KR20190102423A - Nk 세포 매개 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물 - Google Patents

Nk 세포 매개 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 비트의 잎 및 뿌리 혼합 추출물을 유효성분으로 포함함으로써 NK 세포 활성화를 유도하여 체내 면역을 증가시키고 암세포에 대한 억제 활성을 증가시키는 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물에 관한 것이다.

Description

NK 세포 매개 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물{COMPOSITION FOR IMPROVING IMMUNITY AND ANTICANCER ACTIVITY}
본 발명은 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 NK 세포 활성화를 유도하는 비트 추출물을 포함하는 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물에 관한 것이다.
암은 인류의 건강을 위협하는 최대 난치병 중 하나로, 제어되지 않는 세포성장이 특징적이며 이러한 비정상적 세포성장에 의해 세포 덩어리가 형성되어 주위의 정상조직 또는 기관으로 침윤하는 질환군을 총칭한다. 암 발생의 원인으로는 여러가지가 있는데, 화학물질, 바이러스, 세균, 전리방사선 등 환경에 따른 외적 요인과 선천성의 유전자 변이 등 내적 요인으로 구분할 수 있다. 암은 조기에 발견되지 못할 경우 완치가 거의 불가능하고, 병이 진전될수록 환자와 가족의 고통과 경제적 손실이 막대하며, 의료 보험의 재정고갈 등 사회적으로도 큰 비용을 초래한다는 점에서 암의 예방과 조기 치료의 중요성은 갈수록 더욱 강조되고 있는 실정이다. 이에 전 세계적으로 암의 치료법 개발을 위하여 막대한 자본을 투입하고 있으나, 여전히 암으로 인한 사망률은 증가추세에 있다. 암의 치료에는 외과적 수술, 방사선 치료, 화학적 요법 등의 방법이 이용되고 있으나 이러한 종래 치료방법은 부작용이 큰 문제로 대두되고 있으며, 말기 암이나 전이된 암의 경우에는 큰 효과를 발휘하지 못하는 문제가 있다. 이러한 기존 항암치료법의 한계를 보완할 수 있는 치료법 중 하나로 최근 면역세포 치료제가 각광받고 있다.
자연살해세포(natural killer cell, 이하 NK 세포)는 선천면역세포 중 하나로 다양한 대식세포(macrophage), T세포(T cell)과 직접적으로 상호작용하거나 또는 사이토카인(cytokine)을 생성함으로써 면역반응 조절에 관여하며, 이를 통하여 자가면역 질환 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, NK 세포는 암세포를 제거하여 항암 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
NK 세포의 활성은 다양한 활성화 및 억제 수용체 신호전달 균형에 의하여 조절된다. NK 세포의 항암 활성 또한 그 표면에 존재하는 다양한 면역수용체(immune receptor)를 통해 암세포를 구분하여 이루어지는 것으로 알려져 있다. 정상세포는 MHC Class I이 세포에 존재하므로 NK 세포의 억제 수용체의 의해 인식되어 공격을 받지 않으나, 암세포 또는 감염된 일부 세포는 MHC(major histocompatibility complex) Class I가 감소하거나 또는 NK 세포 활성화 수용체에 대한 리간드(ligand)를 가지는 이유로 NK 세포에 의하여 제거된다. NK 세포는 암세포 외에도 암 줄기세포(cancer stem cell)를 제거할 수 있어 암의 발생, 증식, 전이를 억제할 뿐 아니라 완치 후 암의 재발을 저감시킬 수 있는 치료제의 개발원으로 각광받고 있다.
Nitric oixde (NO-)는 L-arginine이 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 citrulline으로 전변되면서 생성되는 라디칼로, 이와 같은 NO-는 macrophage-mediated cytotoxicity의 effector molecules로 mitochondrial respiration이나 DNA synthesis등을 저해하는 역할을 수행한다. 또한, NO는 anti-tumor immune response를 저해하는 suppressive factor의 하나로 인식되면서 많은 관심을 일으키고 있는 물질이다.
비트(Beta Vulgaris)는 쌍떡잎식물 비름과의 한해 두해살이 풀로 브로콜리 등과 함께 서양야채를 대표하는 채소류에 속한다. 아프리카 북부와 유럽이 원산지로 생육적온은 13~18℃이고 베타시아닌, 베타인, 칼륨 등 유용성분을 다수 포함하며, 고혈압, 당뇨 등에 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 혈관에 대한 우수한 효능이 알려지며 최근 해독주스재료로 각광받고 있다.
KR 101753164 B1
Vivier E, Tomasello E, Baratin M, Walzer T, Ugolini S. Functions of natural killer cells. Nat Immunol 2008;9:503-10.
본 발명은 비트 추출물을 유효성분으로 포함하는 NK 세포 활성화를 통한 면역증강 및 항암 활성 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 비트(Beta Vulgaris) 추출물을 유효성분으로 포함하는 NK 세포 활성화를 통한 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물이 제공된다.
또한, 상기 비트는 뿌리 및 잎이 1 : 0.4 내지 1의 중량비로 혼합될 수 있다.
또한, 상기 비트 추출물은 비트의 열수추출물 또는 주정추출물일 수 있다.
또한, 상기 비트의 주정추출물은 5 내지 70%(v/v) 주정에 가용한 추출물일 수 있다.
또한, 상기 비트의 주정추출물은 20 내지 40%(v/v) 주정에 가용한 추출물일 수 있다.
또한, 상기 비트 추출물은 산화질소 생성능을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 비트(Beta Vulgaris) 추출물을 유효성분으로 포함하는 NK 세포 활성화를 통한 면역증강 및 항암활성 증진용 기능성 식품이 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따른 비트 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 NK 세포 활성화를 통하여 우수한 면역증강 및 항암 활성 증진 효과를 나타내므로 면역기능 저하로 인하여 발생하는 질환 및 암 질환의 예방, 개선 또는 치료에 우수한 효능을 발휘할 수 있다.
또한, 인체에 대한 독성을 나타내지 않고 다양한 식품에 첨가 가능하므로 그를 포함하는 기능성 식품으로 제조하여 사람들이 쉽게 섭취하여 건강을 개선시킬 수 있도록 할 수 있다.
도 1은 비트 추출물의 세포독성을 확인한 결과이고,
도 2는 아질산이온(nitrite, NO2-)을 이용한 표준곡선(standard curve)이고,
도 3은 비트 추출물의 산화질소(nitric oxide) 생성능을 in vitro에서 확인한 결과이다.
본 발명은 비트(Beta Vulgaris) 추출물을 유효성분으로 포함하는 NK 세포 활성화를 통한 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물에 관한 것이다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따른 조성물은 비트 추출물을 유효성분으로 포함한다.
상기 비트 추출물을 분리할 수 있는 비트의 추출원료는 비트의 뿌리 및 잎을 포함할 수 있다. 상기 비트의 잎은 비트 식물에서 땅 위로 노출되는 잎 및 잎줄기를 포함한다. 제조되는 추출물의 효과를 최적화하기 위하여, 바람직하게는 상기 비트의 추출원료는 뿌리 및 잎이 1:0.4 내지 1의 중량비로 혼합된 것을 이용하는 것이 좋다. 보다 바람직하게는 상기 비트의 추출원료는 뿌리 및 잎이 1:0.4 내지 0.7의 중량비로 혼합된 것을 이용하는 것이 좋다. 상기 비트의 추출원료를 통상의 방법에 의하여 수제 후 절단하여 이용할 수 있다. 필요에 따라, 절단 전 또는 절단 후 건조가 수행될 수 있다. 상기 건조 방법은 특별히 한정되지 않으며, 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 자연건조, 열풍건조 또는 동결건조를 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 추출물은 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 추출물은 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예를 들어, 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 추출물에 포함된다.
상기 비트 추출물의 분리방법은 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출, 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출, 초음파추출 등의 추출장치를 이용하는 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함하는 흡착 수지를 이용하는 방법 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 추출 용매를 처리하여 추출한 후 감압 농축하여 수득할 수 있다. 상기 추출용매는 당업계에 공지된 것을 이용할 수 있으며, 예를 들면 극성 용매를 이용할 수 있다. 극성용매로는 예를 들면, 물, 알코올, 아세트산, DMFO(dimethyl-formamide) 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 알코올로는 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 및 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 극성용매로 물, 주정 또는 이들의 혼합용액이 이용되는 것이 좋다.
추출용매를 처리하여 추출물을 분리할 시, 추출용매는 준비된 비트 추출원료의 중량을 기준으로 그 1 내지 100배로 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 10 내지 30배로 첨가되는 것이 좋다. 첨가되는 용매의 함량이 추출원료 중량대비 1배수 미만이면 유효성분의 추출 함량이 저감될 수 있고, 100배수 초과이면 추출 후 유효성분을 포함하는 추출용액의 농도가 지나치게 낮아 건조 등 후처리에 오랜 시간 및 비용이 소요되어 생산성이 저하되는 문제가 발생할 수 있다. 추출용매를 처리하여 추출물을 분리할 시의 온도는 10 내지 120℃ 일 수 있다. 바람직하게는, 30 내지 100℃ 일 수 있다. 보다 바람직하게는, 40 내지 100℃ 일 수 있다. 추출 온도가 120℃ 초과이면 고열로 유효성분이 변성되어 면역증강 및 항암증진 효과가 저하되는 문제가 발생할 수 있다. 추출용매가 알코올을 포함하는 경우, 수율을 향상시키기 위한 측면에서 알코올의 함량에 따라 추출온도가 조절되는 것이 좋다. 바람직하게는, 추출용매가 알코올을 10%(v/v)이하로 포함하는 경우에는, 추출온도 80 내지 100℃인 것이 좋다. 추출용매가 알코올을 20 내지 40%(v/v)로 포함하는 경우에는, 추출온도 50 내지 70℃인 것이 좋다. 추출용매가 알코올을 60 내지 80%(v/v)로 포함하는 경우에는, 추출온도 40 내지 60℃인 것이 좋다. 상기 온도범위 내에서 1 내지 72시간 동안 추출하여 비트 추출물을 분리할 수 있다. 바람직하게는 2 내지 12시간, 보다 바람직하게는 3 내지 5시간 동안 추출하여 비트 추출물을 분리할 수 있다.
상기 분리된 추출물은 이후 여과, 농축 또는 건조과정을 통해 용매를 제거함으로써 농도가 조절된 액체 또는 고체 분말의 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 유용 성분의 농도를 높이고 저장성을 향상시키기 위하여, 농축시킨 후 건조하여 분말의 형태로 제공되는 것이 좋다. 상기 여과, 농축 또는 건조시키는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 통상의 방법으로 수행될 수 있다. 비트 추출물에 포함된 유용성분의 활성 저하를 저감시키기 위한 측면에서, 상기 건조는 동결건조로 수행되는 것이 좋다.
본 발명에 따른 비트 추출물의 분리가 상기의 용매 첨가량, 온도 및 시간 조건 하에 수행되는 경우, 추출 시간을 저감시키면서 고농도, 고효율로 유효성분의 분리를 최적화하여 생산성을 증대시키고 약학적 효능을 증대시킬 수 있다.
본 발명에 따른 비트 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 NK 세포를 활성화시킬 수 있다. 이를 통하여, NK 세포 매개 면역반응을 증강시켜 면역기능 저하로 인하여 발생하는 질환의 예방, 개선 또는 치료에 우수한 효능을 발휘할 수 있다. 또한, NK 세포 매개 항암활성을 나타내므로 암 질환 예방, 개선 또는 치료에 우수한 효능을 발휘할 수 있다. 또한, 다른 항암물질과 혼용되는 경우 암세포에 대한 사멸 효과를 증진시킬 수 있어, 암 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료 효과를 증진시키기 위한 보조적 약학적 조성물로 사용되기 적합하다. 또한, 상기 NK 세포 매개 항암활성은 암세포 및 암줄기세포에 대한 사멸효과를 가지므로, 본 발명에 따른 비트 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 암의 재발을 예방하기 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 의해 예방, 개선 또는 치료될 수 있는 대상 암은 특정 암으로 한정되지 않으며, 예를 들면, 폐암, 위암, 유방암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 난소암, 자궁암, 신장암, 갑상선암, 항문암, 구강상피암, 전립선암 또는 대장암일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 비트 추출물을 포함하는 조성물은 약제학적 제제로 제조될 수 있다. 본 발명의 약제학적 제제는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있다. 상기 제제는 분산제 또는 안정화제를 더 포함할 수 있다.
필요에 따라, 상기 약제학적 제제는 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
필요에 따라, 본 발명의 약제학적 제제는 상기 성분들 이외에 당업계에 공지된 첨가물을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 희석제, 가용화제, 결합제, 붕해제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 더 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 제제는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 피부 도포, 직장 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 조절될 수 있으며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001㎎/㎏ 내지 10g/㎏, 바람직하게는 1㎎/㎏ 내지 1g/㎏일 수 있다. 필요에 따라 상기 투여량을 수회에 나누어 일정시간 간격으로 투여할 수 있다.
본 발명의 비트 추출물을 포함하는 조성물은 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 상기 기능성 식품이란 비트 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없어 접근성이 용이한 장점이 있다.
필요에 따라, 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들면, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 기능성 식품은 드링크제일 수 있다. 상기 드링크제는 향미제 또는 천연 탄수화물을 더 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 상기 향미제로는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 첨부된 특허청구범위를 제한하는 것이 아니며, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 실시예에 대한 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예
<비트 추출원료 최적 배합비 선정>
비트 추출물의 제조 전 비트 뿌리 및 잎의 최적비를 선정하기 위한 실험을 수행하였다. 비트를 물로 깨끗이 세척하고 뿌리 및 잎을 절단하기 전 무게를 측정하고, 뿌리 및 잎을 분리 절단한 후 각각의 무게를 측정하고 그 결과를 하기 표 1에 나타냈다. 무게 측정을 위한 비트는 A군과 B군으로 구분하고 A군에 대하여만 뿌리 및 잎을 구분하여 절단을 수행하였다. A군의 뿌리 및 잎의 무게비율은 하기 표 2에 나타냈다. 하기 표 2에서, 평균값은 1 내지 16 샘플 각각의 비율 값의 평균을 계산하여 구한 값이다.
Beta vulgaris
Weight(g) A군 B군
no. Total Stem Root no. Total
1 73.24 10.21 63.24 1 96.7
2 178.91 44.38 134.45 2 168.93
3 154.05 48.8 106.01 3 133.96
4 56.08 40.51 15.43 4 99.62
5 53.73 20.87 32.8 5 105.64
6 66.06 17.47 48.49 6 184.6
7 23.02 20.14 2.8 7 75.34
8 82.31 27.38 55.82 8 164.79
9 89.14 40.46 48.62 9 162.45
10 93.69 10.04 86.62 10 87.34
11 11.51 2.89 8.63 11 46.3
12 62.66 28.67 33.95 - 　-
13 51.2 20.68 30.1 - 　-
14 90.67 27.39 63.25 - 　-
15 106.81 22.77 84.02 - 　-
16 24.49 6.17 18.32 - 　-
계(kg) 1~16 1.22 0.39 0.83 1~11 1.33
평균(g) 1~16 76.1 24.3 52.0 1~11 120.5
Beta vulgaris
Percentage
(%)		 A군
no. Total Stem Root
1 100 14 86
2 100 25 75
3 100 32 68
4 100 72 28
5 100 39 61
6 100 26 74
7 100 88 12
8 100 33 67
9 100 45 55
10 100 10 90
11 100 25 75
12 100 46 54
13 100 40 60
14 100 30 70
15 100 21 79
16 100 25 75
Average 1~16 100 36 64
Proportion 1~16 1 0.4 0.6
비트는 잎의 길이가 길수록 뿌리가 작고, 잎의 길이가 짧은수록 뿌리가 커지는 반비례적 구조를 지니며, 추출원료로 이용할 비트 뿌리 및 잎에 대하여 각각의 중량을 모두 측정하고 그 평균값을 구해 개별 비트 원료별 뿌리 및 잎의 비율을 확인한 결과 뿌리 및 잎의 평균 비율은 3:2로 나타났다. 이러한 배합비 조건에 따라 추출원료의 양을 결정하여 추출을 수행하였다.
<비트 추출물의 제조>
[실시예 1]
추출을 위한 비트 원료는 세절 후 추출하였다. 뿌리 및 잎을 3:2의 비율로 혼합한 비트 추출원료 500g에 중량대비 20배의 정제수를 첨가한 후 100℃에서 4시간동안 추출하여 추출원액을 수득하였다. 이를 감압 농축하여 30brix의 농도로 준비한 후 동결건조하여 분말화된 비트 추출물을 제조하였다.
[실시예 2]
추출용매로 정제수 대신 5%(v/v)주정을 첨가한 것을 제외하면 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 비트 추출물을 제조하였다. 상기 주정은 물에 희석하여 제조하여 사용하였다.
[실시예 3]
추출용매로 정제수 대신 30%(v/v)주정을 첨가하고 추출온도를 60℃로 하여 추출한 것을 제외하면 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 비트 추출물을 제조하였다.
[실시예 4]
추출용매로 정제수 대신 70%(v/v)주정을 첨가하고 추출온도를 50℃로 하여 추출한 것을 제외하면 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 비트 추출물을 제조하였다.
상기 실시예 1 내지 4의 추출물의 수율은 건조 전의 액상 및 건조 후의 분말상을 구별하여 하기 표 3에 나타냈다.
원물량(kg) 추출량(g) 수율(%)
best liquid (30brix) 실시예1 0.5 109.25 7
실시예2 0.5 108.79 7
실시예3 0.5 63 4
실시예4 0.5 66 4
best powder
(30brix)		 실시예1 0.5 33.25 7
실시예2 0.5 31.10 6
실시예3 0.5 20.33 4
실시예4 0.5 22.24 4
각 실시예별 수율을 확인한 결과, 실시예 2를 제외한 다른 실시예의 경우 건조전후의 추출수율이 동일하고, 실시예 2의 경우에도 건조전후의 추출수율에 큰 오차가 없어 건조로 인한 로스(loss)가 낮은 것을 확인하였다.
<비트 추출물의 세포 독성시험>
상기 실시예들을 대상으로 각 시료별 세포 독성을 확인하기 위하여 MTT [(3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]를 이용하여 cell viability를 측정하였다. 마우스의 대식세포주인 RAW264.7 cell을 대상으로 하여 각 시료별 독성을 측정하였다.
RAW264.7 cell은 ATCC(American Type Culture Collection, NO. TIB-71)에서 분양받아 이용하였다. 10%(v/v) Fetal Bovine Serum, 1%(w/v) Penicillin, 0.1%(w/v) Gentamicin, 1%(w/v) L-glutamine, 1%(w/v) sodium pyruvate, 1%(w/v) Hepes 1M 을 함유한 DMEM 배지에서 배양시켜 96 well plate에 세포수가 104cell/well 가 되도록 seeding 하여 24시간 지난 후 각각의 시료를 농도를 달리하여 처리하였다. 시료처리 후 24시간 뒤에 0.5mg/mL MTT를 각 well에 처리하고 37℃, 5% CO2의 조건하에서 3시간동안 배양한 후 상층액을 제거하였고, 100% dimethylsulfoxide 200ul를 넣은 다음 20분간 잘 혼합하여 침전물을 용해시켜 micro plate reader를 사용해 540nm에서 O.D를 측정해 cell viability를 확인하고 그 결과를 도 1에 나타냈다. 도 1에서, (A)는 실시예 1에 대한 실험 결과이고, (B)는 실시예 2에 대한 실험 결과이고, (C)는 실시예 3에 대한 실험 결과이고, (D)는 실시예 4에 대한 실험 결과이다.
도 1을 참고하면, 모든 실시예들에서 독성은 검출되지 않았으며, 아무것도 세포에 처리하지 않은 컨트롤군(CLT)과 비교하였을 때 실시예 2를 제외한 다른 실시예들은 농도의존적으로 면역세포의 생존율이 유의미하게 증가하는 것으로 나타났다. 실시예 1 및 실시예 3의 경우 30μg/ml과 100μg/ml 농도에서, 실시예 4의 경우 100μg/ml 농도에서 과 유의적 차이를 보이는 것으로 나타났다. 실시예 2의 경우에도 고농도로 처리할수록 면역세포가 증가하는 경향은 나타났으나 유의적인 차이는 보이지 않았다. 도 1의 결과에서, 비트 추출물은 무독성의 추출물이며, 면역 세포를 증가시키는 면역증진 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 본 독성검사에서 최대 활성, 유효효능 및 무독성을 나타낸 시료를 선정하여 다른 in vitro 테스트를 실시하였다.
<비트 추출물의 nitric oxide 생성능 측정>
Nitric oxide(NO-)의 반감기는 매우 짧기 때문에 정확하게 검출할 수 없다는 단점이 있어, nitric oxide의 생체 내 전변물질인 nitrite (NO2-)를 간접적으로 측정함으로써 nitric oxide양을 측정하고 Nitrite를 이용하여 표준곡선(Standard curve)을 그려 정량에 이용하였다. 표준곡선은 도 2에 나타냈다.
NO 생성 및 비트 추출물의 면역증강 효능 평가를 확인하기 위한 실험을 실시하였다. 실험 시료로는 실시예들의 시료를 농도를 달리하여 처리하여 사용하였다. 비트 추출물의 Nitric oxide 생성능을 측정하기 위한 실험은 마우스의 대식세포주인 RAW264.7세포를 이용하여 수행하였다. RAW264.7세포를 10%(v/v) FBS, 1%(w/v) Penicillin/streptomycin 을 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하여 사용하였다. NO생성량 측정을 위해 96-well plate에 세포농도 1×104 cells/well 로 희석하여 RAW264.7세포를 분주한 후 12시간 배양하고, FBS가 없는 DMEM배지로 바꾸어 12 시간 배양해주었다. 다음으로 96-well plate의 각 well에 RAW 264.7 cell을 104cell/well 채우고 24시간 배양시킨 후 실험에 수행하였다. 실험 수행을 위한 배지는 Phenol red가 들어있지 않은 DMEM, 1%(w/v) 항생제 배지를 이용하였으며, 24시간 배양 후에 LPS 1μg/ml과 실시예들의 추출물을 각각 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 상기와 같이 cell seeding 후 총 48시간이 경과한 후 배양액 중 NO양을 측정하기 위하여 상층액을 50㎕을 96well plate에 옮긴 후 Griess Reagent 50㎕를 가한 후 15분 이내에 540nm 흡광도에서 OD값을 측정하였다. 산화질소의 생성량이 많을수록 색은 붉은 색에 가깝고, 그와 반대로 생성량이 적을수록 색은 노란색에 가깝다. RAW264.7을 세균성 LPS로 처리할 때 일어나는 NO 생성을 확인한 결과는 하기 표 4 및 도 3에 나타냈다. 도 3에서, (A)는 실시예 1에 대한 실험 결과이고, (B)는 실시예 2에 대한 실험 결과이고, (C)는 실시예 3에 대한 실험 결과이고, (D)는 실시예 4에 대한 실험 결과이다. 도 3에서, B는 Blank를 의미하고, B-1은 시료 1ug/ml를 처리한 실험군이고, B-3은 시료 3ug/ml를 처리한 실험군이고, B-10은 시료 10ug/ml를 처리한 실험군이고, B-30은 시료 10ug/ml를 처리한 실험군이다. 또한, 도 3에서 L은 LPS가 처리된 대조군을 의미하고, L-1은 LPS 및 시료 1ug/ml를 함께 처리한 실험군이다. L-3, L-10 및 L-30은 각각 LPS 및 시료 3, 10, 30ug/ml를 함께 처리한 실험군이다.
구분 반복차수 A. 시료 단독 처리군 B. LPS 및 시료 혼합 처리군
시료 처리 농도(ug/ml) 시료 처리 농도(ug/ml)
Blank 1 3 10 30 LPS단독 1 3 10 30
실시예1 1 9.02 7.14 7.14 4.76 2.38 47.62 19.05 16.67 11.90 9.52
2 9.52 4.76 4.76 7.14 2.38 42.86 26.19 14.29 7.14 9.52
3 9.52 7.14 4.76 2.38 2.38 4286 16.67 16.67 9.52 4.76
평균 9.13 6.35 5.55 3.17 2.38 47.62 20.63 15.87 9.52 7.94
실시예2 1 7.14 9.52 7.14 9.52 4.76 48.92 14.29 9.52 9.52 2.38
2 9.52 7.14 4.76 2.38 4.76 47.62 11.90 7.14 4.76 4.76
3 11.90 7.14 4.76 2.38 2.38 47.62 11.90 9.52 2.38 7.14
평균 9.52 7.94 5.56 4.76 3.97 48.05 12.70 8.73 5.56 4.76
실시예3 1 9.52 4.76 4.76 4.76 2.38 54.76 19.05 4.76 -2.38 -2.38
2 9.52 7.14 7.14 2.38 0.00 47.62 16.67 4.14 4.76 2.38
3 11.90 7.14 2.38 2.38 2.38 54.76 16.67 9.52 2.38 2.38
평균 10.32 6.35 4.76 3.17 1.59 50.79 17.46 7.14 1.59 0.79
실시예4 1 7.14 7.14 4.76 2.38 2.38 47.62 9.52 9.52 9.52 7.14
2 11.90 4.76 2.38 4.76 4.76 54.76 11.90 7.14 9.52 9.52
3 9.52 4.76 2.38 2.38 4.76 47.62 9.52 7.14 7.14 7.14
평균 9.52 5.56 3.17 3.17 3.97 50.00 10.32 7.94 8.73 7.94
상기 표 4 및 도 3을 참고하면, 실시예 1 내지 4의 시료를 처리한 실험군의 경우 무처리군(Blank)에 비해 농도의존적으로 NO의 농도가 감소하는 것으로 나타났다. 이 중 실시예 3의 시료가 NO 농도 감소폭이 가장 큰 것으로 나타났다. 세균성 LPS를 함께 처리한 경우에는, 실시예 1 내지 4의 시료를 처리한 실험군의 경우 무처리군(Blank)에 비해 농도의존적으로 NO의 농도가 현저하게 감소하는 것으로 나타났다.
마우스 대식세포주인 RAW264.7에서 세균성 LPS로 처리할 때 일어나는 NO 생성능의 측정결과 및 면역증강 효능평가를 실시한 결과 30% 주정 추출물인 실시예 3의 면역증강효과가 가장 우수한 것으로 확인되었다.
<비트 추출물의 NK 세포 활성화 효과 측정>
마우스로부터 얻은 비장세포와 NK-sensitive 세포로 알려진 YAC-1세포를 준비하여 실험에 이용하였다. 비장세포의 준비를 위해 마우스에서 비장을 적출하여 HBSS에 넣고 slide glass의 forested end를 이용하여 파쇄한 후, 40 μm nylon cell strainer(BD Biosciences)를 통과시켜 세포를 분리하였다. 세포를 300×g에서 5분간 원심분리한 후 적혈구 용혈액(RBC lysis buffer, sigma)을 가하여 적혈구를 제거하였으며, 얻어진 비장세포를 배양액(RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum(FBS), 100 U/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin) 에 현탁하여 실험에 사용하였다. YAC-1 세포는 한국세포주은행으로부터 받아 실험에 사용하였다.
NK 세포의 세포독성은 NK 세포가 YAC-1 세포를 공격하여 파괴된 YAC-1 세포로 부터 유리된 lactate dehydrogenase를 측정하는 방법(LDH cytotoxic assay)을 이용하여 확인하였다. 96-well plate에 1 × 104 cells/100 μl의 YAC-1 세포를 넣고 비장세포 : YAC-1 세포(effector-to-target) 비가 200 : 1, 100 : 1 및 50 : 1이 되도록 각각 비장세포를 넣은 후 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 배양하고 윈심분리하여LDH가 유리된 상층액 100 μl을 채취하여 96-well plate에 옮겼다.
LDH cytotoxic assay는 LDH assay kit(BioVision)를 이용하여 실행하였다. 세포배양액에 LDH working solution을 100 μl 첨가하고 실온(15~25℃)의 암소에서 30분간 반응시킨 후, 495 nm에서 흡광도를 측정하였다. NK 세포 활성도(%)는 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
Figure pat00001
실험 결과, 실시예 1 내지 4가 농도의존적으로 우수한 NK 세포 활성 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
<비트 추출물의 항암 증진 효과 측정>
추출물의 암세포에 대한 억제 활성을 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 실험 수행을 위한 암세포주는 A549, AGS, HCT 116 및 MCF-7을 한국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 각각의 세포는 10%(v/v) fetal bovine serum (FBS)와 100 U/mL penicillin G, 50 ㎍/mL streptomycin을 첨가한 RPMI-1640 (Gibco Co., Grand Island, NY, USA)과 DMEM (Gipco Co.)을 사용하여 5% CO2, 37℃ 배양기에서 배양하였으며, 세포 밀도가 높아지면 5분간 trypson-EDTA를 처리하여 계대배양 하였다. 각 암세포별로 1×105 cell/well 농도로 96 well plate에 100μL씩 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 후, 전 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 증류수를 이용하여 일정 농도로 희석된 시료를 100μL를 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양 완료 후 2mg/mL 농도의 MTT 시약을 well에 10μL씩 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 배양 후 MTT 시약이 첨가된 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO) 100μL를 가한 후 상온에서 발색시켜, ELISA microplate reader (ELx808, Bio-Tek　 Inc., USA)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 암세포증식 억제율은 생존율(relative cell viability, %)을 확인하여 측정하였다.
실험 결과, 실시예 1 내지 4는 암세포에 대하여 우수한 항암 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 다른 항암제와 혼용되는 경우 현저히 증진된 항암 효과를 나타내는 것으로 나타났다.

Claims (7)

  1. 비트(Beta Vulgaris) 추출물을 유효성분으로 포함하는, NK 세포 활성화를 통한 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 비트는 뿌리 및 잎이 1 : 0.4 내지 1의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 NK 세포 활성화를 통한 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 비트 추출물은 비트의 열수추출물 또는 주정추출물인 것을 특징으로 하는 NK 세포 활성화를 통한 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 비트의 주정추출물은 5 내지 70%(v/v) 주정에 가용한 추출물인 것을 특징으로 하는 NK 세포 활성화를 통한 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 비트의 주정추출물은 20 내지 40%(v/v) 주정에 가용한 추출물인 것을 특징으로 하는 NK 세포 활성화를 통한 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 비트 추출물은 산화질소 생성능을 갖는 것을 특징으로 하는 NK 세포 활성화를 통한 면역증강 및 항암활성 증진용 조성물.
  7. 비트(Beta Vulgaris) 추출물을 유효성분으로 포함하는, NK 세포 활성화를 통한 면역증강 및 항암활성 증진용 기능성 식품.
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