CN117535449A - 同时检测含非洲猪瘟病毒多种猪疫病毒的引物探针和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，公开了一种非洲猪瘟病毒及其四种类症病毒多重荧光PCR检测引物探针组、试剂盒及应用，该引物探针组包括检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型的引物对和探针。本发明能够同时对非洲猪瘟病毒及其四种类症病毒进行快速检测，且具有良好的特异性、敏感性和重复性，对非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型的质粒标准品最低检出限仅为101数量级，为非洲猪瘟及其难以临床区别的病毒性类症的鉴别诊断提供高效、快速和准确的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种同时检测非洲猪瘟病毒及其四种类症病毒的多重荧光PCR引物探针组、试剂盒及应用。
背景技术
非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)、猪瘟病毒(Classical swinefever virus，CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)和猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是目前国内生猪养殖和贸易过程中极具危害性的5种猪疫病病原，近年来这些病原在我国的防控形势非常严峻。
非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病和PCV2引起的猪皮炎和肾病综合征并不总是表现出典型的临床症状，而且这几种疾病的临床症状相似，容易相混淆，在疫病的早期阶段或者当少数动物受到感染时，可能很难实现临床诊断。
目前，这5种病原检测的研究多集中于血清学和分子生物学检测方法。其中ELISA、免疫层析等血清学检测方法成本低、操作简单快速，可满足大批量样本检测，但也存在特异性、敏感性相对较低的缺点，由此该方法在此类重大动物疫病种仅适用于大批量的样本筛选，而对于病原的精确定性仍需要结合其它检测方法。而PCR及荧光PCR技术在特异性、敏感性、稳定性和可定量分析等方面具有独特的优势，是目前当前国内外最常用和可靠的病原检测方法。
多重PCR在单重PCR的基础上进行改进和发展，即在同一个反应体系中加入两对以上引物，可实现对多种病原的快速精准同时检测。与单重PCR相比，多重PCR拥有单重PCR的灵敏性和特异性，又较之快捷和经济，也降低了试剂耗材及时间成本。
目前已有相关学者建立了非洲猪瘟及其1-3种病毒性类症的多重PCR检测方法，但尚未见针对非洲猪瘟病毒和上述4种类症病毒(CSFV、PRRSV、PCV2和PRV)的多重PCR检测方法。多重PCR方法的建立，不但要考虑引物的特异性等方面，还要特别考虑同一体系内各引物之间的相互干扰。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种同时检测非洲猪瘟病毒及其四种类症病毒的多重荧光PCR引物探针组、试剂盒及应用。
本发明的目的之一在于：提供一种同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型的引物探针组，其特征在于，用于多重荧光PCR检测，其中：检测非洲猪瘟病毒的引物对如SEQ ID NO.1-2所示；检测非洲猪瘟病毒的探针如SEQ ID NO.3所示；检测猪瘟病毒的引物对如SEQ ID NO.4-5所示；检测猪瘟病毒的探针如SEQ ID NO.6所示；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对如SEQ ID NO.7-8所示；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针如SEQ ID NO.9所示；检测猪伪狂犬病毒的引物对如SEQID NO.10-11所示；检测猪伪狂犬病毒的探针如SEQ ID NO.12所示；检测猪圆环病病毒2型的引物对如SEQ ID NO.13-14所示；检测猪圆环病病毒2型的探针如SEQ ID NO.15所示。
优选地，检测非洲猪瘟病毒的引物对的PCR产物片段大小为242bp；检测猪瘟病毒的引物对的PCR产物片段大小为245bp；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对的PCR产物片段大小为340bp；检测猪伪狂犬病毒的引物对的PCR产物片段大小为379bp；检测猪圆环病病毒2型的引物对的PCR产物片段大小为569bp。
本发明的目的之二在于：提供上述引物探针组在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型产品中的应用。
本发明的目的之三在于：提供一种包含上述引物探针组的试剂盒。
进一步地，所述试剂盒还包括ASFV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV2的标准质粒，其中构建ASFV的标准质粒引物对如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示；构建CSFV的标准质粒引物对如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示；构建PRRSV的标准质粒引物对如SEQ ID NO.20、SEQID NO.21所示；构建PRV的标准质粒引物对如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23所示序列；构建PCV2的标准质粒引物对如SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25所示序列。
本发明的目的之四在于：提供上述试剂盒的多重荧光PCR反应体系如下：PremixEx TaqTM(Probe qPCR)(2×)25μL，如权利要求1或2所述引物探针组中检测非洲猪瘟病毒的引物对、检测猪瘟病毒的引物对、检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对、检测猪伪狂犬病毒的引物对、检测猪圆环病病毒2型的引物对各3.2μL，如权利要求1或2所述引物探针组中检测非洲猪瘟病毒的探针、检测猪瘟病毒的探针、检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针、检测猪伪狂犬病毒的探针、检测猪圆环病病毒2型的探针各0.6μL，DNA模板2.5μL，ddH2O 3.5μL。
优选地，多重荧光PCR反应程序如下：95℃30sec，95℃5sec，56℃34sec，循环45次，耗时56min。
优选地，非洲猪瘟病毒的最低检测下限为5.38×101copies/μL，猪瘟病毒的最低检测下限为3.65×101copies/μL，猪繁殖与呼吸综合征病毒的最低检测下限为7.06×101copies/μL，猪伪狂犬病毒的最低检测下限为5.03×101copies/μL，猪圆环病毒2型的最低检测下限为5.44×101copies/μL。
本发明的目的之四在于：提供上述试剂盒在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了专用引物以及相应的最佳反应条件，其对ASFV、CSFV、PRRSV、PRV以及PCV2的质粒标准品的最低检出限分别为5.38×101copies/μL、3.65×101copies/μL、7.06×101copies/μL、5.03×101copies/μL、5.44×101copies/μL，灵敏性高。
该方法仅特异扩增ASFV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV2，与PEDV、TGEV、PPV无交叉反应，特异性强；组内、组间变异系数小于2％，具有良好的重复性。
本发明建立的多重荧光定量PCR检测方法为ASFV、CSFV、PRRSV、PRV以及PCV2的临床检测及流行病学调查提供了一种快速、敏感、特异的技术手段。
附图说明
图1为质粒PCR凝胶电泳图，泳道1-6分别为DL2000Marke、ASFV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV2。
图2为ASFV引物、探针浓度优化扩增曲线图，其中A为ASFV引物浓度优化；B为ASFV探针浓度优化。
图3为CSFV引物、探针浓度优化扩增曲线图，其中A为CSFV引物浓度优化；B为CSFV探针浓度优化。
图4为PRRSV引物、探针浓度优化扩增曲线图，其中A为PRRSV引物浓度优化；B为PRRSV探针浓度优化。
图5为PRV引物、探针浓度优化扩增曲线图，其中A为PRV引物浓度优化；B为PRV探针浓度优化。
图6为PCV2引物、探针浓度优化扩增曲线图，其中A为PCV2引物浓度优化；B为PCV2探针浓度优化。
图7为ASFV扩增曲线及标准曲线，其中A为扩增曲线，B为标准曲线。
图8为CSFV扩增曲线及标准曲线，其中A为扩增曲线，B为标准曲线。
图9为PRRSV扩增曲线及标准曲线，其中A为扩增曲线，B为标准曲线。
图10为PRV扩增曲线及标准曲线，其中A为扩增曲线，B为标准曲线。
图11为PCV2扩增曲线及标准曲线，其中A为扩增曲线，B为标准曲线。
图12为多重荧光PCR的特异性试验，1-5分别为ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PRV，6-9分别为PEDV、TGEV、PPV、阴性对照。
图13多重荧光PCR的敏感性试验，其中A、B、C、D、E分别为ASFV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2 108copies/μL至101copies/μL的标准质粒扩增曲线图。
图14为临床样本中部分PRRSV和PCV2混合感染的检测。
图15为临床样本中CSFV和PRRSV混合感染的检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
下载NCBI已发表的ASFV(AF302812.1、AF302816.1、AF449472.1、OP615344.1、MG674297.1、KC610526.1、KP144287.1、KC610522.1)、CSFV(KT953592.1、KT953611.1、MF977827.1、MK814602.1、MT586086.1、MW392291.1、OK169301.1、KP702210.1、HM449067.1、KU375263.1、KX759643.1、KJ417652.1、KY816738.1、JX975465.1、LC090849.1、KC533797.1)、PRRSV(MT268280.1、OM681585.1、MZ747449.1、ON093974.1、HQ315836.1、KC527830.1、AY032626.1、AF176348.2)、PCV2(AF201897.1、AY177626.1、EU727546.1、HQ395061.1、KX814348.1、KP975452.1、KR258797.1、KU193767.1、KY440166.1、MZ593752.1)、PRV(KU360259.1、MK622320.1、MT949537.1、MW250652.1、ON261933.1、OP376823.1、MK622323.1、KT809429.1)序列，通过DNAStar进行比对找到高度保守区，根据ASFV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2保守区设计特异性引物。
在ASFV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2荧光PCR扩增区域的两端设计5对特异性的引物用于质粒标准品的构建，引物均由通用生物公司合成。
多重荧光PCR引物和探针序列见表1，构建标准质粒引物序列见表2。
表1多重荧光PCR引物和探针序列
表2构建标准质粒引物序列
实施例2
ASFV、CSFV、CSFV、PRV、PCV2质粒标准品的制备，步骤如下：
ASFV质粒标准品由生物公司合成；将CSFV、PRRSV、PRV、PCV2的核酸分别使用表2中设计的特异性引物进行PCR扩增。反应体系：2×Rapid Taq PCR Master Mix 25μL，ddH2O16μL，上下引物各2μL，DNA模板5μL，总体系为50μL。
PCR程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，54℃退火15s，72℃延伸10s，循环30次；72℃终延伸5min。
将扩增的PCR产物进行纯化及回收，分别连接至T载体、转化DH5α感受态细胞，涂板，筛选阳性克隆质粒，培养，提取质粒进行PCR、测序鉴定，其中质粒PCR后进行琼脂糖凝胶电泳。
结果如图1所示，ASFV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2扩增出的目的片段大小分别为242bp、245bp、340bp、379bp、569bp，与预期结果一致。
用核酸蛋白分析仪测定质粒浓度，经计算，ASFV拷贝数为5.38×1010copies/μL，CSFV拷贝数为3.65×1010copies/μL，PRRSV拷贝数为7.06×1010copies/μL，PRV拷贝数为5.03×1010copies/μL，PCV2拷贝数为5.44×1010copies/μL。
多重荧光PCR反应条件优化：对多重荧光定量PCR的反应温度，反应体系进行优化，确定反应条件。
以上述构建的5种标准质粒标准品，建立总体系为50μL的多重荧光PCR反应体系，多重荧光PCR反应设置3个梯度退火温度(56℃、58℃、60℃)，8个引物浓度梯度(0.12μmol/L、0.16μmol/L、0.20μmol/L、0.24μmol/L、0.28μmol/L、0.32μmol/L、0.36μmol/L、0.40μmol/L)，8个探针浓度梯度(0.08μmol/L、0.12μmol/L、0.16μmol/L、0.20μmol/L、0.24μmol/L、0.28μmol/L、0.32μmol/L、0.36μmol/L)进行优化，以确定最佳反应条件。
经过优化后的反应体系为Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(2×)25μL，ASFV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2引物最佳浓度均为0.32μmol/L，探针浓度均为0.12μmol/L，DNA模板2.5μL，ddH2O 3.5μL。
反应条件为：95℃30s，95℃5s，56℃34s，共45个循环，结束反应，耗时共约56min，结果见图2-6。
实施例3
选取ASFV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2 108copies/μL至104copies/μL浓度的标准质粒，按照优化好的反应条件进行荧光PCR扩增反应，获得的Ct值为y轴，对应的质粒标准品拷贝数为x轴，制作标准曲线。
结果如图7-11所示，其中图7为ASFV标准质粒的扩增曲线及标准曲线，图8为CSFV标准质粒的扩增曲线及标准曲线，图9为PRRSV标准质粒的扩增曲线及标准曲线，图10为PRV标准质粒的扩增曲线及标准曲线，图11为PCV2标准质粒的扩增曲线及标准曲线。
由图7-11可知：ASFV、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2相关系数R2均在0.995及以上，表明各质粒标准品的起始模板数和Ct值之间均呈现良好的线性关系。
ASFV的标准方程：Y＝-3.364X+39.762，R2＝0.997。
CSFV的标准方程：Y＝-3.434X+41.852，R2＝0.995。
PRRSV的标准方程：Y＝-3.457X+37.432，R2＝0.998。
PRV的标准方程：Y＝-3.288X+44.573，R2＝0.998。
PCV2的标准方程：Y＝-2.875X+40.889，R2＝0.997。
实施例4
分别以ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PRV、PEDV、TGEV、PPV的核酸为反应模板，用所建方法扩增。
结果见图12，图中只有ASFV、CSFV、PRRSV、PCV2、PRV能够出现良好的扩增曲线，而其他样品均未出现扩增曲线，说明建立的多重荧光PCR检测方法特异性良好。
实施例5
选取标准模板浓度梯度为108copies/μL至101copies/μL的标准质粒进行敏感性试验。结果如图13显示：ASFV的最低检测下限为5.38×101copies/μL；CSFV最低检测下限为3.65×101copies/μL；PRRSV最低检测下限为7.06×101copies/μL；PRV最低检测下限为5.03×101copies/μL；PCV2最低检测下限为5.44×101copies/μL。
实施例6
为验证该多重荧光PCR方法的重复性，选取106～104copies/μL三个不同浓度的标准质粒作为模板，每个梯度做三次重复，结果见表3。重复性试验结果表明：
(1)ASFV多重荧光PCR检测方法的组内变异系数在0.341％～1.854％之间，组间变异系数在0.676％～1.540％；
(2)CSFV多重荧光PCR检测方法的组内变异系数在0.758％～1.143％之间，组间变异系数在0.143％～1.097％；
(3)PRRSV多重荧光PCR检测方法的组内变异系数在0.911％～1.905％之间，组间变异系数在0.487％～1.304％；
(4)PRV多重荧光PCR检测方法的组内变异系数在0.043％～0.893％之间，组间变异系数在0.175％～1.638％；
(5)PCV2多重荧光PCR检测方法的组内变异系数在0.900％～1.711％之间，组间变异系数在1.286％～1.836％。
表明本发明方法稳定性高、重复性好。
表3多重荧光PCR的重复性试验
实施例7
应用所建立的方法，对收集的95份临床样品进行检测，结果如表4所示，临床样本中部分PRRSV和PCV2混合感染的检测结果见图14，CSFV和PRRSV混合感染的检测结果见图15。
表4临床样品检测结果
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型的引物探针组，其特征在于，用于多重荧光PCR检测，其中：
检测非洲猪瘟病毒的引物对如SEQ ID NO.1-2所示；
检测非洲猪瘟病毒的探针如SEQ ID NO.3所示；
检测猪瘟病毒的引物对如SEQ ID NO.4-5所示；
检测猪瘟病毒的探针如SEQ ID NO.6所示；
检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对如SEQ ID NO.7-8所示；
检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针如SEQ ID NO.9所示；
检测猪伪狂犬病毒的引物对如SEQ ID NO.10-11所示；
检测猪伪狂犬病毒的探针如SEQ ID NO.12所示；
检测猪圆环病病毒2型的引物对如SEQ ID NO.13-14所示；
检测猪圆环病病毒2型的探针如SEQ ID NO.15所示。
2.根据权利要求1所述引物探针组，其特征在于，检测非洲猪瘟病毒的引物对的PCR产物片段大小为242bp；检测猪瘟病毒的引物对的PCR产物片段大小为245bp；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对的PCR产物片段大小为340bp；检测猪伪狂犬病毒的引物对的PCR产物片段大小为379bp；检测猪圆环病病毒2型的引物对的PCR产物片段大小为569bp。
3.如权利要求1或2所述引物探针组在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型产品中的应用。
4.一种包含如权利要求1或2所述引物探针组的试剂盒。
5.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，多重荧光PCR反应体系包括：
Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)(2×)25μL，
浓度为0.32μmol/L的如权利要求1或2所述引物探针组中检测非洲猪瘟病毒的引物对、检测猪瘟病毒的引物对、检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物对、检测猪伪狂犬病毒的引物对、检测猪圆环病病毒2型的引物对各3.2μL，
浓度为0.12μmol/L的如权利要求1或2所述引物探针组中检测非洲猪瘟病毒的探针、检测猪瘟病毒的探针、检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的探针、检测猪伪狂犬病毒的探针、检测猪圆环病病毒2型的探针各0.6μL，
DNA模板2.5μL，
ddH2O 3.5μL。
6.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，多重荧光PCR反应程序如下：95℃30sec，95℃5sec，56℃34sec，循环45次，耗时56min。
7.如权利要求4所述试剂盒，其特征在于，非洲猪瘟病毒的最低检测下限为5.38×101copies/μL，猪瘟病毒的最低检测下限为3.65×101copies/μL，猪繁殖与呼吸综合征病毒的最低检测下限为7.06×101copies/μL，猪伪狂犬病毒的最低检测下限为5.03×101copies/μL，猪圆环病毒2型的最低检测下限为5.44×101copies/μL。
8.如权利要求4-7任一项所述试剂盒在制备同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病病毒2型产品中的应用。
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