WO2006100710A1

WO2006100710A1 - 重症急性呼吸器症候群の予防および治療用組成物

Info

Publication number: WO2006100710A1
Application number: PCT/JP2005/004907
Authority: WO
Inventors: Tsutomu Okubo; Lekh Raj Juneja; Chiang-Ting Chien; S.Y. Anderson Liou
Original assignee: Taiyo Kagaku Co., Ltd.
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2006-09-28
Also published as: JPWO2006100710A1

Abstract

　本発明によれば、早期に、安全性の高い重症急性呼吸器症候群の予防または治療用組成物を提供することができる。すなわち本発明は、カテキン類を含有してなる重症急性呼吸器症候群の予防または治療用組成物であって、該組成物中の総カテキン類の重量に対するエピガロカテキンガレートの重量の比率が０．３～０．８であることを特徴とする組成物を提供するものである。

Description

明細書

重症急性呼吸器症候群の予防および治療用組成物

技術分野

[0001] 本発明は、力テキン類を特定の比率範囲で含有することを特徴とする、重症急性呼吸器症候群の予防または治療用組成物に関する。

背景技術

[0002] 重症急性呼吸器症候群（Severe Acute Respiratory Syndrome ;SARS)は、 2002年 11月に中国大陸南部で初めて発見され、 2003年 3月に香港で爆発的、大規模に流行した。 2002年 11月 1日から 2003年 6月 18日までの間に、各国から世界保健機関 (WHO)に SARSに疑わしい 8,465例が報告され、そのうち 801人の死亡が確認された。

[0003] この致命的な呼吸器疾病である SARSは、コロナウィルスの一種である SARSウィルス

(severe Acute Respiratory syndrome— Associated Corona Virus (¾ARS—し oV))【こよつて引き起こされることが分かっている。現在、 SARSの治療には、 SARSウィルスに対して抗複製作用を有する、リバビリン、 6-ァザゥリジン、ピラゾフリン (Pyrazoforin)、マィコフエノール酸、グリシルリジンなどといった薬品が使用されている（例えば、非特許文献 1参照)。また、これまでの研究の中では、漢方薬品の甘草根から抽出される活性物質であるグリシルリジン (例えば、非特許文献 2参照）が、最も強い抗コロナウイルス複製作用を有して、ると考えられて、る。

非特許文献 1 : Lancet. 2003 Jun 14;361(9374):2045-6

非特許文献 2 : J Chromatogr A. 2004 Apr 9;1033(1):183- 6

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] し力しながら現在使用されている薬品には、例えば高血圧症や糖尿病といった合併症を引き起こす可能性がある等の問題点があることから、 SARSを有効に治療できる、更なる新薬の開発が望まれている。

[0005] また各国の科学者たちにより、薬物スクリーニング技術等を用いて、 SARSを有効に治療できる化合物の探索が積極的に行われている。しかし、化合物の安全性確認等に要する時間を考慮すると、 SARSを有効に治療できる新薬の完成に、たるまでの道のりは、依然として遠いものと考えられる。

[0006] 従って、本発明の目的は、出来る限り早期に、安全 ¾の高い SARSの予防または治療用組成物を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らは、天然物から抗 SARSウィルス複製作用を有する物質を探索し、食品抽出物の選別を行ったところ、緑茶抽出物カゝら得られた、力テキン類を特定の比率範囲で含有する組成物が、抗 SARSウィルス複製作用を有することを見出した。

[0008] すなわち本発明は、

〔1〕力テキン類を含有してなる重症急性呼吸器症候群の予防または治療用組成物であって、該糸且成物中の総力テキン類の重量に対するェピガロカテキンガレートの重量の比率が 0. 3-0. 8であることを特徴とする、組成物；

〔2〕更に、上記組成物中の総力テキン類の重量に対する総エステル型カテキン類の重量の比率が 0. 5-0. 95であることを特徴とする、請求項 1記載の組成物；ならびに

〔3〕食品または医薬品である、請求項 1または 2記載の組成物

に関する。

発明の効果

[0009] 本発明の組成物は、 SARSウィルスの増殖を抑制する効果を有してヽるため、本発明により SARSの予防および治療用組成物を提供することができる。また、本発明の組成物に含有される力テキン類は既に食用としての安全性が確認されており、また、茶葉などの既にある天然物からの調製が可能であるため、早期に、安全性の高い SARSの予防および治療用組成物を提供することが可能である。

図面の簡単な説明

[0010] [図 1]図 1は、 SARS-CoV感染 Vero E6細胞の病理学的変化の観察結果を示す。

[図 2]図 2は、 SARS-CoV感染 Vero E6細胞の免疫蛍光染色の結果を示す。

[図 3]図 3は、 SARS-CoV感染 Vero E6細胞培養液中の SARS-CoV由来 RNAの発現を示した、 RT-PCR産物の電気泳動像である。 [図 4]図 4は、 SARS-CoV感染 Vero E6細胞抽出液中の SARS-CoV由来タンパク質の発現を示した、ウェスタンブロット像である。

発明を実施するための最良の形態

[0011] 本発明の組成物は、力テキン類を特定の比率範囲で含有することを特徴とする。具体的には、本発明の組成物は、組成物中の総力テキン類の重量に対するェピガロカテキンガレートの重量の比率が 0.3— 0.8であることを特徴とする。この特徴のために、本発明の組成物は SARSウィルスに対する増殖抑制効果を有し、 SARSに対する有効な予防または治療用組成物として使用することが可能である。

[0012] 本発明において「カテキン類」とは、カテキン、ェピカテキン、ガロカテキン、ェピガ口カテキン、力テキンガレート、ェピカテキンガレート、およびェピガロカテキンガレート力もなる群より選択される少なくとも 1種類以上の化合物のことをいう。

[0013] また、本発明において「エステル型カテキン類」とは、力テキンガレート、ェピカテキンガレート、およびェピガロカテキンガレートからなる群より選択される少なくとも 1種類以上の化合物のことをいう。

[0014] 更に、本発明において「総力テキン類」とは、組成物中に含まれる全てのカテキン類を指す。また、「総エステル型カテキン類」とは、組成物中に含まれる全てのエステル型力テキン類を指す。

[0015] 本発明において、組成物中の各カテキン類の含有比率は、 Agilent 1100系液体ク口マトグラフ（Agilent 1100 serious)を用いて分析する。

[0016] 本発明の組成物は、 SARSウィルスに対する増殖抑制効果の観点から、組成物中の総力テキン類の重量に対するェピガロカテキンガレートの重量の比率が 0.3— 0.8であることが必要であり、 0.5— 0.7であることが好ましい。また、組成物中の総力テキン類の重量に対する総エステル型カテキン類の重量の比率は 0.5— 0.95であることが好ましく、 0.6— 0.8であることがより好まし!/、。

[0017] また、上記と同様の観点から、本発明の組成物は、総力テキン類の含有量が 30重量％以上であることが好ましぐ 50重量％以上であることがより好ましい。

[0018] 本発明の組成物は、以下に記載するように力テキン類を含有する天然物から抽出することによって得ることも出来るが、これに限定されるものではなぐ得られた組成物が本発明の特定の比率範囲内で力テキン類を含有していれば良い。例えば、既に製品として市販されている各カテキン類製品を用いて、本発明の特定の比率範囲となるように各力テキン類を配合することによって本発明の組成物を得ることも出来る。

[0019] 本発明に使用される力テキン類を含有する天然物としては、力テキン類を含有するものであれば特に限定されないが、例えば、茶葉などが挙げられる。

[0020] 茶葉としては、例えば、緑茶葉、烏龍茶葉、紅茶葉などが挙げられる。茶葉を用いる場合、茶葉そのままを用いてもよいし、粉砕して用いてもよい。

[0021] 天然物力のカテキン類の抽出は、当該分野の従来技術に従って行うことが出来る。抽出方法としては、例えば、茶葉または粉砕した茶葉などを、水、熱水、メタノール、エタノール、プロパノールなどの一価アルコールまたはグリセリンなどの多価アルコールを用いて抽出する方法、茶葉または粉砕した茶葉などを、水、熱水、メタノール、エタノール、プロパノールなどの一価アルコールまたはグリセリンなどの多価アルコールを用いて抽出した画分に酢酸ェチル、アセトンなどの溶媒を加えて分画する方法などが挙げられる。

[0022] また、上記のように得られたカテキン類にっ、て、例えば極性榭脂カラムを使用して、各力テキン類を分離、精製することが出来る。更に、各カテキン類の上記精製品をブレンドすることによってェピガロカテキンガレートやこれを含むエステル型カテキン類の組成物中の含有比率を所望の通りに調整することができ、本発明の特定の比率範囲で力テキン類を有する組成物を得ることが出来る。

[0023] 上記のようにして得られた本発明の組成物は、 SARSの予防または治療目的のためにそのまま単独で使用することも出来るが、食品または医薬品の形態で使用することもできる。本発明における食品には、食品添加物なども含まれる。

[0024] 食品としての本発明の組成物は、例えば、以下に列挙されるような種類の食品に対して、製造後の食品が本発明における特定の比率範囲で力テキン類を含有するように、各力テキン類を配合して製造することができる。

[0025] 本発明に使用される食品としては、乾燥食品、サプリメントなどの固形食品、また、清涼飲料、ミネラルウォーター、嗜好飲料、アルコール飲料などの液状食品が挙げられる。固形食品としては、例えば、タブレット、ムース、ゼリー、冷菓、飴、チョコレート、クラッカー、ケーキ、パン、麵、ガム、スナックなどの菓子、ハム、ソーセージなどの畜産加工品、蒲鋅などの水産加工品などが挙げられる。また、液状食品としては、例えば、緑茶、ウーロン茶、紅茶、ハーブティーなどの茶類、濃縮果汁、濃縮還元ジユース、ストレートジュース、果実ミックスジュース、果肉入り果実ジュース、果汁入り飲料、果実 ·野菜ミックスジュース、野菜ジュース、炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、コーヒー飲料、日本酒、ビール、ワイン、カクテル、焼酎、ウィスキーなどが挙げられる。

[0026] 医薬品としての本発明の組成物は、例えば、経口投与に適した公知の有機または無機の担体、賦形剤、結合剤、安定剤などに対して、製造後の医薬品が本発明における特定の比率範囲で力テキン類を含有するように各力テキン類を配合して製造することがでさる。

[0027] 医薬品の形態としては、溶液、懸濁物、粉末、固体成型物などのいずれでもよぐその剤型としては、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、貼付剤

、坐剤、吸入剤などが挙げられる。

[0028] 上記のように、本発明の組成物は、そのまま単独で、あるいは食品または医薬品の形態で、 SARSの予防または治療目的のためにヒトを含む哺乳動物に投与することができる。

[0029] 本発明の所望の効果を得るための本発明の組成物の投与量は、通常、好ましくは 1 日あたり 1一 100mg/kg体重、より好ましくは、 1日あたり 5— 50mg/kg体重である。ただし、本発明における投与量は、力かる範囲にのみ限定されるものではなぐ本発明の所望の効果が得られるように、種差、性別、年齢、または個体差、 SARS感染の有無、症状、所望する効果の程度等を考慮して、個別具体的に投与量を適宜設定すれば良い。本発明の組成物の投与時期、投与期間などについても同様に、個別具体的に適宜設定することができる。

[0030] 本発明の組成物の投与方法としては、特に限定されないが、好ましくは経口投与である。

[0031] 本発明の組成物に含有される力テキン類は既に高い安全性が示されており、既にヒトが摂取する食品の食品添加物としても広範囲に使用されている。そのため、本発明の組成物は、安全かつ効果的に、 SARSの予防または治療目的のために使用することができる。

[0032] 以下に実施例を示して本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。

実施例

[0033] 実施例 1：力テキン類含有組成物の調製および該組成物の各カテキン類含有比率の測定

緑茶葉を熱水で抽出した緑茶抽出物から、当該分野で公知であるカフヱインの除去技術（特開平 6-142405、特開平 7-16057)を用いてカフェインを除去し、カテキン類を主成分とする緑茶抽出物を得た。更に、極性榭脂カラムを使用して各カテキン類を分離、精製し、その精製品を、本発明の特定の比率範囲になるようにブレンドすることにより、本発明のカテキン類含有組成物 (組成物 A— F)を得た。

[0034] 得られた組成物 A— F各 1 mgを、 1 mlの溶離液（25%メタノール、 74.9%脱イオン水 (MilliQ, 18.2 Μ Ω)ゝ 0.1%ギ酸 (v/v))に溶解させ（1 mg/ml)、 0.45 μ mのフィルターで濾過し、成分比率分析用試料とした。得られた試料 1 μ 1を、カラム（Eclipse XDB-C8 5 m、 4.6 X 150 mm)を備え付けた Alilent 1100系液体クロマトグラフ (Agilent 1100 serious)〖こ添加し、 0.5 ml/minの流速で上記溶離液を用いて 40°Cで 30分間、溶出した。得られた分析チャートを、各カテキン類の標準品のものと比較することにより、各糸且成物中の各カテキン類含有比率を測定した。

[0035] その結果を、以下表 1および表 2に示す。表 1は、組成物 A— F中の、各カテキン類含有量 (重量％、組成物乾燥重量あたり）を示す。また、表 2は、組成物 A— F中の、総力テキン量に対する各エステル型カテキン類含有量の比率 (各エステル型力テキン重量 Z総力テキン重量)を示す。

[0036] [表 1] A B C D E F

ガロカテキン 0.76 1.45 2.6 2.4 3.5 0.65

ェビガロカテキン 1.7 9.8 11.6 4.1 11.4 2.2

カテキン 1.9 ϋ.76 1.7 2.6 1.77 0.13

ェビカ亍キン 5 5 7.9 7.3 7.6 0.3

カテキンガレート 2.3 0.2 0.2 0.9 0.15 0.13

ェビガロカテキンガレート 36.6 38.3 26 28.9 23.05 38.6

ェビカテキンガレート 24.2 11.58 8.3 11.5 4.8 9.1

総力テキン 72.5 67.09 58.3 57.7 52.27 51.11

(重量％、組成物乾燥重量あたり)

[0037] [表 2]

A B C D E F

力テキンガレート 0. 03 0.002 0.003 0.02 0.002 0.003 ェピガロカテキンガレー卜 0. 5 0.57 0.45 0.5 0.44 0.76 ェピカテキンガレー卜 0. 33 0.17 0.14 0.2 0.09 0.18 総エステル型カテキン 0. 86 0.742 0.593 0.72 0.532 0.943

(各エステル型カ亍キン靈 i/総力亍キン重量）

[0038] 試験例 1：体内での SARS-CoV増殖抑制作用試験

本発明の組成物をあらかじめ投与した力-クイザルに SARS-CoVを感染させることにより、本発明の組成物の、体内での SARS-CoV増殖抑制作用について調べた。

[0039] 6匹の力-クイザルを準備した。 3匹に対しては、実施例 1に記載の方法により調製した本発明のカテキン類含有組成物を体重 lkgあたり 50 mgの用量で 2週間毎日経口投与し、試験群とした。他の 3匹には組成物を投与せず、対照群とした。経口投与開始後 2週間目に、 SARS患者力も単離し、ミドリザル腎臓由来の Vero E6細胞で培養、分離、濃縮した SARS-CoVウィルスを試験群および対照群両方の力-クイザルに経鼻'経気管投与した。力二クイザルは 1匹ずつ陰圧のキャビネット内で飼育し、症状の変化を毎日観察した。定期的に検体を採取し、死亡後は解剖して病理所見を検討し [0040] その結果、対照群については、 3匹とも感染 2日後から鼻、咽頭で SARSウィルスが検出された。また、対照群の 3匹中 2匹は肺胞にびまん性の障害を生じ、感染 3日後に死亡した。残りの 1匹は感染 4日後より肺胞にびまん性の障害を生じ、 5日後に死亡した。一方、試験群については、 3匹中 1匹に鼻、咽頭で SARS-CoVが検出され、感染 10日後に死亡した力試験群の他の 2匹には SARS-CoVは検出されず、死亡もなかった。

[0041] 以上の結果から、本発明の組成物を経口投与することによって SARS-CoVの感染を抑制できることが明ら力となり、本発明の組成物の、抗 SARSウィルス増殖における有効性が確認された。

[0042] 試験例 2 :インビト口における SARS-CoV増殖抑制作用試験

[0043] 本発明の組成物をあらかじめ添カロした培養細胞に SARS-CoVを感染させることにより、本発明の組成物の、インビトロでの SARS-CoV増殖抑制作用について調べた。

[0044] 0細胞病理学的変化の観察

4 X 10⁴個のミドリザル腎臓細胞（Vero E6: American Type Culture

Collection;ATCCより提供）を 48ゥエルの細胞培養皿に播種し、 CO気相下でインキ

2

ュペートした。次いで、実施例 1に記載の方法により調製した本発明の力テキン類含有組成物を 780 μ g/ml、 390 μ gml、 195 μ g/mlの濃度でそれぞれ培地に添カ卩し、これらをそれぞれ試験区 1一 3とした。また、カテキン類含有組成物を添加しないものを対照区とした。組成物の添加から 1時間後に、 Vero E6細胞に SARS-CoV (香港株。台湾台北疾病管制局より提供）を 0.1ウィルス重複感染度（M.O.I)で感染させた。

[0045] 感染から 48時間後に、位相差顕微鏡 (Nikon R)を利用して Vero E6細胞の病理学的変化（CPE)を観察した。図 1に示される通り、試験区 1一 3においては、 Vero E6細胞は生存したままで通常通り培養皿の底に付着固定されており、形態学的な変化も伴っていなかった。これに対して、対照区においては、 Vero E6細胞は培養液に浮遊し、全て死滅していることが観察された。

[0046] ii)免疫蛍光分析による SARSウィルスタンパク質の発現解析

上記と同様に、試験区 1一 3、対照区の Vero E6細胞を準備し、組成物の添加から 1 時間後に、 SARS- CoVを 0.1 M.O.Iで感染させた。 [0047] 感染力 48時間後に細胞を収集し、 10%ホルムアルデヒド、およびメチル ·ァルコ一ルとアセトンを半分ずつ混合した溶液を用いて細胞を固定した後、回復期の SARS患者力得た抗血清を用いて、細胞内の SARSウィルス抗原に対する免疫蛍光染色を行った。

[0048] 細胞内の SARSウィルス抗原が発する蛍光を、倒立型蛍光レーザー顕微鏡 (ZeissR) を用いて観察した。図 2に示されるように、対照区の Vero E6細胞は全て SARSウィルス抗原の蛍光を示したのに対し、本発明のカテキン類含有組成物で処理した試験区

1一 3の細胞は蛍光を示さなかった。

[0049] iii) RT- PCRによる SARSウィルス mRNAの発現解析

上記と同様に、試験区 1一 3、対照区の Vero E6細胞を準備し、組成物の添加から 1 時間後に、 SARS- CoVを 0.1 M.O.Iで感染させた。

[0050] 感染力 48時間後に細胞培養液を収集し、この細胞培養液力 QIAampRVIRAL

RNA MINI Kit (Qiagen)を用いてウィルス RNAを単離した。 1 μ 1のウィルス RNAを用いて、 QiagenR One Step RT- PCR Kitを使用して RT- PCRを行った。 RT- PCRの際の

SARSウィルス特異的プライマーとしては、 5'プライマー：

CTAACATGCTTAGGATAATGG,および 3'プライマー：

CAGGTAAGCGTAAAACTCATCを使用した。 RT-PCRの反応条件は以下の通りである：まず、逆転写反応として、 50°Cで 30分反応させた。次に 95°Cで 15分の反応を 1 サイクル、 94°Cで 30秒、 50°Cで 30秒、 72°Cで 15分の反応を 25サイクル、 72°Cで 10分の反応を 1サイクル行った。

[0051] RT-PCR反応後の産物を 2%ァガロースゲル電気泳動により解析した結果、図 3に示されるように、対照区では 368 bpの位置にバンドが確認された。これに対して、試験区 1一 3ではバンドは確認できな力つた。

[0052] iv)ウェスタンブロット法による SARSウィルスタンパク質の発現解析

[0053] 感染力 48時間後に細胞抽出液を採取した。この細胞抽出液力得られた 10 μ g のタンパク質を、電気泳動した後にナイロンメンブレン上に転写させ、回復期の SARS 患者由来抗血清を用いてウェスタンプロットを行、、 X線によりシグナルを観察した。

[0054] その結果、図 4に示されるように、対照区では SARSウィルスのスパイクタンパク質（S) およびヌクレオ力プシドタンパク質（NP)の存在を示すシグナルが確認されたのに対して、試験区 1一 3ではシグナルは確認されなかった。

[0055] 0の結果により、本発明のカテキン類含有組成物が SARSウィルス感染により生じる細胞病理変化を有効に抑制する効果を有することが明らかとなった。また、 ii)一 iv) の結果により、その効果が分子生物学的にも確認された。以上のように、本発明の組成物は細胞への SARS感染を有効に抑制できることが、インビトロ実験においても明らカゝとなった。

産業上の利用可能性

[0056] 本発明によれば、 SARSウィルスの増殖を抑制する効果のある、安全性の高!、SARS の予防および治療用組成物を提供することができる。

配列表フリーテキスト

[0057] 配列番号： 1は、 SARSウィルス RNAに対する 5'プライマーの配列である。

[0058] 配列番号： 2は、 SARSウィルス RNAに対する 3'プライマーの配列である。

Claims

請求の範囲

[1] 力テキン類を含有してなる重症急性呼吸器症候群の予防または治療用組成物であつて、該組成物中の総力テキン類の重量に対するェピガロカテキンガレートの重量の比率が 0. 3-0. 8であることを特徴とする、組成物。

[2] 更に、上記組成物中の総力テキン類の重量に対する総エステル型カテキン類の重量の比率が 0. 5-0. 95であることを特徴とする、請求項 1記載の組成物。

[3] 食品または医薬品である、請求項 1または 2記載の組成物。