鼠C6胶质瘤细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对TNF-α诱导的PD-L1超表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图16图示了用10μg/ml的LPS和浓度为0μg/ml、10μg/ml或50μg/ml的肉桂鞣质D1处理大鼠C6胶质瘤细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对LPS诱导的PD-L1超表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似；
图17图示了用纯化的A型聚合物材料(含有至少3％重量的在0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml或100μg/ml浓度下测试的A型聚合物)处理大鼠C6胶质瘤细胞，在37℃下24小时，作为免疫荧光研究的定量密度测定结果，对PD-L1表达的影响，其中结果表示为5至10个随机视野的平均±SD，每个平板中的每个视野的细胞密度大致相似。
详述
以下特定方面的描述本质上仅是示例性的，并且绝不旨在限制本发明的范围、其应用或用途，其当然可以变化。关于本文中包括的非限制性定义和术语来描述本公开。这些定义和术语并非旨在用作对本公开的范围或实践的限制，而是仅出于说明性和描述性目的来给出。
本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不是旨在限制性。如本文使用的，单数形式“一个(a)”，“一个(an)”和“该(the)”旨在包括复数形式，包括“至少一个”，除非内容清楚地另外指出。“或”是指“和/或”。如本文使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关联列出的项目的任何和所有组合。将进一步理解的是，用于本说明书中时，术语“包含(comprises)”和/或“包含(comprising)”或“包括(includes)”和/或“包括(including)”指明了所述特征、区域、整数、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、区域、整数、步骤、操作、要素、组分和/或其组合的存在或添加。术语“或其组合”是指包括至少一个前述要素的组合。
各种实施方案通常提供在对象中降低CD274基因或PD-L1蛋白表达并增加PDCD1基因或PD-1蛋白表达的组合物。在某些实施方案中，对象是细胞，例如肿瘤细胞。更特别地，各种实施方案的组合物和方法在对象中降低CD274基因或PD-L1蛋白的表达并增加PDCD1基因或PD-1蛋白的表达，并且可用于治疗肿瘤，具有减少的或甚至没有心脏副作用。在各种实施方案中，组合物包括A型聚合物，所述A型聚合物包括儿茶素或表儿茶素的A型单或双连接原花青素低聚物，其可用于改变对象(包括细胞)中的CD274基因表达产物或PD-L1蛋白、PDCD1基因表达产物或PD-1蛋白的表达水平。
提供了在对象(任选细胞)中抑制CD274基因和/或PD-L1蛋白表达同时增强PDCD1基因和/或PD-1蛋白表达的方法。在一些实施方案中，提供了在对象细胞中抑制CD274基因和/或PD-L1蛋白表达同时增强PDCD1基因和/或PD-1蛋白表达的方法。如本文使用的，将“对象”定义为生物体(如人、非人灵长类、马、牛、鼠或其他哺乳动物)或细胞。细胞的说明性实例包括肿瘤细胞，如C6胶质瘤细胞和人巨噬细胞样THP-1细胞。如本文使用的，将有需要的对象定义为相对于正常细胞水平具有增加的CD274基因和/或PD-L1蛋白的细胞水平和/或相对于正常细胞水平具有降低的PDCD1基因和/或PD-1蛋白的细胞水平的对象，或希望相对于正常细胞水平或对象自身的细胞基线水平具有降低的CD274基因和/或PD-L1蛋白的细胞水平和/或相对于正常细胞水平或对象自身的细胞基线水平具有增加的PDCD1基因和/或PD-1蛋白的水平的对象。
此外，在一些实施方案中，组合物可以用于同时抑制CD274基因和/或PD-L1蛋白的表达同时增强PDCD1基因和/或PD-1蛋白的表达。这样的施用可以用于改善、预防或调节对象的心脏事件。
将术语“抑制”定义为与效应物存在相关的相对于对照的表达、活性或作用的降低，所述效应物如A型聚合物或其组分，如儿茶素和/或表儿茶素的A型双连接原花青素低聚物，将在下面更详细地描述。“抑制”的说明性实例是编码PD-L1的一个或多个基因(如CD274)的细胞表达水平或速率的降低，或PD-L1蛋白水平的降低。
如本文使用的术语“增强”定义为与效应物存在相关的相对于对照的表达、活性或作用的增加，所述效应物如A型聚合物或其组分，如儿茶素和/或表儿茶素的A型双连接原花青素低聚物。“增强的”说明性实例是编码PD-1的一个或多个基因(如PDCD1)的细胞表达水平或速率的增加，或PD-L1蛋白的细胞水平的增加。
“活性成分”是指存在于组合物中的直接或间接地产生预期效果的成分。一个特定的实例是多酚A型聚合物，更特别的实例是单连接A型聚合物和/或双连接A型聚合物。其他特定的实例包括肉桂鞣质D-1和/或肉桂鞣质B-1。在一些实施方案中，术语“活性成分”不包括单连接A型聚合物。
如本文使用的，“多酚”是指在植物中发现的一组化学物质，其特征在于每个分子存在超过一个的酚基。为了本公开的目的，应理解多酚包括但不限于A型聚合物和低聚物或酚材料。多酚的天然来源包括绿茶、白茶、红酒、黑巧克力、橄榄油以及其他水果、蔬菜和植物，包括肉桂。
在各种实施方案中，组合物包含按干重计至少0.5％的A型聚合物。A型聚合物可以包括儿茶素和/或表儿茶素的A型单和/或双连接原花青素低聚物。儿茶素和/或表儿茶素的这种A型单连接原花青素低聚物可以包括A型单连接原花青素二聚物、A型单连接原花青素三聚物、A型单连接原花青素三聚物、A型单连接原花青素四聚物和/或A型单键原花青素低聚物的混合物。儿茶素和/或表儿茶素的这种A型双连接原花青素低聚物可以包括A型双连接原花青素二聚物、A型双连接原花青素三聚物、A型双连接原花青素三聚物、A型双连接原花青素四聚物和/或A型双键原花青素低聚物的混合物。在各种实施方案中，儿茶素和/或表儿茶素的A-型双连接原花青素低聚物包括肉桂鞣质D-1和/或肉桂鞣质B-1。
如本文使用的，A型聚合物是天然可获得的聚合物的生物活性类型。通过它们的质子化分子质量将其鉴定为儿茶素和/或表儿茶素的A型单或双连接原花青素低聚物。聚合物由儿茶素和/或表儿茶素的单体单元组成，分子量为288Da。A型双连接原花青素低聚物的质量范围为576至1728Da，并且分别可以包括二聚物、三聚物、四聚物和低聚物的混合物。例如，两个分开的双连接A型三聚物和双连接A型四聚物分别具有864和1152Da的分子量。三聚物和四聚物低聚物包括末端(T)、中间(M)和基础(B)单元，两个三聚物的M单元由单个儿茶素/表儿茶素组成，而四聚物的M单元由两个儿茶素/表儿茶素组成。儿茶素和/或表儿茶素的双连接A型原花青素低聚物在低聚物的T和M单元之间含有C4→C8碳和C2→O7醚键，并具有以下结构：
(Anderson等，J.Agric.Food Chem.，2004；52:65-70)。因此，在某些实施方案中，A型聚合物可以包括儿茶素和/或表儿茶素的A型单或双连接原花青素二聚物、儿茶素和/或表儿茶素的A型单或双连接原花青素三聚物、儿茶素和/或表儿茶素的A型单或双连接原花青素四聚物，和/或儿茶素和/或表儿茶素的A型单或双连接原花青素低聚物的混合物。在其他实施方案中，A型聚合物可以包括儿茶素和/或表儿茶素的A型双连接原花青素二聚物、儿茶素和/或表儿茶素的A型双连接原花青素三聚物、儿茶素和/或表儿茶素的A型双连接原花青素四聚物、和/或儿茶素和/或表儿茶素的A型双连接原花青素低聚物的混合物。在一些实施方案中，A型聚合物可以包括肉桂鞣质D-1和/或肉桂鞣质B-1。在一些实施方案中，从组合物中排除儿茶素和/或表儿茶素的A型单连接原花青素低聚物。
在一些实施方案中，A型聚合物可以包括肉桂鞣质D1((2R,3R,4S,8S,14R,15R)-2,8-双(3,4-二羟基苯基)-4-[(2R,3S)-2-(3,4-二羟基苯基)-3,5,7-三羟基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-8-基]-3,4-二氢-2H,8H,14H-8,14-甲撑-1,7,9-三氧杂苯并[6,7]环辛基[1,2-a]萘-3,5,11,13,15-戊醇)和/或肉桂鞣质B1。肉桂鞣质D1具有以下结构：
肉桂鞣质B1具有以下结构：
在一些实施方案中，活性成分(例如，肉桂鞣质D1或肉桂鞣质B1)的量范围为0.5％至25％重量，任选为1％至10％重量。例如，活性成分的量大于或等于0.5％，大于或等于1％，大于或等于2％，大于或等于3％，大于或等于4％，大于或等于5％重量，大于或等于10％重量。在一些实施方案中，活性成分是更广泛的组合物或为更广泛的组合物的一部分。例如，活性成分可以以更广泛组合物干重的0.5％重量-100％重量，1％重量-50％重量，1％重量-10％重量，20％重量-50％重量，30％重量-40％重量，或0.5％至100％之间的任何值或范围存在于更广泛的组合物中。
在一些实施方案中，任选为双连接A型聚合物等的多酚A型聚合物的量范围为0.5％至25％重量，任选1％至10％重量。例如，多酚A型聚合物的含量大于或等于0.5％重量，大于或等于1％重量，大于或等于2％重量，大于或等于3％重量，大于或等于4％重量，大于或等于5％重量，或大于或等于10％重量。在其中A型聚合物是双连接多酚A型聚合物的实施方案中，双连接多酚A型聚合物的量范围为0.5％至25％重量，任选地1％至10％重量。例如，双连接多酚A型聚合物的量可以大于或等于0.5％重量，大于或等于1％重量，大于或等于2％重量，大于或等于3％重量，大于或等于4％重量，大于或等于5％重量，或大于或等于10％重量。在一些实施方案中，A型聚合物是膳食补充剂组合物或是其一部分。A型聚合物在膳食补充剂组合物中任选为膳食补充剂组合物干重的0.5％-100％重量，任选为1％-50％重量，任选为1％-10％重量，任选为20％-50％重量，任选为30％-40％重量，或0.5％至100％之间的任何值或范围存在。
诸如儿茶素和/或表儿茶素的A-型单和/或双连接原花青素低聚物的A型聚合物可以化学合成或从一种或多种天然来源获得。从植物分离化学物质的任何方法中的一种或多种可以用于分离A型聚合物，如儿茶素和/或表儿茶素的A型单和/或双连接原花青素低聚物。A型聚合物的一种示例性来源是肉桂。肉桂可以从各种资源中获得。说明性地，肉桂是从树皮获得的。桂皮可以获自世界各地，包括中国、斯里兰卡、印度尼西亚等。A型聚合物可以任选通过精心设计的提取工艺从桂皮获得。肉桂提取物任选来自任何肉桂物种。在一个示例性方面中，肉桂提取物源自Cinnamonum aromaticum、Cinnamonum verum或Cinnamomumburmannii的树皮。在一些方面中，肉桂提取物源自樟科(Lauraceae)属的锡兰肉桂(Cinnamomum zeylanicum)树的树皮。这种树原产于东亚和东南亚。肉桂的其他来源也可以用于本文公开的方法和材料中。肉桂皮可以以生皮、切片或切碎的皮，或粉碎的皮的形式使用，以制备治疗材料，而粉碎的肉桂皮在特定情况下使用。
提取物可以通过精心设计以产生所需浓度或含量的A型聚合物的各种方法来制备。提取物任选是水溶性的。这样，提取物任选是水溶性水提取物、水溶性醇提取物或其他可操作提取过程的水溶性提取物。提取过程与所得提取物的最终组成直接相关。这样，通过一种方法形成的产物不一定等同于通过不同方法形成的提取物，通常由于单个提取参数而不同。本文所述的方法代表了示例性方法，以生产具有所需水平的活性剂-A型多酚(特别是双连接A-型聚合物)的提取物。
诸如水质、加热温度、干燥温度、加热时间、干燥时间和过滤过程的提取参数均有助于过程的质量和效率。水质直接影响活性剂的浓度。劣质的水可能导致A型聚合物在提取过程中分解和氧化。这常常导致肉桂提取物粉末颜色微红并且A型聚合物的百分比浓度低。加热时间决定了提取的各种聚合物的比例。加热时间还会影响提取混合物的稠度，从而直接影响下游的过滤过程。提取温度还影响活性A型聚合物的水平。在某些方面中，提取温度在50℃至100℃之间。任选，提取温度在50℃至95℃之间。任选，温度在50℃至90℃之间。任选，提取温度在50℃至90℃之间。干燥温度可以从75℃到120℃变化，这取决于还使用了哪些其他提取参数。以重量为基准，溶剂的用量通常为原料提取材料的2至100倍。说明性地，使用50克桂皮时，用1000ml水进行提取(1g/ml是水的重量，即20倍体积)。
提取时间对于获得所需量的多酚A型聚合物也很重要，这在上文有详细描述。任选通过在提取溶剂中加热原料超过10分钟，任选超过1小时，任选1至3小时来进行提取，所述范围中的任何细分时间也是可操作的。
提取溶剂任选地是水性的或有机的。蒸馏水或醇(如乙醇)任选单独或组合用作提取溶剂。所获得的提取物任选是水溶性的。
获得提取的多酚组合物的必要的治疗效果需要简单的水或醇提取之外的步骤。在一些方面中，液体提取物通过柱色谱法进一步处理以进一步分离活性物质，任选通过适当大小的分子筛柱以分离活性物质。
含有必需含量的A型聚合物的肉桂提取物的说明性实例可见于美国专利6,200,569，将其按引用整体并入本文中，并在其中描述了以CINNULIN PF出售的产品。任选，可以按照所述的(Anderson等，J.Agric.Food Chem.2004；52：65-70)来制备来自C.burmanni的树皮的干燥提取物中的双连接原花青素A型聚合物(3％重量)，或由IN Ingredients Inc.(以前是Integrity Nutraceuticals，Columbia，TN，USA)作为CINNULIN PF提供。
在一些实施方案中，将50g清洁桂皮研磨成小颗粒或粉末。将粉末或颗粒在合适的烧瓶中与1000ml蒸馏水混合。将混合物在室温下静置约0.5小时。在这个和其他实例中，任选添加一定量的缓冲液以维持提取溶剂的pH。可以添加的另外的水在1:20至1:2000范围中。太少的水可能会使混合物变得太稠而无法提取。但是，过多的水会增加干燥时间。然后，通过使用磁力热搅拌器在搅拌的同时加热水混合物。温度和提取时间对于生物活性聚合物的浓缩效率至关重要。提取过程任选不超过一小时。任选，可将研磨的树皮加热15-20分钟使其沸腾，在持续搅拌的同时熬煮20-30分钟。任选，将研磨的树皮加热至100℃ 15-20分钟，然后在持续搅拌的同时熬煮20-30分钟。加热后，沸腾时间任选控制在约20-25分钟。将混合物冷却并在4℃下储存过夜。通过水提获得的示例性肉桂提取物作为CINNULIN PF出售。
在一个示例性实施方案中，将250公斤的Cinnamomum burnannii研磨成小颗粒或粉末。将粉末或颗粒在合适的烧瓶中与2000ml(8X)蒸馏的乙醇-水混合，并将混合物在环境温度下静置0.5小时。任选，通过使用10倍水体积/重量的研磨的肉桂皮，说明性的，单独使用水作为提取溶剂。通过使用磁力热搅拌器在搅拌的同时将混合物加热至50℃，并循环120分钟。蒸发是在蒸汽温度低于100℃的条件下进行的，工艺温度低于60℃，TS折射仪为45-50％。过滤液体提取物，并如上所述进一步纯化。然后将材料干燥至含水量小于5％。
在一些示例性实施方案中，使用以下方法从肉桂提取A型多酚：将5g肉桂和100ml0.1N乙酸合并并高压灭菌15分钟。将得到的混合物冷却，然后离心并丢弃沉淀物。将四体积的乙醇/0.1N乙酸添加到上清液中，并将混合物在4℃下储存过夜。通过过滤器筛选混合物。为了确定生物活性聚合物的含量，将混合物引入LH-20柱上，并用600ml乙醇/0.1N乙酸洗涤。然后将所需级分用乙腈和0.2N乙酸的1:1混合物洗脱。然后将洗脱物浓缩并引入到275nm的HPLC柱上。
在一些实施方案中，在没有酸的情况下进行初始提取。将50克干净的桂皮研磨成小颗粒或粉末，并在合适的烧瓶中与1000毫升蒸馏水/10％乙醇混合。然后，通过使用磁力加热搅拌器在搅拌的同时加热水混合物。提取过程任选不超过一小时。任选，将提取溶剂中的磨碎的树皮加热至沸腾15-20分钟，然后在持续搅拌的同时熬煮20-30分钟。加热后通常将沸腾时间控制在约20-25分钟。将混合物冷却并在4℃下储存过夜。应当理解，除乙醇之外的醇或除除了乙醇还有其他的醇，例如甲醇，也可以用于提取过程中。在提取溶剂中使用醇时，其存在通常为50％或更少。
本文所述的任何一种提取溶液(或其组合)任选通过滤纸过滤以除去任何固体碎片。如果溶液对于滤纸而言太稠，则任选通过离心除去溶液中的固体。将所得的上清液通过中速滤纸过滤。任选将所得固体溶于200mL蒸馏水或水/乙醇中进行第二次提取。将包含固体的液体溶液混合并在80-90℃下加热30分钟，然后过滤以产生第二提取溶液。
在一些实施方案中，将第一提取溶液和第二提取溶液合并在一起并倒入不粘托盘上，并使其在80-90℃下干燥。任选将真空喷雾干燥设备用于干燥程序。称量所得的干燥提取物粉末。按照w/20×100％计算提取率，w为干提取物粉末的重量(g)。样品和水的比例、加热时间、第二次提取中的水体积可以根据用于提取的原料量来改变。
任选使用高效液相色谱(HPLC)来分析加热温度和提取时间的变化对聚合物浓度的影响。作为非限制性实例，将100mg干肉桂粉在烧瓶中用100ml水溶解。将溶液超声处理30-45分钟，通过0.45μm PTFE注射器过滤。如下制备样品并在不同温度下测试：在50-60℃下提取样品一小时，在17和21分钟洗脱的A型聚合物具有合理的浓度。将温度升至75-82℃保持1小时后，在17和21分钟洗脱的峰减少2-3％。在这个提取过程中似乎还有另外两个相对较小的峰出现。它们分别在28.5分钟、33.5分钟时洗脱。加热温度升高到85-90℃另外持续1小时后，在17和21分钟洗脱的峰减少了约7-9％。在28.5和33.5的峰显著增加。最后，加热温度升至95-100℃保持20分钟，然后再降至85-95℃保持另外40分钟。在17和21分钟洗脱的峰似乎减少了15-20％。在28.5和33.5分钟洗脱的峰增加了两倍多。根据这些结果，在17和21分钟的聚合物分别在28.5和33.5分钟被转化成异构体。
在另一个程序中，分析了A型聚合物的稳定化。测试了50-100℃，特别是95-100℃的加热温度下的各种提取时间段。在50-100℃下提取样品一小时后，在17和21分钟洗脱的聚合物呈现出所需的浓度。在最初的2-3小时内，随着加热温度的升高，在17和21分钟洗脱的峰减少。3小时后，在17和21分钟洗脱的峰不再显著变化，似乎达到了平稳期。这些结果表明，在95-100℃的温度下提取3小时后，聚合物稳定了。
不仅重要的是注意到时间和温度在维持这些A型聚合物关键活性物质的较高浓度中起着关键作用，另外所选择的物种可能对这些A型聚合物的水平产生显著影响。在对世界上许多肉桂种进行彻底审查后，已经证明了以下的提供最高水平的活性A型聚合物：Cinnamomum Burmannii(Nees)Blume-微生物鉴定指数(MIDI)级；Korintji Cassia。
通过使用HPLC，测试如上所述制备的肉桂提取物干粉，以证实一定量的多酚的存在，如双连接多酚A型聚合物，单连接A型聚合物或其他生物活性聚合物。在实施方案中，A型聚合物可以包括肉桂鞣质D-1和/或肉桂鞣质B-1。这允许提取物的标准化。
在特定情况下，肉桂提取物粉末的干重可以基于生物活性组分(如双连接多酚A型聚合物)而标准化。多酚A型聚合物等的含量任选在0.5％至25％重量的范围内，任选1％至10％重量。任选，多酚A型聚合物的含量大于0.5％重量，大于1％重量，大于2％重量，大于3％重量，大于4％重量，大于5％重量或大于10％重量。在进一步的方面中，双连接多酚A型聚合物等的含量任选在0.5％至25％重量的范围内，任选在1％至10％重量。任选，双连接多酚A型聚合物的含量大于0.5％重量，大于1％重量，大于2％重量，大于3％重量，大于4％重量，大于5％或大于10％重量。
根据原料、提取程序、提取溶剂、纯化和浓缩步骤等，A型聚合物的最终浓度通常不足或小于0.5％重量，小于1％重量，小于2％重量，小于3％重量，小于4％重量，小于5％重量或小于10％重量。这样，提取物可以被进一步处理以将A型聚合物浓缩至期望的或需要的浓度。任选将液体提取物通过柱以提供具有目标浓度的A型聚合物的浓缩洗脱物。
桂皮可以以生皮、切片或切碎的皮，或粉碎的皮的形式使用，用于制备治疗材料，并且在特定情况下使用粉碎的桂皮。
在一个实验系列中，使用水提取溶剂根据前述程序制备提取物。样品的浓度约为(例如误差内)5.17mg/ml。同样重要的是要注意，聚合物的浓度随温度和提取时间而变化。
在各种实施方式中，其他天然化合物可以用作活性成分。例如，大蒜酸、芦丁、槲皮素、橄榄叶提取物、迷迭香提取物、来自阿罗尼亚的北美沙果提取物和/或姜黄素提取物可以用作组合物中的活性成分。大蒜酸是一种三羟基苯甲酸，酚酸类型，存在于没食子、漆树、金缕梅、茶叶、橡树皮和其他植物中。芦丁是一种类黄酮，是在蔬菜、水果、草本植物、树叶、种子和几种药用植物中发现的多酚类化合物之一。芦丁是一种生物类黄酮和抗氧化剂。槲皮素可保护细胞DNA，是抗炎、天然的组胺阻滞剂，并具有从癌细胞“窃取”铁的能力，从而阻止其生长。橄榄叶提取物包括被称为橄榄苦苷的植物化学物质。姜黄素具有强大的抗氧化和抗炎特性。
迷迭香提取物可以获自各种来源。迷迭香(rosemary)，或迷迭香(Rosmarinusofficinalis)，是原产于地中海地区的木质灌木。迷迭香的提取物可以从迷迭香属物种植物制成，并优选从新鲜的迷迭香(迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)及其栽培品种)的叶子和幼嫩的开花顶部提取。迷迭香提取可以通过采收迷迭香植物的叶子并减小其尺寸来进行，例如通过切碎来减小尺寸以提高溶剂渗透性。典型的颗粒大小任选为0.5-5.0mm，或之间的任何值或范围。在一些实施方案中，将叶切成颗粒大小小于0.5mm的粉末型物质。将切开的植物材料与合适的提取溶剂(如水或低分子量醇(如乙醇))混合。将植物材料与溶剂组合，提取时间为18到36小时。提取温度任选在10℃至45℃的范围内。将得到的提取液与固体材料分离并过滤，任选使用无菌过滤器。任选，将所得提取物倒入不粘托盘上，并在80-90℃下干燥。任选将真空喷雾干燥设备用于干燥程序。称量所得的干燥提取物粉末。按照w/20x100％计算提取率，“w”为干燥提取物粉末的重量(g)。样品和水的比例、加热时间、第二次提取中的水体积可以根据用于提取的原料量来改变。
根据想要的给药方式，所给药的组合物可以以固体、半固体或液体剂量形式的形式存在于药物组合物中，所述剂量形式如，例如片剂、栓剂、丸剂、胶囊、散剂、液体、油基形式或悬浮液，并且可以以适合单次给药的单位剂量提供。延时释放制品被特别考虑作为有效剂量制剂。组合物将包括有效量的选定物质和药学上可接受的载体，并且另外可以包括其他药用活性剂、药物活性剂、载体或稀释剂。
在固体组合物的实施方案中，常规的无毒固体载体可以包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。液体药学上可给药的组合物可以例如通过将活性剂用赋形剂中的最佳药物佐剂溶解或分散来制备，所述赋形剂如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油或乙醇，以形成溶液或悬浮液。例如，药物组合物可以含有少量的无毒辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂，例如乙酸钠或油酸三乙醇胺。制备这种剂量形式的实际方法对本领域技术人员而言是已知的或显而易见的；例如，参见Remington的The Science and Practice of Pharmacy(第20版)。
在口服给药实施方案中，细粉或颗粒可以含有稀释剂、分散剂或表面活性剂。细粉或颗粒可以存在于水或糖浆中，以干燥状态存在于胶囊或小袋中，或存在于非水性溶液或悬浮液中。悬浮剂也可以包括在片剂中，其可以包括悬浮液中的粘合剂和润滑剂。也可以包括调味剂、防腐剂、悬浮剂、增稠剂或乳化剂，来改变组合物的味道和质地。提供用于口服给药的片剂和颗粒可以进一步包衣以易于消化。
在一些实施方案中，可以将含有活性A型聚合物的组合物与一种或多种补充活性剂组合。补充活性剂任选与A型聚合物协同作用。补充活性剂说明性地包括维生素(如维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E或维生素K)、抗氧化剂(如巴西莓、枸杞、α硫辛酸、虾青素或岩藻黄素)，或以上的任意组合。
包括A型聚合物的组合物任选是食品添加剂的形式。实例包括以液体、半液体、固体、糊状物或凝胶形式的食品。
组合物可以在对象中代谢，以产生治疗有效量的化合物，即多酚，如以上详细讨论的A型多酚、肉桂低聚物、肉桂儿茶素或表儿茶素、肉桂查尔酮和肉桂MHCP。在特定的疗法中，选择肉桂提取物补充剂的每剂剂量，以便将每份0.1毫克(mg)至150毫克，任选1-30mg，和任选3-10mg的A型聚合物含量或两者之间的任何值或范围的A型聚合物递送至个体中。
在示例性方案中，每天口服1-3次组合物。然而，预期可以使用其他给药途径。另外，应当注意，组合物可以衍生物的形式使用。例如，组合物可以化学或物理结合至其他化学物质和部分，如合成聚合物、脂质体、有机小分子、几丁质、壳聚糖、其他生物聚合物等。根据本文提出的教导，对于本领域技术人员而言，进一步的组合将是显而易见的。
在各个实施方案中，给对象施用一定剂量的组合物，使得选择每个剂量的组合物以将每份0.1毫克(mg)至150毫克，任选1-30mg，和任选3-10mg的A型聚合物含量或两者之间的任何值或范围的A型聚合物递送至个体中。进一步考虑到可变剂量方案在该过程中是可操作的。尽管在某些情况下，单剂量治疗可以有效地产生治疗效果或其他所需效果，在其他情况下，可以利用例如六周至三个或六个月或更长时间范围内的治疗期。
组合物可以通过肌内、腹膜内、通过经皮注射，或通过与细胞或组织接触，如通过浸没或其他接触形式，经口、肠胃外或静脉内施用。注射或口服剂量形式可以常规形式制备，既可以是液体溶液或悬浮液，也可以是适用于溶液的固体形式或给药前的固体形式，或作为给药前在液体中的悬浮液或作为乳液。另外，剂量形式可以是油基形式。
组合物的剂量可以根据对象的年龄、体重、一般状况而变化。例如，每天按干重计在1-1,000mg或相当的至少0.5％的A型聚合物的范围内的剂量可以是有效范围。活性剂可以以组合物干重的0.01％-100％存在。例如，活性剂可占组合物干重的0.5％-50％。
相对于对照或基线，向对象(例如，细胞)施用组合物将抑制对象中(例如，细胞中)的PD-L1基因或蛋白的表达。说明性地，相对于如不存在组合物的对照，通过PD-L1 mRNA(如CD274 mRNA)的水平测量，PD-L1基因表达(如CD274)降低。说明性地，PD-L1基因表达被抑制(例如降低)1％至300％或更高的值，或两者之间的任何值或范围。任选，PD-L1基因表达降低1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％，125％，150％，200％，250％，300％或更多。
相对于对照或基线，可以增强(例如增加)对象(例如细胞)中的PD-1基因表达(例如PDCD1)的靶标水平。说明性地，编码PD-1的基因(PDCD1)的表达增强1％至300％或更高的值，或两者之间的任何值或范围。任选，编码PD-1的基因的表达相对于对照增强1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％，125％，150％，200％，250％，300％或更多。
用于检测mRNA表达以确定基因表达的存在或程度的方法是本领域已知的。说明性地，通过实时聚合酶链式反应(如本文使用的qRT-PCR)检测和任选定量mRNA。qRT-PCR任选结合之前的从总细胞RNA的cDNA合成，如使用Superscript II RT，它是由Invitrogen，Corp.，Carlsbad，CA生产的逆转录酶。用于测量基因表达的说明性方案可以在CrujeirasAB等，Eur J Clin Invest，2008；38(9)：672-8以及本领域已知的其他来源中找到。
通过向对象施用组合物，PD-L1蛋白在对象(例如，细胞)中的表达任选被抑制(即，降低)。说明性地，相对于对照或基线，(例如，细胞中)PD-L1蛋白的表达被抑制。说明性地，PD-L1蛋白表达被抑制1％至300％或更高的值，或者两者之间的任何值或范围。任选，PD-L1蛋白表达被抑制1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％，125％，150％，200％，250％，300％或更多。
通过向对象施用组合物，PD-L1蛋白在对象(例如，细胞)中的表达可以增强(即，增加)。在一些实施方案，相对于对照或基线，PD-L1蛋白的表达增强。例如，PD-L1蛋白表达增强1％至300％或更高的值，或者两者之间的任何值或范围。任选，PD-L1蛋白表达增强1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％，125％，150％，200％，250％，300％或更多。
通过本领域已知的许多方法实现检测和任选定量PD-L1蛋白或PD-1蛋白表达。说明性地，通过以下方法来检测PD-L1蛋白或PD-1蛋白表达并任选进行定量：酶联免疫吸附测定(ELISA)、质谱、Western印迹、任选结合染色的凝胶电泳，如通过考马斯亮蓝或银染，或通过靶向特异性染色剂、流式细胞术、免疫沉淀或通过本领域已知的其他方法。在一些实施方案中，ELISA用于检测和任选定量PD-L1蛋白或PD-1表达。例如，可从本领域已知的来源获得用于PD-L1或PD-1的ELISA试剂盒。适用于ELISA中的针对PD-L1或PD-1蛋白的抗体可从本领域已知的来源获得，包括Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA。
应当理解，任选将本文所述的任何膳食补充剂或任何的肉桂提取物或其等效物用于治疗对象(例如，对象的细胞中)的PD-1/PD-L1系统功能障碍以及对象中(例如，对象的细胞中)由这种PD-1/PD-L1系统功能障碍引起的对象症状的方法中，所述PD-1/PD-L1系统功能障碍包括失调的PD-L1水平，特别是高PD-L1水平，失调的PD-1水平，特别是低PD-1水平，或其组合。例如，任选将本文所述的膳食补充剂或任何的肉桂提取物或其等效物用于治疗肿瘤的方法中，具有减少的或甚至没有心脏副作用。
还提供了一种治疗对象的PD-1/PD-L1途径功能障碍的方法，所述PD-1/PD-L1途径功能障碍包括失调的PD-L1水平，特别是高PD-L1水平，失调的PD-1水平，特别是低PD-1水平，或其组合。此类方法说明性地包括向对象施用治疗有效量的包括一种或多种A型聚合物的组合物。将治疗有效量定义为能够在对象中(例如，在细胞中)相对于对照降低PD-L1蛋白或编码PD-L1蛋白的基因的表达和/或增加PD-1蛋白或编码PD-1蛋白的基因的表达的含量。
治疗细胞中的PD-1/PD-L1途径功能障碍的方法说明性地包括以一定剂量向对象施用包括A型聚合物的膳食补充组合物，使得每个剂量的组合物将每份0.1毫克(mg)至150毫克A型聚合物含量或两者之间的任何值或范围，例如1-30mg，或3-10mg中的A型聚合物递送至个体中，所述PD-1/PD-L1途径功能障碍包括失调的PD-L1水平，特别是高PD-L1水平，失调的PD-1水平，特别是低PD-1水平，或其组合。
还提供了一种治疗细胞中与PD-1/PD-L1途径功能障碍(如，失调的PD-L1水平，特别是高PD-L1水平，和/或失调的PD-1水平，特别是低PD-1水平，或其组合)有关的症状的方法，所述症状包括对象的癌症症状。这样的方法说明性地包括向对象施用治疗有效量的A型聚合物。
还提供了一种治疗细胞中与PD-1/PD-L1途径功能障碍(如，失调的PD-L1水平，特别是高PD-L1水平，和失调的PD-1水平，特别是低PD-1水平)有关的症状的方法，所述症状包括对象中的心血管事件的症状。这样的方法说明性地包括向对象施用治疗有效量的A型聚合物以改善、预防或调节对象的心脏事件。例如，相对于对照或其他PD-L1特异性治疗剂，向对象施用任选减少或消除心肌病的事件，任选由于自身免疫性扩张型心肌病而导致的心力衰竭。
在对象中治疗与PD-1/PD-L1途径功能障碍(如，失调的PD-L1水平，特别是高PD-L1水平，失调的PD-1水平，特别是低PD-1水平，或其组合)有关的症状的方法说明性地包括向对象施用一定剂量的包括A型聚合物的组合物，使得每个剂量的组合物将每份0.1毫克(mg)至150mg A型聚合物含量或两者之间的任何值或范围，任选的1-30mg，任选的3-10mg中的A型聚合物递送至个体中，所述症状包括癌症、病毒感染和自身免疫性疾病的症状，所述自身免疫性疾病如自身免疫性扩张型心肌病、狼疮样综合征、自身免疫性脑脊髓炎、系统性红斑狼疮、移植物抗宿主病、I型糖尿病和类风湿性关节炎。
进一步考虑到可变剂量方案在所述方法中是可操作的。尽管在某些情况下，单剂量治疗可以有效地产生治疗效果，在其他情况下，可以利用例如六周至三或六个月或更长时间范围内的治疗期。所述组合物可以通过肌内、腹膜内、通过经皮注射，或通过与对象的其他接触，经口、肠胃外或静脉内施用。注射或口服形式可以常规形式制备，既可以是液体溶液或悬浮液，也可以是适用于溶液的固体形式或给药前的固体形式，或作为给药前在液体中的悬浮液或作为乳液。
组合物的剂量可以根据对象的年龄、体重、一般状况而变化。例如，每天按干重计在1-1,000mg至少0.5％的A型聚合物的范围内的剂量可以是有效范围。A型聚合物也可以构成0.01％-100％的组合物干重。例如，膳食补充组合物可以包含0.5％-50％干重的组合物。
具体实施方案：
1.一种用于治疗或预防对象中与CD274基因或PD-L1蛋白或PDCD1基因或PD-1蛋白表达相关的疾病或病症的方法，其包括：
给需要其的对象施用包含至少0.5％重量的活性成分的组合物，其中活性成分包含肉桂鞣质D-1和/或肉桂鞣质B-1；和
治疗或预防对象中的疾病或病症，同时还改善、预防、调节对象的心脏事件或没有增加对象的心脏事件机会，并且其中以足以在所述对象中降低CD274基因或PD-L1蛋白表达和增加PDCD1基因或PD-1蛋白表达的浓度施用组合物。
2.实施方案1的方法，其中所述肉桂鞣质D-1和/或肉桂鞣质B-1以约1-30毫克存在。
3.实施方案1的方法，其中所述肉桂鞣质D-1和/或肉桂鞣质B-1以约3-10毫克存在。
4.实施方案1的方法，其中所述活性成分基本上由肉桂鞣质D-1和肉桂鞣质B-1组成。
5.实施方案1的方法，其中通过口服、静脉内、通过肌内注射、通过腹膜内注射或经皮来施用组合物。
6.实施方案1的方法，其中所述组合物进一步包含一种或多种维生素、抗氧化剂，或其组合。
7.实施方案1的方法，其中每天施用所述组合物，持续六周或更长的时间段。
8.实施方案1的方法，其中每天施用所述组合物一至三次。
9.一种用于治疗或预防对象中与CD274基因或PD-L1蛋白或PDCD1基因或PD-1蛋白表达相关的疾病或病症的方法，其包括：
给需要其的对象施用包含至少0.5％重量的活性成分的组合物，其中活性成分选自橄榄叶提取物、槲皮素、大蒜酸、芦丁、北美沙果提取物、迷迭香提取物、姜黄素提取物和肉桂提取物；和
治疗或预防对象中的疾病或病症，同时还改善、预防、调节对象的心脏事件或没有增加对象的心脏事件机会，并且其中以足以在所述对象中降低CD274基因或PD-L1蛋白表达和增加PDCD1基因或PD-1蛋白表达的浓度施用组合物。
10.实施方案9的方法，其中所述活性成分以约1-30毫克存在。
11.实施方案9的方法，其中所述活性成分以约3-10毫克存在。
12.实施方案9的方法，其中通过口服、静脉内、通过肌内注射、通过腹膜内注射或经皮来施用组合物。
13.实施方案9的方法，其中所述组合物进一步包含一种或多种维生素、抗氧化剂，或其组合。
14.实施方案9的方法，其中活性成分基本上由迷迭香提取物组成。
15.实施方案9的方法，其中活性成分基本上由姜黄素提取物组成。
16.实施方案9的方法，其中活性成分基本上由橄榄叶提取物组成。
17.实施方案9的方法，其中活性成分基本上由槲皮素组成。
18.实施方案9的方法，其中活性成分基本上由大蒜酸组成。
19.实施方案9的方法，其中活性成分基本上由芦丁组成。
20.实施方案9的方法，其中活性成分基本上由北美沙果提取物组成。
通过以下非限制性实施例来说明各种实施方案。这些实施例仅用于说明目的，并不是对本发明的任何实践的限制。将理解的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以做出变化和修改。
实施例
在本研究中，使用人巨噬细胞-样THP-1细胞来确定活性剂的效果。
利用免疫荧光研究来探索包含A型聚合物的活性组合物对PD-L1和PD-1蛋白的作用。如描述的那样(Anderson等，J.Agric.Food Chem.2004；52：65-70)，制备在来自C.burmanni的树皮的干燥提取物中的双连接原花青素A型聚合物(3％重量)，或由INIngredients Inc.(以前是Integrity Nutraceuticals，Columbia，TN，USA)作为CINNULINPF提供。将干燥的提取物组合物溶解在DMSO中，并在-20℃下保存直至使用。抗体(抗PD-L1，抗PD-1)均获自Santa Cruz Biotech。使用的所有其他试剂均为商业产品中可用的最高等级。
人单核THP-1细胞购自ATCC，Manassas，VA，并维持在RPMI培养基中，该培养基补充有10％热灭活的胎牛血清、10mM Hepes、0.1mM MEM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和100nM青霉素/链霉素，在37℃，含有5％ CO2和95％空气的气氛中维持。通过以10ng/mL浓度在RPMI培养基中用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA，Sigma，P8139)孵育48小时，THP-1单核细胞在巨噬细胞中分化。用或没用以下所示剂量的处理化合物在37℃下孵育细胞24小时。在某些使用LPS研究的处理中，将细胞在补充有10μg/mL LPS和浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml或50μg/ml(来自3％提取物)的A型聚合物的新鲜F-12K培养基中在37℃下孵育24小时。在使用LPS研究的其他处理中，将细胞在补充了10μg/mL LPS和浓度为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml或25μg/ml的肉桂鞣质D-1的新鲜F-12K培养基中在37℃下孵育24小时。
细胞用冰冷的PBS冲洗并在室温下用4％多聚甲醛固定10分钟，然后用0.3％Triton x-100透化10分钟。用PBS洗涤3次后，将细胞在含有10％正常山羊血清阻断溶液的PBS中孵育1小时。在4℃下将细胞接受使用特异性抗体(分析人巨噬细胞样THP-1细胞(Santa Cruz Biotech)用于PD-1)的免疫荧光染色过夜。然后将细胞用冷PBS洗涤3次，每次3分钟，并用Alexa标记的二抗(Invitrogen)在室温下孵育1h。通过荧光显微镜(NikonTE2000-S显微镜，Nikon，东京，日本)检查细胞。对于细胞计数，选择五到十个随机视野用于每个平板中的分析，每个视野中细胞密度大致相似。通过光密度法(ImageJ软件，NIHImage)对这些图像的荧光强度(像素值超过背景标准偏差的五倍)进行了半定量分析。
在所有测试浓度下，相对于对照，人巨噬细胞样THP-1细胞中的A型聚合物组合物(来自3％提取物)产生了显著增强的PDCD-1表达。因此，数据证明双连接原花青素A型聚合物显著增强了细胞中的PDCD-1表达。此外，在所有测试浓度下，A型聚合物组合物均显著提高了LPS诱导的PDCD-1下表达。因此，数据证明双连接原花青素A型聚合物显著增加了细胞中的PDCD-1表达。
如图1中所示，如Anderson等，J.Agric.Food.Chem.2004；52:65-70中所述的分离的双连接A型聚合物，其包括肉桂鞣质B-1和肉桂鞣质D-1，在所有测试浓度(5μg/ml，10μg/ml，25μg/ml或50μg/ml)下，都显著增强了人巨噬细胞样THP-1细胞中的PDCD-1表达。与对照相比，Cinnulin PF导致了PDCD-1表达的百分比增加，Cinnulin PF在5μg/ml时增加13％，10μg/ml时增加29％，25μg/ml时增加67％和50μg/ml时增加58％。
如图2中所示，在所有测试浓度(2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml或20μg/ml)下，肉桂鞣质B-1显著增强了人巨噬细胞样THP-1细胞中的PDCD-1表达。与对照相比，肉桂鞣质B-1导致了PDCD-1表达的百分比增加，肉桂鞣质B-1在2.5μg/ml时增加21％，5μg/ml时增加42％，10μg/ml时增加83％和20μg/ml时增加62％。
如图3中所示，在所有测试浓度(2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml或20μg/ml)下，肉桂鞣质D-1显著增强了人巨噬细胞样THP-1细胞中的PDCD-1表达。与对照相比，肉桂鞣质D-1导致了PDCD-1表达的百分比增加，肉桂鞣质D-1在2.5μg/ml时增加18％，5μg/ml时增加45％，10μg/ml时增加87％和20μg/ml时增加71％。
如图4中所示，如Anderson等，J.Agric.Food.Chem.2004；52:65-70中所述的分离的双连接A型聚合物在所有测试浓度下显著提高了LPS诱导的PD-1下调。与对照相比，双连接A型聚合物导致了LPS-诱导的PDCD-1下表达的百分比抑制，活性物质在5μg/ml时抑制27％，10μg/ml时抑制70％，25μg/ml时抑制79％和50μg/ml时抑制31％。
如图5中所示，肉桂鞣质D-1在所有测试浓度下显著提高了LPS诱导的PD-1下调。与对照相比，肉桂鞣质D-1导致了LPS-诱导的PDCD-1下表达的百分比抑制，肉桂鞣质D-1在2.5μg/ml时抑制42％，5μg/ml时抑制98％，10μg/ml时抑制81％和25μg/ml时抑制48％。
除了肉桂鞣质，测试了多种其他天然化合物来确定它们是否增强了PD-1表达。化合物包括橄榄叶提取物、槲皮素、大蒜酸、芦丁、(来自Aronia的北美沙果提取物，可从IN Ingredients Inc.Columbia，TN，USA商业购得)、迷迭香提取物和姜黄素提取物。
如图6中所示，大蒜酸在所有测试浓度(10μg/ml，20μg/ml或50μg/ml)下显著增强了人巨噬细胞样THP-1细胞中的PDCD-1表达。与对照相比，大蒜酸导致了PDCD-1表达百分比的增加，大蒜酸在10μg/ml时增加47％，20μg/ml时增加71％和50μg/ml时增加52％。
如图7中所示，芦丁在所有测试浓度(10μg/ml，20μg/ml或50μg/ml)下显著增强了人巨噬细胞样THP-1细胞中的PDCD-1表达。与对照相比，芦丁导致了PDCD-1表达百分比的增加，芦丁在10μg/ml时增加17％，20μg/ml时增加48％和50μg/ml时增加43％。
如图8中所示，槲皮素在所有测试浓度(10μg/ml，20μg/ml或50μg/ml)下显著增强了人巨噬细胞样THP-1细胞中的PDCD-1表达。与对照相比，槲皮素导致了PDCD-1表达百分比的增加，槲皮素在10μg/ml时增加33％，20μg/ml时增加78％和50μg/ml时增加57％。
如图9中所示，橄榄叶提取物在所有测试浓度(10μg/ml，50μg/ml或100μg/ml)下显著增强了人巨噬细胞样THP-1细胞中的PDCD-1表达。与对照相比，橄榄叶提取物导致了PDCD-1表达百分比的增加，橄榄叶提取物在10μg/ml时增加28％，50μg/ml时增加67％和100μg/ml时增加79％。
如图10中所示，迷迭香提取物在所有测试浓度(10μg/ml，50μg/ml或100μg/ml)下显著增强了人巨噬细胞样THP-1细胞中的PDCD-1表达。与对照相比，迷迭香提取物导致了PDCD-1表达百分比的增加，迷迭香提取物在10μg/ml时增加35％，50μg/ml时增加53％和100μg/ml时增加89％。
如图11中所示，在所有测试浓度(10μg/ml，20μg/ml或100μg/ml)下显著增强了人巨噬细胞样THP-1细胞中的PDCD-1表达。与对照相比，/>导致了PDCD-1表达百分比的增加，/>在10μg/ml时增加23％，20μg/ml时增加35％和100μg/ml时增加48％。
如图12中所示，姜黄素提取物在所有测试浓度(5μg/ml，10μg/ml或50μg/ml)下显著增强了人巨噬细胞样THP-1细胞中的PDCD-1表达。与对照相比，姜黄素提取物导致了PDCD-1表达百分比的增加，姜黄素提取物在5μg/ml时增加21％，10μg/ml时增加45％和50μg/ml时增加93％。
在本发明的PD-L1表达的研究中，使用大鼠C6胶质瘤细胞和人巨噬细胞样THP-1细胞来确定活性剂的作用。
利用免疫荧光研究来探索包括A型聚合物的活性组合物对PD-L1蛋白的作用。从Planta Analytica(New Milford，CT)获得纯化的肉桂鞣质B1和肉桂鞣质D1。从INIngredients获得作为CINNULIN PF销售的具有至少3％重量的A型聚合物的肉桂水提取物。将每种干燥的材料溶解于DMSO，并在-20℃下储存直至使用。抗体(抗PD-L1)均购自SantaCruz Biotech。使用的所有其他试剂均为商业产品中可用的最高等级。
C6胶质瘤细胞(CCL-107)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)。将细胞培养物在补充10％马血清和2％胎牛血清的F-12K培养基(Gibco/Invitrogen)中生长，并维持在37℃下含有5％ CO2和95％空气的湿润气氛中。将培养物在75mm烧瓶中生长至85％汇合，并用0.05％胰蛋白酶和EDTA对亚汇合培养物进行胰蛋白酶消化来继代培养细胞。将C6胶质瘤细胞以每35mm盘0.5×106个细胞的密度接种，并培养两天。在实验期间，细胞生长至汇合。进行了三项研究：1)细胞没有其他处理；2)用LPS(10μg/mL)处理；和3)用TNF-α(10ng/mL)处理。在某些研究中，将细胞在补充肉桂鞣质D1(浓度为0μg/ml，5μgml，10μg/ml，20μg/ml，25μg/ml或50μg/ml)或肉桂鞣质B1(浓度为0μg/ml，5μgml，10μg/ml，20μg/ml，25μg/ml或50μg/ml)的新鲜F-12K培养基中孵育，在37℃下孵育24小时。在使用LPS处理的某些研究中，将细胞在补充10μg/mL LPS的新鲜F-12K培养基中孵育，或在补充10μg/mLLPS和浓度为10μg/mL或50μg/ml的肉桂鞣质D1的新鲜F-12K培养基中孵育(5μg/ml和25μg/ml未测试)，在37℃下孵育24小时。在使用TNF-α处理的某些研究中，将细胞在补充10ng/mLTNF-α和浓度为10μg/ml，20μg/ml或50μg/ml肉桂鞣质D1的新鲜FK-12培养基中孵育(5μg/ml未测试)，在37℃下孵育24小时。
人单核细胞THP-1细胞购自ATCC，Manassas，VA，并在37℃下含有5％CO2和95％空气的湿润气氛中维持在补充10％热灭活的胎牛血清和50pMβ-巯基乙醇的RPMI培养基中。通过用150nM佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA，Sigma，P8139)孵育24小时，THP-1单核细胞在巨噬细胞中分化。进行了两项研究：1)细胞没有其他处理；2)用LPS(10μg/mL)处理。对于没有其他处理的研究，将细胞在补充所述浓度的0μg/ml，5μg/ml，10μg/ml或25μg/ml提取物的新鲜RPMI培养基中孵育，在37℃下孵育72小时。对于使用LPS处理的研究，将细胞在补充10μg/mL LPS和0μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml或50μg/ml活性物浓度的新鲜RPMI培养基中孵育，在37℃下孵育24小时。
将细胞用冰冷的PBS冲洗，并在室温下用4％多聚甲醛固定10分钟，然后用0.3％Triton x-100透化10分钟。用PBS洗涤3次后，将细胞在含有10％正常山羊血清阻断液的PBS中孵育1h。在4℃下将细胞使用特异性抗体(研究大鼠C6胶质瘤细胞(Santa Cruz Biotech)用于PD-L1；分析人巨噬细胞样THP-1细胞(Santa Cruz Biotech)用于PD-1)进行免疫荧光染色过夜。然后将细胞用冷PBS洗涤3次，每次3分钟，并用Alexa标记的二抗(Invitrogen)在室温下孵育1h。通过荧光显微镜(Nikon TE2000-S显微镜，Nikon，东京，日本)检查细胞。对于细胞计数，选择五到十个随机视野用于每个平板中的分析，每个视野中细胞密度大致相似。通过光密度法(ImageJ软件，NIH Image)对这些图像的荧光强度(像素值超过背景标准偏差的五倍)进行了半定量分析。
如图13中所示，肉桂鞣质D1在所有测试浓度下显著抑制了大鼠C6胶质瘤细胞中的PD-L1表达。与对照相比，肉桂鞣质D1导致了PD-L1表达百分比的抑制，5μg/ml肉桂鞣质D1时抑制39.9％，10μg/ml肉桂鞣质D1时抑制66.8％，25μg/ml肉桂鞣质D1时抑制58.1％和50μg/ml肉桂鞣质D1时抑制43.6％。
如图14中所示，肉桂鞣质B1在所有测试浓度下显著抑制了大鼠C6胶质瘤细胞中的PD-L1表达。与对照相比，肉桂鞣质B1导致了PD-L1表达百分比的抑制，5μg/ml肉桂鞣质B1时抑制35.7％，10μg/ml肉桂鞣质B1时抑制60.8％，25μg/ml肉桂鞣质B1时抑制54.9％和50μg/ml肉桂鞣质B1时抑制41.9％。
如图15中所示，肉桂鞣质D1在所有测试浓度下显著抑制了TNF-α诱导的PD-L1超表达。与对照相比，肉桂鞣质D1导致了TNF-α诱导的PD-L1超表达百分比的抑制，10μg/ml肉桂鞣质D1时抑制32.0％，20μg/ml肉桂鞣质D1时抑制42.2％和50μg/ml肉桂鞣质D1时抑制43.9％。
如图16中所示，肉桂鞣质D1在所有测试浓度下显著抑制了LPS诱导的PD-L1超表达。与对照相比，肉桂鞣质D1导致了LPS诱导的PD-L1超表达百分比的抑制，10μg/ml肉桂鞣质D1时抑制48.9％和50μg/ml肉桂鞣质D1时抑制53.0％。
如图17中所示，A型聚合物组合物(来自3％提取物)在所有测试浓度下(5μg/ml，10μg/ml，50μg/ml或100μg/ml)在大鼠C6胶质瘤细胞中相对于对照产生了显著抑制的PD-L1表达，显示出分别抑制了10.4％、21.7％、58.4％和41.7％的表达。在未显示的其他数据中，两者均使用10μg/ml和10μg/ml的浓度(5μg/ml和20μg/ml未测试)，A型聚合物组合物产生了显著抑制的LPS诱导的PD-L1超表达。此外，使用10μg/ml、20μg/ml和50μg/ml的浓度(5μg/ml未测试)，A型聚合物组合物产生了显著抑制的TNF-α诱导的PD-L1超表达。因此，数据证明了双连接原花青素A型聚合物显著降低了细胞中的PD-L1表达。
本领域技术人员将认识到本发明不限于上文已经特别显示和描述的内容。
除了本文所示和所述的那些，本发明的各种改变将是上述领域中的技术人员显而易见的。这样的改变也预计落入所附权利要求的范围内。
将认识到所有试剂可以通过本领域已知的来源获得，除非另外指出。
说明书中提及的专利和出版物表示本发明所属领域的技术人员的水平。对于其全部教导，将这些专利和出版物按引用并入本文中，与每个单独的申请或出版物具体和单独地按引用并入本文中的程度相同。
之前的描述是本发明特定方面的说明，而不是表示是对其实施的限制。
Claims (20)
1.组合物在制备用于治疗或预防对象中与CD274基因或PD-L1蛋白或PDCD1基因或PD-1蛋白表达相关的癌症或类风湿性关节炎的药物中的用途，
其中组合物包含至少0.5％重量的活性成分，其中活性成分包含肉桂鞣质D-1和/或肉桂鞣质B-1。
2.权利要求1的用途，其中所述肉桂鞣质D-1和/或肉桂鞣质B-1以约1-30毫克存在。
3.权利要求1的用途，其中所述肉桂鞣质D-1和/或肉桂鞣质B-1以约3-10毫克存在。
4.权利要求1的用途，其中所述活性成分基本上由肉桂鞣质D-1和肉桂鞣质B-1组成。
5.权利要求1的用途，其中通过口服、静脉内、通过肌内注射、通过腹膜内注射或经皮来施用组合物。
6.权利要求1的用途，其中所述组合物进一步包含一种或多种维生素、抗氧化剂，或其组合。
7.权利要求1的用途，其中每天施用所述组合物，持续六周或更长的时间段。
8.权利要求1的用途，其中每天施用所述组合物一至三次。
9.组合物在制备用于治疗或预防对象中与CD274基因或PD-L1蛋白或PDCD1基因或PD-1蛋白表达相关的癌症或类风湿性关节炎的药物中的用途，
其中组合物包含至少0.5％重量的活性成分，其中活性成分选自存在于橄榄叶提取物、槲皮素、大蒜酸、芦丁、北美沙果提取物、迷迭香提取物、姜黄素提取物和肉桂提取物中的包含肉桂鞣质D-1和/或肉桂鞣质B-1的活性成分。
10.权利要求9的用途，其中所述活性成分以约1-30毫克存在。
11.权利要求9的用途，其中所述活性成分以约3-10毫克存在。
12.权利要求9的用途，其中通过口服、静脉内、通过肌内注射、通过腹膜内注射或经皮来施用组合物。
13.权利要求9的用途，其中所述组合物进一步包含一种或多种维生素、抗氧化剂，或其组合。
14.权利要求9的用途，其中活性成分基本上由迷迭香提取物组成。
15.权利要求9的用途，其中活性成分基本上由姜黄素提取物组成。
16.权利要求9的用途，其中活性成分基本上由橄榄叶提取物组成。
17.权利要求9的用途，其中活性成分基本上由槲皮素组成。
18.权利要求9的用途，其中活性成分基本上由大蒜酸组成。
19.权利要求9的用途，其中活性成分基本上由芦丁组成。
20.权利要求9的用途，其中活性成分基本上由北美沙果提取物组成。
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