JP2013018788A - かぜの予防および治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明によるかぜの予防および/または治療用組成物はシスタス抽出物を含んでなる。かぜ、特にライノウイルス、アデノウイルスまたはコロナウイルスにより引き起こされる一次感染にも有効である。
【選択図】 図1
Description
C.アルビダスL.(C. albidus L.)
C.キナマデンシスBanares & P. Romero(C. chinamadensis Banares & P. Romero)
C.クルシイDunal(C. clusii Dunal)
C.クリスプスL.(C. crispus L.)
C.ヘテロフィルスDesf.(C. heterophyllus Desf.)
C.インカヌス(C. incanus)(C.クレティクス(C. creticus)とも呼ばれる)
C.インフラツスPourr. Ex Demoly(C. inflatus Pourr. Ex Demoly)(C.ヒルスツスLam.( C. hirsutus Lam.)またはC. プシロセパルスSweet(C. psilosepalus Sweet)とも呼ばれる)
C. ラダニフェルL.(C. ladanifer L.)
C. ラウリフォリウスL.(C. laurifolius L.)
C.リバノチスL.(C. libanotis L.)
C. モンスペリエンシスL.(C. monspeliensis L.)
C.ミュンビーPomel(C. munbyi Pomel)
C.オクレアツスChr. Sm. ex Buch(C. ochreatus Chr. Sm. ex Buch)
C.オズベッキーフォリウスWebb ex Christ.(C. osbeckiifolius Webb ex Christ.)
C. パルビフロルスLam.(C. parviflorus Lam.)
C. ポプリフォリウスL.(C. populifolius L.)
C.ポウゾルジーDeute(C. pouzolzii Deute)
C.サルウィーフォリウスL.(C. salviifolius L.)
C.シンテニシィーLitard.(C. sintenisii Litard.)(C. アルバニクスE.F. Warburg ex Heywood(C. albanicus E.F. Warburg ex Heywood)とも呼ばれる)
C. シンフィチフォリウスLam.(C. symphytifolius Lam.)
ウイルス分離株としてヒトライノウイルス14型を用いた。
宿主細胞株としてHeLa細胞(ヒト子宮頚癌細胞株)を用いた。
顕微鏡検査
顕微鏡検査において、A549肺上皮細胞およびMDCK(Madin-Darby Canine Kidney細胞)イヌ腎臓上皮細胞を、種々の期間(9h、24h、32h、48h)、種々の濃度の抽出物(2、10、25、50μg/ml)を用いて処理し、ついで光学顕微鏡で試験した。試験は2回チェックした。
生存率試験において、A549肺上皮細胞およびMDCKイヌ腎臓上皮細胞を、種々の期間(24h、48h、56h、72h)、種々の濃度の抽出物(2、10、25、50μg/ml)を用いて処理し、ついで、フローサイトメトリーを用いて死細胞対生細胞の関係を決定するためにヨウ化プロピジウムで染色した。実験を全部で4回行った。
アポトーシスによるカスパーゼ活性化を試験するために、25および50μg/mlの抽出物で、A549細胞を48時間処理した。ついで細胞を溶解し、ゲル電気泳動を用いて細胞タンパク質を分離し、抗PARP抗体(ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(カスパーゼ基質))を用い、ウェスタンブロットにおいて、アポトーシスによるによるこのタンパク質のカスパーゼによる切断を試験した。アポトーシス誘導剤であるスタウロスポリンを陽性対照刺激剤として用いた。実験は2つの平行バッチで行った。
シスタス・インカヌス・タウリクス亜種からの抽出物の製造
抽出には、再生した地上の苗条(葉、花および茎)が用いられる。戸外の日陰において、室温で残留水分含有量が最大でも10%になるまで植物材料を室温で乾燥する。続いて、植物部分を≦8mmのサイズに切断する。
MDCK細胞およびA549細胞を用いる試験シリーズの顕微鏡画像において、未処理の対照試料と比較して、用いた抽出物濃度および試験した時間値のいずれにおいても、細胞数および細胞形態に関して有意な変化は認められなかった。
生存率試験の結果を図1および2に示す。図において、比較のために、試料のそれぞれからの生存細胞数が、4回の測定値の平均値として概要で示されている。72時間の全観察時間を通じての結果において、MDCKまたはA549細胞の生存率に対する抽出物の悪影響は検出できなかった。
図3において、アポトーシスによるカスパーゼ活性化の試験結果を示す。図においては、カスパーゼ活性を測定するためのウェスタンブロット分析の結果が示されている。対照刺激剤であるスタウロスポリン(Stauro)はカスパーゼ基質ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼの効率的切断をもたらすが(切断PARPレーン)、未処理(mock)または抽出物処理細胞(25μg/ml、50μg/ml)のいずれにおいても、このような活性は見られない。均一なタンパク質負荷に対する対照として、タンパク質ERK2に対する対照ブロットを用いた。その結果、使用濃度および観察期間において、植物抽出物を用いる処理はカスパーゼ活性化およびアポトーシス誘導をもたらさなかったと結論付けられた。
ライノウイルス培養
HeLa細胞が80%集密的になった4つのT175フラスコにヒトライノウイルス14型(HRV)を植え付け、1週間33℃でインキュベートした。これを行うために、HRV14 50μl(ウイルス力価 108/ml TCID(組織培養感染量))を感染培地16ml(DMEM(ダルベッコ変法イーグル培地)、2%FCS(ウシ胎児血清)、10〜20mM MgCl2)に混合し、各T175に4ml加える。ついで各T175を感染培地10mlで満たし、各T175中に感染培地が14ml存在するようにする。付着細胞が70%溶解し次第、ウイルスを採取する。
細胞ペレットを除去するために、最初にウイルス上清を3,000rpmで30分間遠心分離する。超遠心機を用い、ショ糖クッション(65%ショ糖水溶液1.5ml、10xPBS(リン酸緩衝化生理食塩水)300μl、水1.2ml)上、35,000rpm(ローター型SW41 Ti、 Beckman polyallomerチューブ中)、4℃で3時間ウイルス上清を遠心分離し、ペレットを感染培地100μlに混合する。100kDaカットオフフィルター(Centricon YM100)を用い、4℃、3,300rpmで1時間さらなるウイルス濃縮を行う。保持液は精製ウイルス濃縮物を含んでおり、濾液は捨てる。
前日に、96ウェルプレートのDMEM培地中に5x104HeLa細胞をまき、翌日に細胞がおおよそ70%集密的になるようにする。翌日DMEM培地を吸引して除去し、感染培地(DMEM、2%FCS、10〜20mM MgCl2)90μlに交換する。96ウェルの第1列において、100μg/mlの最高濃度でウイルス含有溶液10μlを用いて感染を起こさせる。上下にピペッティングすることによりこれら100μlを混合した後、それらの10μlを96ウェルの第2列に加える。この手順を後続の列で繰り返す(1:10希釈系列)。同時に2または3バッチを行い、評価のために用いる。
Claims (14)
- かぜの予防および/または治療用組成物を製造するためのシスタスの使用。
- かぜが、ライノウイルス、アデノウイルスまたはコロナウイルスにより引き起こされる一次感染を含む、請求項1記載の使用。
- 鼻かぜ治療のための、請求項1または2記載の使用。
- 植物がシスタス・インカヌスから選択される、請求項1〜3の少なくとも1つに記載の使用。
- 植物の地上部が用いられる、請求項1〜4の少なくとも1つに記載の使用。
- 組成物が液体形、乾燥形または半固体形である、請求項1〜5の少なくとも1つに記載の使用。
- 組成物が抽出物の形で用いられる、請求項1〜6の少なくとも1つに記載の使用。
- 抽出物が水性抽出物またはアルコール性抽出物である、請求項6または7記載の使用。
- 組成物が経口投与または局所投与される、請求項1〜8の少なくとも1つに記載の使用。
- 組成物が点鼻薬または吸入混合物として存在する、請求項1〜9の少なくとも1つに記載の使用。
- 組成物がエアゾールまたはルームスプレーとして存在する、請求項1〜9の少なくとも1つに記載の使用。
- 組成物が錠剤、コーティング錠、発泡錠、カプセル、粉末、顆粒または糖衣錠の形で存在する、請求項1〜7および9の少なくとも1つに記載の使用。
- 組成物が軟膏、ゲルまたはクリームの形で存在する、請求項1〜9の少なくとも1つに記載の使用。
- 組成物がうがい液または植物ジュースとして存在する、請求項1〜9の少なくとも1つに記載の使用。
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